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Manual bIR
VOLUMEN IV: MANUAL DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Autor: Dr. Tomás E. Verdura González
Editora: Dra. Iliana Perdomo López
Manual BIR. VOLUMEN IV: MANUAL DE BIOLOGÍA
MOLECULAR
Autor: Dr. Tomás E. Verdura González
© Iliana Perdomo López (editora). Depósito legal: DLC 614-2012
Reservado todos los derechos. Está prohibido, bajo las sanciones penales y el resarcimiento civil previsto en las leyes, reproducir, registrar o transmitir esta publicación, íntegra o parcialmente por cualquier sistema de recuperación y por cualquier medio, sea mecánico, electrónico, magnético, por fotocopia o por cualquier otro, sin la autorización previa por escrito de la editora.
ÍNDICE BIOLOGÍA MOLECULAR BIR
1.- COMPONENTES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS 1
2.- ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS 13
2.1- ESTRUCTURA PRIMARIA 14
2.2- PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. 14
3.- ESTRUCTURA SECUNDARIA 17
3.1- REGLAS DE CHARGAFF 17
3.2.- MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL ADN 17
3.3.- VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL ADN 20
3.4.- PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ADN 26
3.5.- PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ARN 29
4.- ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DEL ADN Y DEL ARN 31
4.1.- SUPERENROLLAMIENTO DEL ADN (ESTRUCTURA TERCIARIA) 31
4.2.- ESTRUCTURA DE LOS ARNs 35
4.3.- LOS RIBOSOMAS 41
5.- CONDENSACIÓN DEL ADN Y CROMOSOMAS 43
5.1.- PROTEÍNAS COMPONENTES DE LA CROMATINA 43
5.2.- NIVELES DE CONDENSACIÓN DEL ADN NUCLEAR EUCARIÓTICO 45
5.3.- EL CROMOSOMA METAFÁSICO 50
5.4.- DOTACIÓN GENÉTICA EN EUCARIOTAS 56
6.- ORGANIZACIÓN DEL GENOMA DE EUCARIOTAS 57
6.1.- CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL GENOMA. DIFERENCIAS ENTRE PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS
57
6.2.- COMPLEJIDAD DEL GENOMA EUCARIÓTICO 58
6.3.- COMPLEJIDAD DEL GENOMA HUMANO 59
6.4.- ADN DE COPIA ÚNICA, SIMPLE O NO REPETITIVO 60
6.5.- ADN REPETITIVO 60
6.6.- ESTUDIO EXPERIMENTAL DE LA COMPLEJIDAD 66
7.- EL CICLO CELULAR 71
7.1.- CONTROL DEL CICLO CELULAR 72
7.2.- DIVISIÓN CELULAR 84
7.3.- DIFERENCIAS ENTRE MITOSIS Y MEIOSIS 93
7.4.- LA GAMETOGÉNESIS 94
8.- GENÉTICA MENDELIANA Y AMPLIACIÓN DEL MENDELISMO 97
8.1.- LAS LEYES DE MENDEL 97
8.2.- AMPLIACIÓN DEL MENDELISMO 104
8.3.- HERENCIA EN RELACIÓN CON EL SEXO 112
8.4.- COMPROBACIÓN DE LAS PROPORCIONES MENDELIANAS. PRUEBA
CHI-CUADRADO
116
8.5.- POLIGENIA. HERENCIA MULTIFACTORIAL 117
8.6.- LA HERENCIA NO NUCLEAR 118
9.- LIGAMIENTO Y RECOMBINACIÓN 121
9.1.- GENES LIGADOS 121
9.2.- LA RECOMBINACIÓN 124
9.3.- CARTOGRAFÍA EN ORGANISMOS DIPLOIDES 126
9.4.- SEGREGACIÓN Y RECOMBINACIÓN MITÓTICA 132
9.5.- INTERCAMBIOS ENTRE CROMÁTIDAS HERMANAS 132
10.- MECANISMOS DE RECOMBINACIÓN 135
11.- LA REPLICACIÓN DEL ADN 145
11.1.- CARACTERÍSTICAS 145
11.2.- ENZIMOLOGÍA DE LA REPLICACIÓN 148
11.3.- ETAPAS DE LA REPLICACIÓN 152
11.4.- REPLICACIÓN MITOCONDRIAL 159
11.5.- REPLICACIÓN POR CÍRCULOS RODANTES 161
12.- LA TRANSCRIPCIÓN 163
12.1.- CONCEPTO DE GEN 163
12.2.- ENZIMOLOGÍA DE LA TRANSCRIPCIÓN 165
12.3.- TRANSCRIPCIÓN DEL GENOMA MITOCONDRIAL 175
12.4.- INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCIÓN 175
13.- REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN EUCARIOTAS: CONTROL
PRETRANSCRIPCIONAL Y TRANSCRIPCIONAL
177
13.1.- CONTROL PRETRANSCRIPCIONAL 177
13.2.- CONTROL TRANSCRIPCIONAL 184
14.- CONTROL POSTRANSCRIPCIONAL O PROCESAMIENTO DEL ARN 191
14.1.- PROCESAMIENTO DEL ARN MENSAJERO 193
14.2.- PROCESAMIENTO DE LOS ARNs RIBOSÓMICOS Y TRANSFERENTES 200
14.3.- MADURACIÓN DEL ARN MITOCONDRIAL 200
14.4.- REGULACIÓN POSTRANSCRIPCIONAL Y PRETRADUCCIONAL 201
15.- EL CÓDIGO GENÉTICO 203
15.1.- CARACTERÍSTICAS DEL CÓDIGO GENÉTICO 203
15.2.- DESCIFRAMIENTO DEL CÓDIGO GENÉTICO 205
16.- TRADUCCIÓN O SÍNTESIS DE PROTEÍNAS 207
