Post on 04-Oct-2015
description
Prctiques de Gentica. Curs 2012-2013
1
PRCTIQUES DE GENTICA. CURS 2012-2013.
NDEX:
A. ANLISI DE MOSQUES MUTANTS. 1
A1. CONEIXEMENT I MANIPULACI DE D. MELANOGASTER. 1
A1.1. Cicle biolgic.
A1.2. Identificaci dels sexes.
A1.3. Manipulaci de les mosques.
A1.4. Obtenci de femelles verges.
A1.5. Mutants utilitzats.
A2. ANLISI D'UN MUTANT I DETERMINACI DEL SEU GRUP DE LLIGAMENT. 6
A2.1. Material per a manipular mosques.
A2.2. Procediment experimental.
A2.2.1. Observaci de mascles i de femelles.
A2.2.2. Observaci de mosques salvatges i de mosques mutants.
A2.2.3. Disseny experimental.
A2.2.4. Mutant dulls blancs.
A2.2.5. Mutant dulls taronges.
B. ANLISI DUN PEDIGREE HUM. 16
B1. METODOLOGIA I DESENVOLUPAMENT EXPERIMENTAL. 16
C. GENTICA MOLECULAR. 19
C1. METODOLOGIA BSICA. 20
C2. PROCEDIMENT EXPERIMENTAL. 21
C2.1. Amplificaci de DNA a partir duna mostra de saliva.
C2.2. La identificaci de lespcie dorigen a partir de productes lactis.
C2.3. Caracteritzaci molecular del mutant dulls taronges de Drosophila melanogaster.
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
1
A. ANLISI DE MOSQUES MUTANTS.
En aquestes prctiques sutilitza com a material biolgic a lespcie Drosophila melanogaster,
tamb coneguda com a mosca de la fruita o del vinagre. D.melanogaster s, des de la seva
introducci en l'experimentaci gentica l'any 1909 per Castle i Morgan, un material excellent
de laboratori i ha perms descobrir nombroses i importants lleis gentiques.
Figura 1. Exemplar de D.melanogaster amb fenotip salvatge.
A1. CONEIXEMENT I MANIPULACI DE D. MELANOGASTER.
A1.1. Cicle biolgic.
D.melanogaster s un insecte (dpter) holometbol que en el seu desenvolupament a partir
dou, passa per les etapes segents: larva, pupa i finalment imago o insecte adult (veure Figura
2). La durada del cicle, aix com de les diferents fases, depn de la temperatura de cultiu. A 20
C el cicle s duns 15 dies i a 25 C noms duns 9 dies. A aquesta temperatura, la fase dou
dura unes 22 hores, la de larva uns 4 dies i la de pupa tamb uns 4 dies (veure Taula 1).
Taula 1: Cronologia del desenvolupament de D. melanogaster a 25 C.
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
2
Figura 2. Estadis en el desenvolupament de D.melanogaster
A1.2. Identificaci dels sexes.
s obvi que per a poder realitzar els experiments s'han de reconixer, sense cap mena de
dubte, aquells aspectes morfolgics que permeten distingir inequvocament els mascles de les
femelles. A la fase adulta, les diferncies entre mascles i femelles sn diverses i clares (veure
Figura 2 i Figura 3): la pigmentaci de la cara dorsal de la part distal de l'abdomen s contnua
en els mascles, formant una taca fosca sobre els ltims segments abdominals; les femelles sn
una mica ms grans que els mascles i l'extrem de l'abdomen s ms punxegut en les femelles i
ms rom en els mascles. Recordeu la presncia de pintes sexuals noms en els mascles
(observables al binocular).
Mirant la genitalia amb el binocular, s'aprecia que a l'extrem distal de la cara ventral de
l'abdomen, a ms de la placa anal, hi ha en les femelles una plaqueta vaginal de color clar,
mentre que els mascles tenen una estructura de color terrs: l'arc genital (Figura 3).
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
3
Figura 3. Vista ventral posterior de Drosophila melanogaster
A1.3. Manipulaci de les mosques.
Quan s'han de realitzar encreuaments experimentals o b observar i classificar els individus
d'un cultiu, cal anestesiar-los. La cambra d'anestsia consisteix simplement en un flasc,
similar o igual als de cultiu, que es tapa amb un cot impregnat amb ter etlic, substncia
anestsica d's normal per a aquest fi (lter etlic s txic i la seva manipulaci al laboratori ha
de fer-se amb molta cura).
Per introduir les mosques a l'eteritzador, es destapa aquest flasc i el flasc amb el cultiu de
Drosophila, encarant rpidament les boques dambds flascons en posici vertical. Per tal
d'evitar que les mosques puguin escapar-se conv donar, abans de destapar-lo i en posici
vertical, uns cops secs al flasc de cultiu. Una vegada encarats els dos flascons, se subjecten
les dues boques amb una nica m i es colloca l'eteritzador en posici inferior; mitjanant uns
cops suaus, les mosques cauran en aquest des del flasc amb el cultiu. S'ha d'evitar
moviments i cops bruscos ja que sin podria caure tamb a l'eteritzador el medi de cultiu. Quan
s'han de donar cops als flascons, es recomana de fer-ho sobre una placa de suro que
esmorteeix el cop i el soroll.
