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BIOSEPACIONESBIOSEPACIONESDOCENTE: ANGÉLICA MORALESE-MAIL : angelica.morales@biogenesisbago.com
amamoca09@gmail.com
CEBI_E8 Angélica MoralesCEBI_E8 Angélica Morales
Modalidad de las Clases: Teórico (12 horas)Aprobación: Asistencia obligatoria al 80% de las clases + aprobación de una evaluación de contenidos.
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CONTENIDOS MÍNIMOSCONTENIDOS MÍNIMOS
DownstreamDownstream processingprocessing: Definición. Downstream processing I. Downstreamprocessing II. Técnicas de separación. Rendimiento. Pureza. Performance. Costo.Tabla de purificación.
RupturaRuptura celularcelular:: Definición. Métodos químicos. Métodos físicos. Métodosbiológicos. Ecuaciones de velocidad.
SeparaciónSeparación SólidoSólido--LíquidoLíquido:: Centrifugación. Filtración.
PrecipitaciónPrecipitación:: Métodos generales de precipitación. Salting out. Solventesorgánicos. Precipitación isoeléctrica. Polímeros no iónicos. Polielectrolitos.
ParticiónPartición enen dosdos fasesfases acuosasacuosas: Definición. Coeficiente de partición.
CromatografíaCromatografía..
PurificaciónPurificación dede ProteínasProteínas recombinantesrecombinantes..
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INTRODUCCIÓN AL DOWNSTREAM INTRODUCCIÓN AL DOWNSTREAM PROCESSINGPROCESSING
UNIDAD 1UNIDAD 1
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BIOTECNOLOGÍA CLÁSICABIOTECNOLOGÍA CLÁSICA
Tecnología de las Tecnología de las Fermentaciones Fermentaciones
Recuperación y purificación de Recuperación y purificación de productosproductosUPSTREAMUPSTREAM
DOWNSTREAMDOWNSTREAM
CEBI_E8 Angélica MoralesCEBI_E8 Angélica Morales
Downstream Processing…Downstream Processing…
Recuperación y purificación de productosRecuperación y purificación de productos
Downstream I
Downstream II
BioseparacionesBioseparaciones CromatografíaCromatografía
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Productos de la biotecnología Productos de la biotecnología modernamoderna
ÁÁrea agrícola rea agrícola (Verde)(Verde)• Quimosina• Tomates larga vida• Plantas transgénicas resistentes a pesticidas
Área industrial (Blanca):Enzimas industriales
ÁÁrea de Saludrea de Salud (Roja):• Kits de diagnostico médico• Proteínas de actividad terapéutica.• Vacunas de nueva generación.• Anticuerpos Monoclonales
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Productos de la biotecnología Productos de la biotecnología moderna…moderna…
ÁÁrea marina rea marina (Azul)(Azul)• Se ocupa de la aplicación de métodos moleculares y biológicos a los organismos marinos y de agua dulce.• Aumento de la oferta de productos del mar.• Control de la proliferación de microorganismos nocivos transmitidos por el agua.• Desarrollo de nuevos medicamentos
ÁÁrea Ambientalrea Ambiental (Gris):• Desarrollo de soluciones para mitigar el impacto ambiental.• Biorremediación.
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Biotecnologías ParcialesBiotecnologías Parciales
Tratamiento de efluentes: Tratamiento de efluentes: intervención de biológicos en los procesos.Efluente biológico: Métodos fisicoquímicosEfluente mineral: Métodos biológicos
Recuperación y purificación: Recuperación y purificación: A escala comercializable.Productos de seres vivos: Métodos fisicoquímicos (Obtención de albúmina a
partir de plasma humano)Minerales: Métodos biológicos (biolixividación)
Fermentación:Fermentación:Bebidas fermentadas.