16.1.- FASE PREVIA: ACTIVACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS 208
16.2.- INICIACIÓN 209
16.3.- ELONGACIÓN 212
16.4.- TERMINACIÓN 214
16.5.- ENÉRGETICA 215
16.6.- INHIBIDORES DE LA TRADUCCIÓN 216
16.7.- REGULACIÓN TRADUCCIONAL 218
17.- MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES 219
17.1.- TRÁFICO O DESTINO DE LAS PROTEÍNAS 219
17.2.- MADURACIÓN DEL POLIPÉPTIDO NACIENTE 221
17.3.- DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS 230
18.- MUTACIÓN 233
18.1.- MUTACIONES GÉNICAS 233
18.2.- MECANISMOS DE ORIGEN DE LAS MUTACIONES GÉNICAS 236
18.3.- MUTACIONES CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES 240
18.4.- MUTACIONES CROMOSÓMICAS NUMÉRICAS 240
19.- REPARACIÓN DEL ADN 241
19.1.- SISTEMAS PREVENTIVOS 241
19.2.- REVERSIÓN DIRECTA DE LA LESIÓN 241
19.3.- REPARACIÓN POR ESCISIÓN 242
19.4.- REPARACIÓN POSREPLICACIÓN 245
19.5.- REPARACIÓN GO 248
20.- ENFERMEDADES GENÉTICAS. ENFERMEDADES MONOGÉNICAS Y
MULTIFACTORIALES
249
20.1.- CLASIFICACIÓN DE LAS ENFERMEDADES GENÉTICAS 249
20.2.- ENFERMEDADES MONOGÉNICAS NUCLEARES 251
20.3.- ENFERMEDADES MITOCONDRIALES 260
20.4.- ENFERMEDADES POLIGÉNICAS, MULTIFACTORIALES, COMPLEJAS
O MIXTAS
261
20.5.- ENFERMEDADES COMPLEJAS: ENFERMEDAD DE ALZHEIMER 263
21.- CROMOSOMOPATÍAS O ENFERMEDADES CITOGENÉTICAS 265
21.1.- CARIOTIPO HUMANO Y SISTEMA INTERNACIONAL DE
NOMENCLATURA
265
21.2.- CROMOSOMOPATÍAS ESTRUCTURALES 267
21.3.- CROMOSOMOPATÍAS NUMÉRICAS 278
22.- BASES MOLECULARES DEL CÁNCER 285
22.1.- GENES RESPONSABLES DEL CÁNCER 285
22.2.- RUTAS REGULADORAS DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR 288
23.- MÉTODOS DE HIBRIDACIÓN 293
23.1.- HIBRIDACIÓN EN FASE LÍQUIDA 294
23.2.- HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO 294
23.3.- HIBRIDACIÓN IN SITU 296
23.4.- MICROARRAY O MICROCHIP DE ADN 300
23.5.- SINTESIS DE ADNc 303
23.6.- CGH (HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA) 303
23.7.- TRANSFERENCIA WESTERN 304
24.- CLONACIÓN ACELULAR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) 305
24.1.- OBJETIVO Y APLICACIONES DE LA PCR 305
24.2.- REQUERIMIENTOS 306
24.3.- ETAPAS DEL PROCESO 306
24.4.- CARACTERÍSTICAS DEL PROCESO 308
24.5.- VARIANTES DEL MÉTODO 309
25.- TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 313
25.1.- NUCLEASAS 313
25.2.- ENZIMAS DE RESTRICCIÓN 313
25.3.- CLONACIÓN CELULAR DE MOLÉCULAS DE ADN 317
25.4.- GENOTECAS 326
26.- MAPA GENÉTICO Y FÍSICO DEL GENOMA 329
26.1.- MAPA GENÉTICO O DE LIGAMIENTO 329
26.2.- MAPA FÍSICO 329
26.3.- SECUENCIACIÓN 334
27.- LOS GENES EN LAS POBLACIONES 341
27.1.- EQUILIBRIO DE HARDY-WEINBERG 341
27.2.- MODIFICACIÓN DE LAS FRECUENCIAS GÉNICAS Y GENOTÍPICAS 343
27.3.- CÁLCULO DEL COEFICIENTE DE CONSANGUINIDAD INDIVIDUAL 344
BIBLIOGRAFÍA 345
Biología Molecular InspiracleBIR/2014
1
1. COMPONENTES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. (2011) 212; (2010)
167, 219; (2009) 260; (2008) 174, 215, 216, 237; (2007) 185, 186; (2005) 241; (2003) 188.
Los ácidos nucleicos son macromoléculas catenarias compuestas exclusivamente por C,
H, O, N y P y constituidas por monómeros denominados nucleótidos. Existen dos tipos de
ácidos nucleicos, ADN y ARN, formados cada uno por un tipo de nucleótido:
- ADN (ácido desoxirribonucleico) por desoxirribonucleótidos.
- ARN (ácido ribonucleico) por ribonucleótidos.
Independientemente de su tipo, cada nucleótido consta de tres componentes:
1. Una pentosa.
Aparece en su forma más estable, la configuración β: la β-D-ribofuranosa en el ARN y la
β-D-2-desoxirribofuranosa en el ADN.
Fuente: Figura apartado 2.2 (pag 11) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética.,
Barcelona, 1ª ed., 2008”.
2. Una base nitrogenada heterocíclica.
Moléculas con más de un átomo de nitrógeno. Pertenecen a dos familias distintas:
- pirimidínicas: derivadas de la pirimidina, formadas sólo por un anillo. Son tres: citosina (C),
timina (T) y uracilo (U).