Una vegada les mosques (o gran part d'elles) s'han transferit al flasc eteritzador, es tapa
aquest amb el cot impregnat amb ter i s'espera uns segons fins que hagin perdut la seva
mobilitat. Les mosques anestesiades es colloquen sobre una cartolina blanca i ja poden ser
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
4
observades i classificades. s important no sotmetre les mosques a una exposici massa llarga
a lter (uns 30 segons s, moltes vegades, suficient) ja que llavors es moren, la qual cosa es
veu molt b perqu les ales i potes queden en posici perpendicular, separades del cos.
Tamb s'ha de tenir cura de no impregnar molt el tap de cot, si goteja ter no s'ha de collocar
i hem d'esperar o eliminar l'excs dter abans d'utilitzar-lo.
Normalment, les mosques romanen anestesiades d'aquesta manera d'uns 5 a 10 minuts. Si
durant l'observaci les mosques comencen a despertar-se, s'han de reeteritzar. Els exemplars
eteritzats successivament moltes vegades poden tenir problemes d'esterilitat, el que no s
desitjable pels individus que s'han d'encreuar. Per aix es convenient eteritzar cada vegada
noms una quantitat dexemplars adequada a les nostres capacitats d'anlisi, repetint el procs
fins que s'han analitzat tots els exemplars del flasc de cultiu.
Per a la manipulaci del exemplars s'utilitza un pinzell petit, per exemple del n 0. Els individus
que desprs de la seva classificaci no sn mai ms necessaris sn sacrificats collocant-los en
un flasc que cont alcohol de 70.
Quan s'han de transferir individus anestesiats a un flasc de cultiu, no s'han de tirar directament
a l'interior ja que poden quedar enganxats irreversiblement al medi de cultiu i morir. Per tal
d'evitar aquest gran problema podem dipositar les mosques sobre la paret de vidre, conservant
el flasc en posici horitzontal (sense que rodi) fins que despertin completament.
A1.4. Obtenci de femelles verges.
Una femella de Drosophila pot emmagatzemar i utilitzar l'esperma d'una nica inseminaci per
a la major part de la seva reproducci. Els mascles adults poden copular amb femelles recent
emergides de la pupa, diverses hores abans que comencin a ovopositar. Per tant, per a
realitzar els encreuaments experimentals cal disposar de femelles verges per a la generaci
parental, les quals sacostumen a obtenir de la segent manera: del flasc en el qual estan
eclosionant les pupes es retiren totes les mosques, aix tenim la seguretat de que tots els
individus nascuts en les sis primeres hores sn verges i se separen les femelles dels mascles,
mantenint ambds sexes en flascons separats fins el dia de l'encreuament. La virginitat de les
femelles aix obtingudes pot ser comprovada cultivant el flasc on les hem mantingudes
separades dels mascles; si apareixen larves en aquest flasc, no totes les femelles eren verges
i per tant shan de descartar.
A1.5. Mutants utilitzats.
De la gran quantitat de mutants fenotpics, els que s'escullen per a ser utilitzats en el
desenvolupament de les prctiques sn d'identificaci fcil, per tal de no dificultar la tasca de
l'alumne (Figura 4). Moltes vegades no es fa necessari utilitzar el binocular pel seu
reconeixement.
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
5
Les mutacions escollides les podem classificar segons mutacions que afecten:
a) A les ales i altres apndixs: forma, mida i venaci.
b) Al cos: color.
c) Als ulls: forma, mida i color.
d) A les quetes: forma, mida i nombre.
Figura 4: Morfologia de diversos mutants que es podeu observar a Drosophila .
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
6
A2. ANLISI D'UN MUTANT I DETERMINACI DEL SEU GRUP DE LLIGAMENT.
L'objectiu de la prctica s analitzar la naturalesa d'una mutaci problema (dominncia o
recessivitat) i el seu tipus d'herncia (autosmica o lligada al sexe) a partir del fenotip.
Sestudiaran creuaments a on els progenitors sn soques pures homozigtiques que difereixen
en un determinat carcter.
La primera generaci dun creuament s la generaci parental (P), la descendncia dels
progenitors de la generaci P es denomina primera generaci filial (F1) i la descendncia
provinent del creuament dindividus de la F1 es denomina segona generaci filial (F2).
Dominncia i recessivitat. En un locus amb 2 allels, lallel que codifica pel tret que sempre
sexpressa al llarg de totes les generacions sanomena dominant (A) i lallel que no sexpressa
en combinaci amb el dominant sanomena recessiu (a). Aix els individus amb dotaci AA i Aa
presentaran el fenotip A i els individus amb dotaci aa presentaran el fenotip a.
