Post on 23-May-2020
Biopsia Líquida: Experiencia del Hospital Clínico Universitario de Salamanca
Rebeca Lozano Mejorada Hospital Clínico Universitario de Salamanca
CNIO-IBIMA Genitourinary Cancer Clinical Research Unit
BIOPSIA LÍQUIDA
BIOPSIA LÍQUIDA
• Único sistema aprobado por FDA CellSearch® Circulating Tumor
Cell System (VERIDEX)
Sensibilidad y
Especificidad Principio Volumen SP FDA Técnica
Alta Células epiteliales 7,5 mL SI Veridex
Alta S, Baja E RNA 5-10 mL NO RT-PCR
Buena S, baja E Tamaño celular 10 mL NO ISET
Alta, en investigación Células epiteliales 7,5 mL NO Microchip
Alta, en investigación Tamaño celular 7,5 mL NO Microfiltros
Alta Células epiteliales 100 µL NO Citometría de flujo
Caracterización molecular
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
NUESTRO MÉTODO…
Aislamiento y caracterización genómica mediante
técnicas de citogenética molecular
(sistema automatizado MetaFer-MetaCyte)
Nos permite seleccionar células por tamaño y
alteraciones citogenéticas.
2011
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
- 80ºC
Extracción de SP y separación por gradiente de densidad (Ficoll).
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
Extracción de SP y separación por gradiente de densidad (Ficoll).
Primera fase:
Contaje celular + detección de células genéticamente alteradas
> 7 μm
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
Extracción de SP y separación por gradiente de densidad (Ficoll).
Primera fase:
Contaje celular + detección de células genéticamente alteradas
PTENCEP 10
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
Extracción de SP y separación por gradiente de densidad (Ficoll).
Primera fase:
Contaje celular + detección de células genéticamente alteradas.
Segunda fase:
Extracción DNA en plasma.
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
1. VALIDACIÓN METODOLÓGICA DE LA TÉCNICA
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
1. VALIDACIÓN METODOLÓGICA DE LA TÉCNICA
• 30 pacientes con Cáncer de Mama Estadio IV
Alteraciones en PTEN en CTCs
mediante FISH
Alteraciones en el exon 20 de
PIK3CA en plasma mediante
HRM
Cizkova M, et al. Breast Cancer Research 2012.
15 controles
Edad, años Media Mediana Rango
61 61 43-77
Histología, N (%) CDI CLI Otros
24 (80) 4 (13.3) 2 (6.7)
Receptores de estrógenos, N (%) Positivos Negativos Desconocido
20 (66.7) 10 (33.3) 0 (0)
Receptores de progesterona, N (%) Positivos Negativos Desconocido
16 (53.3) 12 (40) 2 (6.7)
HER2, N (%) Positivo Negativo Desconocido
4 (13.3) 22 (73.4) 4 (13.3)
Metástasis. N (%) Viscerales No viscerales (gg, óseas)
18 (60) 12 (40)
Líneas de tratamiento previas, N (%) 2 3 ≥ 4
6 (20) 8 (26.7) 16 (53.3)
Tratamiento actual, N (%) Quimioterapia Hormonoterapia Terapias biológicas
19 (63.3) 9 (30) 2 (6.7)
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
1. VALIDACIÓN METODOLÓGICA DE LA TÉCNICA
• De las 30 pacientes analizadas
3 pacientes: No células > 7 μm.
27 pacientes: Células > 7 μm.
90%
10%
44%
56%
37%
63%
PIK3CA PTEN
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
1. VALIDACIÓN METODOLÓGICA DE LA TÉCNICA
• De las 30 pacientes analizadas
3 pacientes: No células > 7 μm.
27 pacientes: Células > 7 μm.
90%
10%
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
1. VALIDACIÓN METODOLÓGICA DE LA TÉCNICA
• De las 30 pacientes analizadas
3 pacientes: No células > 7 μm.
27 pacientes: Células > 7 μm.