- púricas: formadas por dos anillos condensados. Son dos, adenina (A) y guanina (G).
MELVIN MANUEL MORALES AGUILERA
InspiracleBIR/2014 Biología Molecular
2
Fuente: Figura apartado 2.31 (pag 12) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética.,
Barcelona, 1ª ed., 2008”.
Las bases nitrogenadas poseen las siguientes propiedades:
a) Hidrofobicidad. La naturaleza aromática de los anillos hace que las bases tengan un
marcado carácter apolar, sean hidrofóbicas y poco solubles en agua a pH celular. A pH
ácido o alcalino adquieren carga y se hacen más solubles en agua.
b) Existencia de dipolos. Salvo la adenina, todas las bases poseen átomos de nitrógeno y
oxígeno, lo que determina que se formen entre ellas enlaces polares como los puentes de
hidrógeno.
c) Disposición coplanar de los enlaces de cada anillo.
d) Tautomería. Consiste en el desplazamiento de un H desde un átomo de N o de O nuclear
hacia otro extranuclear y viceversa. Hay dos tipos de tautomerías:
d.1. Tautomería ceto-enol. El grupo ceto forma parte de un enlace amida cíclica o lactama.
Al migrar el átomo de H desde el N nuclear al O del grupo ceto, se convierte en el tautómero
lactima (enol). Esta tautomería afecta a T, G, C y U.
MELVIN MANUEL MORALES AGUILERA
InspiracleBIR/2014 Biología Molecular
20
g) Superficie de la molécula. Todo a lo largo se forman dos surcos, uno mayor y otro menor,
que van girando de forma helicoidal y dejan espacio suficiente para que moléculas externas
puedan interaccionar con las bases.
h) Idoneidad para la replicación. Este modelo permite explicar de una forma muy simple la
duplicación del ADN y la reparación de mutaciones.
3.3. VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL ADN
La molécula de ADN es flexible y dinámica. Gracias a la capacidad de rotación
alrededor de los enlaces de los nucleótidos, el ADN puede adoptar in vivo diversas formas
distintas de la forma B, como son:
- conformaciones A y Z. Descubiertas por difracción de rayos X.
- variaciones conformacionales locales en torno a la forma B.
- interacción de regiones específicas del ADN con estructuras características de
algunas proteínas.
3.3.1. Conformaciones A y Z.
Forma A del ADN
No se encuentra en condiciones fisiológicas, sino en disoluciones muy concentradas
con una humedad relativa por debajo del 75%. Es la forma que adopta el ARN cuando
posee regiones de doble hebra, así como los híbridos ADN-ARN.
Es más ancha (mayor diámetro), más corta para un mismo número de nucleótidos
(menor distancia entre pares de bases) y tiene mayor número de pares de bases por vuelta.
Las bases se disponen inclinadas con relación al eje y más separadas de él. El surco mayor
es más estrecho y muy profundo y el menor casi no se aprecia por ser ancho y poco
profundo.
Comparación entre los tres tipos estructurales básicos de DNA en doble hebra
TIPO DE HÉLICE
A (deshidratada) B (Watson-Crick) Z (Rich-Dickerson)
Sentido de giro de la hélice Dextrógiro Dextrógiro Levógiro
Forma y tamaño La más ancha y corta Intermedia La más estrecha y larga
Diámetro de la hélice 2,55 nm (25,5 Å) 2,37 nm (23,7 Å) 1,84 nm (18,4 Å)
Distancia entre bases (d)1 0,23 nm (2,3 Å) 0,34 nm (23,4 Å) 0,38 nm (3,8 Å)
Pares de bases por vuelta (n) 11 10,4 12
Rotación por cada base (360° ln)2 + 32,7° + 34,6° -30°
Longitud vuelta de hélice (n/d)3 2,53 nm (25,3 Å) 3,54 nm (35,4 Å) 4,56 nm (45,6 Å)
Inclinación del plano de los pares
de bases4
19°
(gran inclinación)
1,2° (casi perpendicular al
eje de la hélice)
9°
(ligera inclinación)
Surco mayor o grande Estrecho, profundo Ancho, profundidad media Plano, sin profundidad
Surco menor o pequeño Amplio, no profundo Estrecho, profundidad
media
Estrecho, profundo
Enlace N-glicosídico Anti Anti Anti (C, T) y Sin (G)
Notas: 1 Distancia entre pares de bases, medida a lo largo del eje de la hélice.
2 Rotación por cada par de bases, o giro respecto al par anterior (+ dextrógiro, - levógiro).
3 Longitud de la vuelta de hélice, medida a lo largo del eje; coloquialmente “paso de rosca” o paso de hélice”.
4 Inclinación respecto al plano perpendicular al eje de la hélice.
Fuente: Tabla apartado 6.1 (pag 52) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética., Barcelona, 1ª ed., 2008”.
MELVIN MANUEL MORALES AGUILERA
Biología Molecular InspiracleBIR/2014
21
Fuente: Figura apartado 6.1.1 (pag 53) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería
Genética., Barcelona, 1ª ed., 2008”.
Fuente: Figura apartado 6.1.1 (pag 53) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería
Genética., Barcelona, 1ª ed., 2008”.
MELVIN MANUEL MORALES AGUILERA
InspiracleBIR/2014 Biología Molecular
42
Fuente: Figura apartado 7.3.2.2 (pag 80) del libro “Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería
Genética., Barcelona, 1ª ed., 2008”.
MELVIN MANUEL MORALES AGUILERA
InspiracleBIR/2014 Biología Molecular
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heterocromáticas de los cromosomas 1, 9 y 16 y en los satélites de los acrocéntricos, que
dan una tinción variable.
