Post on 13-Mar-2020
16. AGROALIMENTARIO
Análisis evolutivo de dos bacterias de interés agrícola Candidatus Liberibacter y
Rhizobium
Salinas Lugo, Alan Gabriel; Cantero, Jorge
evol94.as@gmail.com; jorgecanterop@gmail.com
Facultad de Ingeniería Agronómica
Universidad Nacional del Este
Resumen.
El huanglongbing (HLB) es una enfermedad, que afecta principalmente a los cítricos (Citrus
spp.), contra la cual no existe hasta la fecha control químico ni biológico causando daños
alrededor de todo el mundo. La enfermedad es causada por bacterias llamadas Liberibacterias
(Candidatus Liberibacter spp.). La familia Rhizobiaceae contiene dentro de sí especies
asociadas al suelo y las plantas, siendo el Rhizobium micro simbiontes facultativos habitantes
de los suelos y las Liberibacter, en su mayoría fitopatógenas. Conforme las diferencias
existentes entre los genomas de los organismos se pueden reconstruir su filogenia mediante
herramientas computacionales. Se obtuvieron los genomas de la base de datos taxonómica
del NCBI y los ortólogos se obtuvieron mediante un BLAST. Con ayuda del software R con
sus paquetes se reconstruyo la filogenia de los ortólogos entre ambas especies y del
concatenado de los mismos. La reconstrucción filogenética de los arboles consenso y
"genoma artificial" fueron coherentes entre, el clado de Candidatus Liberibacter con el de
trabajos anteriores y a los reportados sobre el estándar (sub-unidad ribosomal 16S). Las
marcadas semejanzas entre Liberibacter crescens y las especies de Rhizobium pueden
indicar que la especie fue la última en especiarse del clado de los Liberibacters. El marcado
largo de rama en árbol de la fosfopantotenoilcisteina descarboxilasa de Ca. Libetibacter
americanus puede tratarse de un evento de transferencia horizontal desde Arsenophonus. La
importancia de los análisis bioinformáticos sobre los mecanismos biológicos de Ca. L. se
vuelven esenciales con los últimos descubrimientos sobre una posible resistencia por parte
de los Cítricos.
Palabras claves: Candidatus Liberibacter, Rhizobium, filogenia, HLB
Introducción
El huanglongbing (HLB) es una
enfermedad, que afecta principalmente a
los cítricos (Citrus spp.), contra la cual no
existe hasta la fecha control químico ni
biológico, la misma causa grandes daños
en cuanto a volumen y calidad de
producción, puede llevar a la senescencia
de la planta; sin embargo, tarda 4 años
aproximadamente en matar a la planta y los
peores daños se dan en ese intervalo
(SENAVE, 2013), por lo cual fue declarada
emergencia fitosanitaria en el año 2013
(SENAVE, 2014). La enfermedad es
causada por bacterias gram negativas,
llamadas Liberibacterias (Candidatus
Liberibacter spp.), de la clase alfa
proteobacterias, son parásitos obligados
que viven dentro del floema de las plantas
y se transmiten de una planta a otra por
psílidos (Bové, 2006), específicamente
Diaphorina citri de origen asiático y Trioza
erytrea de origen africano, ambos del orden
Hemíptera de la familia Psylidae. Estos
insectos afectan principalmente a los
brotes tiernos, sin embargo, en ausencia
de la bacteria son considerados plagas
menores (Monzó, Urbaneja, & Tena, 2015).
La familia Rhizobiaceae descripta por
Conn en 1938 contiene dentro de sí
especies asociadas al suelo y las plantas,
siendo el Rhizobium el primer genero
estudiado y establecido dentro de la familia
y las Liberibacterias, en su mayoría
fitopatogenas, fueron posteriormente
clasificadas dentro de la familia (Ant &
Souza, 2015). Las bacterias del genero
Rhizobium son micro simbiontes
facultativos y son normalmente
encontrados dentro de la micro biota del
suelo, principalmente dentro del rizoplano y
la rizosfera, alimentándose de los
compuestos despedidos por las raíces de
las plantas y teniendo la particularidad de
captar el nitrógeno atmosférico y hacerlo
disponible para las plantas en simbiosis
con las leguminosas y ocasionalmente
otras plantas (Wang & Trivedi, 2013). La
Liberibacterias están ampliamente
distribuidas por todo el mundo; Ca.