Autosmic o lligat al sexe. Parlem dun carcter autosmic quan el loci que el controla es troba
a un cromosoma somtic (no sexual) i parlem dun carcter lligat al sexe quan aquest es
localitza al cromosoma sexual (X, en aquest cas).
En el cas de treballar amb 2 loci, aquests poden provenir de 2 cromosomes diferents i es
transmeten independentment o del mateix cromosoma (lligats), es poden entrecreuar o no.
A2.1. Material per a manipular mosques.
-Eteritzador
-ter
-Placa de suro
-Pinzell
-Cartolina de color blanc
-Lupa binocular
-Tubets de vidre amb i sense medi de cultiu
-Flasc amb etanol 70.
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
7
A2.2. Procediment experimental.
A2.2.1. Observaci de mascles i de femelles.
Cal adormir les mosques per poder realitzar una observaci amb lupa de diferents caracterstiques. Apunta
les caracterstiques principals que et permeten distingir un mascle duna femella.
Caracterstiques Femella Mascle
Mida
Forma del cos
Extrem de labdomen
Potes
A2.2.2. Observaci de mosques salvatges i de mosques mutants.
Cal adormir les mosques per poder realitzar una observaci amb lupa de diferents caracterstiques.
Mutants que vegis
Carcter Salvatge
Color dels ulls
Forma de les ales
Forma de les quetes
Forma de les antenes
Color del cos
A2.2.3. Disseny experimental.
Cal establir quin seria el disseny experimental ms adequat per poder determinar el tipus dherncia que
presenten els diferents carcters mutats.
A partir daqu comencem a treballar en parallel amb dues soques mutants (mutants dulls blancs,
mutant dulls taronja). Els procediments sindiquen per separat a cada soca.
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
8
A2.2.4. Mutant dulls blancs.
A2.2.4.1. Encreuaments.
Fes un esquema del disseny experimental que sutilitzar per descriure el tipus dherncia daquest mutant.
Indica, sempre que puguis, el fenotipus de tots els individus/generacions que surtin a lesquema. Indica
clarament quines parts de lexperiment no han estat realitzades pels alumnes, i a partir de quines mosques
ha comenat lexperiment daquest mutant.
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
9
A2.2.4.2. Observaci i comptatge de mosques.
Utilitza les taules segents per descriure i comptar les mosques que formen part de lexperiment. Pot ser
que no hagis dutilitzar totes les files.
Generaci Fenotipus Descripci del fenotipus Total de mascles
Total de femelles
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Generaci Fenotipus Descripci del fenotipus Total de mascles
Total de femelles
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
10
A2.2.4.3- Descripci del tipus dherncia.
Cal fer una hiptesi sobre el tipus dherncia, a partir de la qual es calculen unes freqncies esperades.
Aquestes freqncies esperades caldr comparar-les amb les freqncies observades mitjanant una 2.
Hiptesi(s) Qu es deriva daquesta hiptesi que ens permet fer un clcul de
les freqncies esperades?
Freqncies esperades
Freqncies observades
2 g.ll.
Clcul de la 2
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
11
Taula de valors de la 2
Quin tipus dherncia presenta el carcter dulls blancs? Raona la teva resposta.
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
12
A2.2.5. Mutant dulls taronja.
A2.2.5.1. Encreuaments.
Fes un esquema del disseny experimental que sutilitzar per descriure el tipus dherncia daquest mutant.
Indica, sempre que puguis, el fenotipus de tots els individus/generacions que surtin a lesquema. Indica
clarament quines parts de lexperiment no han estat realitzades pels alumnes, i a partir de quines mosques
ha comenat lexperiment daquest mutant.
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
13
A2.2.5.2. Observaci i comptatge de mosques.
Utilitza les taules segents per descriure i comptar les mosques que formen part de lexperiment. Pot ser
que no hagis dutilitzar totes les files.
Generaci Fenotipus Descripci del fenotipus Total de mascles
Total de femelles
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Generaci Fenotipus Descripci del fenotipus Total de mascles
Total de femelles
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Grup Grup
Taula Taula
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
14
A2.2.5.3- Descripci del tipus dherncia.
Cal fer una hiptesi sobre el tipus dherncia, a partir de la qual es calculen unes freqncies esperades.
Aquestes freqncies esperades caldr comparar-les amb les freqncies observades mitjanant una 2.
Hiptesi(s) Qu es deriva daquesta hiptesi que ens permet fer un clcul de
les freqncies esperades?
Freqncies esperades
Freqncies observades
2 g.ll.
Clcul de la 2
Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants
15
Taula de valors de la 2
Quin tipus dherncia presenta el carcter dulls taronges? Raona la teva resposta.
Prctiques de Gentica Anlisi dun Pedigree Hum
16
B. ANLISI DUN PEDIGREE HUM.
La descripci de fenotips estranys o que criden latenci en lespcie humana es comen a produir a
partir del segle XVIII. Des daleshores els investigadors desenvoluparen una tcnica simple dinvestigaci
daquests casos: lestudi de la informaci familiar. Daquesta manera, i ats a la impossibilitat de realitzar
creuaments controlats en lespcie humana, el gentic ha de recrrer a lescrutini dels aparellaments
produts per casualitat.
