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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyN-INTIFCEyN-INTI
Materia de Especialización CEBI_E1bTécnicas de análisis en biotecnología
Macromoléculas
Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio
CEBI_E1b: Técnicas varias
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Técnicas (en esta clase y la siguiente)1. Métodos espectroscópicos para cuantificación de proteínas2. Métodos basados en fluorescencia3. Métodos basados en espectrometría de masa4. ELISA/EIA.5. Amplificación de ADN (PCR)6. Secuenciación de ADN7. Arrays8. Técnicas de análisis para conocer estructura y conformación (FT-IR, light scattering y otras)
Método de BiuretGornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by
means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949El método de Biuret se basa en la reacción de sales de Cu+2 con moléculas
que contienen más de dos enlaces peptídicos en un medio alcalino; el Cu+2 es reducido a Cu+ formando complejos color púrpura que tienen un máximo de absorción a 540 nm. El método se usa para soluciones que tienen de 1 a 10 mg proteína/ml.
Es un método poco sensible. Es útil cuando se quiere analizar grandes lotes de proteína.
Existen compuestos que interfieren con la lectura, tales como tioles y sales de amonio, que pueden removerse precipitando la proteína con un volumen igual de ácido tricloroacético al 10%, resuspendiendo el precipitado que contiene las proteínas en NaOH 1 N.
Cuantificación de proteínas
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Método de BiuretGornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by
means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949
Cuantificación de proteínas
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Método de LowryLowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951
El color producido por el método de Lowry resulta de la reacción de Biuret sobre los enlaces peptídicos, y posterior reducción del reactivo de fosfomolibdato-fosfotungstato (Folin-Ciocalteu) por las proteínas pretratadas con cobre en medio alcalino.
El Cu+ y los grupos R de la tirosina, triptofano y cisteína reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo un producto inestable que es reducido a azul de molibdeno/tungsteno.
El color azul es determinado a 750 nm. Este es un método muy sensible (más aún si se utilizan las
modificaciones introducidas en los últimos años), por lo que permite trabajar con soluciones muy diluídas de proteínas (20 – 1500 ug proteína/ml).
Cuantificación de proteínas
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Método de BradfordBradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248
El método de Bradford de basa en que el Azul Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a azul, al unirse a residuos aromáticos y arginina en las proteínas.
El complejo proteína-colorante tiene un coeficiente de extinción elevado, lo que le confiere gran sensibilidad.
La reacción entre el colorante y la proteína es muy rápida (aproximadamente 2 min), y el complejo proteína-colorante permanece disperso en solución por un tiempo relativamente largo.
Rango de detección: 0,5-1500 ug proteína/ml.
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
Método de BCASe basa en la reacción de biuret.El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de
formar un complejo púrpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos.
OH-Proteína + Cu2+ → Cu1+Cu1+ + BCA → complejo púrpura BCA- Cu1+(se lee a 562 nm)
Rango de detección: 5-2000 ug proteína/ml. (simil Bradford)
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
Absorción Ultravioleta de las ProteínasLa mayoría de proteínas presenta un máximo de absorbancia a
280 nm, debido a la presencia de aminoácidos aromáticos (tirosina, triptofano y fenilalanina).
La absorbancia a 280 nm puede usarse para medir proteínas en concentraciones entre 0,1 y 3 mg/ml, en la ausencia de sustancias que interfieran con la lectura.
Algunas preparaciones de proteínas parcialmente purificadas pueden tener ácidos nucleicos, los cuales tienen un máximo de absorción a 260 nm.
Una ecuación para calcular la concentración de proteína en la presencia de ácidos nucleícos en cubetas de 1 cm de paso es:
(proteína)mg/ml = 1,55 A280nm – 0,76 A260nm
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
Absorción Ultravioleta de las Proteínas
La ecuación fue derivada para enolasa (A280/A260 = 1,75) en la presencia de ácido nucleico de levadura (A280/A260 = 0,49) y por tanto puede no ser precisa para otras proteínas y otros ácidos nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una solución de proteína 0,1% (p/v) varía entre 0,5 y 2,5, dependiendo de la proporción de aminoácidos aromáticos que contengan.