Liberibacter asiaticus (Clasi)
principalmente en Asia y América, Ca.
Liberibacter africanus (Clafr) en África y
Ca. Liberibacter americanus (Clame) en
Sudamérica, son las especies que afectan
a los cítricos (C. sinensis, C. reticulata, C.
limon, C. maxima y C. paradisi), Ca.
Liberibacter solanacearun (Clsol) en
Europa, norte de África, Oceanía (Nueva
Zelanda) y centro y norte América, causa
enfermedad en solanáceas (S. tuberosum,
S. lycopersicum, S. betaceum, C. annum y
P. peruviana), por último Ca. Liberibacter
europaeus (Cleur) en Europa y Liberibacter
crescens (Libcre) en el caribe, causan daño
a plantas leñosas (Pyrus communis, M.
domestica, P. spinosa y C. monogyna)
(Haapalainen, 2014). En la planta, se
hallan concentradas principalmente en el
pedúnculo, también en la corteza, nervio
central de las hojas, raíces, ápices
radiculares, pétalos, pistilos, estambres,
cubierta seminal, fruto joven, sin embargo
no se encuentran en el endospermo
(Tatineni et al., 2008).
Las especies de Candidatus
Liberibacter evolucionaron a su forma
actual hace más de 300 millones de años
(Ma) en el periodo carbónico de la era
paleozoica, cuando todos los continentes
estaban unidos en un súper continente
llamado Pangea, se presume que la
separación entre Clafr y Clasi ocurrió hace
147 Ma en el periodo Jurásico, tras la
separación del continente Godwana,
formando África e India y la separación de
Clame del antecesor común de ambos
hace 309 Ma (Nelson, Munyaneza, McCue,
& Bové, 2013) . Conforme las diferencias
existentes entre los genomas de los
organismos se puede reconstruir su
filogenia (Omland, Cook, & Crisp, 2008),
para lo cual en la actualidad es común el
uso de herramientas computacionales
(Higgs & Attwood, 2005), lo que permite
obtener un panorama general sobre la
conexión de los organismos en el tiempo.
Teniendo un mejor entendimiento del
comportamiento biológico de las especies
se pueden potenciar sus puntos favorables
o disminuir las afecciones, de los mismos
para hombre, en cualquier aspecto de su
vida.
Objetivos
General
- Reconstruir la filogenia de dos especies
de la familia Rhizobiaceae de interés
agrícola.
Específicos
- Obtener los el conjunto de genes
ortólogos entre todas las especies
estudiadas.
- Reconstruir los arboles evolutivos para
cada gen, el consenso de los mismos y
el árbol de los ortólogos concatenados.
- Identificar arboles discordantes del
conjunto de ortólogos e inferir razones
de su discordancia.
- Generar hipótesis de eventos evolutivos
para trabajos posteriores.
Materiales y Métodos
- Obtención de genomas
Se realizó una búsqueda en la base
de datos taxonómica del Centro Nacional
de Información Biotecnología de los
E.E.U.U. (NCBI por sus siglas en inglés)
(Federhen, 2003) y se incluyeron las
especies de Candidatus Liberibacter (CaL)
y Rhizobium (Rhz) cuyo genoma se
encontraron totalmente secuenciados,
además se designó a Bartonella bovis,
también una alfa proteobacteria, como
grupo externo para enraizar el árbol.
Luego se descargaron el conjunto
completo de proteínas de las especies en
el formato FASTA.
- Identificación de ortólogos
La identificación de los ortólogos se
realizó mediante la herramienta básica de
búsqueda de alineamiento local de
proteínas (BLASTp) del NCBI (Altschul,
Gish, Miller, Myers, & Lipman, 1990) ,
utilizando el algoritmo para identificar los
mejores hits recíprocos (RBH) (Moreno-
Hagelsieb & Latimer, 2008) con el
parámetro de corte, valor esperado igual a
1e-24.