El membre duna famlia que crida latenci es denomina propsit o propositus i el seu fenotip s
excepcional. Aleshores, linvestigador rastreja la histria del carcter dinters cap endarrera en la famlia i
dibuixa un arbre genealgic o pedigree tot utilitzant certs smbols normalitzats (veure Taula A). Observant
laparici daquest fenotip s possible determinar el patr dherncia.
Aquesta metodologia clssica es denomina anlisi del pedigree i els gentics lhan utilitzada durant dcades
conjuntament amb les dades mdiques per a determinar el tipus dherncia de molts carcters. Actualment
sutilitza conjuntament amb les tcniques danlisi molecular.
B1. METODOLOGIA I DESENVOLUPAMENT EXPERIMENTAL.
Lalumne haur de realitzar un pedigree familiar propi dun dels cinc carcters que sexposen a continuaci:
1- Daltonisme: Impossibilitat de diferenciar tots els colors.
2- Pic de la vdua: Lnia del cabell termina en un pic al centre del front.
3- Enroscament de llengua: Possibilitat denrotllar la llengua.
Prctiques de Gentica Anlisi dun Pedigree Hum
17
4- Clotet a la barbeta: Presncia dun clotet a la barbeta.
5- Lbuls separats: Lbul de la orella separat.
Quins sn el teus fenotipus pels diferents carcters a estudiar?:
Carcter: Fenotipus:
1- Daltonisme
2- Pic de la vdua
3- Enroscament de llengua
4- Clotet a la barbeta
5- Lbuls separats
Un cop escollit el carcter, lalumne realitzar el seu arbre genealgic incloent-hi tots els individus
emparentats (pares, germans, fills, oncles i avis). Shauria dintentar tenir un mnim de 15 individus i 3
generacions. Una vegada complert el pedigree familiar pel carcter estudiat, lalumne haur de determinar
lherncia del carcter a partir del seu propi pedigree o dels seus companys de curs, aix com el seu propi
genotip.
Prctiques de Gentica Anlisi dun Pedigree Hum
18
Taula A. Smbols que sutilitzen en lanlisi de pedigree humans
Prctiques de Gentica Gentica Molecular
19
C. GENTICA MOLECULAR.
Des de fa uns anys que la gentica molecular ha experimentat un espectacular progrs a causa
del desenvolupament de tcniques molt eficients com ara la seqenciaci, la clonaci i,
sobretot, la reacci en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR va ser descrita lany 1987 per
K. Mullis i aquest descobriment li va suposar l'obtenci del Premi Nobel.
La PCR permet fer in vitro moltes cpies (amplificar) dun fragment concret del genoma d'una
manera rpida i efica. L'obtenci de gran quantitat de cpies de fragments concrets de DNA
amb una mida mxima de 2 o 3 kilobases (Kb), permet la simplificaci de moltes tcniques que
daltra manera no es podrien fer de forma rutinria.
La PCR t dues grans qualitats que la fan una eina realment efectiva i molt simple com a
tcnica de laboratori.
1.-Lespecificitat, ja que noms amplifica una secci molt concreta del genoma.
2.-La robustesa, perqu amplifica a partir de mostres poc purificades.
La PCR te moltes utilitats, entre daltres sutilitza per a clonar i seqenciar gens, per a observar
polimorfismes dels fragments de restricci, per a les tcniques de mutagnesi dirigida. De tota
aquesta metodologia nhan resultat moltes aplicacions. Algunes delles sn les que tenen
alguna aplicaci forense (identificaci individual, paternitats, sexatge), els genotipatges de
mutacions, la identificaci despcies i la reconstrucci de filognies.
Al llarg de les sessions de prctiques es treballaran les tcniques bsiques utilitzades en un
laboratori de gentica molecular. Es realitzaran metodologies d'extracci de DNA a partir de
diferents teixits, electroforesi en gel d'agarosa, reacci en cadena de la polimerasa (PCR),
tcniques de genotipatge i protocols de diagnstic. L'aplicaci d'aquestes metodologies
permetr resoldre els segents casos prctics:
1. Amplificaci de DNA a partir duna mostra de saliva.
2. Identificaci de l'espcie d'origen (vaca, ovella o cabra) a partir de productes lactis.
3. Caracteritzaci molecular del mutant dulls taronges de Drosophila melanogaster.
Els materials i aparells a utilitzar seran:
MATERIAL APARELLS Puntes de micropipetes Centrfuga
Eppendorf Micropipetes Gradetes Estufa
Rotulador de vidre Termociclador Guants Fonts i cubetes delectroforesi
Transiluminador Calculadora
Prctiques de Gentica Gentica Molecular
20
C1. METODOLOGIA BSICA:
Abans de comenar cal:
1. Comprovar que portem l'equip de protecci individual que necessitem.
2. Netejar la taula de laboratori i les micropipetes, si s possible amb alcohol, per evitar
contaminacions.