Las bandas oscuras del bandeado G y las fluorescentes o brillantes del bandeado Q
representan regiones cuyo ADN es rico en el par A-T. De manera que su coloración es
proporcional a la concentración de A + T. Esto ha sido corroborado por los resultados
obtenidos con sustancias estrictamente específicas por su afinidad por pares A-T, como la
daunomicina y el “Hoescht 33258”. Las sustancias que se unen preferentemente al par G-C,
como la cromomicina A3, dan un patrón de bandeado fluorescente inverso al bandeado Q y
al G.
Además de ser ricas en A-T, las bandas G se caracterizan porque su ADN se replica
en la segunda mitad (tardía) del período S del ciclo celular; aunque no tan tardíamente como
las regiones de heterocromatina constitutiva, como los centrómeros. También se
corresponden con los cromómeros o grumos de cromatina de los cromosomas meióticos.
Por último se considera que contienen relativamente pocos genes en comparación con las
bandas claras (no coloreadas) y que las proteínas que contienen son diferentes de las que
integran las bandas claras.
Se ha propuesto que el patrón de bandas G o Q respondería a un empaquetamiento
diferencial de las regiones cromosómicas axiales. Estas regiones constituyen la base de los
lazos de cromatina y se unen a proteínas no histónicas del “armazón cromosómico” rico en
la enzima topoisomerasa II. Son regiones pobres en genes, sólo contienen el 20% del total
de ellos y funcionalmente tienden a la represión génica.
Bandeo R: Se desnaturaliza con calor el ADN rico en AT y luego se tiñe con Giemsa.
Aparecen bandas oscuras, bandas R, que coinciden con las bandas G y Q claras. Del patrón
reverso deriva el nombre. Se consigue el mismo patrón empleando olivomicina, un colorante
con afinidad por los pares GC. Con cromomicina A3 las bandas R son fluorescentes. Las
bandas R contienen ADN rico en GC (50 -60%) poco condensado y activo
transcripcionalmente.
Bandeo T: Identifica un subconjunto de bandas R concentradas en los telómeros, las
de tinción más intensa, que se visualizan aplicando un tratamiento térmico severo antes de
teñir los cromosomas con Giemsa o con una combinación de tinciones y fluorocromos.
Para situaciones particulares se emplea:
- Bandeo C: tiñe sólo la heterocromatina constitutiva, compuesta por ADN de tipo
satélite, muy repetitivo. Sólo tiñe las regiones centroméricas y los bloques de
heterocromatina C de los cromosomas 1, 9 y 16 y del brazo largo del cromosoma Y. El
material cromosómico se desnaturaliza y se extrae con álcali y se incuba en solución salina
para teñirlo después con Giemsa u otros colorantes. Como las regiones de bandas C son
MELVIN MANUEL MORALES AGUILERA
Biología Molecular InspiracleBIR/2014
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altamente polimórficas en la población humana, este bandeado está indicado para la
búsqueda de polimorfismos de heterocromatina.
Bandas cromosómicas del cariotipo de acuerdo con el sistema internacional
- Tinción N o NOR: para la región organizadora del nucleolo que contiene los genes
del ARNr 18S y ARNr 28S. Tiñe las constricciones secundarias en los cromosomas 13-15 y
21-22. El patrón es totalmente diferente al clásico (Q y G) puesto que se basa en la
presencia de proteínas argentafines en esas regiones, que se tiñen con nitrato de plata.
- Bandeo de profase y prometafase o de alta resolución: sobre cromosomas
detenidos en una etapa temprana de la mitosis en un estado relativamente descondensado
en el que su mayor longitud permite apreciar más detalles.
- Hibridación in situ con fluorescencia (FISH): emplea sondas de ADN clonado
específicas para regiones cromosómicas o para cromosomas individuales que permiten
identificar reordenamientos particulares o la existencia de un número anormal de
cromosomas. Es la técnica de mayor potencialidad para el análisis cromosómico.
MELVIN MANUEL MORALES AGUILERA
Biología Molecular InspiracleBIR/2014
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pierdan su forma habitual y adopten una forma esférica. La actina y miosina se dispersan
por toda la célula y los microtúbulos se fragmentan y reorganizan para formar el huso
acromático.
Los cromosomas profásicos aparecen como delicados filamentos extendidos o
enrollados dentro del núcleo. Cada uno de ellos está compuesto por dos filamentos
denominados cromátidas, que se encuentran estrechamente asociados todo a lo largo. A
medida que la profase progresa, las cromátidas van acortándose y engrosándose. Esto se
debe a una espiralización de la cadena de nucleosomas, produciéndose una condensación
de las histonas, que pierden agua y sufren una serie de cambios como acetilación y
fosforilación (hasta 6 fosfatos por molécula de histona H1) por las proteínas quinasas
mitóticas, y también a cambios en la concentración iónica (Ca++, Mg++) del citoplasma. Un
cromosoma de 10 µm de largo y 1 µm de ancho tiene 80.000 µm de longitud de ADN, lo que
significa que el empaquetamiento es de 8.000 veces.
Hacia el final de la profase, los cromosomas tienden a acercarse al borde del núcleo.
En este momento el acortamiento y engrosamiento de la cromatina es máximo y los
cromosomas alcanzaron su configuración completa.
El nucleolo va disgregándose en cuerpos pequeños progresivamente.