Fueron separados en archivos tipo
FASTA, donde cada archivo contenía la
versión del gen ortólogo de todos los
organismos.
- Alineamientos de secuencias
múltiples
Se construyeron los alineamientos de
secuencias múltiples de cada gen
mediante el programa MAFFT con sus
configuraciones por defecto (Katoh &
Standley, 2013) y luego se realizaron
cortes de las partes muy variables de los
alineamientos, en la que la señal evolutiva
se ve saturada por la magnitud de los
cambios, esto se realizó con el programa
trimAl, de esta manera nos aseguramos de
mantener únicamente aquellas regiones
del alineamiento en donde la hipótesis de
homología es más fuerte (Capella-
Gutiérrez, Silla-Martínez, & Gabaldón,
2009).
Con las secuencias alineadas y
depuradas se construyó un “genoma
artificial”, que consistía en la concatenación
de la secuencia de cada organismo,
respetando el alineamiento.
- Construcción de árboles
evolutivos
Para todas operaciones de
manipulación de datos se utilizó el software
R (R Core Development Team, 2015). El
análisis de las secuencias se realizó con el
paquete “seqinr” (Charif & Lobry, 2007). La
identificación de los modelos de tasas de
sustitución de aminoácidos que mejor
predirían la evolución de los organismos
mediante ModelTest del paquete
“phangorn” (Schliep, 2011).
Se construyeron los árboles de los
ortólogos, en base al mejor modelo de
evolución predicho. Para lo cual, primero
se analizaron las distancias entre pares de
aminoácidos (aa) y luego se realizó un
algoritmo de agrupamiento (clustering)
para formar estimaciones de árboles con el
método unión de vecinos (Neighbor-
Joining) (Saitou & Nei, 1987) y utilizarlo
como árbol guía. El ModelTest evaluó 17
modelos de sustitución de aa y se
seleccionó el modelo en base al criterio de
información de Akaike (AIC), a fin de tener
en cuenta las distintas tasas de evolución
entre sitios que se pueden tener a lo largo
del alineamiento, también se incluyó la
evaluación de un parámetro de distribución
gamma (+G) y/o la proporción de sitios
invariantes (+I) para cada modelo, si fuere
necesario conforme a cada gen. Se
construyeron los árboles, utilizando la
función pml del paquete “phangorn”, en
base al modelo seleccionado en el paso
anterior. Luego se optimizaron la topología
y el largo de ramas. Para escapar de los
óptimos locales se utilizó el algoritmo
heurístico de intercambio del vecino más
cercano (Nearest Neighbor Interchange -
NNI). Por último se observaron las
distancias topológicas entre los árboles
construidos con cada gen y se construyó
un árbol consenso a partir de los mismos
(Paradis, Claude, & Strimmer, 2004) . Para
la construcción del árbol con el “genoma
artificial” se realizó el mismo
procedimiento.
- Análisis de los árboles
Se realizó una transformación de los
nodos multicotómicos en dicotómicos a
mediante la función multi2di del paquete
“ape” (Paradis et al., 2004) , de manera a
poder proceder con los análisis siguientes.
A modo de determinar el acuerdo
entre el árbol consenso y el del “genoma
artificial” se calculó la distancia topológicas
entre ambos árboles y se representó con
un tanglegrama (Paradis et al., 2004) .
Posteriormente se identificaron los
árboles discordantes, mediante las
distancias topológicas y geodésicas dentro
del conjunto de ortólogos, mediante el
método descripto en el paquete KDETree
que estima las distribuciones de los árboles
y sus diferencias dentro del conjunto
(Weyenberg, Huggins, Schardl, Howe, &
Yoshida, 2014). Para las diferencias
topológicas se utilizaron los parámetros de
densidad del Kernel k=0,97 y para las
diferencias geodésicas k =1,30, estos
parámetros se definieron mediante un corte
representativo en el gráfico del clasificación
(score) de las densidades no normalizadas.
