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Mapas conceptuales y tablassintéticas
Maestro en Ciencias BioquímicasGenaro Matus Ortega
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HISTORIA Y DESARROLLO DELA BIOLOGÍA MOLECULAR
Primera parte
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HISTORIA
Genes ligados,Genes auto y gonosómicos,Herencia citoplásmica,
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ESTRUCTURA DE ADN Y ARN:PROPIEDADES DERIVADAS
Segunda parte
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Estructura de la doble hélice
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Purinas
GuaninaAdenina
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Purinas Pirimidinas
Timina Citosina UraciloGuaninaAdenina
Timina = uracilo metiladoCitosina = uracilo aminado
Timina – uracilo –citosina
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Purinas Pirimidinas
Ribosa 2’-Desoxi-ribosa
Pentosa
RNA DNA
Timina Citosina UraciloGuaninaAdenina
Aldopentosa
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Estructura del ADN
Características del modelo de Watson y Crick (1953)
1.- El DNA está formado por 2cadenas de polinucleotidos
4.- Cada cadena se encuentrade forma perpendicular al eje.
5.- la doble hélice tiene undiámetro de 20 A (2nm)
6.- la doble hélice gira hacia laderecha del eje siguiendo laorientaión de los azucares.
7.- por cada 10 pares de bases, ladoble hélice da una vuelta
completa con una dimensiónlineal de 34 A.
8.- las bases nitrogenadas seorientan hacia el interior y laspentosas y fosfatos al exterior
9.- la complementaridad de lasbases cumple las leyes de
Chargaff (pares purina-pirimidina)
10.- las cadenas de polinucleo-tidos se unen por puentes de H.
11. Los enlaces fosfato-desoxirribosa están polarizados en
sentido opuesto 5’-3’ y 3’-5’
ESTRUCTURA
3.- las cadenas forman unadoble hélice antiparalela
2.- cada cadena consiste de ungrupo fosfato unido a un residuo
de -D-desoxirribosa y unabase nitrogenada
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Estructura del ARN
Contenido de RNAen la célula
BACTERIAS: 0.5-0.10 pg deRNA, 6% de su peso total
EUCARIOTAS: 20-30 pg deRNA, 1% de su peso total
3 tipos de RNAparticipan en la síntesis
de proteínas.
mRNA.
Contiene al mansajegenético que determina la
secuencia de amino ácidosen la síntesis de proteínas.
rRNA
Presenta cerca del 70% delRNA total.
tRNA
Existen diversas copiaspara cada gen de tRNA(redundancia de genes).
Existen 4 tipos eneucariontes: 18SrRNA,
28SrRNA, 5.8S y 5SrRNA
Existen 32 tipos de tRNA en célulaseucariontes, son pequeños (-4S)
Cada tipo de tRNAtransporta (en su
extremo 3´) uno delos 20 aminoácidos
Procesamiento de lospreRNA---- RNAm.
Splicing:remoción de
intrones.
Eventos de corte:procesamiento de
rRNA y tRNA
Modificacionesquímicas: adición
de gruposquímicos.
Edición del RNA:
Modificacionesquimicas *citidin
desaminasa-convierte una C a U
2 fuentes principales de RNA antisentido
Small interfering RNAs (siRNAs)
Micro RNAs (miRNAs)
ESTRUCTURA
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Desnaturalización del ADN
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Tasas de reasociación del DNA
Según su grado de asociación existendiferentes fracciones genómicas:
A) Componente rápido. Primera fracciónde reasociación. Que representa el 25% del genoma.
B) Componente intermedio. Segundafracción que corresponde al 30 % delgenoma total.
C) Componente lento. La última fracciónen renaturalizarse y supone el 45 %restante del genoma total.
¿Esto significará algo?
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Secuencias repetidas y no repetidas
Las secuencias de renaturalización lenta generalmente son regiones de DNAno repetitivas y casi todas las veces codificantes.
Según el grado de repetición las secuencias de DNA se clasifican en:
A) DNA repetitivo: si están presentes en más de una copia.
B) DNA moderadamente repetitivo: si tienen un rango de reasociación moderado
C) DNA altamente repetitivo: Representa la fracción de reasociación rápida y sonproducto de la reasociación de secuencias cortas localizadas en tandem enfrecuencias de repetición múltiple.
En este grupo también se encuentra el DNA satélite que consiste de regiones cromosómicascentroméricas inertes (no se transcriben).
El DNA microsatelite corresponde a fragmentos más cortos de DNA de alta asociación.
El DNA minisatélite o VTNR y las secuencias cortas forman parte de este DNA.
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Genes y genomasConcepto fundamental: Definición: Complementario:
Gen Secuencia de DNA que codificapara un RNA funcional.
Contiene informaciónextrínseca e intrínseca.
Genoma Conjunto de genes codificadosen el DNA.
Secuencias no codificantes Secuencias regulatorias de laduplicación, transcripción ocontrol epigenético.
OriC, ARS, ACS, Intron,Promotor, Terminador,DNA espaciador
Densidad génica y genómica
Cistron Unidad monogénica. Cis-trans (un promotor controlala expresión de un gen).
Policistron Unidad poligénica dependientede un promotor.
Valor C Cantidad total de DNA en elgenoma
Paradoja del valor C No correspondencia entre eltamaño del genoma y el númerode genes.
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Lynch et al. (2001) Genetics
Nonfunctionalization Neofunctionalization Subfunctionalization
On the fate of duplicated genes……
deletereous mutagenesis
conservation
90% loose function
9% subfunctionalizatión
1% neofunctionalization
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Familias génicas
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CONTROL DE LA CROMATINA
Tercera parte
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Organización del DNAen células eucariontes
El DNA se asocia aproteínas llamadas
HISTONAS
Histonas H1
Histonasnucleosomicas:
H2A, H2B, H3, H4
El bloque de construcción de lacromatina es el nucleosoma
Es la unidad mínima deconstrucción de cromatina,involucra todas las histonas
excepto la H1.
dimeros
Octameros(nucleosoma)
Cubre 200 pares de bases.
Collar de cuentas
solenoide
Asas de cromatinaRegiones de cromatina en metafaseCROMOSOMA
Modelos deinteracción
nucleosoma - DNA
*ricos en hélices
*formación deheterodímeros:
H3-H4. H2A-H2B.
*residuos de fosfatointeraccionan con las
histonas.
*interaccioneselectrostaticas ypuentes de H.
Los extremos amino delas histonas pueden ser
modificadas por enzimas:Acetilación, Metilación, Fosforilación.
Estructurade la
cromatina
Eucromatina (A) Heterocromatina
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La subunidad que se repite en la estructurade la cromatina es el nucleosoma
165pbDNAespaciador
Los trabajos de A. Klug y colaboradores (1980) sobre la disposición delas histonas en el nucleosoma le valieron el Premio Nobel de Química(1982).
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Las fibras de 30 nm se unen aun armazón proteíco enregiones especificas llamadasSAR [regiones asociadas con elarmazón o regiones de unión ala matriz (MAR)].
DNA
Nucleosoma
Fibra de 30 nm (300 Å) o
solenoide
Asas o Bucles radiales deDNA
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CONCEPTO CONCEPTO NECESARIO CONCEPTO COMPLEMENTARIO
CROMATINA
(solo presente en Eucariotas)
Conjunto de ADN, histonas y
proteínas.
Se encuentran en el núcleo de
células eucariontes y constituyen el
cromosoma eucarionta.
HISTONAS Principal proteína presente en las
cromatinas.
Tienen carga positiva.
Ricas en lisina y Argina
Consecuencia de genomas grandes
Proteínas mas conservadas en
eucariontes
NUCLEOSOMA Conjunto de octamero de histonas
que involucran todas menos la H1
Cubre 200 pares de base
EUCROMATINA Representa la forma activa de la
cromatina.
