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Concepción, 17 de abril 2015
JM Sayagués
Citogenética molecular en tumores sólidos:
Aplicación al estudio del cáncer colorrectal
esporádico
Citogenética molecular en tumores sólidos
1. Implicaciones clínicas de las alteraciones genéticas en los
tumores sólidos
2. Aplicaciones de las técnicas moleculares para la identificación de
biomarcadores en cáncer colorrectal esporádico.
3. Predicción de la respuesta a la RQT preoperatoria en cáncer de
recto localmente avanzado mediante técnicas de FISH
Citogenética molecular en tumores sólidos
1. Implicaciones clínicas de las alteraciones genéticas en los
tumores sólidos
2. Aplicaciones de las técnicas moleculares para la identificación de
biomarcadores en cáncer colorrectal esporádico.
3. Predicción de la respuesta a la RQT preoperatoria en cáncer de
recto localmente avanzado mediante técnicas de FISH
Cáncer de mama
Neoplasia más frecuente en la mujer (30%)
700.000 nuevos casos en Europa
1/20 mujeres contraerá cáncer de mama
Por cada 100 mujeres existe un hombre
Hereditario: 5-10% casos
Periodos máxima incidencia: Premenopausia: 45-49 años
Postmenopausia: 65 años (rango 35-80 años).
EPIDEMIOLOGÍA
Cáncer de mama: Factores pronósticos
• Afectación ganglionar• Estadio clínico según la clasificación TNM• Tipo histológico• Grado de diferenciación• Receptores hormonales (RE y RP)• Contenido de ADN (ploidía)• Índice de proliferación: fase S• Proto-oncogenes: Her-2/neu
Factores pronósticos
Ros JS, Fltcher JA, Linette GP, et al: The HER2/NEU/neu gene and protein in breastcancer. Biomarker and target therapy 2003, 8 :307-25.
Esperanza de vidaEtapa TNM Descripción Supervivencia
5 años
0 Tis N0 M0 Carcinoma in situ 99%
IIB T2 N1 M0T3 N0 M0
2 -5 cen + mts Gan>5 cen, no mts Gan 65%
IIIB T4NX M0TX N3 M0
>5 cen + mts gan>5 cen + mts gan mm 44%
IV >5 cen + mts gan >5 cen + mts gan +mts a distancia 14%
AIT0 N1 M0T1 N1 M0T2 N0 M0
No TP, mts gan<2 cm + mts gan,
2 -5 cm82%
Cáncer de mama: Factores pronósticos
• Afectación ganglionar• Estadio clínico según la clasificación TNM• Tipo histológico• Grado de diferenciación• Receptores hormonales (RE y RP)• Contenido de ADN (ploidía)• Índice de proliferación: fase S• ¿Ploidía de ADN? ó ¿alteraciones genéticas?: Her-2/neu
Factores pronósticos
Ros JS, Fltcher JA, Linette GP, et al: The HER2/NEU/neu gene and protein in breastcancer. Biomarker and target therapy 2003, 8 :307-25.