3. Sempre que es treballa al laboratori cal portar guants, tant per evitar la contaminaci
com per a protegir-se dels reactius perillosos.
4. s molt important sempre retolar clarament els tubs.
En els diferents protocols s'utilitzaran les tcniques moleculars bsiques, com sn l'extracci de
DNA, PCR i electroforesi en gel d'agarosa. Els fonaments d'aquestes tcniques sn els
segents:
EXTRACCI DE DNA. En primer lloc, ser necessari obtenir una adequada quantitat i qualitat
de DNA a partir del material biolgic de partida. Per a aix hem d'aplicar una srie de
tractaments que ens permetran allar i purificar el DNA. Hi ha multitud de procediments
d'extracci de DNA i l'elecci dun dependr fonamentalment del tipus de material biolgic de
partida, del tipus de DNA que es vol obtenir, aix com del material disponible al laboratori. La
major part dels protocols d'extracci presenten dues etapes, una primera etapa
d'homogenetzaci i l'etapa final de separaci i purificaci del DNA. L'etapa d'homogenetzaci
consisteix en trencar les estructures cellulars que protegeixen el DNA perqu pugui ser
accessible als reactius i s'aconsegueix aplicant diferents mtodes fsics, qumics o enzimtics o
una combinaci d'aquests. La intensitat del tractament d'homogenetzaci dependr de la
dificultat de trencament de les estructures biolgiques del material de partida. Un cop en
dissoluci, la gran mida i la naturalesa hidroflica del DNA ens permetr separar-lo de la resta
de components. A ms haurem de separar el DNA de les estructures a les que s'associa de
manera natural, principalment de protenes. La separaci i purificaci del DNA es pot
aconseguir a partir de multitud de tcniques, com l'eliminaci de protenes amb dissolvents
orgnics, la precipitaci d'cids nucleics amb alcohols, la digesti enzimtica, la sedimentaci o
la combinaci d'aquestes.
PCR: El principi bsic de la tcnica de la PCR s molt simple. Sutilitzen dos encebadors
oligonucleotdiques o primers (daproximadament 20 parells de bases) de seqncia coneguda
i que hibriden amb les regions que flanquegen el fragment de DNA que volem amplificar.
Aquests primers actuen com a encebadors perqu la DNA-polimerasa actu i pugui amplificar el
fragment. Com que cada cpia nova pot servir de motlle per a una nova amplificaci, el nombre
de cpies del fragment creix exponencialment. Els encebadors utilitzats durant el procs
damplificaci de DNA se sintetitzen basant-se en lalineament de les zones conservades de
seqncies disponibles en bases de dades.
Prctiques de Gentica Gentica Molecular
21
La PCR consta de tres etapes (Figura 1):
I. La desnaturalitzaci, a temperatures normalment entre 90-95 C, del DNA de doble
cadena per a obtenir-nen de cadena senzilla.
II. La uni dels encebadors al DNA motlle de cadena senzilla. La temperatura de l'etapa
depn de la composici nucleotdica del encebador, normalment entre 50-60 C
III. Lelongaci de la cadena de nova sntesi, a temperatures normalment entre 70-74C.
ELECTROFORESI EN GEL D'AGAROSA. S'utilitzar per a la comprovaci de la qualitat del
DNA. L'agarosa s un polisacrid compost principalment per agar i es mpliament utilitzada
com a suport en electroforesi de fragments de DNA. L'agarosa s insoluble en medis aquosos a
temperatura ambient i es dissol en ells a una temperatura de 100 C. Quan es refreda, la
dissoluci d'agarosa forma un entramat de fibres i pels seus porus es poden desplaar les
molcules de DNA quan se'ls hi aplica un camp elctric. El DNA t crrega negativa i es
desplaa per lagarosa a diferent velocitat en funci de la seva mida. Per tal de visualitzar el
DNA sutilitza el bromur detidi, un agent intercalant que se situa entre les dues cadenes del
DNA i t la particularitat demetre fluorescncia quan s illuminat amb llum ultraviolada. El
BROMUR D'ETIDI s MOLT MUTAGEN i s'han de portar guants quan es manipula qualsevol
soluci amb aquesta substncia.
C2. PROCEDIMENT EXPERIMENTAL.
C2.1. Amplificaci de DNA a partir duna mostra de saliva.
s possible extreure DNA de gaireb qualsevol tipus de mostra biolgica, i de fet, lnic
requeriment s que hi hagi cllules nucleades. Tot i aix, segons el tipus de mostra, pot ser
ms o menys difcil purificar el DNA, i la quantitat pot arribar a ser molt escassa.
Prctiques de Gentica Gentica Molecular
22
A la taula segent, tens uns exemples de mostres biolgiques, indica si s possible
extreuren DNA o no, i si en podem obtenir molta o poca quantitat.
