Aspectos de la interacción virus-hospedador a tener en

cuenta en el diagnóstico y control de la Laringotraqueítis

Infecciosa

Ariel VagnozziInstituto de Virología

INTA Castelar.

Bogotá, 17 de abril de 2012

Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria.Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias

AMEVEA

Reseña

• 1925_ Primer reporte de la enfermedad (May & Tittsler. Tracheolaryngitis in

Poultry. J. Am. Vet. Assoc. 67: 229-231).• 1931

_ El comité de enfermedades de las aves de la AVMA adoptó la denominación de Laringotraqueítis Infecciosa (Infectious Laryngotracheitis)

• 1934 _ Primera inmunización contra LT(Brandly & Bushnell (A report of some

investigations of Infectious Laryngotracheitis. Poult. Sci. 13: 212-217).• 1937

_ El agente etiológico de LT fue reconocido como un agente filtrable (virus) (Beudette. Infectious Laryngotracheitis. Poult. Sci. 16: 103-105).

Infectious Laryngotracheitis Virus (ILTV).También Gallid Herpesvirus 1 (GaHV-1).

• α-Herpesvirus

• Rango de hospedador

– Pollos (Gallus gallus domesticus) y faisanes (Phasianidae) son los

únicos hospedadores naturales reconocidos.

• ILTV replica en la parte alta del tracto respiratorio.

• Inmunología

– El título de anticuerpos neutralizantes no correlaciona bien con

protección (Fahey et al, 1983)

– Respuesta mediada por células parece jugar el rol principal en la

inmunidad (Fahey et al, 1984)

Gransow et al, 2001

Laringotraqueítis

• Período de incubación

– Infección experimental (intratraqueal): 2 a 4 días

• Signos Clínicos

– Tos, estornudos, expectoración de mucus fibrina y sangre, y marcada disnea.

– Conjuntivitis.

• Lesiones

– Conjuntiva, laringe, y tráquea (ocasionalmente pulmones).

Entre Ríos, 2010

Lesiones: Diversos grados de conjuntivitis

Lesiones: Diversos grados de traqueítis

Imágenes provistas por Dr. G. Zavala

Epidemiología

• ILTV tiene distribución mundial.

• Mortalidad entre 0 y 70% (dependiendo de la virulencia de la cepa).

• Latencia Luego de la fase aguda

Reactivación generalmente inaparente

• Aves muy jóvenes presentan menor susceptibilidad

Menores de 30 días Entre 30- 40 días Mayores a 40 días0%

25%

50%

75%

100%

5%13%

68%

Casos (porcentaje) de ILTV según edad de las aves (broilers) afectadas (mayo 2006 - octubre 2011)

LatenciaGanglio del trigémino

Replicación viralTráquea

Luego de la fase aguda de la

infecciónStress

Reactivación desde latencia es generalmente

inaparenteDiseminación viral

Latencia

Virus de campo y vacunas vivas atenuadas

Diagnóstico de ILTV

• Signos clínicos y lesiones– Pueden ser muy característicos

• Aislamiento viral– Aves (mayores de 14 días)– Embrión de pollo– Cultivo primario de células

• Histopatología• Inmunofluorescencia • Inmunohistoquímica• PCR• PCR en tiempo real

• Detección de anticuerpos– Virus neutralización

• EP• CEK

– AGID– ELISA

Muestras para el diagnóstico etiológico

Ave con signos incipientes

– Mucosa de la conjuntiva.

• Hisopado

• Parpado incluyendo conjuntiva

– Tracto respiratorio alto.

• Tráquea

• Raspado de tráquea (con bisturí)

• Hisopado de tráquea

Hisopado de tráquea

Control de ILTV: Evitar que el virus contacte al hospedador susceptible

Fuente de

infección

Transmisión Hospedador susceptible

Bioseguridad Bioseguridad Vacunación

Vacunación

Vacunas

– Vacunas vivas atenuadas:

• CEO: Embrión de pollo (Chicken Embryo Origin).

• TCO: Cultivo celular (Tissue Culture Origin).

– Vacunas vectorizadas en virus (recombinantes):

• FPV-LT: Expresa gB (UL-27) y MAP (UL-34) de ILTV.

• HVT-LT: Expresa gI (US-7) y gD (US-6) de ILTV.

Evaluación de la protección inducida (bajo

condiciones experimentales) por vacunas

recombinantes y atenuadas.

Diseño general del estudio

TratamientosVacunación

Desafío (cepa 63140)

vía edad 35 DO

1 NVx-NCh - - -2 CEO Gota en ojo 14 DO +3 TCO Gota en ojo 14 DO +4 HVT-LTio in ovo 18 ED +5 HVT-LTsc subcutánea 1 DO +6 FPV-LTio in ovo 18 ED +7 FPV-LTsc subcutánea 1 DO +8 NVx-Ch - - +

Se evaluó:

• Signos clínicos

• Carga viral en tráquea

Materiales and métodos

Materiales and métodos

Desafío a los 35 días de edad

Resultados

NVx-NCh CEO TCO HVT-LT io

HVT-LT sc

FPV-LT io FPV-LT sc NVx-Ch0

2.5

5

7.5

a a aa

a

bb

b

Signos clínicos (promedio) 5DPCh

Cli

nica

l sco

re (

aver

age)

NVx-NCh CEO TCO HVT-LT io HVT-LT sc FPV-LT io FPV-LT sc NVx-Ch0

2.5

5

7.5

a

a

bc

c

d

c; dc; d

Carga viral 3 DPCh

Ave

rage

log1

0 2-

ΔΔ

Ct

Resultados

Desafío a los 35 días de edad

Para el desafío a 35 días de edad Signos clínicos:

Carga viral:

NVx-NCh CEO TCO HVT-LT io HVT-LT sc

< FPV-LT io FPV-LT sc NVh-Ch

(P < 0.05)

NVx-NCh CEO < TCO

HVT-LT io HVT-LT sc

FPV-LT sc FPV-LT io NVx-Ch< <

Conclusiones del experimento

Vacunas atenuadas mayor protección ante el desafío

Basado en los signos clínicos, la protección inducida por:

HVT-LT fue similar a la conferida por las vacunas atenuadas.

