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7/30/2019 ASPECTOS MECANSTICOS DE LA BIOSNTESIS DE NANOPARTCULAS DE PLATA POR VARIAS CEPAS DE FUSARIUM OX
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ASPECTOS MECANSTICOS DE LA BIOSNTESIS DE NANOPARTCULAS DE PLATA POR VARIAS
CEPAS DE FUSARIUM OXYSPORUM
Resumen
Produccin extracelular de las nanopartculas de metal por varias cepas del hongo Fusariumoxysporum se llev a cabo. Se encontr que los iones de plata acuosas cuando se exponen a
varias cepas de Fusarium oxysporum se reducen en la solucin, lo que conduce a la formacin
de hidrosol de plata. Las nanopartculas de plata se encontraban en el intervalo de 20-50 nm
de dimensiones. La reduccin de los iones de metal se produce por un nitrato reductasa
dependiente de quinona y un proceso de transporte extracelular. Las potencialidades de este
diseo nanotecnolgico basada en la biosntesis de fuga de nanopartculas para varias
aplicaciones tcnicas son importantes, incluido su potencial como material antibacterial.
Antecedentes
La desasimilatoria frrico reductasa, que se encuentra en las bacterias son una parte esencial
de los ciclos de hierro [1] y son esencialmente intracelular, pero una a una extracelular se aisl
a partir de Mycobacterium paratuberculosis [2]. Otro mecanismo posible podra ser activo en
este proceso, ya que se descubri que algunas bacterias reducen Fe3 + por xidos de producir
y secretar compuestos pequeos, difusibles redox que pueden servir como lanzadera de
electrones entre el microbio y el sustrato de hierro insoluble [3]. El papel de los compuestos
excretados en la transferencia de electrones extracelular fue revisado recientemente [4].
La presencia de hidrogenasa en hongos como Fusarium oxysporum se demostr con
suspensiones de clulas lavadas que haban sido cultivadas aerbicas y anaerbicas en un
medio con glucosa y sales modificado con nitrato de [5].
La nitrato reductasa fue aparentemente esencial para la reduccin de hierro frrico [6].
Muchos hongos que exhiben estas propiedades caractersticas, en general, son capaces de
reducir Au (III) o Ag (I) [7]. Adems de estas enzimas extracelulares, naftoquinonas varios [8-
10] y antraquinonas [11] con excelentes propiedades redox, se inform en F. oxysporum que
podra ser actuar como lanzadera de electrones en las reducciones de metal [3].
Aunque se sabe que los microorganismos tales como bacterias, levaduras y hongos juegan
actualmente un papel importante en la remediacin de metales txicos a travs de la
reduccin de los iones de metal, se consider que era interesante como nanofbricas muyrecientemente [12]. El uso de estas propiedades desasimilatoria de hongos, la biosntesis de
los nanomateriales inorgnicos utilizando organismos eucariotas como los hongos pueden ser
utilizadas para el cultivo de nanopartculas de oro [13] y la plata [14] intracelular en clulas de
hongos Verticillium [15]. Recientemente, se ha encontrado que los iones acuosos cloroaurato
puede reducirse extracelularmente usando el hongo F. oxysporum, para generar oro
extremadamente estable [16] o de nanopartculas de plata en agua [17]. Otro proceso, que se
describe en la literatura, se relacion para producir nanopartculas de plata a travs de catlisis
oligopptidos, precipitando las partculas con varias formas (hexagonal, triangular y esfrica)
[18]. Sin embargo, en la reduccin de hongos de iones Ag llev suspensin coloidal, de manera
diferente que en el caso de oligopptidos. A continuacin, los aspectos mecansticos siguen
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siendo una cuestin abierta, sin embargo, este proceso ocurre en el caso de hongos
probablemente, ya sea por accin reductasa o por quinonas lanzadera de electrones o ambos.
Nuestros objetivos en este estudio son comparar los diferentes cepas de F. oxysporum a fin de
comprender si la eficacia de la reduccin de iones de plata est relacionada con una accin
reductasa o quinona.
Figura 1
UV-Vis espectros registrados como una funcin del tiempo de reaccin de una solucin acuosa
de 10-3 M AgNO3 con la biomasa fngica (07SD). El recuadro muestra la absorcin UV-Vis en la
regin de longitud de onda baja.