Mostra Extracci (S/No) Quantitat
Sang
Cabell
Ungles
Semen
Mscul
C2.1.1. Extracci de DNA a partir de saliva.
Lextracci es realitza mitjanant un protocol molt senzill:
Acumular saliva a la boca, al mateix temps que amb la llengua es freguen les dents i
les galtes.
Escopir la saliva en un tub de 15 ml (tap vermell).
Afegir-hi 2 ml de tamp de lisi TT. Aquest tamp cont un detergent (SDS), que trenca
les membranes cellulars i allibera el DNA.
Afegir-hi 200 l de NaCl 5M.
Afegir-hi aproximadament 2 volums detanol absolut, refrigerat a -20C.
Invertir el tub unes 10 vegades, fins que precipiti el DNA, que t una estructura similar
al cot.
Amb una punta de pipeta neta, pescar el DNA i posar-lo en un tub eppendorf de
1,5 ml.
Assecar el precipitat a lestufa, amb el tub obert.
Resuspendre en 500 l de tamp TE.
Durant lextracci hem fet servir un seguit de reactius. Quina creus que s la seva funci?
Reactiu Funci en lextracci
Tamp TT
NaCl 5M
Etanol absolut
Tamp TE
Com qualificaries lextracci en termes de qualitat i quantitat de DNA? Quin origen t,
aquest DNA?
Prctiques de Gentica Gentica Molecular
23
C2.1.2. PCR de lextracci de saliva.
Amb aquesta mostra realitzarem dues PCR diferents, amb dos parells de primers diferents:
PCR 1:
Reactiu Concentraci
estoc Concentraci
final Volum (VF=30 l) N=___ mostres
Tamp 10X 1X
MgCl2 50 mM 1,5 mM
Primer-F1 10 M 0,2 M
Primer-R1 10 M 0,2 M
dNTP 2 mM 200 M
Taq 5 u/l 0,025 u/ l
Aigua
Mostra 1 l
PCR 2:
Reactiu Concentraci
estoc Concentraci
final Volum (VF=30 l) N=___ mostres
Tamp 10X 1X
MgCl2 50 mM 1,5 mM
Primer-F2 10 M 0,2 M
Primer-R2 10 M 0,2 M
dNTP 2 mM 200 M
Taq 5 u/l 0,025 u/ l
Aigua
Mostra 1 l
Un cop muntada la PCR, cal posar els tubets al termociclador. El programa que far laparell
s:
Fase o pas Temperatura Temps Cicles
Desnaturalitzaci 94 3 1
Desnaturalitzaci 94 30
35 Hibridaci 55 145
Extensi 72 145
C2.1.3. Comprovaci de la PCR i anlisi de resultats.
Finalment, per comprovar la reacci damplificaci cal fer un gel dagarosa al 2 %:
tamp TAE Agarosa
100 ml
Prctiques de Gentica Gentica Molecular
24
Carregar, al pou que correspongui, 15 l de la PCR +5 l de tamp de crrega (per donar
densitat a la mostra).
Amplifiquen tots dos parells de primers?
Desprs que el professor us digui qu sn els parells de primers que heu fet servir, qu
diries en relaci a lorigen del DNA que sha extret de la mucosa bucal?
C2.2. La identificaci de lespcie dorigen a partir de productes lactis.
La identificaci despcies sutilitza en camps tant diversos com poden ser la conservaci de
recursos naturals, la gentica forense o la indstria agroalimentria. En general, ls daquestes
metodologies ha de permetre identificar, a partir de diferents mostres biolgiques, lespcie
dorigen, determinar barreges de productes de diferent origen (sobretot en mostres daliments)
o fins i tot detectar algun tipus de contaminacions o dadulteracions.
Per tal de poder identificar correctament lespcie dorigen duna mostra s indispensable
disposar de dues eines fonamentals: una tcnica danlisi i una mostra de referncia.
Segons el tipus de mostra es poden utilitzar tcniques danlisi molt diverses. Per exemple, les
anlisis morfolgiques amb lupa sutilitzen en mostres de pinsos de cereals, lobservaci al
microscopi es fa servir en alguns tipus de mostres forenses i les anlisis qualitatives de
protenes permeten caracteritzar productes lctics. Tot i aquesta diversitat de metodologies, en
general sutilitzen tcniques danlisi basades en lamplificaci del DNA perqu sn rpides,
repetibles, fcils dinterpretar i no requereixen coneixements especfics per cada tipus diferent
de mostra. No obstant aix, aquests protocols funcionen malament en mostres molt
processades, a causa de la degradaci que pateix la molcula de DNA.
En general, la mostra de referncia s una mostra dorigen conegut que podem comparar amb
la mostra problema i aix fer una identificaci correcta. En els protocols basats en lanlisi de
DNA, aquestes mostres de referncia les trobem, habitualment, en grans bases de dades en
lnia, pbliques i que contenen milions de seqncies de DNA. Un cop analitzada al laboratori
la mostra problema podem comparar-la amb tota la informaci de les bases de dades
mitjanant diferents eines informtiques i assignar-la a una espcie determinada.