Cáncer de mama: Factores pronósticos
1 /4 pacientesHER2+ (25%)
HER2
75% vs. 25%
Cáncer de mama: Factores pronósticos
ReceptoresHER2
activados
Cáncer de mama: Estudio de HER2
AltaAmplificación
1+1+2+2+ Negative/0Negativo/0
NormalNormal
3+3+
BajaAmplificación
TÉCNICA FISH(n=108)
Cáncer de mama: Estudio de HER2
Trisomía + Tetrasomía: 18%
Normal: 25%
Ganancias: 40%
Trisomía: 16% Tetrasomía: 6%
PATRONES FISH (n=108)Her-2/neu/CEP17
Am J Clin Pathol 2003;120:917-927
Cáncer de mama: Estudio de HER2
Amplificación: 29%
Amplificación media: 6%Baja Amplificación : 11% Amplificación alta: 12%
PATRONES FISH (n=108)Her-2/neu/CEP17
Her-2/neu/CEP17> 2.2
Cáncer de mama: Estudio de HER2
Am J Clin Pathol 2003;120:917-927
ANTECEDENTES FAMILARES
P= 0.01
Normal Pérdidas Ganancias Amplificación
Noantecedentesfamiliares
16/68 (23%) 4/68 (6%) 34/68 (50%) 14/68 (21%)
7/28 (25%) 3/28 (11%) 5/28 (18%) 13/28 (46%)Antecedentesfamiliares
Cáncer de mama: Estudio de HER2
Am J Clin Pathol 2003;120:917-927
Aneuploidía
P<.001
amplificación
pérdidas
ganancias
normal
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0DIPLOIDE
15
15
12
59
ANEUPLOIDE
37
50
10
3
Índice ADN
amplificaciónpérdidasgananciasnormal
Med
ia d
el I
DNA
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
,8
676291
10730
516
P<.001
Fase S
amplificaciónpérdidasgananciasnormal
Med
ia d
e la f
ase
S
60
50
40
30
20
10
0
-10
17
80
51
72591
P=.001
ESTUDIO DEL ADN
P<.001
Am J Clin Pathol 2003;120:917-927
Cáncer de mama: Estudio de HER2
Espinosa A et al, Am J Clin Pathol 2003;120:917-927
Cáncer de mama: Estudio de HER2
La amplificación de HER2 en cáncer de mama marcan un tratamiento muyespecifico con el uso de terapias dirigidas, trastuzumab.
Algoritmo para la evaluación de HER2
*ASCO/CAP HER2 Testing Update: Wolff AC, et al. J Clin Oncol. 2013 Nov 1;31(31):3997-4013
Carcinoma de mama con componente infiltrante
IHQ
Negativo (0,1+) Boderline (2+) Positivo (3+)
FISH
No AmplificadoHER2/CEP17 < 2*
HER2 < 4 señales/núcleo
– Se evalúa sólo el componente infiltrante.– Se evalúan al menos 50 células en al menos dos áreas tumorales distintas.
* doble sonda: HER2/CEP17 Sonda única: HER2
BoderlineHER2/CEP17 < 2*
HER2 ≥ 4 y < 6 señales/núcleo
AmplificadoHER2/CEP17 ≥ 2*
HER2 ≥ 6 señales/núcleo
Melanoma vs Nevus
160.000 casos nuevos de melanoma el en mundo (↑4,1%)
Histopatología técnica “gold estándar”
158 melanomas invasivos 22 lesiones benignas
513 melanomas invasivos 85 nevus benignonevus dísplasicomelanoma in situ
Veenhuizen KCW, et al. Quality assessment by expert opinion in melanomapathology: experience of the pathology panel of the Dutch Melanoma WorkingParty. J Pathol 2005;182:266-72.
Melanoma
Actas Dermosifiliogr. 2009;100:Supl. 1:52-65
BRAFPTENCDKN2A CCND1 E-caderina
TRPM1 TRPM1
Uso de Zelboraf en pacientes con MM metastásico irresecablecon mutación en BRAF identificada con plataforma Cobas®
Nevus displásico vs. Melanoma maligno
>38%
>29%
>40%
Melanoma
>19%
>16%
>42%
U. Chicago NeoGenomics
Sensibilidad: 86%Especificidad: 95%
Abbot
≥2.5*
31%
≥2.5*
*Media de señales por núcleo
Am J Surg Pathol 2012;36:808–817
Spitz benigno vs. Melanoma Spitzoide
Am J Surg Pathol 2012;36:808–817
Sensibilidad: 86%Especificidad: 95%
11q13 (CCND1)
6q23 (MYB) 8q24 (CMYC)
Sensibilidad: 94%Especificidad: 98%
9p21 (P16)
N=27 LESIONES AMBIGUAS(5 años de seguimiento)
6 casos MTS: 6+ (100%)
21 casos NO-MTS: 5+ (24%)
Oligodendrogliomas
• Deleción de 19q en un 50-80% de los casos
• Deleción 1p en 70% casos
• Coexistencia de deleción 1p/19q
• Polisomía y deleciones otros cromosomas
• Progresión relacionada con amplificación de EGFR
• Progresión relacionada con pérdida de PTEN
• Falta de correlación entre la histología y los marcadores
moleculares
Aplicación:
Detección de deleciones 1p36 y 19q13 importantes en elestablecimiento del pronóstico en oligodendrogliomas.