Resultados y Discusin
Los matraces Erlenmeyer con la biomasa de F. oxysporum eran de un color amarillo plido
antes de la adicin de los iones Ag + y esto cambi a un color pardusco en la terminacin de la
reaccin con los iones Ag + de 28 h. La aparicin de un color amarillo es el color marrn en
solucin que contiene la biomasa sugiri la formacin de nanopartculas de plata [21]. Los
espectros UV-Vis registrada de los vasos de reaccin 07SD F. oxysporum cepa (Mtodo A) a
diferentes tiempos de reaccin se presenta en la figura 1. La fuerte resonancia de plasmn
superficial centrado en aproximadamente. 415-420 nm aumenta claramente en intensidad con
el tiempo. La solucin fue extremadamente estable, sin evidencia de floculacin de las
partculas incluso varias semanas despus de la reaccin. La insercin de la figura 1 muestra
espectros UV-Vis en la regin de longitud de onda mnima registrada del medio de reaccin
mostr una banda de absorcin a aproximadamente. 265 nm y fue atribuido a los aminocidos
aromticos de las protenas. Es bien sabido que la banda de absorcin a ca. 265 nm surgedebido a excitaciones electrnicas en residuos de triptfano y tirosina en las protenas. Esta
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observacin indica la liberacin de protenas en solucin de F. oxysporum y sugiere un posible
mecanismo para la reduccin de los iones metlicos presentes en la solucin [17].
La Figura 2 muestra los espectros de emisin de fluorescencia de hongos filtrado de una de la
cepa (07SD). Una banda de emisin centrada a 340 nm se observ. La naturaleza de la banda
de emisin indica que las protenas unidas a la superficie de las nanopartculas y los presentesen la solucin de existir en la forma nativa [22]. Los resultados similares fueron observados
para todas las cepas estudiadas, como se muestra en la Tabla 1. En la Tabla 1, la cepa 07SD
apareca como el ms eficiente en la produccin de nanopartculas de plata. Aparentemente,
las diferentes eficiencias estn relacionados con la reductasa y / o para la generacin de
quinona y se discutir ms adelante. Una desestabilizacin de las nanopartculas es evidente
en el caso de F. oxysporum 534, 9114 y 91248 cepas en 28 horas, como se indica por una
disminucin en la absorcin de 420 nm.
Figura 2
Espectro de emisin de fluorescencia registrada de la mezcla de reaccin nanopartculas de
plata-hongo. La longitud de onda de excitacin fue 260 nm.
De manera similar, cuando la biomasa se sumergi en agua y slo el fngica filtrado (Mtodo
B) se aadi a una solucin de AgNO3 10-3 M, la solucin acuosa inicialmente incolora cambi
a un color marrn amarillento plido dentro de 28 h de reaccin (datos no mostrados ),
indicando claramente que la reduccin de los iones se produce extracelularmente a travs de
agentes reductores liberados en la solucin de F. oxysporum como lo muestra el espectro de
UV-Vis para la cepa 07SD (Fig. 3).
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Figura 3
UV-Vis espectros registrados como una funcin del tiempo de reaccin de una solucin acuosa
de 10-3 M AgNO3 con el fngica filtrado (07SD). El recuadro muestra la absorcin UV-Vis en la
regin de longitud de onda baja.
Las figuras 4 y 5 se muestra la micrografa SEM registrados a partir de la nanopartcula de plata
(Mtodo A). Esta imagen muestra los agregados de nanopartculas de plata. En esta
micrografa, nanopartculas esfricas en el intervalo de tamao de 20-50 nm se observaron.
Las nanopartculas no estaban en contacto directo, incluso dentro de los agregados, lo que
indica la estabilizacin de las nanopartculas por un agente de proteccin terminal. Esto
corrobora con la observacin anterior de Ahmad et al. [17] en su estudio sobre F. oxysporum.
La micrografa misma en el Mtodo B se observ (no mostrada). En el anlisis por
espectroscopia de dispersin de energa (EDS) de las nanopartculas de plata se confirm la
presencia de la seal de plata elemental (Figura 6).
La TLC (Cromatografa de Capa Fina) anlisis en gel de slice de 60 placas utilizando cloroformo-
metanol-cido actico (195:5:1) mostr una mancha con valor de Rf de 0,65, y utilizando
benceno-nitrometano-cido actico (75:25: 2) mostr una mancha con valor de Rf de 0,85, que
corresponde a 2-acetil-3, 8 - dihidroxi-6-metoxi antraquinona o sus ismeros en 2 - acetil-2,8-
dihidroxi-6-metoxi antraquinona (Esquema 1). Esto fue corroborado por el espectro de
fluorescencia del filtrado (Mtodo A), lo que indica un resto antraquinona fluorescencia [11].