Por último se analizaron de forma
individual los árboles discordantes para
poder identificar los falsos positivos y
excluirlos, observando los largos de rama y
la topología, verificando los alineamientos
y su similitud con otros organismos
utilizando el BLASTp contra la base de
datos de secuencias de proteínas no
redundantes del NCBI. Con el propósito de
fortalecer o rechazar hipótesis establecidas
en trabajos anteriores.
Resultados y discusión
- Obtención de secuencias
Se obtuvieron los genomas
totalmente secuenciados de seis especies
de Candidatus Liberibacter y Rhizobium
(Tabla 1); Ca. Liberibacter asiaticus (Clasi),
Ca. Liberibacter africanus (Clafr), Ca.
Liberibacter americanus (Clame), Ca.
Liberibacter solanacearun (Clsol),
Liberibacter crescens (Libcre), Rhizobium
leguminosarum (Rlegu), Rhizobium etli
(Retli), Rhizobium gallicum (Rgall),
Rhizobium mesoamericanum (Rmeso),
Rhizobium phaseoli (Rphas), Rhizobium
anhuiense (Ranhu), Rhizobium leucaenae
(Rleuc), Rhizobium sullae (Rsull),
Rhizobium tropici (Rtrop), Rhizobium
rhizosphaerae (Rrhiz), Rhizobium tibeticum
(Rtibe), Rhizobium oryzae (Roryz),
Rhizobium favelukesii (Rfave), Rhizobium
bangadeshense (Rbang), Rhizobium
acidisoli (Racid), Rhizobium alamii
(Ralam), Rhizobium pusense (Rpuse) y se
designó como grupo externo a la Bartonella
bovis (Barto).
Tabla 1. Identificación de los organismos para el análisis filogenético.
Nro Nombre ID Size (Mb) GC% Proteinas
1 Candidatus Liberibacter asiaticus 1.750 1,27 36,6 1.082
2 Candidatus Liberibacter americanus 16.492 1,20 31,1 953
3 Candidatus Liberibacter africanus 38.432 1,19 34,5 991
4 Liberibacter crescens 15.865 1,50 35,4 1.245
5 Candidatus Liberibacter solanacearum 2.244 1,26 35,2 1.048
6 Rhizobium leguminosarum 744 7,55 60,7 7.029
7 Rhizobium etli 827 6,53 61,1 6.148
8 Rhizobium gallicum 14.339 7,31 59,6 6.759
9 Rhizobium mesoamericanum 12.540 6,69 58,9 6.113
10 Rhizobium phaseoli 12.244 6,73 61,3 6.224
11 Rhizobium anhuiense 55.528 7,22 61,1 6.716
12 Rhizobium leucaenae 17.319 6,76 59,3 6.191
13 Rhizobium sullae 14.213 7,53 59,9 6.968
14 Rhizobium tropici 11.072 7,26 60,0 6.675
15 Rhizobium rhizosphaerae 52.931 5,35 64,6 4.547
16 Rhizobium tibeticum 50.473 6,98 59,7 6.240
17 Rhizobium oryzae 49.832 5,39 62,8 4.653
18 Rhizobium favelukesii 45.735 7,20 59,6 7.021
19 Rhizobium bangadeshense 45.174 6,61 60,9 6.082
20 Rhizobium acidisoli 40.956 7,36 61,1 6.686
21 Rhizobium alamii 33.170 7,35 60,1 6.909
22 Rhizobium pusense 21.527 5,98 59,1 5.383
23 Bartonella bovis 91-4 155.194 1,62 37,4 1.330
En la búsqueda de genes ortólogos
mediante el BLASTp identificaron 468
genes entre los organismos, los cuales
fueron separados en 468 archivos tipo
FASTA, donde cada archivo contenía la
versión del ortóloga del gen en todos los
organismos.
