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Canales iónicos
Luciano Moffatt
INQUIMAE
Tópicos de Fisicoquímica en Sistemas Biológicos
16 de noviembre 2004
• Qué son los canales iónicos?
• Cuáles son sus roles fisiológicos?
• Cómo se los estudia?
Que son?
• Proteínas de membrana que tienen permeabilidad selectiva por ciertos iones.
• Son multiméricas con varios dominios trans-membrana
• Comprenden de:– Poro– Compuerta (gate)– Filtro (selectivity filter)– Sensor (voltage, neurotransmisor, etc)– Mecanismo de transduccion
Que no son?
• Transportadores (2 gates)
• Receptores metabotropicos (no ionotropicos)
Bomba sodio
Ionotropico vs metabotropico
Que hacen?
• Son responsables de la permeabilidad selectiva de la membrana
• Permiten cambios rápidos en la concentración de iones (calcio) y del potencial de membrana (transmisión de la información a distancia).
Que no hacen?
• Mantener la concentracion diferencial ambos lados de la membrana, esto lo hacen las bombas
Como se los estudia
• Se mide la corriente que pasa a través de ellos. Como solo se puede medir la corriente total, se deben eliminar otros canales.
Dos estrategias• Se buscan células que expresen el canal de
interés, los otros canales se bloquean farmacológicamente
• Se usan células que expresen naturalmente pocos canales, se sobre-expresa el canal de interés. (Util para mutagénesis).
Como se los estudia
• Se miden diferentes parametros:– Conductancia– Permeabilidad relativa a distintos iones– Probabilidad de apertura en distintas condiciones
• Se analiza la modulación por distintos factores (potencial de membrana, concentracion de agonistas, ph, concentracion de iones, temperatura, etc)
• Se analizan transitorios y situaciones de steady state
Sistemas de expresion
• Se tiene el gen o genes clonados y se los expresa en algun sistema, tipicamente:– Oocytos de Xenopus: se inyecta RNA.– Celulas HEK-293: se transfecta con el
plasmido con un promotor fuerte. Se usa lipofectamina.
Oocytos de Xenopus
• Lupa, no microscopio• Expresion a 20C• Corrientes grandes:
µA• Aplicación lenta del
agonista (10ms-1s)• Voltage clamp lento
Celulas HEK 293
• Mas parecido al mamifero: expresion a 37C
• Microscopio• Patch clamp: voltage
clamp rapido• Uso de EGFP para
detectar la eficiencia de la transfeccion
• Aplicación del agonista hasta 100µs
Sistemas nativos
• Cultivos primarios: modificaciones post-traduccionales, distribucion celular
• Fetas de tejidos (slices): conexiones sinápticas
• In vivo: patrones de actividad sinaptica
Voltage clamp
voltage clamp vs current clamp
• Voltage clamp: como las propiedades del canal dependen del potencial de membrana, conviene mantenerlo constante.
• Current clamp: estudiar los canales en un contexto natural
Modelo RC de la membrana
• Capacidad de las membranas: 0.01pF/µm2
• Densidad de canales: 1-1000/µm2
• 1 canal-0.5ms
• En voltage clamp a Vm=cte la capacidad de la membrana no influye
• Se corrige la capacidad para saltos de Vm
Patch clamp• Gigaseal• Canal
unico
Whole cell vs patch
• Whole cell: mas fisiologico.
• Isolated Patch: mas versatil (1 µm2)
Canal unico
Equipamiento
Amplificador de patch
Ejemplo de estudio de canal unico
Estrategia de analisis cinetico
• Obtener datos de canal unico y/o de macrocorrientes en distintas condiciones de Vm, concentracion de agonista, etc
• Proponer un modelo cinetico markoviano• Optimizar los parametros del modelo que
minimicen la suma de los cuadrados de los residuos.
• Si la prediccion no resulta buena cambiar el modelo cinetico.
Modelos cineticos
• Ver apunte de Sigworth
Ejemplo de modelo cinetico
Ejemplo de estudio de macrocorrientes
100%
100 ms
100%
100% 1 ms
100%
100%
1 ms
100%
100%
100 ms
100%
AB
C D
C13kon
C2 C3 C4 O52kon kon
2koffkoff 3koff
C1/2/3 C4 O5
3koff
C13kon
C2 C3 C42kon kon
A Scheme I
B sub-Scheme Ia
C sub-Scheme Ib
C13kon
C2 C3 C4 O62kon kon
2koffkoff 3koff
D Scheme II
F5k+
3k-
Alosterismo
C1
O9
F6 F7 F8
O14 O15 O16
EB-1 EB-1 EB-1 EB-1
EEE
K 1/3K
1/3KK3K
2KA 1/2KA
1/2KA2KAEB-3
C2 C3 C4
O10 O11 O12
E
3KA
3KA
F5
O13EB-3
3K
FA-3 FA-2 FA-1 F
FA B-3 FA B-2 FA B-1 FB
Scheme III
C1
O11
F5 F6 F7
O15 O16 O17
F8 F9
O18 O19
F10
O20
EB-3 EB-3 EB-3 EB-3
EB-2EB-2EB-2
EB-1EB-1
E
KFB
3K 1/3K
1/3KK3K
2K 1/2K
1/2K2K
K
K
2FB 3FB
3F2FF
C2 C3 C4
O12 O13 O14
1/2F F
1/2FB FB
1/3FB
1/3F
SCHEME IVB
Performance de modelos
Applied ATP (µM s)
0.01 0.1 1
Nor
mal
ized
Am
plitu
de
0.001
0.01
0.1
1
Applied ATP (µM s)
0.01 0.1 1
rise
(m
s)
0.1
1
Applied ATP (µM s)
0.01 0.1 1
dela
y (m
s)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Applied ATP (µM s)
0.01 0.1 1
deca
y(m
s)
10
100
I
II
IV
III
II, 4 steps
III
IIIIV
II, 2 steps
I
II
III
IV
III
IVIII
Resumen
• Mediante los modelos cineticos se puede describir y predecir cuantitativamente el comportamiento de un canal en condiciones arbitrarias de los factores que definen su comportamiento (Vm, concentracion, etc)
• El paso siguiente hacia arriba es construir una celula virtual donde se puede predecir la interaccion entre distintos canales
• Para abajo se puede tratar de determinar la base estructural de las diferentes constantes cineticas obtenidas.