90%
10%
PIK3CA Mut PIK3CA wt TOTAL
PTEN Del 5 (18,5%) 7 (26%) 12 (44,5%)
PTEN wt 5 (18,5%) 10 (37%) 15 (55,5%)
TOTAL 10 (37%) 17 (63%) 27 (100%)
62,9 %
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
N (%) PTEN Del N (%) PTEN Norm P (Χ2)
Histología CDI CLI Otros
8 (26.7) 3 (10) 1 (3.3)
16 (53.7) 1 (3.3) 1 (3.3)
NS
Receptores hormonales RE- RE+ RP- RP+ Desconocido
3 (10) 9 (30) 1 (3.3) 9 (30) 2 (6.7)
7 (23.3) 11 (36.7) 11 (36.7) 7 (23.3) 0 (0)
NS NS
Estado HER2 HER2- HER2+ Desconocido
9 (30) 1 (3.3) 2 (6.7)
15 (50) 1 (3.3) 2 (6.7)
NS
Metástasis Viscerales No viscerales
12 (40) 0 (0)
6 (20) 12 (40)
*0.000
Líneas de tratamiento 2 3 ≥ 4
2 (6.7) 1 (3.3) 9 (30)
18 (60) 7 (23.3) 7 (23.3)
NS
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
• Distribución según subtipo intrínseco (subrogado)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
PIK3CA PTEN
Luminal
HER2
TN
Desconocido
5 casos con asociación entre
deleción de PTEN y mutación LUMINAL de PIK3CA
Cizkova M, et al. Breast Cancer Research 2012 Jones N, et al IJC, 2012
Kalinsky K, et al. Clin Cancer Res 2009
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE MAMA
2. VALIDACIÓN CLÍNICA DE LA TÉCNICA
Total pacientes: 76
Pacientes evaluables: 70
Pacientes excluidas: 6
Muestra no valorable
Pacientes con Cáncer de Mama Localizado (Estadios I-III)
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE PRÓSTATA
• AR-V7
A NOVEL CAPILLARY NANO-IMMUNOASSAY FOR ASSESSING ANDROGEN RECEPTOR SPLICE VARIANT 7 IN PLASMA. CORRELATION WITH CD133 ANTIGEN EXPRESSION IN CIRCULATING TUMOUR CELLS. A PILOT STUDY IN PROSTATE
CANCER PATIENTS.
García J.L, Cruz J.J, et al. Clin Trans Oncol 2017. In Press Antonorakis ES, et al. N Engl J Med 2014
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE PRÓSTATA
• CD 133
Guzel E, et al. Cancer Res Frontiers 2015 Reyes EE, et al. J Transl Sci 2015
Pal SK, et al. Clin Genitourin Cancer 2015
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE PRÓSTATA
• AR and PTEN
Claessens et al, Nat Rev Urol 2014
Dehm SM, Endoc Related Cancer 2011
Ferraldeschi R, Eur Urol 2015
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE PRÓSTATA
• N: 72 Prostate Cancer patients
FACS
A NOVEL CAPILLARY NANO-IMMUNOASSAY FOR ASSESSING ANDROGEN RECEPTOR SPLICE VARIANT 7 IN PLASMA. CORRELATION WITH CD133 ANTIGEN EXPRESSION IN CIRCULATING TUMOUR CELLS. A PILOT STUDY IN PROSTATE
CANCER PATIENTS.
Localized PCa
Metastatic PCa (CRPC, Castration-näive)
CD45- CD34-
García J.L, Cruz J.J, et al. Clin Trans Oncol 2017. In Press
CD133+
FISH
AR
PTEN
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE PRÓSTATA
• AR-V7
A NOVEL CAPILLARY NANO-IMMUNOASSAY FOR ASSESSING ANDROGEN RECEPTOR SPLICE VARIANT 7 IN PLASMA. CORRELATION WITH CD133 ANTIGEN EXPRESSION IN CIRCULATING TUMOUR CELLS. A PILOT STUDY IN PROSTATE
CANCER PATIENTS.
García J.L, Cruz J.J, et al. Clin Trans Oncol 2017. In Press
1. Cell lines
VCaP (Positive control)
PC3 (Negative control)
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE PRÓSTATA
• AR-V7
A NOVEL CAPILLARY NANO-IMMUNOASSAY FOR ASSESSING ANDROGEN RECEPTOR SPLICE VARIANT 7 IN PLASMA. CORRELATION WITH CD133 ANTIGEN EXPRESSION IN CIRCULATING TUMOUR CELLS. A PILOT STUDY IN PROSTATE
CANCER PATIENTS.