Esta diseminada por el resto del
núcleo y aquí se encuentran la
mayoría de genes activos.
HETEROCROMATINA Representa la forma inactiva de la
cromatina.
Se localiza en la periferia del núcleo
y puede ser de dos tipos:
constitutiva y facultativa.
REGIONES Y TERRITORIOS NUCLEARES Nucleólos,
Dominios OPT,
Cuerpo PcG
Cuerpo PML,
Cuerpos de Cajal,
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Estructura del nucleonema
NucleoloNucleolo
No tiene membranasdelimitantes.
Es la estructura subnuclearmás prominente.
Producción y ensamblaje de lassubunidades ribosomales.
Precursor de 45S
Usa proteínas importadas delcitosol = RNP
FC: Centro Fibrilar
DFC: Componente denso fibrilar
GC: Componente granular
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Cuerpos nucleares
Cuerpos de Cajal:
Orgánulos esféricos nucleares presentes en células en alta proliferación(tumorales), o metabólicamente activas con alta tasa transcripcional(neuronas).
Ramón y Cajal las denominó “cuerpos accesorios nucleolares”, debido a suasociación con el nucléolo en las neuronas.
Su tamaño se sitúa entre 0.1 - 2.0 micrometros y su número es de entreuno a cinco por cada núcleo, variando a lo largo del ciclo celular y entre losdiferentes tipos celulares.
Los cuerpos celulares “son posibles lugares de ensamblaje o modificaciónde la maquinaria de transcripción del núcleo”.
Se encuentran únicamente en los núcleos de plantas, animales ylevaduras.
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Cuerpos nucleares
Los dominios OPT se relacionan con nuevas síntesis de RNA polimerasaII y dominios que contienen proteínas relacionadas con la transcripción yfactores de transcripción TFIIH, Oct1, BRG1, E2F-1, estos puedenrepresentar complejos de iniciación de transcripción incompletos, complejosinhibitorios, o sitios del almacenamiento.
El complejo grupo Polycomb (PcG, o cuerpo PcG) es una asociacióncromatina multiproteica relacionada con la represión estable de mutacioneshomeóticas, además de ser un complejo de represión transcripcional.
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Cuerpos nucleares
Las manchas -nuclear speckles- son estructuras intranuclearescaracterizadas por concentraciones altas de pre-mRNA, aunque su funciónes polémica, existe evidencia fuerte de que son sitios que unen piezas dealmacenaje o ensamblaje.
Cuerpos PML. Cuerpos nucleares promielocíticos, donde se sintetiza laproteína PML (882 residuos de aa, 97,5 kDa), cuya su función principales lasupresión del crecimiento celular.
Posee otras funciones relacionadas con la regulación de genes eimplicación en las vías de supresión tumoral y, por tanto, de la inhibición delcrecimiento celular.
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MEMORIA CELULAR: modificación química de lacromatina
Mediante acetilación, fosforilación, que permitenencender y apagar diferentes genes para formar untejido específico
DIFERENCIACIDIFERENCIACIÓÓN Y ESPECIALIZACIN Y ESPECIALIZACIÓÓNN CELULAR:proceso de remodelación de la cromatina
Determina características estructurales y funcionalesdistintas
ENVEJECIMIENTO CELULAR: mediado por genes Lleva a 2 tipos de muerte: apoptosis y necrosis
CELULAS TOTIPOTENCIALES
CELULAS MULTIPOTENCIALES
CELULAS OLIGOPOTENCIALES
CELULAS DIFERENCIADAS
CELULAS ESPECIALIZADAS
INSULATOR
ENHANCER
SILENCER
LCR
Control de la expresión génica
Cuerpos nucleares
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DUPLICACIÓN Y REPARACIÓNDEL DNA
Cuarta parte
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¿Cómo es la replicación del DNA?
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El oriC
El origen de replicación bacteriano se denomina OriC y corresponde a 245pb.
Tiene las siguientes características:
Es una secuencia rica en A y T.
Presenta 4 cajas de reconocimiento a DnaA (R1-R4 nonámeros repetidos).
Tiene 3 repeticiones de treceámeros que permiten la disociación del DNA.
Posee secuencias palindrómicas GATC de reconocimiento para lasmetilasas de Adenina (DAM)
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Proteina DnaA
- multicomplejo (10-20)
- ATP
- se une a los repetidos de 9 pb del
OriC
- provoca la separación de las
cadenas de los repetidos de 13 pb
Proteina DnaC
- “escolta” la DnaB a las DnaA
Proteina DnaB (Helicasa)
- hexamero
- ATP
- “abrazadora” alrededor de cad.
sencillas
- se desplaza a lo largo del DNA para
separar las cadenas en el sentido 5´-3´
5´ 3´
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Inicio de la replicación
Proteína: Funciones:
DnaA: 1.- Reconocimiento de OriC,2.- Curvatura, desestabilización y apertura del DNA,3.- Reclutamiento de DnaB y DnaC.
DnaB, DnaC 1.- Helicasas que impiden la reasociación del DNA,2.- Permiten el reclutamiento de SSB y de la DnaG(primasa).
SSB 1.- Impide la reasociación de las hebras de DNA,2.- Permite la liberación de DnaA (pre-primosoma)
DnaG 1.- Sólo se integra si DnaC ha sido retirado.2.- Coloca el cebador de RNA. Define la formacióndel primosomaprimosoma.
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Crecimiento de DNA y RNA 55’’⇨⇨33’’
Se requiere un extremo 3’-OHlibre para que ocurra el ataqueelectrofílico sobre el alcohol.
El crecimiento de cada cadenaes unidireccional.
La doble hélice crece demanera bidireccional
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Elongación de la replicación
Proteína: Funciones:
Hda/Ida: Permiten que se retire las DnaA
DnaG Coloca el primer (iniciador, cebador, prímero) de 10-12nucleótidos de RNA sobre el molde de DNA.
Se requiere para dejar un extremo 3’-OH.
Dnapol III Toma el extremo 3’-OH dejado por la primasa ypolimeriza DNA en ambas cadenas (líder continua,retrasada discontinua F. OkazakiF. Okazaki).F y x permiten la retirada de SSB.
Dnapol I (Rnasa) Retira los fragmentos de RNA.
Dnapol I (polimerasa) Rellena los huecos dejados por la actividad de RNAsa.
Dna Ligasa Sella los fragmentos de Okazaki.
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FIDELIDAD:FIDELIDAD:
El seguimiento exacto de la secuenciaque sirve como molde.
La actividad de exonucleasa 3’ 5’ dela DNA polimerasa contribuye a lafidelidad pues tiene actividad correctora(proofreading).
Hay dos propiedades importantes de las DNA POLIMERASAS:
FIDELIDAD Y PROCESIVIDAD
PROCESIVIDAD:PROCESIVIDAD:
La capacidad de una DNA polimerasa de elongar una cadena de DNA pormuchos nucleótidos antes de disociarse del complejo que forma con el sustrato.
La DNA polimerasa I tiene una procesividad baja. Es distributiva.
La DNA polimerasa III tiene una procesividad alta.
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La DNA polimerasa III está compuesta por varias subunidades
Subunidad : 129 kDa, tiene actividad de DNA polimerasa
Subunidad : 27.5 kDa, tiene actividad de exonucleasa 3’ 5’
Subunidad : 41 kDa, se une al DNA. Es el factor de procesividad
Subunidad : Factor de dimerización
Subnidad : cargado de la hebra de DNA.