- Mejores modelos de sustitución
de aa
El 64,32% de los genes evaluados
(Figura 1) prefirió el modelo de sustitución
de aa LG (Le & Gascuel, 2008) , por la
fuerte influencia del Rhizobium dentro del
conjunto. En trabajos anteriores (Salinas &
Cantero, 2017), se determinó que mejor
modelo para Candidatus Liberibacter fue el
cpREV de evolución de plastidios y
organismos fotositetizadores (Adachi,
Waddell, Martin, & Hasegawa, 2000) . Lo
cual induce a pensar que CaL co-
evoluciona con su hospedero por ser
dependiente del mismo (Haapalainen,
2014), a diferencia del Rhz simbionte
facultativo (Burdass, 2002).
Figura 1. Modelos de sustitución de aminoácidos estimados para el conjunto de genes
ortólogos.
El árbol filogenético reconstruido a
partir del “genoma artificial” mediante el
método de Máxima Verosimilitud,
utilizando el modelo LG+G+I (logLike = -
2366687) se muestra en la Figura 2.
Los arboles de ambas especies
están claramente separados, a una
distancia de 0,387 de largo de rama y estos
a su vez a 0,629 de Barto, con lo que se
demuestra la diferencia evolutiva entre
ambas especies. Se observa que Libcre es
el miembro más lejano de los CaL, por lo
que es el más emparentado con Rhz, lo
cual puede ser una explicación del porque
los genes discordantes de Libcre
encontrados en trabajos anteriores se
muestran muy emparentados con especies
de Rhz. Se puede inferir que fue la última
especie de los CaL que sufrió un evento de
especiación. El sub árbol de CaL
concuerda con trabajos anteriores (Salinas
& Cantero, 2017) y a su vez con otros
estudios que reportan la filogenia (Bové,
2006; Fagen et al., 2014; Nelson et al.,
2013; Raddadi et al., 2011; Vegetale, 2011)
de la sub unidad ribosomal 16S
.
Figura 2. Árbol filogenético de las especies de Ca. Liberibacter y Rhizobium construidas a
partir del “genoma artificial” mediante el método de Máxima Verosimilitud utilizando el modelo
LG+G+I (logLike = -2366687).
-Comparación de arboles
En la Figura 3 se muestra un
tanglegrama donde se observa que árbol
consenso de los ortólogos y el reconstruido
con el “genoma artificial” son
topológicamente idénticos, lo que da más
solidez a la reconstrucción filogenética.
Figura 3. Tanglegrama del árbol consenso y el árbol del “genoma artificial” mediante el
programa Dendroscope3 muestran una historia evolutiva coherente (Huson & Scornavacca,
2012).
Del conjunto de árboles
reconstruidos con los genes ortólogos se
identificaron 16 y 17 árboles discordantes,
teniendo en cuenta diferencias geodésicas
y topológicas respectivamente Figura 4, los
cuales fueron observados de forma
individual para discriminar a los falsos
positivos.
En un trabajo anterior se habían
identificado 9 genes discordantes de
Libcre, estrechamente relacionados con
Rhz, 1 gen de Clame relacionado con
Arsenophonus, según BLASTp y 1 gen de
Clafr del cual se presumía una aceleración
evolutiva (Salinas & Cantero, 2017
Figura 4. Árboles discordantes del conjunto (puntos azules), discriminados por diferencias
geodésicas (izquierda) y topológicas (derecha).
Se trató de identificar a los genes de
Libcre relacionados con Rhz dentro del
conjunto de genes discordantes
identificados en este trabajo, sin embargo
no se encontraron a todos y se identificaron
3 genes nuevos con las mismas
características, totalizando 12 genes hasta
el momento, los cuales además de estar
emparentados con Rhz Agrobacterium del
mismo grupo y Ensifer de la misma familia,
al igual que CaL. Por lo cual se presume
que la razón de la semejanza entre las
especies se debe a que Libcre fue el último
especiarse dentro de los CaL (Handwerk,
2006).
El gen de la fosfopantotenoilcisteina
descarboxilasa perteneciente a Clame
volvió a mostrar un largo de rama mayor a
las otras especies (Figura 5), lo cual da
más consistencia a la hipótesis de un
evento de transferencia horizontal (Koonin,
Makarova, & Aravind, 2001) desde
Arsenophonus, mientras compartían
hábitat en algún momento de su historia
evolutiva (Jousselin, Cœur D’Acier,
Vanlerberghe-Masutti, & Duron, 2013
).