Los espectros de excitacin en el mximo de emisin (550 nm) encajan muy bien con el
espectro de absorcin de la antraquinona en la Figura 7.
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Figura 4
Micrografa SEM de F. oxysporum cepa 07 en SD 11000 magnificacin.
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Figura 5
Micrografa SEM de F. oxysporum cepa 07 en SD 40000 magnificacin.
La Figura 8 muestra la nitrato reductasa a travs de la reaccin de nitrito con 2,3-
diaminophthalene. El espectro de emisin presenta dos picos principales de intensidad defluorescencia a 405 y 490 nm correspondiente a la emisin mxima de la
diaminonapthotriazole y 2,3-, DAN (exceso), respectivamente. La intensidad de estas dos
bandas aument con la adicin de un 0,1% KNO3 solucin, lo que confirma la presencia de la
nitrato reductasa.
Figura 6
EDS espectros de nanopartculas de plata
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Figura 7
Espectro de emisin de fluorescencia de la solucin acuosa de 10-3 M AgNO3 con la biomasa
fngica (07SD). La longitud de onda de excitacin fue 465 nm. El recuadro muestra el espectro
de excitacin de fluorescencia (emisin a 550 nm ).
Parece que la reductasa es responsable de la reduccin de los iones Ag + y la subsiguienteformacin de nanopartculas de plata. La misma observacin se inform con otra cepa de F.
oxysporum y se seal que esta reductasa fue especfico para F. oxysporum. Sin embargo,
Fusarium moniliforme, no dio lugar a la formacin de nanopartculas de plata, ni
intracelularmente ni extracelularmente pero contena reductasas intra y extra celulares en una
manera similar como F. oxysporum [17,23]. Esto es una indicacin de que probablemente las
reductasas en este tipo de Fusarium son importantes para el Fe (III) a Fe (II), pero no a Ag (I) a
Ag (0). Adems, en F. moniliforme derivados de antraquinonas no se detectaron a diferencia
del caso de F. oxysporum. Tanto fusarium eran iguales en la produccin de naftaquinonas [8],
pero difieren en la produccin de antraquinonas. Probablemente, en nuestro caso, Ag (0)
reduccin se debi principalmente a una conjugacin entre la lanzadera de electrones con la
participacin reductasa como se muestra en la Figura 9.
Conclusin
Aunque el oro / plata nanopartculas han sido sintetizados utilizando procariotas tales como
bacterias [24,25] y eucariotas tales como hongos [13,14], las nanopartculas crecer
intracelularmente, excepto en el caso de un reciente informe en el que F. oxysporum fue
utilizado. En ese caso, las nanopartculas creci extracelularmente [17]. En nuestro caso, todas
las cepas de F. oxysporum estudiadas mostraron la capacidad de produccin de nanopartculas
de plata, sin embargo, dependiendo de las relaciones de conexin reductasa / electrn enestas condiciones. Biolgicamente sintetizadas nanopartculas de plata podran tener muchas
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aplicaciones en reas como la ptica no lineal, revestimientos espectralmente selectivos de
absorcin de energa solar y materiales de intercalacin para las bateras elctricas, como los
receptores pticos, catlisis en reacciones qumicas, bio-etiquetado [26], y como capacidad
antibacterianos [27].
Mtodos
Las cepas de F. oxysporum utilizados fueron los siguientes: O6 SD, SD 07, 534, 9114 y 91248 de
la Esalq-USP Gentica y Biologa Molecular Laboratorio-Piracicaba, SP, Brasil. El inculos
fngicos se prepararon en un 2% de extracto de malta y extracto de levadura 0,5% a 28 C en
placas de Petri. El crecimiento de los hongos lquido se llev a cabo en presencia de extracto
de levadura al 0,5% a 28 C durante 6 das. La biomasa se filtr y se resuspendi en agua
estril.
Figura 9
Mecanismos hipotticos de la biosntesis de las nanopartculas de plata
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Plata reduccin y su caracterizacin
Mtodo A: En la reduccin de la plata, la metodologa descrita anteriormente fue seguido [17].