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
Absorción Ultravioleta de las Proteínas
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
(lipasa)
Efecto de los solventes: agua
Absorción Ultravioleta de las Proteínas
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuantificación de proteínas
No cambian los máximos
Efecto de los solventes: etanol
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Cuadro comparativo: métodos espectroscópicos
Lowry: muchas interferencias con EDTA (50 mM), cloruro de guanidina (4 M), Triton X-100 (1%), sacarosa (40%), sulfato de amonio (3%), DTT o mercaptoetanol. No todas las proteínas reaccionan de la misma forma en la tinción.
BCA: interferencias con EDTA (50 mM), sulfato de amonio (20%)
Bradford. Interferencia con detergentes y lípidos.
Biuret. Poco sensible.
Absorción. Muchos compuestos absorben en el UV. Cuidado!
Cuantificación de proteínas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Fluorescencia - fenómeno
Fluorescencia
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Fluorescencia
Los espectros de emisión y excitación proveen información fundamental de todos los experimentos de fluorescencia. Sirven para identificar las especies que emiten, verificar su pureza, detectar artefactos, y pueden indicar fenómenos como uniones de ligandos o transferencia de energía. Son más sensibles que los fenómenos de absorción a cambios del entorno. Algunas reglas generales:
*la emisión se da a longitudes de onda mayores que la excitación*La forma general del espectro de emisión no varía al cambiar la excitación*para especies de emisión única, el espectro de excitación es el mismo que el de absorción*el espectro de emisión es la imagen especular del de excitación
Fluorescencia
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Ej de espectros de fluorescencia en proteínas.Experimentos de quenching para análisis de fracciones accesibles y no accesibles.
Trp, Tyr y Phe: regla general: fluorescen a 360 nm, se excitan a 280 nm..., se cumple?.
0100000200000300000400000500000600000
200 400
Long de onda (nm )
u.a.
de
Fl TrpTyr
Phe
Aminoácido Absorbancia Emisión
Trp 285 real 274 exp.
350
Tyr 275 real270 exp
300-305
Phe 256 real250 exp
280
Fluorescencia
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Quenching
Nota: un requisito importante (metodológicamente hablando) para los análisis es que la absorbancia de la muestra, en la longitud de excitación, no debe ser mayor a 0,1 con respecto al blanco, debido a que si no existen problemas de filtro interno.
0
5E+10
1E+11
1.5E+11
2E+11
2.5E+11
250 300 350 400 450
Long de onda (nm)
u.a.
Fl
Trp s/QTrp + 50 ul QTrp + 100 ul QTrp + 150 ul QTrp + 200 ul QTrp + 250 ul QTrp + 300 ul Q
Fluorescencia
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Fluorescencia
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Ecuación de Stern Volmer Fl°/ Fl = 1 + kq tau° [Q][Q] = Vq/ (Vo + Vq) 1MFl= Imax (Vo+Vq)/Vo(siendo: Flº = Imax de Fluorescencia en ausencia de Quencher Q; Fl = Imax de Fl con el Q; kq = cte de quenching; tau° = tiempo de vida media en ausencia de Q; [Q] = concentración de Q; Imax = intensidad máxima de Fl, Vo = volumen inicial; Vq = volumen de Q agregado).
y = 4.1107x + 0.9965R2 = 0.9952
0
0.5
1
1.5
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
[Q] (M)
Fl°/
Fl
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Fluorescencia
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Ecuación de Stern Volmer
Albumina: posee 5 Trp y 10 Tyr. Abs. 285, emis. 330 nm.Máximo de fluorescencia del Trp se desplaza a λ menores si en entornos hidrofóbicos. Por lo tanto, al desplegarse la proteína, habrá cambios en el máximo de Fl. si hay aa no accesibles.