1p36/1q25 and 19q13/19p13 FISH Probe Kit
Oligodendrogliomas
Oligodendrogliomas: Subtipos moleculares
▫ 1) Pérdida de 1p/19q Más probable en frontal, parietal Respuesta cercana al 100% Supervivencia mayor a 10 años
▫ 2) Pérdida de 1p sin pérdida de 19q Respuesta cercana al 100% Supervivencia aproximada de 6 años
▫ 3) Sin deleción de 1p/19q con mutación TP53 Más probable temporal, insular 33% de respuesta Supervivencia menor a 6 años
▫ 4) Sin deleción de 1p/19q, sin mutación TP53 18% de respuesta Supervivencia generalmente inferior a 18 meses
Hamalat et al. Oligodendroglioma: clinical study and survival analysiscorrelated with chromosomal anomalies. Neurosurg Focus. 2005 Nov15;19(5):E15.
Deleción 1p-19q
No del. 1p-19q
Polisomías
Gliomas
Aplicación:
La amplificación es un marcador de mal pronóstico, deprogresión
Excluyente con deleción 1p/19q
Diagnóstico diferencial entre glioblastomas de célulaspequeñas y oligodendrogliomas anaplásicos
EGFR / CEP 7 FISH Probe Kit
Cáncer de pulmón NSCLS
• La translocación del gen ALK es unevento poco frecuente en NSCLC(3-5% de los casos)
• Frecuente en pacientes jóvenes,no fumadores y mujeres
• Los pacientes con translocaciónALK responden al tratamiento conCrizotinib con una reducción muysignificativa del tamaño tumoral,aumento de la esperanza de vida ycalidad de vida
• Al igual que las mutaciones EGFRdeben realizarse medianteplataforma Cobas®: tratamientoanti-EGFR Kwak EL, et al. 2010. NEJM. 363 :1693-703.
Translocación ALK
Antes Después
Paciente con cancer de pulmón NSCLSALK+ tratado con Crizotinib.
Cáncer de pulmón NSCLS
• FISH:- El tratamiento con Crizotinib establece la selección de pacientes
utilizando la sonda LSI ALK Break Apart (Abbott, Santa Clara, Ca)
• IHC:– La detección por inmunohistoquímica que ha dado una correlación
excelente en linfoma anaplásico y tumores miofibroblásticosinflamatorios no ha funcionado igual en NSCLC y no se ha podidoestablecer correlación
• RT-PCR para cDNA– Tienen grandes dificultadas debido a los diferentes puntos de ruptura
identificados.– Muy malos resultados en tejido FFPE debido al gran tamaño del
amplicón con muchos casos falsos negativos
Citogenética molecular en tumores sólidos
1. Implicaciones clínicas de las alteraciones genéticas en los
tumores sólidos
2. Aplicaciones de las técnicas moleculares para la identificación de
biomarcadores en cáncer colorrectal esporádico.
3. Predicción de la respuesta a la RQT preoperatoria en cáncer de
recto localmente avanzado mediante técnicas de FISH
HETEROGENEIDAD INTRATUMORAL EN CÁNCER DECOLON Y SU RELACIÓN CON METASTASIS HEPÁTICAS
Mucosa normal
Pólipo
Cr 5qMutaciones de APC
Adenoma
Cr. 12p,Ganancia del cr. 7 y 20q
Mutaciones de KRAS
CarcinomaMetástasis
Hepática
TP53, DCCGanancias de: 5q, 8q, 13q, XPérdidas de: 4, 8p, 15, 17q, 18q
¿Cariotipos complejos?
Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, et al. Genetic alterations duringcolorectal-tumor development. N Engl J Med 319 (9): 525-32, 1988.