En ausencia de la subunidad , la DNA Pol III tiene muy baja procesividad, pues sedisocia del molde
Permiten quese retire SSB
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Termino de la replicación
El fin de la replicación es mediada por secuencias TerCTerCricas en A y T que pueden retrasar el avance losreplisomas debido a la unión de proteínas Ter y TTer y Tus quemuestran una unión cooperativa al DNA.
La metilacimetilacióónn--desmetilacidesmetilacióónn del OriC permite controlarlos ciclos de inicio de cada replicación del DNAprocarionte.
La disponibilidad de las DnaA y los demás factores queforman el pre-primosoma constituyen un mecanismo deregulación.
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Eucariotas = más genoma (DNA + proteína)
oriC
Ter
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Tres características comunes de los orígenes dereplicación de procariontes y eucariontes
1) Son segmentos de DNA singulares que contienen múltiples secuencias
repetidas cortas
2) Estas unidades repetitivas cortas son reconocidas por proteínas
multiméricas ORCORC (origin recognition complex) que reconocen regiones ARSARS
(Autonomously Replicating Sequence) que se unen al origen para iniciar la
replicación
3) Las orígenes de replicación suelen ser regiones ricas en AT, lo que facilita
la desnaturalización del duplex de DNA (menos energía).
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- cada 40 kb
- aprox. 400 orígenes de replicación en los 17 cromosomas de S. cerevisiae
- activación sucesiva de las diferentes ARS: regulación
Eucariontes Inferiores - Secuencia de replicación autónoma
de S. cerevisiae: ARS (Autonomously Replicating Sequence)
- mutaciones puntuales inhiben el inicio de la replicación
- Sitio de unión del ORC (Origin Recognition Complex), 6
proteínas que forman la maquinaria de iniciación de la replicación)
B1 B2 B3A
5´- (A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T) -3´
ARS consensus sequence (ACS)
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G1
SM/G2Ciclina E/Cdk2 >> Inhibe unión de
Mcm2-7 (Cdc6)
Germinina >> secuestra Cdt1
P
P
Cdc6 + Cdt1
ORC (6 proteínas)
origen
Helicasas Mcm2-7
síntesisciclinas yactivaciónCdkDegradación
ciclinas
Xenopus
Cdc45PP
P
- Fosforilación Cdc6y liberación- Fosforilación ORC yMcm2-7-Associación Cdc45
P
P
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Control positivoControl positivo de la replicación en eucariontes
1.1.-- AcumulaciAcumulacióón de proten de proteíínasnas
““permisivaspermisivas”” en el nen el núúcleo en G1:cleo en G1:
- CDC-6 y CDT-1, las cuales se unen al
ORC y reclutan las helicasas MCM
- helicasas MCM se unen al DNA y
catalizan su desenrollamiento
2.- Una vez que empieza la replicación
en la fase S:
- CDC-6 y CDT-1 se despegan del ORC
(por fosforilación)
- MCM progresan con el avance de la
horquilla de replicación
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Control negativoControl negativo de la replicación en eucariontes
• En la célula en fase M/G2 se impide la activacion del ORC, a través de ctd1 y el
reclutamiento de las helicasas MCM a las nuevas cadenas de DNA.
•Por tanto no se puede iniciar la replicación.
• En G1, la germinina es degradada, de tal manera que el DNA de la célula
pueda responder al control positivo por las proteínas permisivas y iniciar su
replicación
Helicasa Mcm2-7
Complejopre-replicativo
- Ciclina Cdc6, reguladorpositivo no fosforilado(Expresión alta en G1)- Ctd1
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TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’AACCCC-5’
cadena en extensión, incompleta
cadena molde
TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’AACCCC-5’
Telomerasa contemplado
de RNAACCCCAAC3’ 5’
TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’AACCCC-5’ ACCCCAAC
3’ 5’
TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’AACCCC-5’
TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’AACCCC-5’ CCCAACCCCAACCCCCAAC-5’
DNA polimerasa
Elongaciónextremo 3’por latelomerasa
Adición primer RNA
Extensióncadenaretrasada porla polimerasa
CCAACPrimer RNA
Cromosoma telomero
TELOMERASA
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DAÑO EN EL DNA
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AGENTES INDUCTORES DE DAÑO
Físicos:
•Radiación ultravioleta
•Radiación ionizante
•Radiación nuclear
Químicos:
•Agentes químicos
•Hidrocarburos
•Quimioterapéuticos
•Radicales libres
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Entrecruzamiento covalente depirimidinas adyacentes en lamisma cadena de DNA.Generalmente son timinas.
También se puede generar el“fotoproducto 6-4”
Radiación ultravioleta (200-300nm) 11
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Radiaciones ionizantes: Rayos X y rayos gamma.
Ionizan moléculas que rodean al DNA radicaleslibres
algunos contienen oxígeno que tienen un electrón desapareado. Son especiesaltamente reactivas y pueden atacar la molécula del DNA causando rupturas enuna o en las dos cadenas.
También pueden modificarquímicamente una base, como laguanina.
Generación de 8-oxo-guanina.
Causa transversiones: GC -> TA
22
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Radiación nuclear
Enlaces covalentes O-P
Extremos romos Translocaciones Cáncer
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Modificación de bases en el DNA
Las desaminaciones pueden ser espontáneas o inducidas.
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Modificación de bases en el DNA: Desaminación por ácido nitroso.
Desaminación de citosinagenera uracilo
Desaminación de 5-metilcitosina genera timina
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Tipos de Daño alDNA. Alquilación.
Tipos de Daño alDNA. Alquilación.
Metilación o acetilación de las bases en los átomos (O/N) queparticipan en la formación de puentes de H, desestabiliza la doblehélice de DNA y hace esa zona susceptible a mutación.
La presencia de estas regiones dañadas puede causar detenciónde la replicación, o si ésta continúa, está sujeta a errores.
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Efectos del daño al DNA
Veamos la contraparte al dañoVeamos la contraparte al daño
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CONCEPTO CONCEPTO NECESARIO CONCEPTO COMPLEMENTARIO
Mutación Alteración o cambio en la información
genética (genotipo) de un ser vivo. Alteración Espontánea: se producen de forma
natural o normal en las poblaciones
Alteración Inducida: surgen como consecuencia
de la exposición a mutágenos químicos o fisicos
Alteraciones Espontáneas
Causados por:
• Errores durante los procesos de
replicación, recombinación o
reparación del DNA.
• Cambios químicos espontáneos
Cambios tautoméricos - Formas alternativas
isoméricas de las bases nitrogenadas que
cambian el patrón de apareamiento normal.
depurinación, desaminación y oxidación de
Bases.
Alteraciones Inducidas Causados por:
• Agentes químicos
• Agentes físicos
Modificación de Bases en DNA
(desaminantes, alquilantes)
Rayos UV (dimeros de T), Ionizante (radicales
libres), Nuclear (extremos romos)
Reparación del DNA Es un proceso constante en la
célula, esencial para su
supervivencia ya que protege al
genoma de daños y mutaciones
dañinas.
Mecanismos de Reparación:
Directa
Apareamiento
NER - Reparación por Escisión de Nucleótido
Recombinación
VER Reparación por Escisión de Base
Daño en el DNA
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REPARACIÓN DEL DNA
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Mecanismos de Reparación
Glucosilasas
RnasaH, Dnapol I,Dnapol ligasa
u.v.rABC
RecA, RAD51
Glucosilasas
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1. Reparación directa: Fotorreactivación
Fotoliasas
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1. Reparación directa: Fotorreactivación
Fotoliasas
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2. Actividad de las Glucosilasas (BER)
¿Cuál OH es?¿1’, 2’, 3, 5’?
Esto lo respondenhasta los que noson “masters”.