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Biotecnología RecombinanteBiotecnología Recombinante
Ingeniería Genética
Tecnología de las Fermentaciones
Recuperación y Purificación
Tratamiento de efluentes
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Sistemas de expresión de proteínas Sistemas de expresión de proteínas recombinantesrecombinantes
Microorganismos Microorganismos → Bacterias, levaduras y hongos
Células de mamífero Células de mamífero → CHO, BHK
Células de insectos Células de insectos → sistema baculovirus
Animales transgénicos Animales transgénicos → Vacas productoras para producciónde insulina humana
Plantas transgénicas Plantas transgénicas → Vacuna de VFA en alfalfa
Reemplazar sistemas mamíferos
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Sistemas de expresión de proteínas Sistemas de expresión de proteínas recombinantesrecombinantes
Product Company Host System Status (U.S. approval)Humulin Eli Llly E. coli 1982
Protropin Genentech E. coli 1985
Recombivax Merck Yeast 1986
Activase Genentech Mammalian cells 1987
Epogen Amgen Mammalian cells 1989
Pulmozyme Genentech Mammalian cells 1993
Nutropin Genentech E. coli 1994
Avonex Biogen Mammalian cells 1996
Antithrombin III Genzyme Transgenics Goats
Alpha-1-antityrpsin PPL Therapeutics Sheep
Alpha-glucosidase Pharming Cow
Avicidin antibody IPT/NeaRxCom
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Características del producto a obtenerCaracterísticas del producto a obtener
COSTOCOSTO razonable (Negocio)
RENDIMIENTORENDIMIENTO máximo
PUREZAPUREZA adecuada
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS Y BIOLÓGICAS PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS Y BIOLÓGICAS deseadas
Axioma de la Biotecnología:Axioma de la Biotecnología:
NO HAY QUE PURIFICAR MÁS DE LO NECESARIO !!!
Porque…. Aumenta los costos.Baja la competitividad del producto.
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Costos de Recuperación y PurificaciónCostos de Recuperación y Purificación(% respecto al costo total de producción)(% respecto al costo total de producción)
Dependiendo del producto el costo de recuperación y purificación puede ser hasta un 80% del costo de producción.
Depende principalmente de la complejidad del proceso de purificación.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Etanol
Penicilina
Proteína
Proteína Recombinante
ETOH → Des laciónPenicilina → Extracción por solventeProteína → Cromatogra aProteína Recombinante → Calidad inyectable, > pureza
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Rendimiento total vs Número de etapasRendimiento total vs Número de etapas
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Factores que influyen en el costo de un Factores que influyen en el costo de un proceso de purificaciónproceso de purificación
Número de etapas de purificación
Tipo de etapa
Rendimiento de cada etapa
Composición del Medio de cultivo
FermentaciónFermentación PurificaciónPurificación
- Alta eficiencia de producción - Retirar los aditivos agregados
- Agregado de aditivos al medio de cultivo - Repercusiones en la purificación
Tipo de producto
Concentración del producto
Pureza requerida
Reciclado de matrices cromatografías
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Precio de venta vs. concentración en el Precio de venta vs. concentración en el material de partidamaterial de partida
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Ejemplo. Tipo de producto según su ubicación en Ejemplo. Tipo de producto según su ubicación en el productorel productor
• Fácil purificación• Medio de cultivo diluye el producto extracelular
• Romper la células• Contaminación con proteínas de la célula
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Técnicas de SeparaciónTécnicas de Separación
RECUPERACIÓN (1ra Etapa)Aislamiento, enriquecimiento
PURIFICACIÓN (2da Etapa)
Características generales Características particulares
Grandes volúmenes Sofisticado
Lento
Pequeños volúmenes
TÉCNICA RECUPERACIÓN PURIFICACIÓN
Centrifugación X
Filtración X
Ultrafiltración X X
Precipitación X X
Partición X X
Cromatografía X
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Parámetros de evaluación de un proceso Parámetros de evaluación de un proceso de purificaciónde purificación
RendimientoRendimiento : :
Pureza:Pureza:
Porcentaje (%)
Cantidad de producto al final de la purificación x 100Cantidad de producto en el material de partida
Actividad Específica (AE):
Cantidad de proteína de interésCantidad total de proteínas
1) Peso: mg proteína después de la purificaciónmg proteína total
Unidades:
2) Unidad de Enzima: Unidad enzimática mg de proteínas totales