11q+++
34%
8p-,17p-,18q-
8q+, 20q+8%
17p- , 18q-
12%
1p- 8p-17p-18q-
8q+13q+20q+
17%17%
1p-,17p- ,18q-
13q+, 20q+
4%
8p-
7q+, 13q+
8%
1p- , 18q-
20q+
17%
17p-
4%
1p-
8%
8p-
20q++
Tumor
primar
ioM
etás
tasis
hepá
tica
8%8%
13q++
8%
13q+++
4%
7q+
4%8q+, 11q+
4%
11q+
4%7q+11q+13q+
12%
4%
17p-
7q+11q++
4%8q+,13q+
8%
17%
11q+, 13q+
17%
8q++, 20q++
12%
8q+++
8%
7q+
11q+13q++
1p-, 8p- ,18q-
8q+
12%7q+13q+20q+
4%11q+
8%
8q++
8%
13q+
4%20q++
8%
8%
8q++
8q+++, 11q+
4%11q+
8%
7q+
8q++20q++
8%
1st aneuploid tumor cell clone 2nd aneuploid tumor cell clone 3th aneuploid tumor cell clone
24 2, 3, 6, 11 5, 14 8, 9, 12, 13, 15,18, 20, 22 10, 1617, 19, 231, 4, 7, 21Cases:
HETEROGENEIDAD INTRATUMORAL EN CÁNCER DECOLON Y SU RELACIÓN CON METASTASIS HEPÁTICAS
TUMOR PRIMARIO METASTASIS HEPÁTICA
HETEROGENEIDAD INTRATUMORAL EN CÁNCER DECOLON Y SU RELACIÓN CON METASTASIS HEPÁTICAS
0
20 Mb
40 Mb
60 Mb
80 Mb
0 0.5 1 1.5-0.5-1-1.5
17p11.2
Genotipado masivo: Cáncer de colon metastásico
0
20 Mb
40 Mb
60 Mb
80 Mb
0 0.5 1 1.5-0.5-1-1.5
17p11.2
20,156,497 bp
22,975,771 bp
A B
C
TEL
Clon B
20156497 22975771
17q11.217p11.2 17p11.117q11.1
25280000
Clon A
CEN
Genotipado masivo: Cáncer de colon metastásico
PLoS ONE 7(8): e42683. doi:10.1371/journal.pone.0042683
All patients(n=58)
Metastatic tumors(n=27)
Non-metastatic tumors(n=31)
Univariateanalysis
Chromosome 1Normaldel(p)Polysomy
21 (36%)26 (45%)11 (19%)
7 (26%)13 (48%)7 (26%)
14 (45%)13 (42%)4 (13%)
NS
Chromosome 7Normaldel(q)q+Polysomy
19 (33%)6 (10%)3 (5%)
30 (52%)
5 (19%)5 (19%)1 (3%)
16 (59%)
14 (45%)1 (3%)2 (7%)
14 (45%)
NS
Chromosome 13NormalPolysomy
20 (35%)38 (65%)
7 (26%)20 (74%)
13 (42%)18 (58%)
NS
Chromosome 17Normaldel(17p13)Polysomy
25 (43%)26 (45%)7 (12%)
5 (19%)20 (74%)
2 (7%)
20 (65%)6 (19%)5 (16%)
p 0.001
Breakpoints at 17p11.2 21 (36%) 18 (67%) 3 (10%) p 0.001Chromosome 22
Normaldel(q)Polysomy
38 (66%)6 (10%)
14 (24%)
15 (56%)6 (22%)6 (22%)
23 (74%)0 (0%)8 (26%)
p=0.021
Cáncer de colon metastásico vs. no metastásico:Características genéticas
PLoS ONE 7(8): e42683. doi:10.1371/journal.pone.0042683
All patients(n=58)
Metastatic tumors(n=27)
Non-metastatic tumors(n=31)
Univariateanalysis
Age (years) 72 (38-83) 73 (48-80) 72 (38-83) NSGender
FM
20 (34%)38 (66%)
11 (41%)16 (59%)
9 (29%)22 (71%)
NS
LocationRLRe
16 (28%)28 (52%)14 (20%)
5 (19%)13 (48%)9 (33%)
11 (36%)15 (48%)5 (16%)
NS
Histological gradeWellModeratePoor
39 (67%)15 (26%)4 (7%)
16 (59%)8 (30%)3 (11%)
23 (74%)7 (22%)1 (4%)
NS
HistopathologypN0pN1pN2
38 (66%)12 (21%)8 (13%)
7 (26%)12 (44%)8 (30%)
31 (100%)0 (0%)0 (0%)
p ≤ 0.001
Size (cm) 5 (2.5-14) 5 (2.5-9) 5 (2.5-14) NSALP (mg/dl) 101 (1-495) 94 (1-330) 108 (55-495) NSCEA (ng/ml) 7.2 (0.6-4598) 45.4 (0.8-4598) 3.2 (0.6-84) p ≤ 0.001Exitus 23 (40%) 20 (74%) 3 (10%) p ≤ 0.001
Cáncer de colon metastásico vs. no metastasico:Características clinico-biologicas
