Post on 29-Aug-2018
Silenciamiento génico para el control del hongo causal de escoba de bruja
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
Ana Cristina Caribé dos Santos, DSc
Guayaquil
25 a 28 de agosto, 2014
QUE ES RNAi
Conjunto de procesos mediados por pequeños
RNAs regulatorios conservado entre eucariotas
Protege el genoma de patógenos y transposones
Regula el programa celular de expresión génica y desenvolvimiento
Previene el acumulo de mRNAs não funcionales
APLICACIONES DE RNAi EN LA
CIENCIA
Control de la expresión génica experimentalmente
Defensa contra patógenos
Estudio funcional de genes
POR QUE UTILIZAR RNAi -
VENTAJAS
PTGS
Degradación del mRNA, por tanto,
no altera la estructura del gen
endógeno
Su eficiencia no es comprometida
por la presencia de núcleos no
transformados o de genes
multicópias
Silenciamiento
de alta especificidad
Silenciamiento simultáneo
de secuencias conservadas
(familias multigénicas)
POR QUE UTILIZAR
RNAi - VENTAJAS
Silenciamiento sistémico
Plamodesmatas
Plantas
Diliporo
Basidiomicetos
Proteínas transmembranas
C. elegans
POR QUE UTILIZAR RNAi - VENTAJAS
Determinación de la
operacionalidad del
silenciamiento génico
por RNAi en
M. perniciosa, usando o
gen gfp, como modelo
LO QUE YÁ HICIMOS
Gene Organismo c/ Proteína Valor E
homologia
Qde-1 N. crassa RdRP 2e-04
QDE3 N. crassa qde-3 6e-15
(RecQ DNAhelicase)
CAF Arabidopsis CAF 3e-12
(endoribonuclease dicer homolog)
SDE3 Arabdopsis RNA helicase 4e-24
Secuencias identificadas en el banco de dados del genoma de
M. perniciosa que tienen homología con genes vinculados al
mecanismo de RNAi
PROYECTO DE SECUENCIAMIENTO DEL GENOMA DE Moniliophthora perniciosa (http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura)
Cerca de 39 Mbp y 14.000 genes predichos
hph
Vector usado en la transformación
de M. perniciosa
Dra. Regine Kahmann, Munchen, Germany
pHSP70-SG (Spellig et al. 1996)
Producción de una linaje transgénica de M. perniciosa
que expresa el gen heterólogo gfp
Transfixión del vector pHSP70-SG para protoplastos de M.
perniciosa por el método PEG/CaCl2
A. Protoplastos, micrografía de fase de contraste 400X. B Hifa parecida con
tubo de germinación saliendo directamente de una simple célula esférica. C e
D. Algunos protoplastos agregados en el proceso de regeneración,
contribuyendo para la formación de micelio. E. Desenvolvimiento de hifas en
un estado mas avanzado.
E D C
B A
Transformación de M. perniciosa con el gen repórter gfp
Expresión de gfp - linajes control y transformante
Plasmid Template - Estrategia para obtención de gfp (Plasmid Template)
en las orientaciones senso y antisenso para síntesis de gfpdsRNAs,
usando o MEGAscript RNAi Kit transcription reaction.
Estrategia para síntesis de dsRNAs
lacZ ddt T7 promoter ddt gfp sense
NcoI MCS MCS
lacZ ddt T7 promoter ddt gfp antisense
NcoI MCS MCS
EcoRI
EcoRI
SILENCIAMIENTO DEL GEN gfp POR RNAi
CT
.
T5. T4
T1
T2
T6
T3.
A
B
Silenciamiento del gen repórter gfp por RNAi
Diagnóstico del silenciamiento usando RT-qPCR. Expresión relativa de gfp
en linajes transgénicas de M. perniciosa tratadas con gfpdsRNA (51 – 97%).
LO QUE YÁ HICIMOS
Silenciamiento de genes
endógenos de M. perniciosa
por RNAi, visando análisis
funcional
SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyd
Estrategia para síntesis de dsRNAs
SalI
lacZ T7 promoter Sp6 MpHYD3 sense
MCS MCS
lacZ T7 promoter Sp6 MpHYD3 antisense
MCS MCS
SalI
SalI
SalI
SalI
SalI
Plasmid Template - Estrategia para obtención de MpHyd en las orienta-
ciones senso y antisenso para la síntesis de MpHyddsRNAs usando o
MEGAscript RNAi Kit transcription reaction.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Hd
1
Hd
1
Hd
1
Hd
1
Hd
1
Hd
2
Hd
2
Hd
2
Hd
2
Hd
2
Hd
4
Hd
4
Hd
4
Hd
4
Hd
4
Hd
5
Hd
5
Hd
5
Hd
5
Hd
5
CT T1 T2 T3 T10 CT T1 T2 T3 T10 CT T1 T2 T3 T10 CP T1 T2 H3T10
Lines M. perniciosa
RQ
SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyd
Expresión relativa de MpHyd en linajes control y tratadas con
MpHyddsRNA vía PEG/CaCl2 (18 a 97%)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Hd
1
Hd
1
Hd
1
Hd
1
Hd
2
Hd
2
Hd
2
Hd
2
Hd
4
Hd
4
Hd
4
Hd
4
Hd
5
Hd
5
Hd
5
Hd
5
CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6
Lines M. perniciosa
RQ
Expresión relativa de MpHyd en
linajes control y tratadas con
MpHyddsRNA vía electroporación
(89 a 97%)
Fenotipo
SILENCIAMENTO DO GENE MpHyd
Estrategia para obtener MpPrix1 (PCR Template) en las
orientaciones senso y antisenso para síntesis de
MpPrix1dsRNAs, usando MEGAscript RNAi Kit transcrip-
tion reaction.
