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Caracterización morfológica, fisiológica y molecular de aislamientos de amebas de
vida libre (Acanthamoeba) obtenidas del medio ambiente y de pacientes con
queratitis amebiana.
Laconte M Laura 1, Rivero Fernando
2, Lujan Hugo
2, Casero Rodolfo
1
1 Departamento de Parasitología Hospital de Clínicas. Facultad de Ciencias Médicas.
Santa Rosa 1564 (5008).Universidad Nacional de Córdoba. 2 Laboratorio de Biología
Molecular de Parásitos. Facultad de Medicina. Universidad Católica de Córdoba.
rodaca@argentina.com
TE de contacto 3516073378
2
RESUMEN
Las amebas de vida libre (AVL) son protozoos ubicuos que a menudo se comportan
como agentes infecciosos para humanos. Para conocer si AVL obtenidas del ambiente
(CA) presentan características similares a cepas clínicas (CC), evaluamos la morfología,
la termo/osmotolerancia y caracterización molecular de estos aislamientos. De un total
de muestras (n=142, CC n=134, CA n=8), la frecuencia de aislamiento de AVL en CC
(3/134) fue del 2,2%. Trofozoítos recuperados de CC revelaron mayor crecimiento a
37º C comparados con los de CA, en relación a la osmotolerancia, el 87,5% de las cepas
crecieron bajo diferentes concentraciones de manitol (0,5-1,5M). La caracterización
molecular por PCR reveló amplicones compatibles con género Acanthamoeba, en el
100% de las CC y el 20% de las CA, dato que permitió reclasificarlas dentro del Grupo
II de Pussard y Pons. Las diferencias fenotípicas y genotípicas entre CC y CA podrían
reflejar rasgos patogénicos de cada aislamiento.
Palabras clave: Acanthamoeba, queratitis, tipificación molecular, osmo-
termotolerancia, exflagelación.
Abreviaturas: AVL: amebas de vida libre, CC: cepas clínicas, CA: cepas de ambiente;
QA: queratitis amebiana, ANNE: agar no nutritivo enriquecido, PAGE: sol de
electrolitos según PAGE, PYG: proteosa, levadura, glucosa, ASA.S1: Acanthamoeba-
specific amplimer” S1.
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INTRODUCCIÓN
Las amebas de vida libre (AVL) son protozoos amfizoicos que se encuentran
ampliamente distribuidas en el medio ambiente, habitando en una variedad de
ecosistemas como el aire, suelo, aguas (dulces, saladas, residuales, agua mineral
embotellada, piletas de natación), productos alimenticios, materia fecal, tracto
respiratorio, etc (1,2). El ciclo de vida de las AVL está compuesto por dos diferentes
biotipos: los trofozoítos, formas tróficas y reproductivas, y los quistes o estadío de
resistencia, capaces de permanecer viables durante años en el medio ambiente, por lo
que la exposición humana a estos protozoos ubicuos resulta muy frecuente. No obstante,
especies de estas amebas pertenecientes a los géneros Acanthamoeba, Balamuthia,
Naegleria y Sappinia no sólo son de patogenicidad reconocida para los humanos y
animales, sino que al transportar en forma simbiótica bacterias en sus citoplasmas
podrían desempeñarse como potenciales vectores de otras enfermedades infecciosas
(3,4). Las patologías ocasionadas por estas amebas oportunistas incluyen infecciones
diseminadas (dermatitis, neumonitis, encefalitis, meningoencefalitis) o localizadas
como en el caso de la queratitis amebiana (QA), infección del tejido corneal producida
por especies del género Acanthamoeba (5,6). Si bien los mecanismos potenciales que
ponen en marcha estos parásitos para colonizar e infectar huéspedes permanecen aún en
estudio, numerosos reportes demuestran que especies de AVL obtenidas de nichos
naturales poseen morfotipos y mecanismos de virulencia similares a los que se
describen en cepas aisladas de tejidos humanos. Pussard y Pons (7) clasificaron estas
amebas en base a la estructura de sus quistes en grupos I, II y III (GI, GII, GIII) y
posteriormente se asociaron AVL pertenecientes a los GII y GIII con infecciones en
humanos, principalmente queratitis y encefalitis. Uno de estos marcadores de
patogenicidad es la termo-osmotolerancia, capacidad que poseen ciertas amebas para