C2.2.1. Extracci de DNA a partir de formatge.
Lextracci es realitza mitjanant el segent protocol:
Talla un tros petit de la mostra de formatge i posal dins dun eppendorf.
Afegir-hi 550 l de tamp de lisi TT. Aquest tamp cont un detergent (SDS), que
trenca les membranes cellulars i allibera el DNA.
Prctiques de Gentica Gentica Molecular
25
Afegir-hi 10 l de protenasa K (20 mg/ml) i sincuba 12 hores a 56C.
Afegir-hi 600 l de NaCl 5M i centrifugar-lo a 12.000 rpm 10 min.
Transfereix 400 l de la fase aquosa (200 l +200 l) a un eppendorf nou.
Precipita amb 800 l de etanol absolut a -20 C.
Invertir el tub dues vegades.
Centrifugar-lo a 12.000 rpm 10 min i decantar el sobrenedant.
Afegir-hi 800 l de etanol 70% a -20C.
Centrifugar-lo a 12.000 rpm,10 min i decantar el sobrenedant.
Deixa assecar les restes detanol a lestufa 94 C durant 1 minut (anar controlant).
Resuspendre amb 200 l de tamp TE.
Per comprovar lextracci de DNA genmic es prepara un gel dagarosa a l1%:
tamp TAE Agarosa
100 ml
Carregar 10 l d extracci +5 l tamp de crrega.
Durant lextracci hem fet servir un seguit de reactius. Quina creus que s la seva funci?
Reactiu Funci en lextracci
Tamp TT
Protenasa K
NaCl
Etanol Absolut
Etanol 70%
Tamp TE
Com qualificaries lextracci en termes de qualitat i quantitat de DNA? Quin origen t,
aquest DNA?
C2.2.2. PCR espcie-especfiques.
Amb aquesta mostra realitzarem tres PCR diferents, amb tres parells de primers diferents, que
amplifiquen en productes dorigen ov (parell OA), cabrum (parell CH) i bov (parell BT).
Prctiques de Gentica Gentica Molecular
26
Encebador Seqncia (53)
OA12S959 ATATCAACCACACGAGAGGAGAC
OA12S1130 TAAACTGGAGAGTGGGAGAT
CH12S144 CGCCCTCCAAATCAATAAG
CH12S469 AGTGTATCAGCTGCAGTAGGGTT
BT12S916 GTACTACTAGCAACAGCTTA
BT12S1171 GCTTGATTCTCTTGGTGTAGAG
PCR 1:
Reactiu Concentraci
estoc Concentraci
final Volum (VF=30 l) N=___ mostres
Tamp 10X 1X
MgCl2 50 mM 1,5 mM
10 M 0,2 M
10 M 0,2 M
dNTP 2 mM 200 M
Taq 5 u/l 0,025 u/ l
Aigua
Mostra 1 l
PCR 2:
Reactiu Concentraci
estoc Concentraci
final Volum (VF=30 l) N=___ mostres
Tamp 10X 1X
MgCl2 50 mM 1,5 mM
10 M 0,2 M
10 M 0,2 M
dNTP 2 mM 200 M
Taq 5 u/l 0,025 u/ l
Aigua
Mostra 1 l
Prctiques de Gentica Gentica Molecular
27
PCR 3:
Reactiu Concentraci
estoc Concentraci
final Volum (VF=30 l) N=___ mostres
Tamp 10X 1X
MgCl2 50 mM 1,5 mM
10 M 0,2 M
10 M 0,2 M
dNTP 2 mM 200 M
Taq 5 u/l 0,025 u/ l
Aigua
Mostra 1 l
Un cop muntada la PCR, cal posar els tubets al termociclador. El programa que far laparell
s:
Fase o pas Temperatura Temps Cicles
Desnaturalitzaci 94 3 1
Desnaturalitzaci 94 30
35 Hibridaci 50 145
Extensi 72 145
C2.2.3. Comprovaci de la PCR i anlisi de resultats.
Finalment, per comprovar la reacci damplificaci cal fer un gel dagarosa al 2 %.
tamp TAE Agarosa
100 ml
Carregar, al pou que correspongui, 15 l de la PCR +5 l de tamp de crrega.
Omple la taula segent amb els resultats de lelectroforesi:
Mostra PCR BT PCR OA PCR CH
Formatge 1
Formatge 2
Formatge 3
Formatge 4
En aquesta prctica, qu hem fet servir de mostres de referncia?
Prctiques de Gentica Gentica Molecular
28
Comproveu, amb el professor, si els vostres resultats quadren amb les indicacions de les
etiquetes dels productes que heu analitzat.
C2.3. Caracteritzaci molecular del mutant dulls taronges de Drosophila melanogaster.
