Post on 05-Aug-2015
AUTOMATIZACION EN
HEMATOLOGICA
LIC. TM. NOE OLAYA NIÑO
BLGA. SANDRA CRUZ GUERRERO
INTRODUCCION
Los métodos manuales tradicionales han sido sustituidos por contadores electrónicos que conllevan mejores condiciones en rentabilidad, fiabilidad y condiciones de trabajo.
Estos contadores permiten realizar el hemograma analizando en pocos segundos miles de células.
HISTORIA
1934: Andrew Moldavan, recuento fotoeléctrico de células en suspensión que pasan a través de un capilar montado a un microscopio (detectaría cambios de luz producidos por GR).
1956: Hermanos Coulter, Wallace y Joseph, patentan su equipo basado en el método de la impedancia eléctrica, únicamente para contar leucocitos y eritrocitos.
AUTOMATIZACION VENTAJAS
RAPIDEZ
EFICIENCIA
PRECISIÓN
EXACTITUD
NUEVOS ÍNDICES
REPRODUCIBILIDAD (CV)
MANUAL AUTOMATIZADO
Eritrocitos 11% 1%
Leucocitos 16% 2%
Plaquetas 22% 4%
VCM 9.5% 1%
HCM 10% 1.5%
Delta Check
Delta Check - el proceso
de revisar los resultados
de pacientes actuales y
compararlos con
resultados previos en
busca de diferencias
significativas.
Generación según avance tecnológico
4ta. G: Hemograma automatizado Con perforación de tapa, histograma, dispersograma para GB, diferencial GB de 5 estirpes.
3ra. G: Hemograma automatizado: Histogramas de GR, Plaquetas y recuento diferencial de GB en 3 estirpes.
2da. G: Hemograma semiautomatizado:
1ra. G: Hemograma manual.
Parámetros hematológicos Directos (determinados)
• Recuento de eritrocitos
• Volumen de eritrocitos
• Recuento de Plaquetas
• Volumen de plaquetas
• Hemoglobina
• Recuento de leucocitos,
• Volumen de leucocitos
• Formula leucocitaria
Parámetros hematológicos Indirectos (calculados)
• Hematocrito
• Índices eritrocitarios: VCM, HCM, CHCM
• ADE (RDW)
• VPM, Plaquetocrito.
• Histograma leucocitario, eritrocitario, plaquetario
Diagrama funcional simplificado de un sistema
multiparamétrico de recuentos celulares
Equipos automatizados
TECNICAS DE RECUENTO CELULAR:
Existen tres tipos de equipos automatizados
según su funcionamiento:
Por impedancia
Radiofrecuencia y Corriente directa.
Por dispersión de luz
IMPEDANCIA ELECTRICA
PRINCIPIO
Se basa en la resistencia
que ofrecen las células al
paso de la corriente
eléctrica, cuando atraviesan
un orifico de apertura que
separa dos medios con
diferente potencias (uno
positivo y otro negativo)
Sistema de medición no óptico,
con un rango de medición que
excede las 6000 células
individuales por segundo.
El numero de células contadas
por muestra es aproximadamente
100 veces mayor que los
recuentos microscópicos,
reduciendo el error estadístico
aproximadamente 10 veces.
IMPEDANCIA ELECTRICA
IMPEDANCIA ELECTRICA
Eritrocitos y Plaquetas:
Las células de una muestra de sangre total es diluida en una solución electrolítica.
Se hacen pasar, una detrás de la otra, a través de una abertura de determinado diámetro, por la que circula una corriente eléctrica de cierta intensidad inducida por 2 electrodos dispuestos a ambos lados de la abertura u orificio.
IMPEDANCIA ELECTRICA
Cada que una célula atraviesa el orificio de apertura
obstaculiza la corriente (se produce un cambio de
resistencia eléctrica), que genera un cambio en la diferencia
de potencial: Pulso
IMPEDANCIA ELECTRICA
Se producen pulsos que son clasificados por tamaños, varias
miles de células por segundo, haciendo que los resultados sean
más fiables que los obtenidos por métodos manuales
La amplitud de los pulsos es directamente proporcional al
tamaño de la partícula (Volumen celular).
Nº Cantidad Tamaño
Volumen
PULSO
Flujo
CC
AP : 50 um : GR >= 36 fl Pq >= 2 – 20 fl
AP : 100 um : GB >= 35 fl
PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO
IMPEDANCIA ELECTRICA:
SUSPENSIÓN CELULAR EN MEDIO ELECTROLÍTICO.
PASO DE CÉLULAS POR APERTURA PEQUEÑA.
GR y Plaquetas: 50 x 60 micras
Leucocitos: 100 x 70 micras
FLUJO ELÉCTRICO POR EL PORO.