sobrevivir al estrés y que esta fuertemente asociada con la virulencia de cepas aisladas
tanto de nichos naturales como de tejidos humanos (8). El propósito de este trabajo fue
aislar en nuestro medio cepas de AVL de pacientes con QA y del ambiente a fin de
estudiar comparativamente sus aspectos morfológicos, fisiológicos y moleculares, con
el objetivo de determinar si existen patrones de comportamiento similares entres los
aislamientos y poder establecer una probable asociación entre cepas ambientales y
patología en humanos.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de las muestras
Entre Enero de 2009 y Diciembre de 2012 se realizó la pesquisa de cepas de AVL en
muestras provenientes del medio ambiente (CA): aguas de ríos (n=3, Ríos Quilpo,
Suquía y San Marcos, Provincia de Córdoba, Argentina), aguas estancadas de fuentes
(n=2), de soluciones salinas de hisopados anales efectuados en pacientes pediátricos
(n=3) y de muestras clínicas (CC): líquidos de lentes de contacto de pacientes con
úlceras de córnea ( n=17), epitelio corneal de pacientes con queratitis amebiana
(n=117). Del total de muestras recolectadas (n=142), 8 arrojaron cultivos positivos para
algún tipo de AVL: a) aguas de fuentes (n=2), b) proveniente del líquido conservante de
lentes de contacto (n=1), c) epitelio corneal de pacientes con queratitis amebiana (n=2),
d) solución salinas de escobillados anales con AVL (n=3) , las que fueron incluidas
dentro de las CA debido al hallazgo reiterado de estos protozoos como contaminantes
de soluciones salinas y en particular en muestras provenientes de escobillados anales.
Para el análisis de las muestras de ríos, se recolectaron 500ml de agua de cada fuente
natural en frascos estériles, los que fueron filtrados en gasa doble, centrifugados 10 min
a 3000rpm y posteriormente 50µl del sedimento fueron sembrados en medio de cultivo
para AVL. Las muestras clínicas se obtuvieron de pacientes con queratitis y/o úlcera
corneal que acudieron a la consulta al Servicio de Oftalmología del Hospital de
Clínicas. Tras la observación de la lesión bajo lámpara de hendidura, y previa anestesia
de la córnea, las muestras fueron extraídas con aguja hipodérmica e inmediatamente
sembradas en medio de cultivo. Para el estudio de las soluciones conservadoras de las
lentes de contacto, el contenido líquido de los estuches fue centrifugado por 10 min a
3000rpm y 50 µl del sedimento sembrado en medio de cultivo para AVL. Las muestras
salinas de escobillados anales conteniendo sus hisopos fueron homogeneizadas por
agitación durante 2 min, centrifugadas durante 10 min a 3000 rpm, y posteriormente
50µl del sedimento fue sembrado en placas con medio de cultivo para AVL.
Aislamiento de AVL
El aislamiento de las cepas se realizó en placas con medio de cultivo ANNE, base de
agar no nutritivo en solución salina PAGE enriquecido con una suspensión de
Escherichia coli ATCC 25922 (9). Las muestras fueron incubadas entre 7 y 15 días a
28° C y examinadas cada 24hs en microscopio de luz invertida para evaluar su
crecimiento. Posteriormente fueron mantenidas in vitro a partir de repiques realizados
5
mediante la extracción de fragmentos de agar obtenidos de cultivos tardíos (15 días), los
que fueron transferidos sucesivamente a nuevas placas de ANNE y conservados a
temperatura ambiente hasta su uso.
Identificación molecular
La extracción del ADN de las cepas se realizó a partir de suspensiones de 105
– 106
quistes /ml provenientes de cultivos en ANNE de 7 días, según protocolo de Schroeder
y col (10). Los primers género-específico que se utilizaron para desarrollar la PCR,
fueron JDP1 (5’GGCCCAGATCGTTTACCGTGAA) y reverso JDP2
(5’TCTCSCAAGCTGCTAGGGGAGTCA), los que amplifican una región específica
del ADN ribosomal (18S rDNA). El producto de la PCR de acuerdo a este protocolo
presenta un amplicon entre 423 a 551 pb, denominado ASA.S1 (Acanthamoeba-
specific amplimer” S1) (11).