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3. Reparación de apareamientos erróneos (MMR)
1. Reconocimiento de la lesiónMutSalfa: AE, ins/del (2-8)MutSbeta: ins/del (1-16)
2. Act. ATPasa MutSalfa libera el AE
3. Discriminación de la hebra (Okazaki)
4. Excisión y síntesis de reparación
1
PCNA
RPA- SSDNA
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4. Reparación de excisión de nucleótidos
NERGenómica Global
NER-TCRAcoplada atranscripción
1.Reconocimiento XPC/HR23B2. Entrada del factor TFIIH a laLesión3. Ensamblaje del complejo NER4. Helicasas actúan y XPA-RPAInteractúan con la lesión5. Endonucleasas:XPG y F6. Remoción 25-32 n7. Liberación complejo8. Síntesis y ligación
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5. uvrABCMecanismo resumido:
1.- UvrA se une al DNA en la regióndañada.
2.- UvrB/UvrC tienen actividad deendonucleasa y corta en los ladosadyacentes de la cadena liberando unoligonucleótido de unos 12-13 nts delargo.
3.- La región “vacía” es rellenada poruna DNA polimerasa I y
4.- Sellada por una DNA ligasa.
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6. Recombinación Homóloga
•Eucariontes•Libre de error•Fase S y G2
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Intercambio de cadenas mediadopor REC A O RAD51 (sistema SOS)
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Ruptura
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•Mamíferos•Predispone al error•Fase GO/G1
7. Reunión de extremos no homólogos
Exonucleasa ssDNA
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Rescata lo más importante:
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Reparación del DNAAgente causal Daño producido Mecanismo de reparación:
U. V. Dímeros de pirimidina (timina- timina,
citosina-timina, citosina-cistosina).Fotoproducto 6-4.Bultos y aductos.
Fotoreactivation (UvrABC)NERRecombination Repair.
Radiación ionizante(rayos X y )
8-oxo-guannina.Transversión GC-TA.Ruptura de cadenas (1 y 2),Intercruzamiento.
BERNERRecombinación
Radiación nuclear Ruptura de cadenas de DNA.Extremos romos y adhesivos.Traslocaciones.
Missmatch repair (MSH,MLH, PMS).Recombination repair (DSB,RPA,RAD52, RAD51).
Alquilaciones,metilaciones,
O6-EtilguaninaCambio en la información(apareamientos erróneos).Timina -Uracilo
Direct Reversal.
DesaminacionesDespurinacionesDespirimidaciones
Citosina – UraciloCambio en la información(apareamientos erróneos).
BER (glicosilasas)
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Tipos de mutaciones de pares de bases
CATTCACCTGTACCAGTAAGTGGACATGGT
CATCCACCTGTACCAGTAGGTGGACATGGT
Sustitución/ Transición o Transversión
CATCACCTGTACCAGTAGTGGACATGGT
Deleción o eliminación
CATATCACCTGTACCAGTATAGTGGACATGGT
Inserción
Secuencia silvestre
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EFECTO DE SUSTITUCIONES EN UN GEN
PROTEÍNADIFERENTE
PROTEÍNAINCOMPLETA
PROTEÍNANORMAL
PROTEÍNANORMAL
PROTEÍNANORMAL
AAC
Codón deasparagina
UAG
Codón determinación
UAU
Codón detirosina
UAC
Codón detirosina
AAC
TTG
TAG
ATC
TAT
ATA
TAC
ATG
DNA molde : 5’----T A C---3’RNAm 3’----A T G ---5’
Replicaciónnormal
Replicaciónnormal
Mutaciónsilenciosa
Mutaciónsilenciosa
Mutación consentido erróneo
Mutación consentido erróneo
Mutaciónsin sentido
Mutaciónsin sentido
Carácter conservativo vs no conservativoCarácter conservativo vs no conservativo
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LA TRANSCRIPCIÓN
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Proceso celular por el cuallos RNAm (y los demástipos de RNA) sonsintetizados a partir deuna secuencia de DNAque sirve como molde.
¿Es el primer paso de laexpresión génica? R =NO.
Es el punto principal deEs el punto principal decontrol celular de lacontrol celular de laexpresiexpresióón gn géénica.nica.
La Transcripción
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•La enzima RNA polimerasa (mensajero II).
•DNA
•Ribonucleótidos (trifosfatados) ATP, GTP, CTP, UTP.
•Proteínas nucleares o factores de transcripción.•-factores generales o basales de transcripción•-proteínas activadoras o represoras
interaccionan con secuencias específicas de DNA (secuencias consenso)
Hebra molde 3’-5’
Señales de iniciación (promotor) y de terminación
Secuencias regulatorias.
Se requiere:
La Transcripción
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Características de la transcripción
Se copia sólo una de las hebras del DNA.
La discriminación o selección de la hebra a copiar está dada por lospromotores.
El super-enrollamiento negativo incrementa la potencia de los promotores.
La actividad de la Rna pol de Procariontes y Eucariontes NO requiere de uncebador.
El transcrito resultante es idéntico a la cadena complementaria a la moldeexcepto en T-U.
Se requieren nucleótidos trifosfatados para catalizar la reacción depolimerización en sentido 5’-3’.
La transcripción es selectiva. Sólo ocurre bajo control temporal en genesespecíficos.
Nomenclatura:Nomenclatura: nucleótido de inicio (n+1), curso abajo (+), curso arriba (-).
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LA TRANSCRIPCIÓN
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Elementos de control transcripcional en procariotes:
Elementos CisCis (Cis-acting regulatory sequences):
Secuencias de DNA con un determinado arreglo de bases. Tienenfunción reguladora positiva o negativa.
Promotor Mínimo*Promotor proximal*
- Genes constitutivos (Housekeepinkg)
- Genes inducibles
Proteínas Reguladoras TransTransactivadoras o Factores de Transcripción(Trans-acting regulatory proteins)
Proteinas activadores o represores
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Elementos de control transcripcional en eucariotes:
Elementos CisCis (Cis-acting regulatory sequences):
Secuencias de DNA con un determinado arreglo de bases. Tienenfunción reguladora positiva o negativa.
Promotor Mínimo*Promotor proximal*Potenciadores (Enhancers)*Silenciadores*Elementos de Respuesta*
Proteínas Reguladoras TransTransactivadoras o Factores de Transcripción(Trans-acting regulatory proteins)
Factores Generales de transcripción*Proteinas activadores o represores
* Sólo presentes en eucariotas.
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La enzima que sintetiza RNA es la RNA POLIMERASA(Samuel Weiss y Jerard Huwitz, 1960)
La enzima de E. coli tiene 4 tipos de subunidades
Es susceptible a inhibición por: RIFAMPICINA y ACTINOMICINA DEs susceptible a inhibición por: RIFAMPICINA y ACTINOMICINA D
Holoenzima formado por:
: Reconocimiento del promotorespecífico
: ensamblaje de las unidades y unión alpromotor
’: Se une al DNA
: Sintetiza el RNA
: estabiliza la unión de ’ con 2-
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Inhibidores de las RNA polimerasas
Precursor de amatoxinas
Derivado de la rifamicinaB
ojo
Anticancerígeno-Quimioterapia
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Inicio de la transcripción
La subunidad sigma reconoce la caja de Pribnow en el promotorprocarionte.
Alfa permite el ensamblaje de las otras subunidades de la Rna pol.
Se une la subunidad b’ al DNA y b añade 9-10 nt.
Elementos de la región promotorapromotora:
Región -10 TAT AAT (caja de Pribnow)
Región -35 TCT TGA CAT
Separación de ambas cajas (16-19 pb).
Velocidad 20-50 nt
Error 10-4 a 37°.