ELABORACIÓN DE GRÁFICAS:
Eritrocitos: 30 a 350 fL
Plaquetas: 2 a 20 fL
Leucocitos: 35 a 430 fL
Impedancia Electrica
Gráficas X
Y
ENFOQUE HIDRODINAMICO
Para conseguir una trayectoria
uniforme de las células por el
centro de la región sensible del
orificio de apertura (en hilera).
Con esto se evita que las células
pasen por el borde del orificio de
apertura o que, una vez
atravesado este, retrocedan e
interfieran en la lectura de las
otras células que le siguen.
ENFOQUE HIDRODINAMICO
La sensibilidad y exactitud de la lectura dependen de que las células en suspensión fluyan por un núcleo central sin mezclarse con el liquido de arrastre (flujo en hilera)
Mejora la exactitud y reproducibilidad del conteo de células sanguíneas.
Previene la generación de pulsos anormales.
IMPEDANCIA ELECTRICA
Eritrocitos y plaquetas: Son contados en un canal exclusivo. Discriminadores automáticos separan las dos poblaciones celulares. GR y Plaquetas se cuentan juntos y se separan por la altura de los pulsos.
IMPEDANCIA ELECTRICA
Impedancia de Leucocitos:
El conteo es posible gracias a la adición del lisante, que ocasiona salida de agua del citoplasma, ocasionando que la membrana se adhiera al núcleo de la célula.
Las células lisadas pasan por la apertura de 70 u, lo que genera impulsos eléctricos de alta variabilidad, generándose 3 poblaciones:
Linfocitos
Región media: (monocitos,
eosinófilos y basófilos.
Granulocitos: Neutrófilos.
IMPEDANCIA ELECTRICA
En la actualidad, este principio se
aplica como método de
referencia para el recuento
celular hemático y la medición de
los volúmenes (tamaño) de cada
población celular.
Es utilizado por la mayoría de los
contadores hematológicos
debido a su marcada
reproducibilidad, rapidez y
disminución del error estadístico.
RADIOFRECUENCIA Y CORRIENTE DIRECTA
PRINCIPIO:
El tamaño de las células es detectado por
medio de cambios en la resistencia a la
corriente eléctrica y
La densidad del interior de las células
(tamaño del núcleo y otras informaciones)
se detecta por medio de cambios en la
resistencia a la frecuencia de radio.
DISPERSION LUMINICA (método óptico)
PRINCIPIO
Técnica de análisis
celular multiparamétrico.
Analiza el efecto que
sobre un haz de luz
monocromática de alta
densidad (Láser) ejercen
las células de la sangre al
cruzarse, una a una en
su trayectoria.
DISPERSION LUMINICA
Una suspensión de células
diluidas fluye a través de una
abertura.
Las células pasan alineadas una
detrás de otra, a través de una
pequeña zona sobre la que incide
perpendicularmente un haz de luz
halógena o láser, lo que provoca
la interrupción y dispersión
lumínica de la energía radiante en
diversos ángulos.
DISPERSION LUMINICA
Es mas complejo que la impedancia:
Además del tamaño y la concentración de
las células permite analizar la complejidad
de la estructura celular (Granularidad,
características del núcleo) y así
diferenciarlas.
Por ello es el procedimiento de elección
para la automatización de la fórmula
leucocitaria.
METODOS ADICIONALES
Los métodos pueden incluir también:
Actividad de enzimas celulares como la
peroxidasa. (Citoquímica)
Fluorescencia
Análisis digital de la imagen.
CITOQUIMICA CELULAR
Citoquímica: Son aquellas reacciones químicas
que se dan en la célula para evidenciar las
estructuras que la componen.
Proporcionan la formula leucocitaria, de
acuerdo con el tamaño de los leucocitos y su
tinción con determinados colorantes.
Ventaja: En cada espécimen se cuentan
muchas células (unas 10,000), lo que hace
que aumente su precisión.
CITOQUIMICA Actividad de enzimas celulares: Peroxidasa
Para aumentar la fiabilidad del recuento
diferencial combinan Citometría de flujo con la
Citoquímica
Miden con un colorante la actividad peroxidasa:
Alta en eosinófilos,
Menor positividad en neutrófilos,
Monocitos tienen muy poca actividad y
Linfocitos no tienen actividad peroxidasa.
RECUENTO DIFERENCIAL
AUTOMATIZADO
La mayoría de contadores diferenciales
automatizados utilizan la citometría de flujo
incorporada a un contador de sangre total.
Proporcionan recuento diferencial de 3, 5 a 7
componentes.
Los recuentos se realizan en sangre completa
diluida en la que los eritrocitos se han lisado o
se han vuelto transparentes.
RECUENTO DIFERENCIAL
AUTOMATIZADO Recuento diferencial de 5 componentes:
Neutrófilos
Eosinófilos
Basófilos
Linfocitos
Monocitos
Recuento extendido:
Grandes células inmaduras (Blastos y granulocitos inmaduros)
Linfocitos atípicos (incluye blastos pequeños)
ANALISIS DIGITAL DE LA IMAGEN
PRINCIPIO:
Se basa en el reconocimiento de los
leucocitos por medio del análisis
computarizado de las imágenes que
proporciona un microscopio, a partir de
extensiones sanguíneas teñidas.
