Post on 23-Sep-2018
La distinción fundamental entre la microscopía
óptica convencional y la microscopía óptica confocal
es la manera en la cual se produce la imagen.
6. Microscopía confocal espectral
Microscopía óptica convencional● Interacción de la radiación con la muestra en una
región extensa.
● Imágenes degradadas por toda la información óptica
que se origina en esa extensa iluminación, así como
por la información óptica contenida en planos que no
son el plano enfocado.
6. Microscopía confocal espectral
● Se producen punto a punto en el plano imagen a
partir de los correspondientes puntos de iluminación
del plano de la muestra.
● La fuente de iluminación puntual ilumina una región
del objeto y el detector puntual recibe la radiación de
esta área objeto. La imagen se construye por el
barrido sincronizado de la fuente y el detector.
6. Microscopía confocal espectral
Microscopía óptica confocal
El principio de confocalidad:
6. Microscopía confocal espectral
Detector
Objetivo
Divisordel haz
Luz láser Diafragma(PINHOLE)
Muestra
Microscopía óptica confocal
● La calidad de las imágenes resultantes se debe a la
omisión de toda la información óptica fuera de foco
que degrada la imagen en la microscopía
convencional.
6. Microscopía confocal espectral
Microscopía óptica confocal
El principio de confocalidad:
● El pinhole está conjugado con el punto focal de las
lentes por eso es un pinhole confocal.
6. Microscopía confocal espectral
Microscopía óptica confocal
6. Microscopía confocal espectral
Detector
Objetivo
Divisordel haz
Luz láser Diafragma(PINHOLE)
Muestra
Microscopía óptica confocal
● La microscopía confocal permite obtener secciones
ópticas en profundidad que generan imágenes
tridimensionales de la morfología de una muestra.
6. Microscopía confocal espectral
Microscopía confocal Microscopía convencional
Microscopía óptica confocal
● Una imagen confocal es una sección óptica de una
muestra. Tomando distintas imágenes confocales se
obtiene una imagen tridimensional en foco.
● Esta capacidad es útil para medir perfiles de
superficie y cuando se acopla con la fluorescencia
da una representación tridimensional de la
morfología interna de la muestra.
6. Microscopía confocal espectral
Microscopía óptica confocal
¿Cómo funciona un microscopio confocal?6. Microscopía confocal espectral
muestra
microscopio
espejosde barrido
espejodicroico
pinhole detector
láser
¿Cómo funciona un microscopio confocal?6. Microscopía confocal espectral
muestra
microscopio
espejosde barrido
espejodicroico
pinhole detector
láser
¿Cómo funciona un microscopio confocal?6. Microscopía confocal espectral
muestra
microscopio
espejosde barrido
espejodicroico
pinhole detector
láser
¿Cómo funciona un microscopio confocal?
La imagen se forma punto a punto
y sección a sección.
6. Microscopía confocal espectral
6. Microscopía confocal espectral
Filtro de excitación
Filtro barrera
Espejo dicroico
Muestra
Microscopio confocal ESPECTRAL
6. Microscopía confocal espectral
Microscopio confocal ESPECTRAL
Fluoresceína Rodamina
498
537
552
665
La luz emitida por la muestra se separa en bandas
espectrales de modo que se pueda recoger el rango o
rangos de longitud de onda que interese.
6. Microscopía confocal espectral
Microscopio confocal ESPECTRAL
6. Microscopía confocal espectralMicroscopio confocal ESPECTRAL
● El sistema de detección espectral ofrece la posibilidad de seleccionar libremente las bandas de detección y aumenta la captación de luz en un 20 – 40 % frente a sistemas de detección basados en filtros ópticos.
● Esto supone una mayor relación señal/ruido, una mejor calidad de imagen, menor blanqueado y mayor viabilidad de muestras vivas ya que se requiere menor potencia de láser, y mayor poder de penetración en muestras con mucha dispersión de luz.
6. Microscopía confocal espectralMicroscopio confocal ESPECTRAL
● El resultado es un sistema de detección multibanda que permite ajustar individualmente las bandas de emisión aumentando la calidad y reduciendo el cruzamiento.
● Es un espectrómetro que permite hacer barridos a diferentes longitudes de onda.
● La longitud de onda puede ser adaptada a las características reales de emisión de la muestra.
● Fácilmente adaptable a nuevos fluorocromos.
Preparación de la muestra● La mayoría de los protocolos de microscopía
confocal se basan en los desarrollados para la
preparación de muestras en microscopía óptica
convencional.
● Un buen punto de comienzo para el desarrollo de un
nuevo protocolo es preparar la muestra para la
microscopía óptica convencional e ir modificándolo
para el confocal según sea necesario.
6. Microscopía confocal espectral
Preparación de la muestra● El sistema confocal recoge menos fluorescencia de
una muestra gruesa comparado con el microscopio
convencional por lo que las muestras requerirán
tiempos de tinción mayores o bien mayores
concentraciones, y en el microscopio convencional
pueden aparecer sobreteñidas.
6. Microscopía confocal espectral
Preparación de la muestra● Muchos protocolos incluyen un antiblanqueante que
protege el fluoroforo de los efectos de blanqueo del
láser.
● Es aconsejable utilizar la menor potencia de láser
que sea práctica y así se protege el fluorocromo.
6. Microscopía confocal espectral
Preparación de la muestra● Se deben tomar medidas para preservar la
estructura tridimensional de las muestras utilizando
algún tipo de espaciador entre el porta y el cubre.
● Cuando las muestras vivas están sujetas a estudio,
generalmente es necesario montarlas en una
cámara que provea todo lo necesario para la vida.
6. Microscopía confocal espectral
Preparación de la muestra● Las propiedades de la muestra tales como opacidad
o turbidez pueden influir en la profundidad que es
capaz de alcanzar el láser dentro de la muestra.
Muchos protocolos incorporan algún agente
aclarante que aumenta la transparencia de la
muestra.
6. Microscopía confocal espectral
Preparación de la muestraFijación:● Buena preservación de la muestra y del anfígeno● Sin añadir fluorescencia
Fijadores:● Metanol● Aldehídos: Paraformaldehído 4%
Formaldehído 3,9% = Formalina 10% Glutaraldehído
● Especiales: PLP(paraformaldehído, lisina, periodato)
6. Microscopía confocal espectral
Preparación de la muestraMarcaje:● Específico e intenso● Sin cruzamiento● Mínimo photobleaching
6. Microscopía confocal espectral
Preparación de la muestraMarcaje:1. Autofluorescente2. Tinciones fluorescentes● Tinciones generales: naranja de acridina, eosina● Tinciones específicas: (Molecular Probes)
● nucleo: DAPI, Hoechst, Ioduro propidio, Sytox● mitocondrias: mitotracker● lípidos: nile red● filamentos de actina: faloidina
6. Microscopía confocal espectral