0.9
1.1
1.3
1.5
0 0.05 0.1
[Q] (M)
F°/F
y = 0.051x + 3.9136R2 = 0.9343
02468
0 20 40 60 80
1/[Q] (M)F°
/AF
Desviación por Fl. residual
Eq modificada por fracción accesibles (fa) de fluoróforos. Puedo calcular fa
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Fluorescencia
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Ecuación de Stern Volmer
Ecuación de Stern- Volmer modificada (Ec. 2)F°/∆F = (1/(fa kq τ° [Q])) +1/fa, que corresponde a la ecuación de una recta.Se toma como ∆F = F- F° = F°a/(1+ kq τ° [Q]) +F°a = F°a kq τ° [Q]/ 1 + kq τ° [Q].(las referencias utilizadas son idénticas a las utilizadas en la ec. (1), siendo fa = fracción accesible de fluoróforos = F°a/ F°).
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Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Varias técnicas pueden acoplarse a espectrometría de masa para la identificación de proteínas.
ESPECTROMETRIA DE MASA
Componentes básicos:
Generador de iones
Analizador de masas
Detector
Generación de iones:
MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption – sin límite
ESI: Electro Spray Ionization – límite práctico: 10 kDa
Espectrometría de masa
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Las proteínas se mezclan con una matriz , usualmente orgánica, y se permite que se evapore, y se forman cristales. Sobre la muestra se aplica un pulso de láser, que produce la desorción y carga de la proteína.
Matrices
MALDI
Espectrometría de masa
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Técnicas de Análisis-Macromoléculas
ESI
En ESI la muestra de proteína con buffer es hecha spray a través de una pequeña aguja al final de la cual se aplica una diferencia de potencial.
El solvente se evapora y las partículas quedan cargadas
El spray se produce a partir de una columna de HPLC de fase reversa.
Espectrometría de masa
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Misma proteína, diferentes cargas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
En una primera etapa los iones son separados por m/z y transmitidos a un segundo cuadrupolo, a partir de este se transmite un ión en particular y pasa a la cámara de colisión.
En la cámara de colisión el ión es fragmentado por irradiación con un gas inerte
Los fragmentos del ión péptidico son luego resueltos en base a su relación m/z en el tercer cuadrupolo.
Masa/masa (MS/MS)
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Ejemplo de aplicaciónMS/MS
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Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
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Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Permite el fraccionamiento de una muestra utilizando los principios de cromatografía, la detección de las proteínas se realiza mediante SELDI (semejante a MALDI)
Los Chips para proteínas o Protein chips arrays están preparados con diferentes propiedades cromatográficas: - intercambio aniónico o catiónico; - afinidad por metal; - fase reversa, etc
Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
• Proteins are captured, retained and purified directly on the chip (affinity capture )
Sample
Laser
Molecular Weight
100 µ m2to
1 mm2
Chemical, Biochemical or Biological Affinity Capture Surface
The SELDI Process andThe SELDI Process and ProteinChip ProteinChipTMTM Arrays Arrays• Sample goes directly onto the ProteinChip™ Array
• Retentate Map™ is “read” by Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization (SELDI)• Retained proteins can be processed directly on the chip
ProteinChipTM Array
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Espectrometría de masa
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Patricio Santagapita_CEBI_E1b
Electroforesis capilar - MasaTécnicas de Análisis-Macromoléculas
Para la identificación de las bandas que salen de la CE, muchas veces se acopla la misma a un espectrómetro de masa.Para ello es necesario primero someter la muestra a una ionización por electrospray, lo que requiere que el buffer de corrida sea volátil. Esto altera la resolución del sistema.
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ELISA
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
ELISA = Enzyme- Linked Inmunoabsorbant Assay
Procedimiento
BIORAD ©
Recordar detección en Western blot
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ELISA
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
ELISA = Enzyme- Linked Inmunoabsorbant Assay
Anticuerpo Resultado
Animación sobre el procedimiento de la técnicahttp://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2004/04-0522/04-0522_ELISA.html
ELISA
vs.
Western Blot
ELISA- Resultado rápido- Screening primario- Identifico proteínas basado en la especificidad del anticuerpo
Western Blot- Confirma resultados ELISA- Más específico- Identifico proteínas tanto por especificidad del anticuerpo como por tamaño
ELISA
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
BIORAD ©
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EIA
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
EIA = Enzyme Inmunoenzymatic
Assay
Es en fase sólida,
pero similar a ELISA
Principio de prueba
Disponible para varios
inmunoensayos:
HIV/ Chagas/ Clamidia
Toxoplasmosis/
Rubeola/ Hepatitis
Dengue IgM e IgG – Immunocomb Orgencis
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EIA
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
EIA = Enzyme Inmunoenzymatic Assay.