PLoS ONE 7(8): e42683. doi:10.1371/journal.pone.0042683
120100806040200
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Chromosome 22 p0.001
Time from surgery (months)
Polysomy
Normal
del (22q11.2)
120100806040200
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
del (17p13)
Polysomy
Normal
Chromosome 17 p=0.041
120100806040200
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
< 7.5 ng/ml
Cum
surv
ival
CEA p0.001
>7.5 ng/ml
120100806040200
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
No
Yes
Breakpoints at 17p11.2 p0.001
Cum
surv
ival
Time from surgery (months)
Time from surgery (months) Time from surgery (months)
A B
C D
Cáncer de colon: clasificación pronóstica
Cum
surv
ival
Time from surgery (months)
120100806040200
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Score 0 (n=14)
Score 1 (n=36)
Score 2 (n=5)
Factores pronósticos:1. CEA2. del(17p11)3. del(22q11)
Cáncer de colon: clasificación pronóstica
P<.001
0%
60%
100%
PLoS ONE 7(8): e42683. doi:10.1371/journal.pone.0042683
Citogenética molecular en tumores sólidos
1. Implicaciones clínicas de las alteraciones genéticas en los
tumores sólidos
2. Aplicaciones de las técnicas moleculares para la identificación de
biomarcadores en cáncer colorrectal esporádico.
3. Predicción de la respuesta a la RQT preoperatoria en cáncer de
recto localmente avanzado mediante técnicas de FISH
• Biopsia• Análisis histopatológico• Colonoscopia• Rectoscopia rígida• RMN• Niveles séricos CEA• ECO endo-rectal
Métodos diagnósticosT1-2, N0
T3, N0 oTx N1-2
T4 localmenteirresecable
T o Nx M1Metástasis resecables
T o Nx M1Metástasis irresecables
NCCN. Practice guidlines in Oncology.
Abordaje terapéutico cáncer de recto
• Biopsia• Análisis histopatológico• Colonoscopia• Rectoscopia rígida• RMN• Niveles séricos CEA• ECO endo-rectal
Métodos diagnósticosT1-2, N0
T3, N0 oTx N1-2
T4 localmenteirresecable
T o Nx M1Metástasis resecables
T o Nx M1Metástasis irresecables
NCCN. Practice guidlines in Oncology.
Abordaje terapéutico cáncer de recto
T3, N0 óTx N1-2
T3, N0 oTx N1-2
TratamientoNeoadyuvante
QuimioterapiaRadioterapia
CIRUGIA
Amputaciónabdominoperineal
Resecciónanterior
Protocolectomía Hartmann Laparotomía
Abordaje terapéutico cáncer de recto
20-30% no responden
40-60% respuesta parcial
5-25% respuesta completa
G0: Ausencia de regresión
Sistema de regresión tumoral de Dworak
G4: Respuesta completa.
G3: Células tumorales aisladas
G2: Dominio de cambios fibróticos (fibrosis)
G1: Dominio de masa tumoral
Respuesta al tratamiento neoadyuvante
A) PACIENTES: 45 pacientes- 45 muestras pre-tratamiento (biopsias)- 31 muestras post-tratamiento (pieza tumoral)
– 30 Varones y 15 mujeres (2:1)– Edad media: 67 años (rango: 39-85)– Diagnóstico –Criterios de la OMS- (Jass JR & Sobin L. WHO. 2nd edition, New York, NY.