Figura 5. Árbol filogenético de la proteína fosfopantotenoilcisteina descarboxilasa donde se
aprecia el largo de rama de Clame en comparación a las otras especies (logLike = -7115.08).
El gen de la chaperona dependiente
de ATP de Clafr volvió a presentar un largo
de rama considerable, sin embargo se
identificó que el gen entro duplicado en el
BLAST, junto con su ortólogo en Rfave, lo
cual deja una brecha a ser aclarada en
trabajos posteriores
.
Figura 6. Árbol filogenético de la proteína Chaperona dependiente de ATP ClpB (logLike = -
6036.84).
Conclusión
El análisis evolutivo de las especies
de Candidatus Liberibacter mediante la
reconstrucción de árboles filogenéticos de
genes ortólogos, en conjunto con especies
de Rhizobium, fueron coherentes entre sí,
con el de trabajos anteriores y a los
reportados sobre el estándar, la sub-
unidad ribosomal 16S. Lo que da mayor
evidencia a la filogenia inferida para la
especie.
Las marcadas semejanzas entre
Liberibacter crescens y las especies de
Rhizobium, al mantener siempre la
topología del árbol, pueden indicar que la
especie fue la última en especiarse del
clado de los Liberibacters, no obstante la
brecha sigue abierta para lo cual es
necesario realizar análisis más profundos
para aumentar la precisión de la inferencia.
Se observa un marcado largo de
rama en árbol de la fosfopantotenoilcisteina
descarboxilasa de la especie Clame, al
igual que en trabajos anteriores, pudiendo
se tratar de un evento de transferencia
horizontal en algún momento de su historia
evolutiva donde compartieron hábitats.
Los organismos causantes del HLB
son causantes de pérdidas económicas
alrededor de todo el mundo, así también en
varias zonas del Paraguay. La constante
lucha contra este patógeno sigue vigente,
aunque se están realizando trabajos sobre
inducción a resistencia por parte de los
cítricos (Jia et al., 2017) , el mecanismo de
acción aún queda sin resolver, he ahí la
importancia del uso de herramientas
computacionales para tener un mejor
panorama del mecanismo biológico de
afección por parte del patógeno. Quizás
mirando atrás en el tiempo se pueda
encontrar soluciones para el futuro.
Literatura citada
Adachi, J., Waddell, P. J., Martin, W., &
Hasegawa, M. (2000). Plastid
Genome Phylogeny and a Model of
Amino Acid Substitution for Proteins
Encoded by Chloroplast DNA.
Journal of Molecular Evolution, 50(4),
348–358.
https://doi.org/10.1007/s0023999100
38
Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers,
E. W., & Lipman, D. J. (1990). Basic
local alignment search tool. Journal
of Molecular Biology, 215(3), 403–
410. https://doi.org/10.1016/S0022-
2836(05)80360-2
Ant, J., & Souza, M. De. (2015). The Family
Rhizobiaceae. International Review
of Cytology, (December 2014).
Bové, J. M. (2006). Huanglongbing: A
destructive, newly-emerging,
century-old disease of citrus. Journal
of Plant Pathology, 85(4), 265–270.
Burdass, D. (2002). Rhizobium , Root
Nodules & Nitrogen Fixation. Society
for General Microbiology, 16, 1–4.
Capella-Gutiérrez, S., Silla-Martínez, J. M.,
& Gabaldón, T. (2009). trimAl: A tool
for automated alignment trimming in
large-scale phylogenetic analyses.