Tiene lugar la formación del huso acromático. Hacia la mitad de G1 los dos centríolos
comienzan a separarse, iniciando la duplicación a finales de G1 o principios de S y
finalizándola a finales de G2, dando lugar a una pareja doble de centríolos. Rodeando los
centríolos hay un áster, una estrella de microtúbulos cortos y una zona clara periférica,
donde no penetran los microtúbulos del áster, que se llama centrosfera. A microscopio
electrónico se observa un material denso del que salen los microtúbulos. Esta matriz
pericentriolar es el verdadero centro organizador de microtúbulos. Uniendo ambas parejas
de centríolos hay un haz de microtúbulos, denominados microtúbulos polares, que va
alargándose a medida que las parejas de centríolos comienzan a separarse. Uno de los
pares de centríolos permanece en su lugar, mientras que el otro par, describe un trayecto
semicircular de 180º alrededor del núcleo para alcanzar el polo opuesto. Al final, cada pareja
de centríolos, con su áster, queda en un polo de la célula.
Los microtúbulos están en constante renovación, perdiendo tubulinas por sus
extremos – en los polos e incorporando tubulinas por sus extremos + en la zona ecuatorial.
Los haces se solapan en la zona ecuatorial, donde se interconectan con proteínas motoras
del tipo quinesinas, que contribuyen a estabilizar su posición.
Las mitosis cuyo aparato acromático contiene centríolos, ásteres y husos, se
denominan astrales o anfiastrales.
MELVIN MANUEL MORALES AGUILERA
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10. MECANISMOS DE RECOMBINACIÓN. (2013) 95.
La fuente primaria de variabilidad es la mutación, sin embargo, en los organismos
con reproducción sexual la producción de individuos con nuevas combinaciones de alelos a
partir de los ya existentes en la población, es el mecanismo más importante de producción
de variabilidad genética. Existen diferentes tipos de recombinación:
- recombinación homóloga general.
- recombinación específica de sitio.
- transposición.
En eucariotas la recombinación genética se produce por la distribución independiente
de los cromosomas durante la meiosis y por la existencia de un intercambio físico de
segmentos cromosómicos entre dos cromátidas no hermanas de dos cromosomas
homólogos, a través del entrecruzamiento que tiene lugar en la profase I de la meiosis. En
procariotas la recombinación genética se lleva a cabo mediante fenómenos parasexuales:
conjugación, transformación, transducción y sexducción.
MECANISMOS MOLECULARES DE LA RECOMBINACIÓN GENERAL HOMÓLOGA
1. MODELO DE HOLLIDAY
El primer modelo aceptado fue propuesto por Holliday en 1964 para procariotas.
Consiste en un proceso de ruptura de dos moléculas de ADN homólogas en el mismo lugar
de una sola cadena en cada doble hélice, seguido de un intercambio de fragmentos entre
ellas y una reconstitución de dos moléculas que contienen partes intercambiadas. Los
pasos básicos son los siguientes:
- Apareamiento de los cromosomas homólogos mediado por el complejo sinaptonémico. Las
dobles hélices implicadas en el entrecruzamiento rotan de manera que queden enfrentadas
con la misma polaridad.
- Producción de cortes en las dos cadenas de la misma polaridad y desenrollamiento de la
doble hélice. Este paso lo lleva a cabo el complejo RecBCD con actividad nucleasa y
helicasa, que genera cadenas sencillas. La actividad nucleasa reconoce el sitio chi, una
secuencia constituida por 8 pb (5´-GCTGGTGG-3´) y que se encuentra en multitud de sitios
del genoma. La cadena sencilla originada, una vez estabilizada por la proteína Ssb
desencadena el proceso.
- Los extremos rotos invaden la doble hélice contraria: una hélice sencilla desplaza a la
cadena de su misma polaridad y la otra hace lo mismo. Las cadenas desplazadas se unen a
RecA, que reconoce el ADN de cadena sencilla y promueve la invasión de esta cadena
hacia una doble hélice que esté en su proximidad. Si encuentra homología desplaza a la
cadena de igual polaridad. El que se mueve es siempre el extremo 3´-OH. La cadena
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InspiracleBIR/2014 Biología Molecular
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desplazada formaría un bucle D. Las cadenas invasoras buscan la posibilidad de
apareamiento y cuando encuentran la zona con bases complementarias se fijan
estableciendo puentes de hidrógeno entre ellas. Finalmente los huecos que se han originado
son sellados mediante una ligasa. Este es el intermediario de Holliday: dos dobles hélices
entrecruzadas por una de sus cadenas.
- Migración: el intermediario de Holliday crea un cruce entre las cadenas que puede moverse
a lo largo del heterodúplex (doble hélice híbrida). Este movimiento se origina desde el punto
en que se produjo la invasión y, en su movimiento, incrementa la región de ADN
heterodúplex. Las proteínas RuvA y RuvB son responsables de la migración. RuvA es un
tetrámero que reconoce específicamente el punto de entrecruzamiento y, entonces, dos
moléculas de RuvB la flanquean, constituyendo un complejo hexamérico. El complejo se
desplaza abriendo la hélice en dirección 5´ y cerrándola por detrás (3´).
- Resolución del intermediario de Holliday: Tiene lugar por un corte y posterior unión entre
las dos cadenas originales o de las cadenas intercambiadas. En el primer caso, el corte no
da lugar a cromátidas recombinantes entre los marcadores flanqueantes A y B. Sin
embargo, en el segundo caso, el corte origina recombinación, cambiando las relaciones de
ligamiento de los marcadores (aB/Ab). Los cortes son realizados por RuvC, una
endonucleasa que realiza dos cortes simétricos en cadenas que no se crucen. Parece que
también podrían intervenir en el corte RecG y Rus.