Springer-Verlag NY Inc. 1989)
B) LOCALIZACIÓN TUMORAL:
- 4% recto bajo- 51% recto medio- 40% recto alto
Materiales y métodos
C) Clasificación -American Joint Committee on Cancer- (TNM):
D) Estadio tumoral (Pre/post-tratamiento; NS):
- 0: 0%/11%- I: 2%/38%- II: 11%/18%- III: 87%/29%- IV: 0%/4%
E) CEA (Pre/post-tratamiento; p .002):- ≤5ng/mL: 59%/88%- ≥5ng/mL: 41%/12%
Materiales y métodos
Recurrencia local
T0 T1 T2 T3 T4 N0 N1 N2 M0 M1 G0 G1 G2 G3 G4 APR AR Hartmann R0 R1 R2
0% 0% 2% 65% 33% 16% 84% 0% 100% 0% NA
13% 9% 36% 42% 0% 67% 22% 11% 96% 4% 13% 25% 40% 9% 13% 29% 69% 2% 91% 7% 2% 4%POST-TRATAMIENTO
PRE-TRATAMIETNO
Resección tumoral
NA
M CirugíaT N Regresión Dworak
NA NA
(p .009) (p .005) (NS)
• uTNM estadio
• Determinación CEA
tiempo(semanas)
5Semanas
CT
CT
45 biopsias tumorales
Cirugía
Estadio histopatológico(ypTNM y evaluación de la
respuesta)
Terapia neoadyuvanteRadioterapia: 45 Gy ( )Quimioterapia:Capecitabina (CT)
0
20
Materiales y métodos
Medicine (Baltimore). 2014 Nov;93(26):e153.
iFISH: Regiones cromosómicas analizadas (N=51)
-100
-80
-60
-40
-20
020
4060
80100
YX
22q
21q
20q
20p
19q
19p
18q
18p
17q
17p
16p
15q
15p
14q
13q
12q
12p
11q
11p
10q
10p9q9p8q8p7q7p6q6p5q5p4q4p3q2q2p1q1p
Frecuencia de alteraciones cromosómicas:Pre-tratamiento vs. Post-tratamiento
% d
e ca
sos
Cromosomas
Medicine (Baltimore). 2014 Nov;93(26):e153.
8p
8q 13q 20q
1p 17p
Pre-tratamientoPost-tratamiento
Gana
ncia
s
Pérdidas
Frecuencia de alteraciones cromosómicas:Pre-tratamiento vs. Post-tratamiento
Medicine (Baltimore). 2014 Nov;93(26):e153.
PRE-TRATAMIENTO POST-TRATAMIENTO
Medicine (Baltimore). 2014 Nov;93(26):e153.
Adquisición de número copias de 20q entre lamuestra pre-tratamiento y post-tratamiento
Perfiles genéticos en función de la respuestaal tratamiento neoadyuvante
Medicine (Baltimore). 2014 Nov;93(26):e153.
P: .0002
CONCLUSIONES
La contribución de la genética molecular ha mejoradosignificativamente la precisión en el diagnóstico de diferentes tipos deneoplasias
Los estudios citogenéticos son fundamentales para el tratamiento dealgunos subtipos de leucemias, linfomas y tumores sólidos.
Las alteraciones citogenéticas predicen el pronóstico de lospacientes con leucemias, linfomas y tumores sólidos.
Agradecimientos
Servicio de Citometría
Alberto Orfao
Laboratorio de FISH
ML Gutiérrez
María González
Servicio de Bioinformatica
Javier de las Rivas
Celia Fontanillo
Servicio de Oncología
Emilio Fonseca
Servicio de Cirugía
Luís Muñoz
Jacinto García
José Antonio Alcázar
Servicio de Patología
Mar Abad
Oscar Bengoechea
Gracias
Por
Vuestra Atención