Dengue IgM e IgG – Immunocomb Orgencis
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Síntesis repetitiva bidireccional de ADN por primer extention de una región de ácidos nucléicos de interés.
Requerimientos y animación del proceso:
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Requerimientos:• Template de ácidos nucleicos (102 –105 moléculas)• Buffer de reacción (10-50 mM Tris-HCl, pH 7,5- 9) • dNTP* ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP ): • DNA polimerasa• Primers• MgCl2 (cofactor polimerasa)
Concentraciones de dNTP, primers, MgCl2 y condiciones de ciclado dependen de cada reacción y de la relación especificidad – eficiencia – fidelidad que se quiere obtener (eficacia de la reacción de la PCR).
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
a)ESPECIFICIDAD. Generación de un único producto de amplificación,
b)EFICIENCIA. Máxima producción de amplificación en función del número de ciclos,
c)FIDELIDAD. Número de errores que comete la DNA pol. durante la copia.
d)SENSIBILIDAD. Mínima cantidad de DNA que se necesita para obtener una gran cantidad de copias.
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Ciclado1. DESNATURALIZACION: 5min. 94ºC,2. CICLO típico de 3 repeticiones: a) Desnaturalización: 1-2 min. 94ºC, b) Annealing del primer: 1-2 min. 50-65ºC
(apareamiento) (5ºC debajo de Tm), c) Extensión: 1-2min. 72ºC,
(depende del tamaño del fragmento)3. EXTENSIÓN FINAL: 5-10 min. 72ºC, 4. HOLD: 4ºC.
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swfhttp://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Acumulación de producto Nf = No ( 1 + Y )n, donde n: número de ciclos Y: eficiencia.
• Ciclos extras: > n < especificidad
Para obtener más masa de amplificación se realiza una reamplificación.
N° ciclos: aprox. 30
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
0.0E+00
2.0E+08
4.0E+08
6.0E+08
8.0E+08
1.0E+09
1.2E+09
1.4E+09
1.6E+09
1.8E+09
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR cycle
DNA
copy
num
ber
Sin tener en cuenta las consideraciones anteriores: copias de ADN = 2n
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Template• DNA o RNA (genómico, plasmídico, cDNA, RNAm)• Grado de purificación intermedio• DNA genómico mamífero (1 ug)• DNA genómico bacteria o plasmídico (1fg-1pg)
< Tamaño de fragmento > Eficiencia (100- 400 pb.) hasta 40 kb.
> Cantidad de templado > Fidelidad < Eficiencia.
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
PRIMERS Y dNTPs
• Especificidad: Hibridizar eficientemente a la secuencia target y no a otra secuencia relacionada o con homología que puedan estar presentes en la muestra.• Tamaño 15 a 30 Nt. > Tamaño, < Eficiencia, > especificidad.• Tm = 2°C Σ(A+T) + 4°C Σ(G + C ) hasta 20 pb (después fórmula + compleja). (circa 50-65°C)• Concentraciones de dNTPs depende del tamaño del target.(20 a 200 uM)
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS
• Detección en geles (electroforesis): Southern Blot (revelado con sonda marcada)
• Detección inmunológica:Hibridación del producto de PCR con una sonda inmovilizada en placa de ELISA (revelado con anticuerpos anti-biotina acoplado a abidina y a la peroxidasa para reacción de color).
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Si quiero secuenciar los productos obtenidos por PCR: debo purificar.
Algunos métodos:UltrafiltraciónPrecipitación con etanolPurificación cromatográficaPurificación enzimática
Ver detalles en archivo adjunto DNA sequencing by capillary electrophoresis chemistry guide
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
Real Time-PCR
Ventajas principales: -sigo el proceso en tiempo real-cuantificación (pare ver detalles ver archivo adjunto Appl Note RT-PCR. Applied Biosystems)
Animación:http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055079.swf
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
RT-PCR
Uso: PCR en muestras de ARN.