RNApol
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ATPGTPUTPCTP
Sustratos
+ DNA(como molde)
Polimerasa del RNAdirigida por DNA
(Mg++)
nPPi
5’ 3’pppApUpCpCpCpGpU…
RNA
(tipo, longitud ysecuencia de este RNAdependen del gen deDNA que se estátranscribiendo)
Elongación:
1.- Se disocia la subunidad de la RNA polimerasa.2.- Comienza la adición de ppp G o ppp A, en el extremo 5’del RNA naciente.
3.- Se añaden ribonucleótidos polimerizándose la cadena através de enlaces fosfodiéster (la cadena va creciendo en ladirección 5’ – 3’)
El RNA que se va copiando del DNA se llama transcrito
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4.- La “burbuja de transcripción” va avanzando, por un ladose abre el DNA duplex y por el otro se re-bobina.5.- El RNA sintetizado va formando un híbrido (transitorio),con la cadena 3’ – 5’ del DNA
3
5
5
3
5’ ppp RNAnaciente Desplazamiento de
la polimerasa
RNA polimerasa
Hélice híbridaRNA - DNA
3
Punto deelongación
RebobinadoDesenrollado
Hebra molde
Hebra codificadora
BURBUJA DE TRANSCRIPCIÓN
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Termino de la transcripción:
La Rna pol deja de añadir RNA
La Rna pol se disocia del DNA
Secuencias de terminación en 5´ respecto al sitio determinación.
Dos tipos de terminadores respecto al DNA:
Intrínsecos:
Extrínsecos:
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Terminación en procariontes
Terminadores intrínsecos:
Serie de 4-10 nt AT consecutivos en 5´.
Estructura secundaria en forma de horquilla (harpin)
Sucesión de 6 U al final de la horquilla.
Generalmente región rica en GC (palindrómica) en la base del tallo.
Terminadores dependientes de Rho:
Rho actúa como hexámero y tiene actividad de helicasa dependiente deATP.
Se une a regiones de 50-90 pb en posición 5´ respecto al terminador ricasen C y pobres en G.
Rho avanza en dirección 3´ y desestabiliza la unión de la RNApol cuandollega a la región terminadora.
La desestabilización se debe a la disociación del híbrido DNA:RNA
Es apoyada por NusA que reconoce a box A.
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Tramo de uridinascontiguas
Independiente de Rho
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Terminación dependiente de Rho:
1.- La RNA polimerasa encuentra señales de terminación en el DNA(región Palindrómica rica en GC y luego en AT).2.- El RNA se disocia del molde.3.- La RNA polimerasa se disocia del DNA.4.- La proteína rho, hidroliza ATP en presencia de RNA o DNA de unasola hebra, rompiendo el DNA del RNA
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Independiente de Rho
Palíndromerico en GC:horquilla
Informaciónestructural-desestabilización.
Secuencia ricaen (T): lineal
Informaciónposicional
El ITP (análogodel GTP) ¡impidela terminación!Generando uncambioconformacional.
¡Pregúntame!
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Antiterminación
La RNA pol lee más allá de los sitios de terminación.
Es utilizada por los fagos para regular la transición de unaetapa de expresión génica a otra.
Proteína antiterminadora (pN, pQ) que reconoce la secuenciaantiterminadora en DNA (Box B),
La proteína antiterminadora interacciona con la Rna pol através de proteínas intermediarias.
El complejo estabiliza a la Rna pol unida Nus A y evita laterminación de la transcripción.
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En procariotes casi todos los RNAm que se van sintetizando se vancopiando en proteínas (traducción). Pero los RNA, los RNAt y todos losRNAm de eucariontes sufren modificaciones antes de ser usados o leídos.
TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTES
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TIPO DEPOLIMERASA
GENES QUE TRANSCRIBE
RNA polimerasa I Genes de rRNA 5.8S, 18S y 28S
RNA polimerasa II Todos los genes que codifican proteínas, los UsnRNA (1-5), los genes plus snoRNA y algunosgenes snRNA
RNA polimerasa III Genes de tRNA, 5S-rRNA, algunos genes snRNAy genes para otros RNAs pequeños (UsnRNA).
Anota en tu cuaderno esto:
En Eucariontes hay tres tipos de RNA polimerasas
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En Eucariontes hay tres tipos de RNA polimerasas
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Cada tipo de RNA lleva una forma diferente de PROCESAMIENTOPOST-TRANSCRIPCIONAL o MADURACIÓN
RNAt
RNAmEuc.
RNAr
PROCESAMIENTOPROCESAMIENTOo MADURACIo MADURACIÓÓNNDIFERENCIALDIFERENCIAL
Remoción de los extremosModificación de la ribosaModificación de las bases
Empalme o splicingAdición del CAP en el extremo 5’Adición del poliA en el extremo 3’
Metilación de la ribosaRemoción de partes intermedias de un pre-RNAr largo que originavarios RNAr más cortos
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Rna pol I Rna pol II Rna pol III
RNA sintetizado RNAr (5.8, 18 y 28S) RNAmUsnRNA (1-5)
RNAtRNArUsnRNA (6)
Localización Nucleolo Nucleoplasma Nucleoplasma
Sensibilidad a -amanitina
No sensible Muy sensible Sensible
Subunidadescomunes
2 subunidades grandes similares a y ´de E. coli2 subunidades similares a de E. coli5 subunidades comunes pero sin homólogos con E. coli
Subunidades totales 14 subunidades 12 subunidadesSubunidad grandecon repeticiones enCOO- terminal.Secuencias CTD(carboxi teminaldomain): TSTSP26 repeticiones enlevaduras,56 repeticiones enmamíferos.
17 subunidades
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Rna pol I Rna pol II Rna pol III
Promotor Dos regiones decontrol:Core element: -40 a+20Rico en GCElemento alrededordel sitio de unión(especie específico).Upstream controlelement (UCE):-180 a -107.
Tiene variedad deelementos cortos encis:
Promotor mínimo.TATA-like (-30) cajade Golberg-Hogness.
Promotor proximal:CAAT (-80)GGGCGG (-90) cajaGC de genesgenesconstitutivosconstitutivos
Enhancers.(incrementadores,potenciadores,intensificadores…)
Promotor de tRNAs:Dentro de lasecuencia transcrita(interna):Caja ACaja BPromotor de 5srRNAs:Caja ACaja CPromotor deUsnRNA6Caja TATAPSEOCT-1
Factores detranscripción:
UBF1, SL1, TBP TBP, TFIIB, TFIIF,TFIIE, TFIIH, TFIIA
Pregunta:¿Si se quita el
promotor mínimohabrá transcripción?
Promotor de tRNAs:TFIIBn (incluye TBP)TFIICPromotor de 5s-rRNAs:TFIIA, TFIIB, TFIIIC.
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Rna pol I Rna pol II Rna pol III
Inicio de latranscripción:
No requiere hidrólisis deATP.1. Unión de UBF1 aUCE y en el core.2. SL1 (TBP-TAFcomplex) se une aUBF1 de formacooperativa paraextender la región deADN que es cubierta.3. Se disoscia hRRN3.4. Se une la Rna pol I.5. Se requiere la TIFpara iniciar la adicióndel primer nt.
1. Unión de TBP a lacaja de Goldberg-Hogneess.TBP interactúa con elsurco menor del Dna enlas TATA y curba ladoble hélice.2. Unión de TFIIB.El C-terminalinteracciona con TBP yDNA. El N-terminal seextiende hacia el sitiode inicio de latranscripción.3. Unión de TFIIF.Provoca elreclutamiento de laRNApol II.4. Unión de TFIIE:Permite reclutar TFIIH.5. Unión de TFIIH:TFIIH tiene actividad dehelicasa y ATPasa,comienza la síntesis deRNA.6. La RNA pol se liberade casi todos los TFs.
No requiere hidrólisis deATP.tRNAs:1. TFIIC reconoce loselementos control.2. TFIIB se une a TFIICy dirige a la Rna pol IIIal sitio correcto.•TFIIB contiene a TBPque se une al DNA pesea no existir cajas TATA.