Caracterización morfológica de quistes y trofozoítos
Los quistes provenientes de cultivos en ANNE de 7 días fueron removidos del agar
mediante 3 lavados sucesivos con 2,5 ml de solución salina de PAGE, el volumen final
fue centrifugado durante 5 min a 2500 rpm y del pellet se tomaron 20 µl y tras la
observación de 10 campos con micrómetro ocular, se evaluaron sus tamaños y
morfotipos para clasificarlos en GI, GII o GIII según criterios de Pussard y Pons (7,
12). Paralelamente para comprobar su viabilidad se tomaron alícuotas de 20 µl de
quistes centrifugados y se mezclaron con igual volumen de solución de Azul de Tripan
0,7%. La caracterización morfológica de los trofozoítos se realizó con amebas
provenientes de cultivos tempranos (48 hs) en ANNE y resuspendidas en PAGE. Para
evaluar la presencia de formas flageladas (exflagelación), suspensiones de trofozoítos
en 2ml agua destilada (grado 1,0 Mc Farland) fueron incubados durante 3 horas a 37ºC,
y posteriormente observados al microscopio óptico y de contraste de fase (13).
Crecimiento in Vitro, ensayos de termotolerancia y osmotolerancia
Quistes y trofozoítos mantenidos en medio ANNE fueron removidos del agar como se
indicó mas arriba, y fueron ajustados a una concentración de 103
-104
cel/ ml mediante
recuento en hemocitómetro de Neubauer. Para determinar la termotolerancia de cada
6
cepa, 50µl de cada suspensión fueron transferidos a placas policubetas conteniendo 2ml
de medio de cultivo axénico de PYG ( proteosa peptona, extracto de levadura, glucosa)
con antibióticos e incubados a 28º C, 37º C y 42º C durante 5 días (14,15). Todos los
ensayos de crecimiento in vitro (cultivos ANNE en placa de Petri y PYG en
policubeta), como los recuentos de quistes y trofozoítos fueron realizados por
duplicado. Para evaluar la osmotolerancia, quistes y trofozoítos mantenidos en medio
ANNE fueron removidos del agar, ajustados a una concentración de 105
cel/ ml como se
indicó anteriormente y 50µl de cada suspensión fueron transferidos a placas de ANNE
conteniendo manitol 0,5-1,0 y 1,5M respectivamente, e incubados a 28º C durante 7
días.
Análisis estadístico.
Para determinar la asociación entre parámetros de crecimiento, termotolerancia y
osmotolerancia entre diferentes cepas, se utilizó el test de chi cuadrado desde el
programa MedCal Version 10.0.2.
RESULTADOS
Del total de muestras recolectadas (CA+CC, n=142), aquellas que arrojaron cultivos
positivos para AVL (n=8) fueron seleccionadas para este estudio (Fig.1), siendo que del
total de CC (n=134) provenientes de abscesos corneales y del líquido conservante para
lentes de contacto, el aislamiento de AVL (3/134) arrojó una frecuencia del 2,2%. El
análisis morfológico de los trofozoítos de cultivo en ANNE, permitió observar la
presencia de acantopodios polidireccionales, formación de vacuolas contráctiles y
tamaño promedio entre 10-22,3 µm y la generación de formas flageladas (exflagelación)
solo se observó en una muestra proveniente de aguas. El morfotipo de los quistes se
determinó acorde a la presencia de núcleos visibles, endoquistes estrellados o
redondeados y ectoquistes arrugados o lisos, permitiendo su clasificación dentro de los
GII (n=6) y GIII (n=2) (Tabla1)(Fig.2). Si bien todas las cepas demostraron crecimiento
a las distintas temperaturas ensayadas, los trofozoítos recuperados de córnea CC 01 y
CC 79, axenizados en medio líquido PYG, revelaron a 37º C mayores patrones de
crecimiento comparados con las AVL aisladas de aguas y de escobillado anal
(p=<0,0001). En general las CA reflejaron mejor crecimiento a 28º y 42º C, mientras
que las CC a 28º C se desarrollaron en forma aletargada (p<0,05) (Gráfico I). En
7
relación a la osmotolerancia, el 87,5% (n=7) de las cepas estudiadas soportaron
concentraciones crecientes de manitol, dentro de las cuales todos los aislamientos
clasificados dentro GII proliferaron en medios con mayor estrés osmótico (Tabla 2). La
caracterización molecular por PCR reveló que el 50% (4/8) de nuestros aislamientos
correspondieron a amplicones ASA.S1 compatibles con género Acanthamoeba, y dentro
de las mismas el 75% (3/4) correspondió a CC y el 25% (1/4) a CA, dato que permitió
su posterior reclasificación morfotípica dentro del Grupo II según Pussard y Pons. El
análisis de los amplicones obtenidos del DNA extraído separadamente de trofozoítos y
de quistes no reveló diferencias en sus patrones de amplificación (Fig. 3).