3) Unidad de Enzima: Unidad Enzimamg de N proteico
4) Unidad de Enzima: Unidad EnzimaAbs 280nm
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Parámetros de evaluación de un proceso Parámetros de evaluación de un proceso de purificaciónde purificación
Performance:Performance:
CostoCosto
Factor de Purificación (FP):
AE luego de la purificaciónAE antes de la purificación
Cálculo de cuanto se purifica de la proteína con respecto al paso anterior
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Tabla de purificaciónTabla de purificación
Operación Volumen(ml)
Cantidad de Proteína
Total (mg)
ActividadTotal (U)
Actividad Específica
(U/mg)
Rendimiento (%)
Factor de Purificación
1
2 ↓ ↓ ≈ ó ↓ ↑ ↓ ↑
3
4
5
Concentración del producto
Reduce los contaminantes
Cantidad de proteína de
interés
Depende del paso
[proteína total] * VActividad enzimática
Prot. totalesAE n *100%
AE n-1
AE final * 100%AE inicial
Unidad Enz. n * 100%Unidad Enz. n-1
Unidad Enz. final * 100%Unidad Enz. inicial
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Tabla de purificaciónTabla de purificación
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Tabla de purificaciónTabla de purificación
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Ejemplo proceso de purificación Ejemplo proceso de purificación
Figure 1. SDS-PAGE analysis of expression and purification of recombinant L-asparaginase II from E. coli IBs. Samples were analyzed on 12% polyacrylamide gel. Lane M; low molecular weight marker proteins (Pharmacia, Sweden) in (A–E). Arrow indicates recombinant asparaginase. (A) Lane 1: uninduced cell lysate; lane 2: induced cell lysate. (B) Lane 1: purified IBs.(C) Lane 1–9: supernatants of solubilized asparaginase from IBs in 0 to 8 molar urea respectively in 50 mM Tris pH 8.5 buffer. (D) Eluted fractions of asparaginase from DEAE ion exchange chromatography. Lanes 1–9 are eluted fractions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, and 17 from DEAE ion exchange chromatography. (E) Lane 1: purified recombinant asparaginase after S-200 gel chromatography.
Table 1. Purification of recombinant E. coli L-asparaginase II from IBs (culture volume 1 liter).
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Downstream Processing…Downstream Processing…
Recuperación y purificación de productosRecuperación y purificación de productos
Downstream I
Downstream II
BioseparacionesBioseparaciones CromatografíaCromatografía
CEBI_E8 Angélica MoralesCEBI_E8 Angélica Morales
BioseparaciónBioseparación
BIOSEPARACIÓN…BIOSEPARACIÓN…
La ingeniería de las ingeniería de las BIOSEPARACIONES BIOSEPARACIONES se refiere al estudio sistemático de los
principios científicos y técnicos utilizado para la purificación a gran
escala de productos biológicos
Operaciones y técnicas Operaciones y técnicas utilizadas para los procesos
de purificación de productos biológicos
Ruptura celular
Separación Sólido-Líquido
Precipitación
Partición en dos fases acuosas
Destilación
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Fundamentos de las técnicas de Fundamentos de las técnicas de BioseparaciónBioseparación
1. Tamaño de partícula →→ Filtración / Separación por membrana
2. Densidad →→ Centrifugación / Sedimentación / Flotación
3. Difusividad →→ Separación por membranas / Extracción
4. Forma →→ Sedimentación / Centrifugación
5. Polaridad →→ Extracción
6. Solubilidad →→ Extracción / Precipitación / Cristalización
7. Cargas electrostáticas →→ Membrana electrostática / Electroforesis
8. Volatilidad →→ Evaporación / Volatilidad
Low-resolution + high-throughput High resolution + low-throughputCell disruption Ultracentrifugation
Precipitation Chromatography
Centrifugation Affinity separation
Liquid-liquid extraction Electrophoresis
Leaching
Filtration
Supercritical fluid extration
Microfiltration
Ultrafiltration
AdsorptionCEBI_E8 Angélica MoralesCEBI_E8 Angélica Morales
Técnicas de BioseparaciónTécnicas de BioseparaciónLas técnicas de bioseparación se dividen principalmenteen dos grandes grupos:
ALTO RENDIMIENTO ALTO RENDIMIENTO (Productividad) / BAJA SELECTIVIDAD BAJA SELECTIVIDAD (Resolución)
BAJO RENDIMIENTO BAJO RENDIMIENTO (Productividad) / ALTA SELECTIVIDAD ALTA SELECTIVIDAD (Resolución)
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Propiedades del Propiedades del mmaterial biológicoaterial biológico
1.1. TamañoTamaño
Muchas propiedades se utilizan para su aplicación en bioseparaciones, las más importantes son:
Partículas esféricas → Diámetro
Macromoléculas (Proteínas, ácidos nucleídosProteínas, ácidos nucleídos)Difícil definición del diámetro, son necesarias dos magnitudes.