Estas se comparan con imágenes
programadas en el ordenador.
ANALISIS DIGITAL DE LA IMAGEN
• La extensión teñida se coloca en un
microscopio, que se mueve controlada por el
ordenador.
• Se inicia el sistema de rastreo semejante al
manual.
• Cuando se localiza un leucocito, se digitaliza la
imagen con una cámara de video.
• Se compara con las características
morfológicas programadas en la memoria del
equipo para los distintos tipos de leucocitos
ANALISIS DIGITAL DE LA IMAGEN
REPORTE:
Polinucleares neutrófilos: segmentados y no segmentados.
Eosinófilos
Basófilos
Monocitos
Linfocitos.
Algunos identifican; Mielocitos, metamielocitos, linfocitos atípicos y blastos.
Recuentos de Reticulocitos
Método de Referencia: Azul de Metileno
Altos coeficientes de variación, laboriosos
Métodos automatizados
Fluorescentes: naranja de tiazol, auramina O.
Absorvancia: oxazina 750 , azul de metileno.
Colorantes que interaccionan con el ARN de
reticulocitos.
Canal reticulocitos - Fluorescente
Fl alta
Fl baja
Fl muy alta
Tinción:
Polimetino: ARN
Oxazina: ADN
RET
WBC
RBC
RETSEARCH II (Diluyente + Colorante)
Recuentos de Reticulocitos
Actualmente, diversos autoanalizadores tienen la capacidad de contar los reticulocitos de sangre periférica, ofrecen:
Parámetros:
•Nº porcentual y absoluto,
• Volumen reticulocitario
• Concentración en
hemoglobina.
DETERMINACIÓN DE LA
CONCENTRACIÓN DE HEMOGLOBINA
El sistema utiliza la dilución de LEU lisados para
calcular la hemoglobina.
La absorbancia de luz de un foco incandescente se
determina en 525 nm a través de la longitud óptica
del baño.
Un haz de luz del foco pasa a través de la muestra,
con un filtro de 525, y se determina mediante un
fotodiodo.
La señal se amplifica y el voltaje se calcula y se
compara con la lectura del blanco de referencia.
Tecnologías de Hemoglobinometría
Con Cianuro
Cianmetahemoglobina
Sin Cianuro Hidroxilamina
Lauril Sulfato de Sodio
Formulado a partir de concentración de
Hemoglobina y Rcto. De GR
Hemoglobina
Lauril sulfato sódico:
Reactivo libre de cianuro
No causa daño al medio ambiente
Menor interferencia en muestras:
Lipémicas
Ictéricas
Conteos altos de leucocitos
Proteinas anormales
Determinación de Hb
Instrumento Método de
identificación
Método de
detección:
Beckman-
Coulter
HiCN Absorción a 525 nm
Sysmex LSS-meta-Hb Absorción a 555 nm
Bayer HiCN con Hb
celular directa
Absorción a 546 nm
Abbott HiCN Absorción a 546 nm
ABX HiCN Absorción a 540 nm
Hematocrito
Calculado:
VCM x Número de GR
No se mide directamente con los citómetros de flujo y se calcula a partir del VCM y en número de GR. Tiene menor precisión.
Indices Hematimétricos
VCM
HCM
CHCM
RDW-CV
RDW-SD
Plaquetocrito
VMP
CONTROL DE CALIDAD
Control de Calidad
Métodos estadísticos y
cuantitativos usados en
el laboratorio para
asegurar la validez de
los resultados de tests.
LIMITACIONES DE LA
AUTOMATIZACIÓN
No se detectan inclusiones intraeritrocitarias
No puede distinguir exactamente los leucocitos patológicos
Existen interferencias que afectan las determinaciones
Pseudo trombocitopenia por EDTA
Policromatofilia, Eliptocitos, Esferocitos, Acantocitos, Hematíes fragmentados, GR en lágrima, Macroovalocitos, Punteado Basófilo, Anillos de Cabot, Corpúsculos de Howell-Jolly, Rouleaux, Parásitos hemáticos, etc.
AUTOMATIZACIÓN: ASPECTOS ORGANIZATIVOS
LA AUTOMATIZACIÓN NO PUEDE LLEVAR A QUE EL
LABORATORIO SE CONVIERTA EN UN EXPEDIDOR DE
CIFRAS AISLADAMENTE.
ES NECESARIO AUMENTAR LA EFICIENCIA Y CALIDAD
DE LOS RESULTADOS Y UNA CONTINUA SUPERACIÓN
DE TODO EL PERSONAL QUE LABORA EN ESTE. Gracias por su atención