García J.L, Cruz J.J, et al. Clin Trans Oncol 2017. In Press
1. Cell lines
2. Healthy donors
3. PCa patients
VCaP (Positive control)
PC3 (Negative control)
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE PRÓSTATA
AR-V7 –
N:51 (%)
AR-V7 +
N:21 (%)
TOTAL
N:72 (%)
p-values
GLEASON SCORE
GS ≤ 6 8 (16) 2 (9,5) 10 (14)
GS 7 12 (23) 8 (38) 20 (28) NS
GS ≥ 8 29 (57) 9 (43) 38 (53)
Not available 2 (3,9) 2 (9,5) 4 (5,5)
CRPC
Yes 30 (59) 15 (71) 45 (62) NS
No 21 (41) 6 (29) 27 (37)
M1
Yes 38 (74) 18 (86) 56 (78) NS
No 13 (25) 3 (14) 16 (22)
Localization
Bone Only 20 (53) 6 (33) 26 (46) NS
Lymph node only 3 (7,9) 1 (5,6) 4 (7,1)
Bone and LN 10 (26) 6 (33) 16 (29)
Visceral 5 (13) 5 (28) 10 (18)
Treatment
Local 9 (18) 2 (9,5) 11 (15) NS
ADT 13 (25) 2 (9,5) 15 (21)
Abi/Enza 12 (24) 3 (14) 15 (21)
Chemotherapy 13 (25) 12 (57) 25 (35)
Corticosteroids 4 (7,8) 2 (9,5) 6 (8,3)
PSA (Median) 14,7
(0,04 – 3160)
672,50
(2,7 – 1349)
23
(0,04 – 3160)
p<0.05
CD133+ (Median) 3
(0 – 1922)
7
(1 – 81)
4
(0 – 1922)
NS
81% Gleason ≥ 7
71% CRPC
86% M1
Median PSA (672 Vs 14)
Median CD133+ (7 Vs 3)
AR-V7+ 29 %
García J.L, Cruz J.J, et al. Clin Trans Oncol 2017. In Press
BIOPSIA LÍQUIDA: CÁNCER DE PRÓSTATA
• CD133+ 96% patients (69/72)
In half of patients (37/72 51%) ≥ 4 CD133+
• AR amplification 60 cases analyzed
≥ 4 CD133+ 30 AR amplification (81%)
• PTEN deletion 59 cases analyzed
≥ 4 CD133+ 27 PTEN deletion (72%)
A NOVEL CAPILLARY NANO-IMMUNOASSAY FOR ASSESSING ANDROGEN RECEPTOR SPLICE VARIANT 7 IN PLASMA. CORRELATION WITH CD133 ANTIGEN EXPRESSION IN CIRCULATING TUMOUR CELLS. A PILOT STUDY IN PROSTATE
CANCER PATIENTS.
García J.L, Cruz J.J, et al. Clin Trans Oncol 2017. In Press
BIOPSIA LÍQUIDA: CONCLUSIONES La detección y aislamiento de CTCs nos permite no sólo cuantificar, si no
también estudiar alteraciones genómicas específicas.
En CMM se ha realizado la validación metodológica de la técnica MetaFer-MetaCyte para la detección de CTCs por tamaño y alteraciones moleculares.
Análisis de alteraciones en dos genes implicados en la misma cascada de señalización, como son PTEN y PIK3CA.
Sus alteraciones pueden tener efectos aditivos o sinérgicos a través de las rutas funcionales no canónicas.
En cáncer de próstata se ha realizado la validación metodológica de una técnica novedosa y relativamente sencilla para la detección de AR-V7 en plasma.
Existe asociación entre el status de AR-V7 y la presencia de células CD133+, amplificación del AR y deleción de PTEN.
BIOPSIA LÍQUIDA
EXPERIENCIA:
“Conocimiento de algo, o habilidad para ello… que se adquiere al haberlo realizado, vivido, sentido o sufrido una o más veces.”