Ej.: Par culas elipsoidales → Magnitud mayor (Largo)Magnitud menos (Ancho)
Moléculas lineales como el ADN ADN se miden por su longitud
Formas más complejas como anticuerposanticuerpos requieren otro tipo de medida.
Diámetro de StokesStokes--EinsteinEinstein: : Es el diámetro de una esfera que tiene la misma difusividad de una partícula
rSE = RT 6pDmN
Donde:D = difusividad (m2/s)m = viscosidad (kg / m s)N = número de Avogadro
Alpha amylasae
DNA
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Propiedades del Propiedades del mmaterial biológicoaterial biológico2.2. Peso molecularPeso molecular
Como una medida del tamaño.Detalle de algunos pesos moleculares de sustancias biológicas:
Material Molecular Weight (kg/kg-mole)
Sodium chloride 58.44
Urea 60.07
Glucose 180
Penicillin G 334.42
Insulin 5,800
Lysozyme 14,100
Myoglobulyn 17,000
Human serum albumin 67,000
Immunoglobulin G 155,000
Dextrans 10,000-1000,000
Catalase 250,000
Collagen 345,000
Myosin 493,000
Tobacco mosaic virus 40590,000
Plasmids Few kilo-base pairs
Chromosomal DNA Hundreads of kilo-base pairs
La mayoría de las muestras biológicas presentan una distribución de pesos.
Se estudia en forma estadística Se estudia en forma estadística siguiendo una distribución de siguiendo una distribución de tamaño.tamaño.
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Propiedades del Propiedades del mmaterial biológicoaterial biológico3.3. DifusividadDifusividad
Se refiere al movimiento aleatorio de las moléculas, debido a las colisiones intermoleculares.
Fuerza impulsora Fuerza impulsora entre diferentes concentraciones.
Base de las separaciones por transferencia de masa.
La tendencia a la difusividad está medida por la difusividaddifusividad ó Coeficiente de difusiónCoeficiente de difusión, predicho por la Ley de Fick.Ley de Fick.
Material Diffusitivy in water (m2/s)
Sodium chloride 2.5 x 10 -5
Urea 1.35 x 10 -9
Acetic acid 1.19 x 10 -9
Ethanol 8.4 x 10 -10
Glycerol 7.2 x 10 -10
Lysozyme 10.4 x 10 -11
Human serum albumin 5.94 x 10 -11
Human immunoglobulin G 4.3 x 10 -11
Collagen 0.69 x 10 -11
Tobacco mosaic virus 0.46 x 10 -12
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Propiedades del Propiedades del mmaterial biológicoaterial biológico44.. SedimentaciónSedimentación
Tendencia de las macromoléculas y partículas a depositarse en un medio líquido.
Producido por la gravedad ó campos gravitatorios inducidos.
Base de la decantación, centrifugación y ultracentrifugacióndecantación, centrifugación y ultracentrifugación.