5s-rRNAs:TFIIA se une a la cajaC,TFIIC se une a TFIIATFIIIB se une y coloca ala RNA pol en el sitiocorrecto.
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Rna pol I Rna pol II Rna pol III
Elongación Requiere factores deelongación DSIF,ELONGATOR,FACT, Spt6, ELL…etc.
-
Termino de latranscripción
Región reconocidapro la polimerasa(10-12 pb ricos enT).Región reconocidopor elementosterminadores Reb1p(10 pb) en S.cerevisiaeTTF-1(18 pb) enratón.
No clara -
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MODIFICACIONESPOSTRANSCRIPCIONALES
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RNAm Eucarionte:Adición del CAPo “capuchón”
7-metil guanosina7-metil guanosina
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RNAm Eucarionte:Metilación del CAP
• Ocurre antes que la cadena tenga 20nucleotidos de largo.
Se añade un residuo 7-metil guanosina,por una guanililtransferasa en forma reversa.
Se forma un puente 5´-5´ trifosfato
El “capuchón” o “capping” puede estarmetilada en O(2´) (1 o dos nucleosidosterminales) o no (cap-0).
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RNAm eucarionte: Adición de la cola de poliA
Secuencias consenso
PABP
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RNAm eucarionte:Sólo después de la modificación en 5’ y 3’ocurre el corte y empalme/ “splicing” de exones
Este proceso de remoción de exones es llevado a cabo por un cuerpo desplicing con snRNA catalíticos (Joan Steitz, 1960).
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RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing
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RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing
Esta conducción (transporte yarrastre de RNA) es llevado acabo por apareamiento debases formando heteroduplexRNAm-snRNA
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RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing
Ex1
Ex2
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RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing
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Functional roles for each snRNP
U1 Initially bound to 5'-splice site. Determines which 5'-splice site is usedReleased on recruitment of U4/U5/U6 ?
U2 Initially binds branchpoint sequence.Brings intron 5'-splice site close to the branchpoint
U4 Initially complexed with U5 and U6 Keeps U6 in an unfolded conformationReleased after delivering U6 to the 5'-splice site
U5 Initially complexed with U4 and U6 Binds exon sequences LocationUpstream of 5'-splice site Downstream of 3'-splice site ?
U6 Initially complexed with U4 and U5 Displaces U1 from 5'-splice site Formsduplex with intron sequences Complexes with U2. Brings intron 5'-splice siteclose to branchpoint
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Cromatina y Regulación Transcripcional
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PROMOTOR exón 1 exón 2intrón
5’ 3’
transcripción
La mayoría de los cambios en los niveles de mRNA ocurrenpor variaciones en la transcripción.
m7GpppN
AAAAAA5’ 3’
mRNA
Región CodificanteRegión Reguladora
Controla la tasa a la cual la RNApolTranscribe la región codificantedel gen.
Los genes tienen dos regiones distintas funcionalmente:
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Componentes de la Región Reguladora de un gen
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Promotores y la Maquinaria basal de transcripción
Funciones del “Promotorromotor MMíínimonimo””:
•Sitio de unión de la RNApolII, factores generales de transcripción y coactivadores.
Controla el sitio de inicio de la transcripción y la direccionalidad.
•Responde a elementos activadores o silenciadores.
•Necesarios para la transcripción basal
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Promotores y Potenciadores
Promotor Proximal: Se encuentran muy cercanos al sitio de inicio de la transcripciónaprox. de 50 a 200 pb. A estas regiones se unen proteínas activadoras.
Potenciador: Potenciadores (“Enhancers”) son secuencias capaces de inducir unincremento en la transcripción de un gen. Se encuentran localizados río arriba o abajoa distancia del sitio de inicio de la transcripción o en Intrones.
Activadores/ RepresoresEnhancers / Silencenciadores
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Organización y Función de unPotenciador:
• Diferentes combinaciones de proteínasactivadoras los reconocen.
Pueden funcionar de manera tejido-especifica
Funcionan a distancia eindependientemente de la orientación.
• Pueden estar compuestos por móduloscon diferentes secuenciasconsenso (cooperatividad).
• A los enhancers se unen activadores yotras proteínas con actividadremodeladora
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Formación del complejo de inicio de transcripción
Ensamblaje
Inicio de latranscripción
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RNA polimerasa
DNA de doble héliceDNA desenrollado
(17 pb abiertos)
Formación del complejo de inicio de transcripciónSe abre la doble hélice del DNA (17pb) y se forma la “burbuja de
transcripción”
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Transcripción en Eucariotas.
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REGULACIÓNPOSTRANSCRIPCIONAL
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Policistronic transcription
DNA
mRNAtranslation
degradation
protein
Celularfunctions
Levels of gene expression regulationin bacteria
mRNA stability(half life)
Degradationof RNA
Postranscriptionalcontrol
Transcriptionalcontrol
Translationalcontrol
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mRNA
Postranscriptional regulation
mRNA stability(half life)
Degradationof RNA
mRNAsteady-state levels
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mRNAstability °radationcontrol
pre-mRNAprocessing
proteinstability °radationcontrol
Eucariotes
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Significado biológico dela estabilidad del mRNA
Significado biológico dela estabilidad del mRNA
La expresión genética es modulada por los niveles
estacionarios del mRNA disponibles para la producción
de proteínas, los cuales son producto del equilibrio
entre la síntesis (transcripción) y la degradación
(estabilidad) de los transcritos.
Mayor estabilidad mRNA = Mayor expresión genética
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Características importantes de la abundancia del mRNAen bacterias:
¿Qué determina laestabilidad de un mRNA enla célula?
1. ¡ La estructura del RNA !
2. ¡ La tasa de degradación del RNA !Actividad de proteínas que degradan el mRNA(Degradosoma y otras ribonucleasas)
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Toma nota:
La estabilidad y la tasa de degradación del mRNA regulan laexpresión genética de dos maneras:
1. La estabilidad determina el tiempo en el cual un mRNApuede estar presente para ser traducido
2. La estabilidad del mRNA regulada así misma porestímulos del ambiente celular, provee un medio derespuesta mediante el control de la capacidadtraduccional
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AUUUA
mRNA Elemento estructural
3´ UTR
Elementos ricos en AU y tractos de PyAn
Tallo-burbuja del 3´ terminal
Histonas
An
c-myc, c-fos
Elementos en la región codificante
Jeff Ross 1995
PyBP
p70
AAAAAAAAn
PABP
Tracto de poli (A)
Todos
AUBP
Py
Algunos
Elementos estructurales del 3´ UTR que regulan laestabilidad del mRNA en eucariontes
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Jeff Ross 1995
AUG UAA
AUG UAA
AUG UAA
Desadenilación
Decapping
AAAAAAAAA250
A-10
7mGpppG
7mGpppG
pG
3´ UTR
Degradación3´ – 5´
En eucariontes la degradación del tracto de poli (A)inicia el decaimiento del mRNA
AAAAAAAAA250
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RNases involved in mRNA degradationin bacteria
• RNase E Poly(A) ribonucleaseEndonuclease
• PNPase Poly(A) ribonucleasePoly(A) polymeraseExonuclease 3´to 5´
• RNase II, III
DEGRADOSOME
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Degradación 3’-5’
Ojo:
Siempre ocurre unahidrólisis espontáneade los enlaces 5’-5’ y5’-5’ en ambosextremos.