Bioinformatics, 25(15), 1972–1973.
https://doi.org/10.1093/bioinformatics
/btp348
Charif, D., & Lobry, J. R. (2007). SeqinR
1.0-2: A Contributed Package to the
R Project for Statistical Computing
Devoted to Biological Sequences
Retrieval and Analysis. In U. Bastolla,
M. Porto, H. E. Roman, & M.
Vendruscolo (Eds.), Structural
Approaches to Sequence Evolution:
Molecules, Networks, Populations
(pp. 207–232). Berlin, Heidelberg:
Springer Berlin Heidelberg.
https://doi.org/10.1007/978-3-540-
35306-5_10
Fagen, J. R., Leonard, M. T., Coyle, J. F.,
McCullough, C. M., Davis-
Richardson, A. G., Davis, M. J., &
Triplett, E. W. (2014). Liberibacter
crescens gen. nov., sp. nov., the first
cultured member of the genus
Liberibacter. International Journal of
Systematic and Evolutionary
Microbiology, 64(PART 7), 2461–
2466.
https://doi.org/10.1099/ijs.0.063255-
0
Federhen, S. (2003). 4. The Taxonomy
Project. In M. J & Ostell J (Eds.), The
NCBI Handbook [Internet] (pp. 1–34).
Bethseda (MD): National Center for
Biotechnology Information (US).
Retrieved from
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxono
my
Haapalainen, M. (2014). Biology and
epidemics of Candidatus Liberibacter
species, psyllid-transmitted plant-
pathogenic bacteria. Annals of
Applied Biology, 165(2), 172–198.
https://doi.org/10.1111/aab.12149
Handwerk, B. (2006). Evolution Comes in
Bursts, Gene Study Finds.
Higgs, P. G., & Attwood, T. K. (2005).
Phylogenetic methods. In
Bioinformatics and Molecular
Evolution (pp. 158–195).
Huson, D. H., & Scornavacca, C. (2012).
Dendroscope 3: An interactive tool for
rooted phylogenetic trees and
networks. Systematic Biology, 61(6),
1061–1067.
https://doi.org/10.1093/sysbio/sys06
2
Jia, H., Zhang, Y., Orbović, V., Xu, J.,
White, F. F., Jones, J. B., & Wang, N.
(2017). Genome editing of the
disease susceptibility gene CsLOB1
in citrus confers resistance to citrus
canker. Plant Biotechnology Journal,
15(7), 817–823.
https://doi.org/10.1111/pbi.12677
Jousselin, E., Cœur D’Acier, A.,
Vanlerberghe-Masutti, F., & Duron,
O. (2013). Evolution and diversity of
Arsenophonus endosymbionts in
aphids. Molecular Ecology, 22(1),
260–270.
https://doi.org/10.1111/mec.12092
Katoh, K., & Standley, D. M. (2013).
MAFFT multiple sequence alignment
software version 7: Improvements in
performance and usability. Molecular
Biology and Evolution, 30(4), 772–
780.
https://doi.org/10.1093/molbev/mst0
10
Koonin, E. V., Makarova, K. S., & Aravind,
L. (2001). Horizontal Gene Transfer
in Prokaryotes: Quantification and
Classification. Annual Review of
Microbiology, 55(1), 709–742.
https://doi.org/10.1146/annurev.micr
o.55.1.709
Le, S. Q., & Gascuel, O. (2008). An
improved general amino acid
replacement matrix. Molecular
Biology and Evolution, 25(7), 1307–
1320.
https://doi.org/10.1093/molbev/msn0
67
Monzó, C., Urbaneja, A., & Tena, A. (2015).
Los psílidos Diaphorina citri y Trioza
erytreae como vectores de la
enfermedad de cítricos
Huanglongbing ( HLB ): reciente
detección de T . erytreae en la
Península Ibérica. Boletín SEEA,
2011, 29–37.
Moreno-Hagelsieb, G., & Latimer, K.
(2008). Choosing BLAST options for
better detection of orthologs as
reciprocal best hits. Bioinformatics,
24(3), 319–324.
https://doi.org/10.1093/bioinformatics
/btm585
Nelson, W. R., Munyaneza, J. E., McCue,
K. F., & Bové, J. M. (2013). The
Pangaean origin of “Candidatus
Liberibacter” species. Journal of
Plant Pathology, 95(3), 455–461.
https://doi.org/10.4454/JPP.V95I3.00
1
Omland, K. E., Cook, L. G., & Crisp, M. D.