MELVIN MANUEL MORALES AGUILERA
InspiracleBIR/2014 Biología Molecular
142
TRANSPOSICIÓN
Descubiertos por McClintock, los elementos genéticos transponibles son elementos
genéticos capaces de moverse de una posición a otra del mismo cromosoma o a otros
cromosomas y se han detectado por las alteraciones que producen en los genes a los que
se mueven. La entrada y salida del elemento se realiza por recombinación, pero no hay
homología de secuencias ni sitios específicos, es una recombinación al azar. Hay diferentes
tipos en los distintos seres vivos.
Elementos genéticos transponibles bacterianos
1. Secuencias de inserción (IS): Son los elementos transponibles más simples. Su tamaño
va de 768 pb a más de 5000.Contienen sólo los genes necesarios para la movilización: el
gen de la transposasa (enzima necesaria para la transposición) rodeado de repeticiones
invertidas. Cuando se insertan provocan la repetición directa de una de una secuencia diana
corta. La transposición de una secuencia de inserción puede provocar mutaciones de
inserción. También pueden producirse deleciones e inversiones por entrecruzamiento entre
IS repetidas en el genoma.
MELVIN MANUEL MORALES AGUILERA
Biología Molecular InspiracleBIR/2014
143
2.Transposones: Son elementos transponibles más complejos. Contienen los genes
necesarios para la transposición y generalmente otros genes que confieren resistencia a
determinadas drogas. Algunos fagos se comportan como transposones, por ejemplo el fago
Mu. Hay dos tipos:
· Transposones compuestos: Flanqueados por dos elementos IS del mismo tipo. Ejemplos:
Tn9, Tn10
· Transposones no compuestos: No terminan en elementos IS pero sí están flanqueados
por repeticiones terminales invertidas y también dan lugar a la duplicación directa de la
secuencia diana. Ejemplo: Tn3, contiene tres genes: tnpA, gen de la transposasa, tnpB, gen
de la resolvasa, y bla, gen de la b-lactamasa, que confiere resistencia a ampicilina.
Mecanismos de transposición
a) Transposición replicativa: el elemento se duplica, una copia permanece en la posición
original y otra se mueve a otro lugar. Ejemplo: Tn3, modelo del cointegrado.
b) Transposición conservativa (no replicativa): el elemento cambia de posición sin dejar una
copia en la posición original
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150
ADN polimerasa I ADN polimerasa II ADN polimerasa III
Actividades
enzimáticas
1. Polimerasa 5´→3´.
Elongación.
2. Exonucleasa 3´→5´.
Correctora de pruebas.
3. Exonucleasa 5´→3´.
Eliminación del cebador y
traslación de la mella.
1. Polimerasa 5´→3´.
Elongación.
2. Exonucleasa 3´→5´.
Correctora de pruebas.
1. Polimerasa 5´→3´.
Elongación.
2. Exonucleasa 3´→5´.
Correctora de
pruebas.
Función en
la célula
Eliminación del Cebador y
Extensión de los fragmentos
de Okazaki.
Reparación. Replicación (síntesis
continuada de las dos
hebras).
Velocidad
de
replicación
-16-20 nucleótidos/segundo.
- Procesividad baja: 3-200
nucleótidos añadidos antes
de su disociación.
- 2-7 nucleótidos/seg.
- Procesividad media: ≥
10.000 nucleótidos
añadidos.
- 250 -1000 nucl/seg.
- Procesividad muy alta:
≥ 5 ∙ 105 nucleótidos
añadidos.
Las ADN polimerasas IV y V intervienen en la ruta de reparación “síntesis de
ADN propensa al error a través de la lesión” (Respuesta SOS). Carecen de actividad 3´
exonucleasa correctora por lo que reducen la fidelidad de la replicación a un error cada 1000
nucleótidos.
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151
Formación y composición de la holoenzima ADNpol III
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288
periférico) y leucemia mieloide.
NF-2 Relacionado con meningioma y ependinoma (encéfalo) y
schwanoma (nervios periféricos)
Genes de proteínas nucleares
MTS1 Codifica para la proteína p16, uno de los frenos del sistema de
control del ciclo celular. Relacionada con muchos cánceres.
RB Codifica para la proteína RB (retinoblastoma). Esta proteína es uno
de los principales frenos en el ciclo celular.
p53 Codifica para la proteína p53, la cual detiene la división celular e
induce a las células anormales al suicidio (apoptosis). Relacionado
con la mayoría de los cánceres .
WT1 Relacionado con el Tumor de Wilms del riñón.
Genes que codifican proteínas de ubicación aún no determinada
BRCA1 Relacionado en cánceres de mama y ovario.
BRCA2 Relacionado con cáncer de mama.
VHL Relacionado con cáncer de células renales.
22.2. RUTAS REGULADORAS DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR.
Las tres rutas que regulan la proliferación celular y cuya alteración conduce al
cáncer son:
1. La transducción de señales extracelulares al interior celular hasta conectar con
el ciclo celular.
2. La regulación del ciclo celular.
3. La apoptosis o muerte celular programada.
22.2.1. La transducción de la señal extracelular al interior celular.
El mecanismo de activación en el que interviene la proteína Ras, causante de
numerosos procesos cancerosos, es un paso esencial en la transducción de señales
producidas por muchos factores de crecimiento.
1.- La molécula señal actúa como ligando al interaccionar, con gran afinidad y de modo
reversible, con el dominio extracelular de una proteína receptora específica, cuyo dominio
transmembrana hidrofóbico está insertado en la bicapa lipídica de la membrana. El
número de receptores de un tipo concreto en cada célula es muy variable, desde cientos
a millones. En el caso de la ruta que activa a Ras, la señal procede de diversos
receptores: para el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de
crecimiento epidérmico (EGF), la insulina, etc.