DISCUSIÓN
Las amebas de vida libre han ganado creciente atención en la comunidad científica y
cada vez son más numerosos los estudios publicados vinculados con su biología celular,
fisiología, bioquímica y relación huésped-parásito (16,17). Estos microorganismos
amfizoicos de localización ubicua, tras miles de años de evolución desarrollaron
mecanismos adaptativos para sobrevivir al estrés del medio ambiente y junto a sus
huéspedes lograron sobrepasar el sistema inmune para comportarse como parásitos
oportunistas y causar diferentes patologías. Dado el incremento de casos de pacientes
con úlceras corneales compatibles con queratitis amebiana es que enfocamos nuestro
estudio al aislamiento de cepas de Acanthamoeba recuperadas tanto de muestras clínicas
como de cepas salvajes a fin de investigar paralelamente sus características biológicas,
fisiológicas y moleculares. Nuestros hallazgos evidenciaron que del total de muestras
oculares (n=134) provenientes de abscesos corneales y del líquido conservante para
lentes de contacto, el aislamiento de AVL (3/134) arrojó una frecuencia del 2,2%
ubicándose este dato por debajo de lo reportado por otros autores quienes describen una
frecuencia entre el 4 y 8% de este protozoo como causal de patología ocular (6).
Asimismo nuestros resultados en relación a la clasificación feno-genotípicamente,
permitieron ubicar a nuestros aislamientos como cepas de Acanthamoeba, los que
coinciden con las tipificaciones realizados en otros centros, donde se describe a este
género de AVL como el más detectado en infecciones corneales(16). Por otra parte
consideramos que el aislamiento de una cepa de Acanthamoeba proveniente de una
muestra ambiental (EA7) que fue clasificada dentro del GII, indicaría un potencial rol
patógeno en nuestro medio, tal como lo demuestran estudios realizados en los que se
aislaron en diferentes ambientes cepas de estas amebas oportunistas pertenecientes a
genotipos patogénicos(17). De igual manera en este estudio incluimos como CA a
8
muestras aisladas de soluciones salinas de hisopados anales ya que consideramos su
presencia en estos materiales como resultado de contaminaciones ambientales, lo que
refleja su capacidad de sobrevida en fomites y medios adversos. Los ensayos de
osmotolerancia reflejaron comportamiento similar en más del 80% de nuestros
aislamientos, a diferencia de otros reportes donde las cepas analizadas demostraron
mayor variabilidad para soportar el estrés osmótico. Estas características desarrolladas
por las AVL para soportar cambios del medio, han sido explicadas como el resultado de
modificaciones del citoesqueleto y en especial en la composición lipídica de sus
membranas, haciendo posible que trofozoítos termofílicos y quistes se mantengan
viables mediante procesos de enquistamiento y/o desenquistamiento (8, 18,19). Esta
adaptabilidad a variaciones abruptas de osmolaridad y salinidad, explicaría la
recuperación de cepas en tejidos humanos las que a su vez demostraron mejor
adaptación para crecer a 37º C. Si bien el análisis molecular nos permitió clasificar estas
AVL solo a nivel de género, en un futuro su genotipificación resultará de utilidad dado
que actualmente se conoce que distintos genotipos pueden producir distintas patologías
(T3 y T1 asociados a queratitis y encefalitis), a la vez que dentro de un mismo genotipo
pueden coexistir parásitos con distinta patogenicidad (20, 21, 22). Además luego de
evaluar las características de las cepas clínicas vs las de ambiente, este trabajo demostró
diversidad en los patrones moleculares como en algunos de los aspectos fisiológicos
analizados, datos que podrían reflejar no solo rasgos propios de cada especie, sino
además un potencial patogénico propio de cada asilamiento. Finalmente conocer más en
profundidad sobre la biología de estos protozoos, será de utilidad para evitar la
patología irreversible que a veces ocasionan, y al mismo tiempo facilitaría el hallazgo
de compuestos que pudieran ser utilizados para reforzar la terapia amebicida utilizada
en la actualidad.
9
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11
Tablas, Gráficos y Figuras
aguas de rios
aguas de fuentes
escobillado anal
liquido lentes de
contacto
cornea
cornea
escobillado anal
aguas
lentes de contacto
Figura1. a) Procedencia de las muestras analizadas, b) Cepas de AVL incluidas en el
estudio
Gráfico 1. Ensayo de termotolerancia a 28º,37º y 42º C de trofozoítos en medio axénico
PYG.