A nivell molecular, la base gentica del mutant dulls taronges s una inserci a lintr 2 del
locus White, que naltera la funci. Al llarg de lexperiment, a part de determinar quin tipus
dherncia presenta aquesta mutaci, podrem identificar exactament el genotipus de les
mosques, i per tant, comprovar com es correspon amb els fenotipus observats.
Lallel salvatge del locus White (el que t la seqncia sense canvis i per tant no t la funci
alterada) el detectarem mitjanant la PCR1 (combinaci de primers We2F2 i We3R2), que
genera un fragment de 362 pb.
Ex 2 Ex 3
Intr 2 Primer: We2F2
Primer: We3R2
PCR1: Estructura de l al lel salvatge del locus White
362 pb
Ex 2 Ex 3
2 Primer: We2F2
PCR1: Estructura de l al lel salvatge del locus White
362 pb
Ex 2 Ex 3
Intr 2 Primer: We2F2
Primer: WcopiaR1
PCR2: Estructura de l al lel apricot del locus White
300 pb
Element copia
Primer: We3R2
> 5 kb
No funciona!
Ex 2 Ex 3
Intr 2 Primer: We2F2
Primer: WcopiaR1
PCR2: Estructura de l al lel apricot del locus White
430 pb
Element copia
> 5 kb
No funciona!
Prctiques de Gentica Gentica Molecular
29
Tal com us indica lesquema, tant lallel salvatge com lallel apricot tenen tota la seqncia
dels exons i dels introns, i lnic canvi s la inserci de Copia. Aquest element fa que la PCR1
no pugui utilitzar lallel apricot de motlle, perqu s massa llarg.
Lallel mutant (apricot) t una inserci dun element anomenat Copia a lintr 2 del locus White.
Aquest fragment t una mida de ms de 5 kilobases, i el detectarem mitjanant la PCR2
(combinaci de primers We2F2 i WcopiaR1), que genera un fragment de 430 pb.
En un homozigot per lallel salvatge, qu esperarem que passi a la PCR1? I a la PCR2? I en
un heterozigot? I en un homozigot per lallel apricot?
Genotipus PCR1 PCR2
Homozigot salvatge
Heterozigot
Homozigot apricot
Hi ha alguna categoria genotpica ms que no hgim tingut en compte?
C2.3.1. Extracci de DNA.
Lextracci de DNA es realitza mitjanant el protocol de Chelex, una resina quelant que permet,
duna manera molt senzilla, obtenir DNA de qualitat.
Cal separar les mosques individualment en un tub eppendorf d1.5 ml.
Afegir-hi 300 l de tamp Chelex 10% .
Afegir-hi 20 l de protenasa K (a 20 mg/ml).
Sincuba una hora a 56C i tot seguit es posa 5 a 94C.
Finalment, cal vortejar el tub durant 1 i centrifugar-lo a 12.000 rpm 1.
Per qu en aquest cas no comprovem lextracci amb una electroforesi en gel dagarosa?
Prctiques de Gentica Gentica Molecular
30
C2.3.2. PCR.
Reactius i concentracions:
Reactiu Concentraci estoc Concentraci final
Tamp 10X 1X
MgCl2 50 mM 1,5 mM
Primer 1 10 M 0,2 M
Primer 2 10 M 0,2 M
dNTP 2 mM 200 M
Taq 5 u/l 0,025 u/l
Cal que feu els clculs per poder preparar les reaccions de PCR.
PCR 1:
Reactiu Concentraci
estoc Concentraci
final Volum (VF=30 l) N=___ mostres
Tamp 10X 1X
MgCl2 50 mM 1,5 mM
We2F2 10 M 0,2 M
We3R2 10 M 0,2 M
dNTP 2 mM 200 M
Taq 5 u/l 0,025 u/ l
Aigua
Mostra 1 l
PCR 2:
Reactiu Concentraci
estoc Concentraci
final Volum (VF=30 l) N=___ mostres
Tamp 10X 1X
MgCl2 50 mM 1,5 mM
We2F2 10 M 0,2 M
Wcopia R1 10 M 0,2 M
dNTP 2 mM 200 M
Taq 5 u/l 0,025 u/ l
Aigua
Mostra 1 l
Prctiques de Gentica Gentica Molecular
31
Un cop muntada la PCR, cal posar els tubets al termociclador. El programa que far laparell
s:
Fase o pas Temperatura Temps Cicles
Desnaturalitzaci 94 3 1
Desnaturalitzaci 94 30
35 Hibridaci 55 145
Extensi 72 145
C2.3.3. Comprovaci de la PCR i lectura de resultats
Finalment, per comprovar la reacci damplificaci cal fer un gel dagarosa al 2 %.
tamp TAE Agarosa
100 ml
Carregar, al pou que correspongui, 15 l de la PCR +5 l de tamp de crrega.
Fenotipus Generaci Sexe N PCR 1 PCR 2 Genotipus
Els genotipus es corresponen correctament amb els fenotipus? Fes una taula amb els
resultats observats i els esperats.