(2008). Tree thinking for all biology:
the problem with reading phylogenies
as ladders of progress. BioEssays,
854–867.
https://doi.org/10.1002/bies.20794
Paradis, E., Claude, J., & Strimmer, K.
(2004). APE: Analyses of
phylogenetics and evolution in R
language. Bioinformatics, 20(2), 289–
290.
https://doi.org/10.1093/bioinformatics
/btg412
R Core Development Team. (2015). R: a
language and environment for
statistical computing, 3.2.1.
Document freely available on the
internet at: http://www. r-project. org
(Vol. 2).
https://doi.org/10.1017/CBO9781107
415324.004
Raddadi, N., Gonella, E., Camerota, C.,
Pizzinat, A., Tedeschi, R., Crotti, E.,
Alma, A. (2011). “Candidatus
Liberibacter europaeus” sp. nov. that
is associated with and transmitted by
the psyllid Cacopsylla pyri apparently
behaves as an endophyte rather than
a pathogen. Environmental
Microbiology, 13(2), 414–426.
https://doi.org/10.1111/j.1462-
2920.2010.02347.x
Saitou, N., & Nei, M. (1987). The
neighbour-joining method: a new
method for reconstructing
phylogenetic trees. Molecular Biology
and Evolution, 4(4), 406–425.
https://doi.org/citeulike-article-
id:93683
Salinas, A., & Cantero, J. (2017). Análisis
Filogenético de bacterias del genero
Candidatus Liberibacter causantes
del HLB en Cítricos y otras
enfermedades en plantas vasculares.
In Anais: I Seminário Internacional de
Pós-Graduação em
Desenvolvimento Rural Sustentável
e IV Jornada Questão Agrária e
Desenvolvimento (20th ed., Vol. 94).
Marechal Candido Rondon:
UNIOESTE-PPGDRS. Retrieved
from
https://midas.unioeste.br/sgev/event
os/SIPGDRS/anais
Schliep, K. P. (2011). phangorn:
Phylogenetic analysis in R.
Bioinformatics, 27(4), 592–593.
https://doi.org/10.1093/bioinformatics
/btq706
SENAVE. (2013). Manual técnico de
identificación a campo del
huanglongbing (HLB) de los citrics y
el insecto vector. Diaphorina citri.
Direccion de Proteccion Vegetal,
Departamento de Vigilancia
Fitosanitaria.
SENAVE. (2014). Campaña de
emergencia fitosanitaria para el
Huanglongbing de los citricos (HLB)
en el Paraguay. Direccion de
Proteccion Vegetal, Departamento
de Vigilancia Fitosanitaria, 9.
Tatineni, S., Sagaram, U. S., Gowda, S.,
Robertson, C. J., Dawson, W. O.,
Iwanami, T., & Wang, N. (2008). In
Planta Distribution of ‘Candidatus
Liberibacter asiaticus’ as Revealed
by Polymerase Chain Reaction
(PCR) and Real-Time PCR.
Bacteriology, 98, 592–599.
Vegetale, P. (2011). MOLECULAR
CHARACTERIZATION AND
PHYLOGENETIC ANALYSIS OF
16S rRNA FROM A NEW
“CANDIDATUS LIBERIBACTER”
STRAIN ASSOCIATED WITH
ZEBRA CHIP DISEASE OF POTATO
(SOLANUM TUBEROSUM L.) AND
THE POTATO PSYLLID
(BACTERICERA COCKERELLI
SULC). Journal of Plant Pathology,
16–17.
Wang, N., & Trivedi, P. (2013). Citrus
Huanglongbing: A Newly Relevant
Disease Presents Unprecedented
Challenges. Phytopathology, 103(7),
652–665.
https://doi.org/10.1094/PHYTO-12-
12-0331-RVW
Weyenberg, G., Huggins, P. M., Schardl, C.
L., Howe, D. K., & Yoshida, R. (2014).
KDETREES: Non-parametric
estimation of phylogenetic tree
distributions. Bioinformatics, 30(16),
2280–2287.
https://doi.org/10.1093/bioinformatics
/btu258