La disminución de lapoliA y del CAP
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Differences in mRNA degradation mechanismsbacteria eukayotes
mRNAs are unstable with halflives of minutes to 1 hr
Endonucleolytic cleavage is thefirst step in degradation
Major via: 3´to 5´. Has not beendetected 5´to 3´exoRNases
mRNA decay is not linked to3´end formation
Poly(A) tract destabilize RNAs
Poly(A) tail length control inimportance in mRNA stability ?
mRNAs are more stable hours todaysEndocleavage is less importantDeadenylation 3´- 5´ is the firststepMajor via: 5´to 3´degradationDegradation mechanisms are linkedto 3´end formation andtranscription of mRNA
Poly(A) tract, PABs stabilizesmRNAsPoly(A) tail length control isimportant in mRNA stability
CAP-dependent decay mechanisms(decapping enzymes)
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1.- Polinucleótido fosforilasa (PNPasa): Actividad 3’ a 5’ procesativa
2.- RNasa II: No son específicas y son procesativas 3’ a 5’ exoribonucleasa
3.- RNasa D: 3’ a 5’ exoribonucleasa, participa en la maduración de pequeñosRNAs estables.
4.- RNasa BN: Esencial en la maduración del extremo 3’ de ciertos tRNAs de fagos.
5.- RNasa T: Maduración del 3’ de pequeños RNAs estables,tRNA y rRNA, reciclamientode tRNAs
6.- RNasa PH: 3’ a 5’ distributiva
7.- RNasa R: 3’ a 5’ procesativa
8.- Oligoribonucleasa: Actividad 3’ a 5’ exonucleasa específica para pequeñosoligonucleótidos .
Funciones asociadas a cada componente del degradosoma
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LA TRADUCCIÓN
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La traducción
La traducción corresponde a lasíntesis proteica que se lleva acabo en los ribosomas.
Una vez traducida la informacióncontenida en los RNAm paragenerar las cadenas deaminoácidos, no hay “vueltaatrás” en el flujo informativo.
El flujo de información hacia lospolipéptidos constituye unproceso irreversible.
mRNA
proteína
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Estructura de Ribosomas
23S(2900 bases)
rRNA
5S(120 bases)
Proteínas(31)
Proteínas(21)
16S(1500 bases)
28S:5.8S(4800+160 bases)
5S(120 bases)
28S
5.8S
18S(1900 bases)
Eucario
nte
sP
rocario
nte
s
Proteínas(50)
Proteínas(33)
50S
30S
60S
40S
70S
80S
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Anatomía de los ribosomas
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EPA E P A
Traten de no verlo en 2D
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Ribosomas (RNAr +proteína)
Aminoacil-RNAt
RNAm
proteínas
cationes
GTP
El ensamblado de unaproteína requiere los 3 tiposprincipales de RNA yelementos accesorios:
TRADUCCIÓN
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Inicio de lacadena
Elongación
Terminación
LA SÍNTESIS DE UNA CADENA POLIPEPTÍDICA PUEDEDIVIDIRSE EN TRES ETAPAS DISTINTAS
TRADUCCIÓN
30S
50S
Met
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Iniciación:Formación del complejo de iniciaciónColocación del ribosoma en el codón AUGPosicionamiento de la primera metionina
Alargamiento:Adición de todos los aminoácidoscon enlace peptídico entre ellos
Terminación:Reconocimiento de codón determinación y liberación del peptido y delribosoma
PASOS GENERALES DE LATRADUCCIÓN
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INICIO
Paso 0. Reconocimiento de lasecuencia señal Shine-Dalgarnopor la subunidad menor delribosoma.
PASO 1. Traslado de lasubunidad pequeña alcodón de inicio
PASO 2. Traslado delprimer aa-tRNA (f-met)al ribosoma
PASO 3. ensamblado delcomplejo de iniciocompleto.
30S
AUG
1
2
3
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unión de los factores deiniciación IF-3 e IF-1
unión del RNAm – SecuenciaShine Dalgarno.
unión de la subunidad 30S conel RNAm en el codón de inicioAUG, se requiere de IF1 e IF3
30S
AUG
El ribosoma seune al DNA enun sitio preciso
La unión a este codón pone alribosoma en el marco de lectura=lectura correcta del mensaje
La interacción entre estas secuenciasComplementarias en el mRNA y elrRNA lleva a unión de la subunidad30S al codón de inicio
5-10nucleótidos
INICIO
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ELONGACIÓN
PASO 1. Selección delaminoacil tRNA
PASO 2. FORMACIÓN DELENLACE PEPTÍDICO(liberación de EF-Tu GDP)
PASO 3. TRASLOCACIÓN(dependiente de EF-G ehidrólisis de GTP)
PASO 4. LIBERACIÓN DELtRNA DESACILADO
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TERMINACIÓN
La terminación requiere factoresde liberación (RF) que reconocenlos codones de terminación.
Codones de terminación.
UAA, UAG, UGA
RF1=> UAA y UAG /
RF2 => UAA y UGA
Ruptura del enlace ester entre el aa ysu RNAt del último aminoacil-RNAt.
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Antibiótico Acción:
Estreptomicina Provoca una mala lectura del código genético en las bacterias a concentracionesrelativamente bajas e inhibe la iniciación a concentraciones mayores, enlazándose ala subunidad ribosómica 30s.
Tetraciclina Se une a la subunidad 30S del ribosoma e inhibe la elongación impidiendo la unióndel aminoacil-RNAt (Procariontes) que bloquea el sitio A.
Cloramfenicol Inhibe a la peptidil transferasa (Procariontes). Bloquea la fase de la transferenciapeptídica de la elongación en la subunidad ribosómica 50s, tanto en las bacteriascomo en las mitocondrias.
Cicloheximida Impide la elongación bloqueando a la peptidil transferasa de Eucariontes (tóxico,espermicida y mutagénico).
Eritromicina,macrólidos ylincosamidas
Se enlazan a las subunidades ribosómicas 50s, inhibiendo la reacción de lapeptidiltransferasa o la traslación, o ambas cosas.
Puromicina Causa terminación prematura de la traducción. Actúa como análogo estructural delaminoacil-RNAt. Se enlaza al sitio A del ribosoma y participa en la formación deenlaces peptídicos, produciendo peptidil-puromicina.
Toxina diftérica Inhibe a la translocasa eEF-2 (eucariote). Es un péptido de 535 residuos de a.a.unidos por S-S.
Aminoglucósidos La tobramicina y la kanamicina evitan la asociación ribosómica al final de la fase deiniciación y provocan una mala lectura del código genético.
Inhibidores de la traducción (anótalos)
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60 S
40 S
eIF 6
eIF 3
Complejo de iniciación
¿Espontáneo?
eIF-4C
eIF 4B
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eIF 3
Interacción del complejo ternario con la subunidad40 S para formar el complejo de preiniciación
43-45Scomplejo de preiniciación
complejo ternario
eIF4C
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AUGCap
4G
4A
4E
4B
eIF 3eIF4C
5’
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Cap5’
4G
4A
4E
4B
eIF4CeIF 3
AUG
eIF5
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Alargamiento
Factores de reconocimiento al Cap
eIF 4FeIF 4F Ayuda a la union del ribosoma
4G
helicasa4A
AUG
40 S
4E
Reconocimientoy unión al Cap
eIF-4BEstimula a la helicasaSe una al eIF-3
5’ Cap
Factores de laFactores de la iniciaciiniciacióón de la traduccin de la traduccióón (eIFs)n (eIFs)
AUG40 S
60 S
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3’Cap AU
G
5’ NNN
EF-1 .GTP. aatRNAP
E
A
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3’Cap AU
G
5’ NNN
EF-1 .GDP. aatRNAP
E
A.GTP.