Tabla 2. Ensayo de osmotolerancia de trofozoítos frente a concentraciones
hiperosmóticas de manitol. Crecimiento (+) sin crecimiento (-)
Cepa
Manitol
01
GII
79
GII
48
GII
A5
GIII
A6
GII
EA7
GII
EA8
GIII
EA11
GII
0,5M + + + + + + - +
1,0M + + + + + + - +
1,5M + + + + + + - +
n=117
n=17
n=2 n=3 n=3
n=2
n=3
n=1
n=2
A B
12
Figura 3. Análisis por PCR de aislamientos de Acanthamoeba provenientes de CC y
CA: a) DNA extraído de trofozoítos (línea1) y quistes CC( línea2), b) cepas de CC y de
CA; línea 1, cepa control Acanthamoeba spp; línea 2, CA EA7 (Escobillado anal, DNA
degradado); línea 3, CA EA8 (Escobillado anal); línea 4,CC OI (córnea); línea 5, CC
48 (líquido de lente de contacto); línea 6, CC 79 (córnea); c) línea 1, Escherichia coli
ATCC 25922; línea 2, cepa control Acanthamoeba spp; línea 3, CC 01(córnea); línea 4
CA A5(agua de fuente); línea 5, CA A6 (agua de fuente); línea 6, CA EA7 (escobillado
anal ); línea 7, CAEA11( escobillado anal).
1000 pb
a 1 2 1
b c 2 3 4 5 6 2 1 3 4 5 6 7
13
Tabla 1. Características fenotípicas y morfo-métricas de quistes (Q) y trofozoítos (T)
Abreviaturas: Acant (acantopodios); Exf (exflagelacion). C: Córnea; L: líquido de lentes
de contacto; F: fuentes; H: Hisopado anal.
Cepa Origen Morfología Q / T
Tamaño
Quistes /
Trofozoítos
(µm)
Acant Exf Clasif.
de
quistes
(Pussard
y Pons)
01 CC
C Q: Endoquiste definido,
oval, redondo, poligonal.
Ectoquiste irregular,
aspecto arrugado.
Núcleo No visible. T:
Redondeados, ameboides
7,5 -17,5/
7,5 -22
Si
No
GII
79 CC
C
Q: Endoquiste estrellado,
ovalado. Ectoquiste
arrugado Núcleo No
visible. T: Redondeados,
ameboides
12,5 – 15 /
12,5 - 20
Si
No
G II
48 CC
L
Q: Endoquiste redondo y
poligonal. Ectoquiste
arrugado. Núcleo No
visible. T: Ameboides,
redondeados, ovales
10-17,5/
10- 25
Si
No
G II
A5
CA
F Q: Endoquiste redondo,
ligeramente anular, sin
Ectoquiste aparente. Núcleo
No visible. T: Alargados,
ameboides
5 - 7,5 /
7,5 -10
No
Si
GIII
A6
CA
F Q: Endoquiste estrellado,
poligonal, ameboide.
Ectoquiste liso No visible.
Núcleo visible T:
Redondeados, ameboides
10 - 13,7/
10 - 15
Si
No
GII
EA7
CA
H Q: Endoquiste poligonal,
ovalado, estrellados,
ameboide. Ectoquiste liso.
T: Redondeados,
ameboides
10 -17,5 /
10 - 15
Si
No
G II
EA8
CA
H Q: Endoquiste redondeado,
ovalado. Ectoquiste
ligeramente arrugado,
débilmente marcado.
Núcleo visible. T:
Redondeados, ameboides,
poligonales
10 -13,7 /
10 - 15
No
No
GIII
EA11
CA
H Q: Endoquiste poligonal,
estrellado, redondeado.
Ectoquiste Reticulado
débilmente marcado.
Núcleo no visible. T:
Redondeados, ameboides
10 - 15 /
7,5 - 15
Si
No
GII
14
Figura 2. Fenotipos de quistes y trofozoítos provenientes de cultivos en ANNE: a –b)
morfotipo de quistes y trofozoitos Gupo III, cepas de aguas; c-j) morfotipo de quistes y
trofozoítos Grupo II, cepas oculares: c) quistes con doble membrana; d-e) trofozoítos
con acantopodios expuestos; f-g) trofozoitos binucleados y uninucleados mostrando
vacuola contráctil (microscopía de contraste de fase); h-i) trofozoítos uninucleados y
quistes con endo y exoquistes evidentes (microscopía de campo oscuro); j) ensayo de
viabilidad de quistes (coloración con azul de tripan); k) formas flageladas cepas de
agua(col. de Giemsa).
A B C
E F G
H
I
D
J k