FPV-LT resultó menor que la conferida por las vacunas atenuadas. .

La dificultad de las vacunas vectorizadas para generar el clearence de

virus en la tráquea sugiere que cierta diseminación viral podría estar

ocurriendo en los planteles vacunados con este tipo de vacuna.

Estudio preliminar de los mecanismos de la vacuna CEO

Pollos SPF vacunados (Vx) Pollos SPF Naïve (NVx)

Vx-Ch Vx-NCh NVx-Ch NVx-NCh

Muestras fueron tomadas a las 6 y 12 horas post-desafío (hpch)

6 HPCh 12 HPCh 6 HPCh 12 HPCh 6 HPCh 12 HPChNVx-NCh Vx-Ch NVx-Ch

0

200

400

600

2-Δ

ΔC

t (av

erag

e)

Carga viral en tráquea a las 6 y 12 Hs. post desafío con una cepa virulenta de ILTV de aves vacunadas (CEO) y no vacunadas.

¿Por qué no es conveniente utilizar CEO?

• Virulencia residual

• Latencia

Aves vacunadas pueden convertirse en fuente de virus para aves susceptibles

Posibilidad de reversión

• Caracterización de muestras de campo (Oldomi et al, 2007; 2008).

Mayoría (cerca del 70 %) de las muestras de campo presentaron patrón de RFLP

idénticas o muy cercano a CEO.

Vacunas atenuadas

VacunaWild-type

VirulenciaVirulencia

AtenuaciónAtenuación

Pasajes en serie

Cultivo celular / embrión

Atenuación

VacunaWild-typeVirulenciaVirulencia

AtenuaciónAtenuación

Pasajes en serie

Hospedador

Cultivo celular / embrión

Atenuación

Reversión

Título

(TCID50/ave)

Número de aves

(broilers)

NCh 12

2 x 101 12

2 x 102 12

2 x 103 12

2 x 104 12

Diseño del ensayo

Importancia de la dosis inicial en la infección con ILTV

3 DPCh 5 DPCh 7DPCh 9DPCh-1

0

1

2

3

4

5

6

7

863140 ILTV load at day 3, 5, 7 and 9 DPCh

1.00E+04 1.00E+03 1.00E+02 1.00E+01 Negative Control

Days post-challenge (DPCh)

Vir

al lo

ad (

Log

10 2

-ΔΔ

Ct)

Carga viral de las aves infectadas con baja dosis (10 TCID50/ave)

3 DPCh 5 DPCh 7 DPCh 9 DPCh-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8913

914

915

916

917

918

919

920

921

922

923

924

Dias post-desafio

Car

ga v

iral

(lo

g10

2-∆

∆C

t)

Caracterización de aislamientos de ILTV de Argentina (2006-2012).

Genotipo 1 Genotipo 2\4 Genotipo 3 Genotipo 50

10

20

30

40

50

5.36 %

41.07 %

35.71 %

17.86 %

Genotipificacion de aislamientos argentinos

Por

cent

aje

Caracterización genotípica de aislamientos Argentinos de ILTV (2006-2012)

2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

-5

0

5

10

15

20

25

Distribucion de los genotipos en el tiempo

Genotipo 1Genotipo 2\4Genotipo 3Genotipo 5

Por

cen

taje

Datos de muestras procesadas en el laboratorio de Sanidad Aviar de INTA EEA Concepción del Uruguay (Entre Ríos)

2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

6 421

85

23

92

Número de brotes por año

Se resolvió prohibir el uso de vacuna CEO en

Argentina

Cierta replicación viral (en ausencia de manifestaciones clínicas severas), podría estar ocurriendo en el campo en aves vacunadas (TCO o vectorizadas).

No se observan signos de enfermedad

¿Es posible que luego de sucesivos ciclos productivos con animales inmunizados con HVT-LT o con TCO, la carga viral ambiental se reduzca hasta desaparecer?

¿Cuántos ciclos productivos son necesarios para tomar la decisión de suspender la vacunación con cierto grado de seguridad?

¿Qué variables deberían evaluarse antes de decidir la suspensión de la vacunación?

¿Evaluación de anticuerpos séricos por ELISA?

¿Qué tan factible sería dejar de vacunar planteles alojados en zonas donde hubo brotes de ILTV?

Una compañía dejó una granja sin vacunar

ILTV! ¿Uso de aves centinela?

Estos interrogantes abrirán nuevas líneas de investigación

Agradecimientos

University of Georgia (PDRC)

• Dra. Maricarmen García

• Dr. Guillermo Zavala

• Dr.Andrés Rodríguez Ávila

• Dr. Taylor Barbosa

• Ms. Sylva Riblet

• Dra. Alice Mundt

INTA Instituto de Virología

• Dr. Ariel Pereda

• Dra. María Isabel Craig

INTA EEA Concepción del

Uruguay

• Dr. Federico Vera

• Lic. Florencia Rojas

Muchas gracias!