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3’Cap AU
G
5’ NNN
P
Translocación
NNN
E
A
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3’Cap AU
G
5’ NNN
P
Translocación
NNN
EEF-1a.GTP.aatRNA
A
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3’Cap AUG5’ NNN NN
N
P
NNN
UAG
Terminación
Cuando los RFs reconocen a los codones de terminación, activan al ribosomapara que se hidrolice el peptidil tRNA mediante una reacción semejante a la detransferencia del peptidil, solo que el aceptor es H2O en vez del aa-tRNA.
eRF 3
eRF1.GTP
A
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3’Cap AU
G
5’ NNN
UAG
RF.GTP
Proteína
RF 3
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Terminación
UAA (codón de término)
“STOP”
Factor de liberación o determinación (RF)
Los codones UAA, UAG y UGAno son reconocidos por ningúnRNAt
RF1=> UAA y UAG / RF2 => UAA y UGA
Ruptura del enlace
éster
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IRES: región de unión interna del ribosoma
pNp AUG
AU
G
AU
G
AU
G
Poli AALTORNT 3’
ITAFs
IRES
AUG
RNT 5’ UAAUAGUGA
eIF 3
eIF2Met GTP
Complejo ternario
Traducción
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3’ AAAAA1 743 7441
ORF
RNT 5`
I IIIII
IV
V
VI
RNT 3’
PoliproteínaCap 5’X
Historia: Traducción de Poliovirus
AUG
AUG AUG AUG
PTBPTB
PCBP2
La
Proteínas celulares eIFs
IRES
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RNA ribosomal 28 SRNA ribosomal 28 SPeptidil-transferasa
La resolución atómica de cristales de estructuras de la subunidad ribosomal 60Sprueban que la peptidil transferasa, localizada en el centro del ribosoma, esta compuestaen su totalidad por RNA; el ribosoma es una ribozima.
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Se doblan en formas tridimensionales y forman las plataformas en las quese ensamblan las proteinas ribosomales.
RNA ribosomales pequeRNA ribosomales pequeñños 5 y 5.8 Sos 5 y 5.8 SPapel estructural
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RNA de transferenciaRNA de transferencia
D
ABrazo aceptor
C
C
Brazo T C
Brazo extra
ANTICODON
NNN
Brazo D
CODON
Añadido despuésde la síntesis yprocesamiento deltRNA
La ribosa se uneal carbón 5 en vezde al N 1 deluracilo.
mG
El uridilato metilado estimidilatoPseudo uridina
7pb no Watson
5’
dihidrouridina
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The Aminoacyl Synthetase binds both the anticodon (top) and the amino acid acceptor(bottom) and attaches the appropriate amino acid according to the Genetic Code.
The exact mechanism by which this recognition takes place is uncertain, and hassometimes been described as a "second genetic code".
Aminoacil tRNA sintetasaAminoacil tRNA sintetasa
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ORFORF
Cap AAAAAAA
AUG
UAG- ÁmbarUGA- ópaloUAA- ocre
RNT 5RNT 5’’ RNT 3RNT 3’’
5’ 3’
RNA mensajero (mRNA)RNA mensajero (mRNA)
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EL CÓDIGO GENÉTICO
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UUU UUUUUU Phe PhePhe
AAA AAAAAA Lys LysLys
CCC CCCCCC Pro ProPro
+
+
+
RNAm sintético Polipeptido
Extrácto Bacteriano
ACA ACACAC CAC
HisThr HisThr
ACA ACAACA ACA CAC CACCAC CAC
Thr ThrThr Thr His HisHis His
(mezcla de aa y uno radiactivo cada vez)
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1. Es una regla de correspondencia entre los codones (F. Crick y Sidney Brenner,1961) y anticodones que permite el acoplamiento o ensamble de los residuosde aminoácidos cargados por la aminoacil-t-RNA sintetasa.
2. El codón es un triplete de nucleótidos,
3. El codón constituye una “palabra” en el lenguaje de los ácidos nucléicos que estraducida para codificar un aminoácido.
4. El código es universal, desde las bacterias hasta el hombre *.
5. La interpretación de los codones por aminoácidos es igual en todas las células,todas "leen" de la misma manera los genes.
El Código Genético Estándar
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5. El código esta basado en tripletes, sin puntuaciones ni sobrelapamientos.
6. Posee un codón de inicio* y tres codones de término (UAA, UAG, UGA).
7. Todos los tripletes tienen un sentido y marco de lectura.
8. Es un código degenerado (sinonímica o redundancia no uniforme).
9. No es ambiguo (es inequívoco)*.
10. Tiene un carácter altamente conservativo (atenuador) de mutaciones..
11. Requiere un “adaptador” para traducir la información genética en proteína(tRNA).
12. La disponibilidad de los tRNA redundantes (sinonímias) genera laaparición de “dialectos” o índices de uso preferencial de codones (IchiIkemura). CAI (codon adaptation index).
El Código Genético Estándar
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El Código Genético Estándar
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Aminoácidos hidrofóbicos ---hidrofílicos
Máxima amortiguación en cambios puntuales
El Código Genético Estándar
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La hipótesis del balanceo de Crick
La “wobble hypothesis” de Crickproponía que las dos primeras basesdel codón deben poseer paresgeométricos Watson-Crick normales,mientras la tercera podía ser“solapada”.
Sólo existen limitaciones estructuralesen los dos primeros apareamientos y latercera base permite flexibilidad yajustes conformacionales.
De esta forma se necesitarían almenos 31 tRNA aminoacil cargadospara leer los 61 codones posibles.
S. cerevisiae sólo tiene 25 aminoacil-tRNA para leer el código del mensajerosegún su ICA.
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Selenocysteine Selenocysteine is an aminoacid
that is present in several enzymes(for example gluthatione,peroxidases, tetraiodothyronine 5'deiodinases, thioredoxinreductases,formatedehydrogenases,glycinereductases and somehydrogenases).
Selenocysteine has a structure similarto cysteine, but with an atom ofselenium taking the place of the usualsulfur.
Proteins that include a selenocysteineresidue are called selenoproteins.
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Selenocysteine
Selenocysteine is encoded in aspecial way by a UGA codon,which is normally a stop codon.
The UGA codon is made toencode selenocysteine by thepresence of a SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence)in the mRNA.
The SECIS element is definedby characteristic nucleotidesequences and secondarystructure base-pairing patterns.
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Selenocysteine tRNA
The primary and secondary structureof selenocysteine tRNA, tRNA(Sec),differ from those of standard tRNAs inseveral respects, most notably in:
An 8-base (bacteria) or 9-base(eukaryotes) pair acceptor stem.
A long variable region arm,
Substitutions at several well-conservedbase positions.
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MODIFICACIONESPOSTRADUCCIONALES
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¿Porqué las proteínas son modificadaspostraduccionalmente?
Regulación de la actividad Activar función Apagar función Generar una función diferente
Propiciar interacciones proteína-proteína El sitio modificado puede ser una interface de unión.
Localización subcelular El sitio modificado puede ser una señal de localización. El sitio modificado puede ser un anclador a la membrana.
Envejecimiento La modificación puede identificar a la proteína para ser degradada. La modificación puede marcar a una proteína para ser procesada.
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Ejemplos
•Apropiado plegamiento y propiedades mecánicas mejoradas (ej. Triple hélice delColágeno)
•Solubilidad de las proteínas (carbohidratos)
•Estabilidad o inestabilidad de las proteínas (carbohidratos, ubiquitinación,fosforilación)
•Procesamiento proteolítico (remoción de secuencia líder)
•Localización de proteínas ( anclaje a lípidos de membrana, destino a lisosomaspor la presencia de Manosa-6P)
•Regulación de interacciones moleculares (fosforilación, acetilación, acilación,glicosilación).
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Modificaciones postraduccionales
Mann and Jensen, Nature Biotech. 21, 255 (2003)
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EL SISTEMA DE OPERONES
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PIPOZYA
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Sistemas de operón
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