La velocidad de sedimentaciónvelocidad de sedimentación, s, depende de:
Se define el Coeficiente de sedimentación Coeficiente de sedimentación como:
• Las propiedades de la partícula: tamaño y forma.• Las propiedades del solvente: densidad y viscosidad• De la afinidad entre ambos.
s = M (1-nMr)f
Material Sedimentation coefficient
Citochrome c 1.17
Chymotrypsinogen 2.54
Alpha amylase 4.5
Fibrinogen 7.9
Human serum albumin 4.6
Collagen 6.43
Tobacco mosaic virus 198
M = Peso molecular (kg/kg mol)nM = Volumen específico (m3/kg)r = densidad (kg/m3)f = Factor de fricción
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Propiedades del Propiedades del mmaterial biológicoaterial biológico5.5. Presión osmóticaPresión osmótica
Si la solución acuosa diluida de un soluto se separa de una concentración por una membrana semipermeable que solo permite el paso de agua, una diferencia de presión se genera a través de la membrana.
Para soluciones diluidas aplica la ecuación de Van`t HoffVan`t Hoff:
Base de separación por membranamembrana.
p = RTcR = constante universal de los gasesT = Temperatura absoluta (K)c = concentración del soluto
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Propiedades del Propiedades del mmaterial biológicoaterial biológico
Iones tales como Na+ y Cl- llevan cargas electrostáticas en función de su valencia.
Los grupos COOH y NH2 de los aminoácidos pueden ionizarse a COO- y NH3+ además de
otros grupos ionizables en las cadenas laterales.
El grado de ionización grado de ionización de una proteína depende del pH del pKa y pKb de los aminoácidos constituyentes.
Anfóteras: pH bajo → carga +pH alto → carga –
A un dado pH → neutro (Punto isoeléctricoPunto isoeléctrico) → PrecipitaciónPrecipitación
A pH fisiológico, los ácido nucleídos están cargados negativamente.
Base para la separaciones como: Electroforesis, intercambio iónico, cromatografía de Electroforesis, intercambio iónico, cromatografía de adsorción, electrodiálisis y precipitaciónadsorción, electrodiálisis y precipitación.
66.. Cargas electrostáticasCargas electrostáticas
Valor de pH en el que una molécula no tiene carga neta)
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Material Isoelectric point
Ovalbumin 4.7
Conalbumin 7.1
Insulin 5.3
Urease 5.0
Lysosyme 11.0
Pepsin 1.0
Myoglobulin 7.0
Collagen 6.7
Fibrinogen 4.8
Human serum albumin 4.9
Hemoglobine 7.1
Prolactin 5.7
Detalle de algunos puntos isoeléctricos de proteínas:
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Propiedades del Propiedades del mmaterial biológicoaterial biológico
La solubilidad de una sustancia química en el agua, como un solvente estándar, es una de las propiedades fundamentales para los propósitos de caracterización.
Un compuesto polar será más soluble en agua que un compuesto no polar, que será más soluble en solventes orgánicos.
La solubilidad esta influenciada por la T, pH y los aditivos.
Base de las separaciones por extracción, precipitación, cristalización y separación por extracción, precipitación, cristalización y separación por membranamembrana.
7.7. SSolubilidadolubilidad
A tener en cuenta…
Precipitaciones: Precipitaciones: Deben ser reversibles para evitar la desnaturalización.
En el punto isoeléctrico es menor la solubilidad
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Propiedades del Propiedades del mmaterial biológicoaterial biológico
Es una medida de cómo un compuesto se distribuye entre dos fases líquidas.
Igualación de los potenciales químicos del componente en cada fase.
Base de la separación extracción líquido-líquido y cromatografía de partición
Caracterización: el coeficiente de reparto octanol/agua (Ko/w) decide entre hidrófilos e hidrófobos.
Para identificación y cuantificación.
Soluciones de diferentes sustancias absorben luz a diferentes longitudes de onda.
La longitud de onda en la que un compuesto absorbe la máxima cantidad de luz se conoce como su lmax.
Proteínas en agua: absorben luz ultravioleta, aprox. a 280nmADN en agua absorbe aprox. a 260nm
8.8. Coeficiente de repartoCoeficiente de reparto
99.. Absorción de la luzAbsorción de la luz
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GRACIAS!!!