PDNR-LIB PDNR-LIB
T7 MpPRIX1 sense
Estrategia para síntesis de dsRNAs
SILENCIAMENTO DO GENE MpPrix1 POR RNAi
T7
MpPRIX1
MpPRIX1 antisense
Silenciamiento del gen MpPrix1 por RNAi
Expresión relativa de MpPrix1 en linajes
control y tratadas con MpPrix1dsRNA (23
a 87%).
Curva de sobrevivencia de linajes con-
trol y tratadas con MpPrix1dsRNA ex-
puestas a H2O2
Actividad de la enzima 1 cys-peroxidase en
linajes control y tratadas con MpPrix1dsRNA
LO QUE ESTAMOS HACIENDO
Proyecto “Rede Cacau Renorbio – Vassoura de Bruxa”
Proyecto interinstitucional (FINEP, FUNPAB, CEPLAC,
UESC, CENA-USP, CENERGEN-EMBRAPA, UNICAMP)
Coordinador: Dr. José Luis Pires (CEPLAC)
Vice-coordinador: Dr. Raúl René Valle (CEPLAC)
Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopa-
tógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi
Coordinadora: Dra. Ana Cristina Caribé (UESC)
Investigadores:
Dres. Raúl René Valle (CEPLAC), Carlos Pirovani (UESC);
Dras. Karina Gramacho (CEPLAC), Acássia Pires (UESC),
Virginia Soares (UESC), Fátima Alvim (UESC)
Sub-proyecto: Silenciamiento génico y
control del fitopa-tógeno Moniliophthora
perniciosa por RNAi
Producir biofungicida a base de moléculas
de RNA duplo filamento (dsRNAs)
homólogos a genes esenciales a procesos
relacionados al desenvolvimiento y
patogenicidad de M. perniciosa
Gen Organismos Función probable
Sintase de quitina (CHS3) Pleurotus, Agaricus Síntesis de quitina - pared
celular de fungos
Septina (SEP/CDC/SPR) Laccaria, Coprinopsis Formación de septos
Trehalose fosfato sintase
(TPS1/TPS2) Pleurotus, Grifola
Síntesis de trehalose - azúcar
que regula turgencia.
Catalasa (CTA1/CTT1) Aspergillus Previene la acumulación de
niveles tóxicos de H2O2
Moniliolisinas (Mp-AaPri1
e MpPri2) Pleurotus, Agrocybe Formación del hongo
Glucanasa (EGT) Coprinopsis, Postia Degradación de celulosa
Hidrofobinas (CoH1) Coprinopsis,
Lentinula
Formación de película
hidrofóbica en la superficie
de hifas
Genes candidatos a silenciamiento por el método dsRNA.
Acción de Pesquisa 1. Realizar identificación y silenciamiento por RNAi
de genes de M. perniciosa esenciales a: infección, crecimiento, nutrición,
reproducción y patogenicidad
Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopató-
geno Moniliophthora perniciosa por RNAi
1. Síntesis de microesferas de quitosana:
Síntesis de microesferas de quitosana utilizando el
método de coacervación (ARAL et al., 2000; BERTHOLD et al.,
1996).
2. Síntesis de liposomas:
Síntesis de vesículas unilamelares grandes (LUVs), a
partir de la extrusión de la dispersión lipídica del lipidio
catiónico bromato de dioctadecildimetilamonio
(DODAB) en solución acuosa conteniendo el dsRNA
albo.
Acción de Pesquisa 2. Síntesis de vehículos para protección y
entrega de dsRNAi en el hongo Moniliophthora perniciosa, in vivo
Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopató-
geno Moniliophthora perniciosa por RNAi
3. Síntesis de cápsides virales: técnica de VIGS
(vírus-induced gene silencing)
Vectores virales - El genoma viral será modificado
removiendo genes de patogenicidad y insiriendo genes o
secuencias que codifiquen moléculas de dsRNA
correspondientes a los albos a ser silenciados
Acción de Pesquisa 2. Síntesis de vehículos para protección y
entrega de dsRNAi en el hongo Moniliophthora perniciosa, in vivo
Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopató-
geno Moniliophthora perniciosa por RNAi
Producción de la formulación del biofungi-
cida, suspensión concentrada(SC)
Establecimiento del procedimiento para apli-
cación del biofungicida a base de dsRNAs:
por aspersión o inyección (concentración del
fungicida; equipo para aplicación; período y
condiciones climáticas para aplicación, etc.)
Acción de Pesquisa 3. Elaborar biofungicida a base de dsRNAs
homólogos a genes esenciales al desenvolvimiento o patogeni-
cidad de M. perniciosa
Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopató-
geno Moniliophthora perniciosa por RNAi
Prueba de eficiencia del fungicida en inverna-
dero con clones de cacao con padrones de
resistencia y susceptibilidad e inoculados con
basiodiosporas de M. perniciosa (1,0X105 basio-
diosporas viables/mL)
Observación y análisis del desenvolvimiento
del hongo y síntomas producidos
Acción de Pesquisa 3. Elaborar biofungicida a base de
dsRNAs homólogos a genes esenciales al desenvolvimiento
o patogenicidad de M. perniciosa