2- Al unirse el ligando al receptor, éste se estimula.En el caso del receptor de PDGF,
forma un dímero y se activa una actividad proteína quinasa intrínseca, concretamente del
tipo tirosina quinasa, fosforilando con gasto de ATP, el dominio intracelular propio o bien
otras proteínas.
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289
3- La “1ª cascada de transmisión de la señal “, puede realizarse por varias vías en las que,
se producen modificaciones en la conformación de una proteína que a su vez permiten la
interacción con otras proteínas “adaptadoras” o su fosforilación.
4- La propagación de la señal continúa mediante la activación de la proteína Ras, una
proteína G monomérica (también llamada p21Ras, por su masa de 21 kDa). Las proteínas
G actúan en numerosos procesos como “interruptores moleculares”, al poder pasar de su
forma inactiva, unida a GDP, al estado activo , unida a GTP. El complejo activo Ras :GTP
trasmite la señal mediante su interacción con otras proteína quinasas citoplasmáticas
(proteínas “efectoras”), activándolas, con lo que comienza una “2ª cascada de transmisión
de la señal”. La consiguiente hidrólisis del GTP por Ras devuelve a ésta al estado
inactivo, interrumpiendo así la transmisión de señal hasta que haya un nuevo estímulo.
Existen otras proteínas relacionadas que forman la familia Ras e intervienen en varios
procesos celulares ( como Rab, Rho y Arf).
Una alteración frecuente en una proporción elevada de tumores (especialmente de
colon y páncreas ) es la mutación del gen ras, dando lugar a una proteína Ras incapaz
de hidrolizar GTP, y que permanece siempre en su forma activa Ras: GTP,
desencadenando una señal de proliferación continua.
5- Cada proteína efectora activada por Ras produce a continuación cambios de
conformación o fosforilaciones en sucesivas proteínas componentes de la “ 2ª cascada
de señales”, entre las que cabe citar Raf, MEK y MAP quinasas.
6- Finalmente, algunas de estas proteína quinasas de la 2ª cascada actúan sobre un
factor de transcripción, al que fosforilan. Como consecuencia, éste cambia su
conformación, lo que le permite unirse al DNA y activar o reprimir la transcripción de
genes específicos que codifican las proteínas que regulan el ciclo celular y la apoptosis.
22.2.2. La regulación del ciclo celular.
El gen supresor del retinoblastoma (Rb)
El descubrimiento de una predisposición hereditaria para sufrir retinoblastoma, un
tipo infrecuente de cáncer que afecta a los ojos, permitió identificar un gen (denominado Rb
) cuyo producto génico, la proteína del retinoblastoma ( Rb, pRb), se encuentra presente y
actúa en el control de todo tipo de células normales.
La proteína Rb experimenta cambios de fosforilación a lo largo del ciclo celular,
que modulan su actividad como freno en el punto de control G1/S. Esta actividad se debe
a la asociación de Rb no fosforilada con una gran cantidad de otras proteínas necesarias
para la proliferación celular, en especial factores de transcripción inducibles como Myc y
E2F.
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314
Poseen una gran especificidad de reconocimiento de una secuencia corta de ADN
dúplex, e hidrolizan un enlace fosfodiéster en cada hebra en secuencias concretas llamadas
sitios de reconocimiento o de restricción. Los fragmentos de ADN originados son útiles
para realizar la clonación, elaborar mapas físicos de restricción, detectar polimorfismos. . .
Hay 3 familias de enzimas de restricción:
Tipo I y Tipo III
- Tienen actividad endonucleasa (cortan) y metilasa, en distintas subunidades de una
misma proteína.
- Necesitan como coenzimas o cosustratos: ATP para moverse a través de la molécula de
DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte; Mg2+ y S-adenosilmetionina.
- Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento:
Las tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, a unos 1000 pb upstream
o downstream y corta las dos hebras en puntos cercanos entre sí y poco específicos.
Las tipo III cortan las dos hebras en puntos distales entre sí 2 ó 3 nt, situados a 24-
26 pb del sitio de reconocimiento.
- El punto de metilación está dentro de la secuencia de reconocimiento. En el tipo I en
ambas hebras y en el tipo II es una adenina presente sólo en una hebra.
- Estructura proteica: en el tipo I hay 3 subunidades, la S de reconocimiento, la R de
restricción y la M de mutilación. En el tipo II hay 2 subunidades: MS de reconocimiento y
mutilación y la R de restricción.
- El sitio de reconocimiento no es palindrómico. En el tipo I consta de 2 partes separadas (ej.
TGA(N)8TGCT).
Tipo II
- Sólo tienen actividad endonucleasa.
- Es una sola subunidad, aunque actúa como homodímero.
- Sólo requieren Mg++ como cofactor.
- El sitio de reconocimiento es palindrómico, de 4-8 pb. Los más frecuentes tienen 6 pb.
- Corta las 2 hebras en puntos equivalentes, muy específicos, dentro de la secuencia de
reconocimiento.
- El punto de metilación es una adenina o un citosina muy específica dentro de la
secuencia de reconocimiento, en ambas hebras.
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25.2.2. Papel biológico del sistema metilación-restricción
Los sistemas de restricción-modificación o metilación-restricción son un
mecanismo de defensa bacteriano frente a fagos.
El ADN propio de la bacteria es metilado de una forma característica específica de
cada especie en secuencias reconocidas por la restrictasa y por la metilasa. La metilación
de las bases impide la unión de la enzima de restricción, con lo que el ADN propio no es
hidrolizado. Si en la célula entra ADN de otro organismo, no metilado o con un patrón de
mutilación distinto, es degradado por la nucleasa.