La transcriptasa reversa se utiliza para copiar todos los ARNm en una muestra de RNA en cADN.
Este cADN de cadena sencilla puede ser amplificado por PCR utilizando los primers que reconocen una secuencia de transcripción específica.
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PCR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
PCR – Polymerase chain reaction
RT-PCR
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Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADN – Sanger dideoxy sequencing (Sanger et al., 1974)
Requerimientos y animación del proceso:
http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055078.swf
Notar el acoplamiento con Capillary Electrophoresis
Detalles experimentales completos en archivo adjunto DNA sequencing by capillary electrophoresis chemistry guide
http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055079.swfhttp://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055079.swf
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Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADN
Pasos (se pueden automatizar):
1. Preparación de la muestra2. Ciclos de secuenciación3. Purificación4. Detección (CE permite automatización)5. Análisis de datos
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Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADN
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Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADNCrecimiento:
dirección 5’-3’
http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055078.swfhttp://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055078.swf
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Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADN
Recuerden complementariedad de bases…
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Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADN - ciclos
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Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADN
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Secuenciación de ADN
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Secuenciación de ADNPuedo separar los productos obtenidos por electroforesis y revelado radioactivo (la secuenciación se realiza con nucléotidos marcados), como ya vimos en las primeras teóricas, o por CE.
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Microarrays
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Microarrays
-Los microarrays permiten el análisis simultáneo de la expresión de miles de ARNm.- Se basan en las secuencias EST (expressed sequence tags).- Miles de copias de estas se colocan en cada uno de los spots.- Útiles para determinar los cambios en los patrones de expresión génica de un tejido de una muestra a otra.-Por ejemplo: uso de los microarrays para estudiar las diferencias en la expresión génica en los tejidos tumorales diferentes.
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Microarrays
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Microarrays
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Microarrays
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Microarray ej: identificación de cáncer de pulmónMuestrasMuestras
Genes
Genes
Garber, Troyanskaya et al. Diversity of gene expression in adenocarcinoma of the lung. PNAS 2001, 98(24):13784-9.
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FT-IR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
FT-IR: Fourier transform infrared spectroscopy
Método para análisis de vibraciones moleculares2
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FT-IR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Absorción de radiación IRCondiciones para que se produzca
1) Cuando una molécula es irradiada con radiación IR, la unión vibrante absorberá energía si la frecuencia de la radiación coincide con la frecuencia vibracional.
1) Para que se produzca la absorción, la molécula debe experimentar un cambio neto en su momento dipolar como consecuencia de los movimientos vibracionales o rotacionales.
1) Las bandas observadas dependerán del nivel poblacional en cada nivel vibrac. o rotacional.
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FT-IR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Análisis de proteínasSe debe analizar la banda amida I (1700-1600 cm-1).
Review: Infrared spectroscopy of proteins, Barth, A., 2007, BBA 1767, 1073.
Se deben aplicar técnicas de estrechamiento al espectro (band narrowing techniques). Opciones:
1) Cálculo de derivada segunda. 2)Fine structure enhancement. 3) Deconvolución de la FT.
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FT-IR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Conformación de las proteínas por FTIR.
Rey, L., May, J.C. (Eds.), Freeze-Drying/ Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products, Marcel Dekker, Inc., New York, pág. 123- 160.
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FT-IR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
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FT-IR
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Tutoriales sobre análisis por FT-IR
-Tutorial más simple sobre la técnica: http://www.a2technologies.com/downloads/Tutorial.swf
De macromoléculas (es claro pero extenso):http://shaker.umh.es/docencia/aesma/Espectroscopia_de_infrarrojo.swf
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DLS
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Dynamic Light scattering
Mide el radio hidrodinámico de una partícula en solución
Ej. Lisozima (15 kDa)Baja polidispersidad (20%) - mejorableRadio alrededor de 1,95 nm
http://www.chemeurope.com
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DLS
Técnicas de Análisis-Macromoléculas
Dynamic Light scattering
Muestra agregada y polidispersa
http://www.chemeurope.com
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