En pocas palabras, aproximadamente 10 g de F. oxysporum biomasa fue tomada en un matraz
cnico que contena 100 ml de agua destilada. Solucin de AgNO3 (10-3 M) se aadi al matraz
erlenmeyer y la reaccin se llev a cabo en la oscuridad. Peridicamente, las alcuotas de lasolucin de reaccin y se eliminaron las absorciones se midieron usando un espectrofotmetro
de UV-Vis (Agilent 8453 - matriz de diodos).
Mtodo B: Otra prueba se llev a cabo de la siguiente manera: aproximadamente 10 g de F.
oxysporum biomasa fue tomada en un matraz cnico que contena 100 ml de agua destilada,
se mantuvo durante 72 horas a 28 C y despus los componentes de la solucin acuosa se
separaron por filtracin. A esta solucin, AgNO3 (10-3 M) se aadi y se mantuvo durante
varias horas a 28 C.
Las nanopartculas de plata se caracterizaron por microscopa electrnica de barrido (SEM) yespectroscopia de dispersin de energa (EDS) con una tensin de 20 kV (Jeol - JSM-6360LV) y
previamente recubierta con oro a vaco.
Determinacin de los compuestos de electrones-trasladados
Liberacin de electrones-trasladados compuestos se sigui la metodologa descrita
anteriormente [11]: A fin de determinar las quinonas solubles en agua que podran funcionar
como una lanzadera de electrones, los cultivos se filtraron 4-6 semanas, y el filtrado se ajust a
pH 3 con HCl 1 M. La solucin acidificada se pas entonces a travs de una columna con resina
de intercambio inico (Amberlite ) para la absorcin de los pigmentos. Los compuestos se
eliminan de la columna por elucin con acetona, se elimin la acetona utilizando una
evaporacin rotatorio Buchi y la fase acuosa se extrajo 3 veces con acetato de etilo. Todas las
extracciones de acetato de etilo se combinaron y se redujeron usando el evaporador rotatorio.
Despus de eso, 2 uL muestras fueron vistos repetidamente sobre una placa de gel de slice 60
hasta un punto era visible bajo luz UV a 254 nm. Las muestras fueron resueltas utilizando un
cido cloroformo-metanol-actico (195:5:1) y benceno-nitrometano-cido actico (75:25:2)
sistema diseado para movilizar pigmentos polares. Las placas fueron secadas al aire y las
manchas se visualizaron bajo luz ultravioleta [19].
El nitrato reductasa ensayo
La reduccin de nitrato se demostr en el mismo medio (Mtodo A y B) de la misma caldo de
crecimiento de F. oxysporum con la adicin de 0,1% de KNO3 [6]. La prueba para la nitrato
reductasa se hizo despus de 2 das por el mtodo fluoromtrico [20]. Brevemente, 100 l
hongos filtrado y los 200 l de agua desionizada. Para esto, 10 l de recin preparada 2,3 -
diaminonaphtalene (DAN) (0,05 mg / ml en HCl 1 M) y se mezcla inmediatamente. Despus de
10 minutos de incubacin a 20 C, la reaccin se detuvo con 5 l de 0,1 M NaOH.
La intensidad de la seal fluorescente producida por el producto se maximiza mediante la
adicin de base. la formacin de 2,3-diaminonapthotriazole se midi utilizando un Perkin-
Elmer (LS-55) con espectrofotmetro de luminiscencia y longitud de onda de excitacin a 375nm y la banda de emisin medida a 550 nm [20].
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Determinacin de los residuos de triptfano / tirosina
Presencia de residuos de triptfano / tirosina en las protenas de liberacin que en el filtrado
fngica se analiz por fluorescencia [17]. la mediciones de fluorescencia se llevaron a cabo en
un espectrofotmetro de luminiscencia Perkin-Elmer (LS-55). La longitud de onda de excitacin
era 260 nm, cerca de mximos transiciones pticas del triptfano y tirosina.
Autores de las contribuciones
ND concibe el estudio, junto con la Oficina de Asuntos Jurdicos y EE y particip en su diseo y
la coordinacin y recogieron todos los datos y escribi el documento. PDM obtenido todos los
puntos de vista de SEM, realizado los ensayos enzimticos, los aspectos de electrones
trasladados y discutieron las tres partes relacionadas en el manuscrito. GIHS realizado todaslas pruebas de hongos y medida de todas las variaciones espectroscpicas de la resonancia de
plasmn de las nanopartculas de plata bajo la supervisin de EE. Oficina de Asuntos Jurdicos
tambin supervis todos los aspectos de las nanopartculas en este trabajo. Todos los autores
ledo y aprobado el manuscrito final.