Si está metilada una sola hebra de ADN, el sitio no es reconocido por la enzima de
restricción, pero sí por la metilasa, que añade el grupo metilo a la otra hebra. Esto ocurre al
final de la replicación. La metilación afecta principalmente a citosinas y adeninas de la
secuencia reconocida y las metilasas utilizan como donador del grupo metilo el compuesto
S-adenosilmetionina.
25.2.3. Enzimas de restricción de tipo II.
Son las empleadas en ingeniería genética como tijeras para cortar el ADN. El sitio de
restricción es sitio de reconocimiento y de hidrólisis. El enlace hidrolizado es siempre el 3´-P
(tipo a) y no necesitan ATP.
Algunas enzimas cortan ambas hebras justo en el centro de simetría del palíndromo
y resultan dos fragmentos de ADN dúplex cuyos extremos no contienen bases
desapareadas. Se denominan extremos romos. Ejemplo de estas endonucleas es Hae III.
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342
Una vez calculadas las frecuencias alélicas, se comprobará mediante una prueba de
X2 con 1 grado de libertad, si el número de individuos esperado de acuerdo con H-W y el
número observado difieren o no significativamente.
Si no hay diferencias significativas será un indicio de que la población está en
equilibrio.
2º- Genes autosómicos con dominancia
Si no se distinguen los homocigotos dominantes (AA) de los heterocigotos (Aa), no
se pueden calcular directamente las frecuencias alélicas. Una forma indirecta de estimarlas
es suponer que la población está en equilibrio (el número de individuos observado y
esperado coinciden) y como la frecuencia de homocigotos recesivos (aa) es q2, la frecuencia
del alelo recesivo será
q = √ frecuencia de aa
3º - Genes ligados al X (o al Z) codominantes o con herencia intermedia
Hay que tener en cuenta la estructura genotípica de la población;
La frecuencia de los fenotipos de los machos da directamente la frecuencia de los
alelos. Si la población está en equilibrio, no se detectarán diferencias significativas en las
hembras entre el número observado y el esperado, teniendo en cuenta las frecuencias
alélicas de los machos.
Para una estima conjunta de las fecuencias alélicas hay que tener en cuenta que en
las hembras se encuentran las 2/3 partes de los alelos de un gen dado y el cálculo se hace
según la fórmula:
A2 = q = (2Q + H + S) / 3 Siendo Q = frecuencia de A2A2
H = frecuencia de A1A2
S = frecuencia de A2Y
Genotipo Nº esperado por H-W Nº observado
A1A1 p2 x total Número de individuos A1A1
A1A2 2pq x total Número de individuos A1A2
A2A2 q2 x total Número de individuos A2A2
Hembras Machos
A1A1, A1A2 A2A2 A1 o A2
p2 , 2pq , q2 p o q
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27.2. MODIFICACIÓN DE LAS FRECUENCIAS GÉNICAS Y GENOTÍPICAS.
Las excepciones al modelo de H-W permiten averiguar las causas que modifican el
equilibrio en las poblaciones reales y que dan lugar a cambios en las frecuencias.
a. Un alelo presente en la población desaparece y se convierte en otro por mutación, con el
consiguiente cambio de las frecuencias alélicas. Puede establecerse el equilibrio:
u v
A1 (p) → A2 (q) A1 (p) ← A2 (q)
en donde u es la tasa de mutación directa de A1 a A2 , y v,la tasa de mutación retrógrada de
A2 a A1. El equilibrio se alcanzará cuando el número de alelos A1 que pasa a A2 (p x u) sea
igual al número de alelos A2 que pasa a A1 (q x v). Sustituyendo q = (1 – p) o p = (1 – q),
tenemos:
p = v / (u+v) y q = u / (u+v)
Debido a que las tasas de mutación, por gen y por generación, son muy bajas, los
cambios en las frecuencias alélicas por mutación son lentísimos.
b. La migración de los individuos de una población puede aumentar o disminuir la
frecuencia de los alelos de la misma. Tiene efectos similares a la mutación pero a gran
escala. Si emigran individuos desaparecen sus alelos en la población y si entran individuos
aparecen nuevos alelos. La tasa de cambio por gen y por generación depende del
porcentaje de migrantes y de la frecuencia de sus alelos.
c. La selección natural puede disminuir la frecuencia de ciertos alelos que confieren menos
eficacia a sus portadores, permitiendo que aumenten otros. En el modelo más simple, un
gen con dos alelos, si la selección (s) actúa en contra de un alelo recesivo (referido a la
eficacia biológica), disminuirá el número de los genotipos A2A2 en una fracción s.
d. Las poblaciones son de tamaño finito, lo que hace que por azar pueden pasar a la
siguiente generación más alelos de un tipo que de otro y sus frecuencias pueden variar
aleatoriamente, lo que recibe el nombre de deriva genética. En una población el efecto de
la deriva será mayor cuánto menor sea su tamaño y puede dar lugar a que un alelo
desaparezca y otro quede fijado. En un conjunto de muchas poblaciones, lo que variará
serán las frecuencias genotípicas, aumentando los homocigotos, sin que varíen las
frecuencias alélicas en el conjunto.
e. Los individuos no se aparean totalmente al azar sino que lo hacen siguiendo criterios de
semejanza, apareamiento selectivo, o de parentesco, apareamiento consanguíneo. El
apareamiento no aleatorio, selectivo o consanguíneo, al igual que la deriva, modifica las
frecuencias genotípicas, aumentando los homocigotos sin que varíen en conjunto las
frecuencias alélicas. Es una consecuencia del tamaño finito de las poblaciones.
MELVIN MANUEL MORALES AGUILERA
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BIBLIOGRAFÍA
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