“La citometría de flujo es un método analítico que permite la medición rápida de ciertas características físicas y químicas de células o partículas microscópicas en suspensión que producen una señal de forma individual al interferir con una fuente de luz”

CITOMETRIA DE FLUJO

NIVELES DE ANALISISMOLECULAR(esferas fluorescentes)

SUBCELULAR CELULAR SUPRACELULAR

Proteínas extracelulares

Viriones individuales

Bacterias Hibridomas

Secuencias de ADN o ARN libres

Liposomas Hongos unicelulares

Fusiones celulares

Complejos inmunes circulantes

Cromosomas aislados

Células humanas y animales

Orgánulos aislados

Protoplastos vegetales

Núcleos aislados

EXTRACELULARES

DE SUPERFICIE

CITOPLASMATICO

NUCLEARES

PARAMETROS DE ANALISIS

A NIVEL CELULAR

Ploidía de ADN Regulación del ciclo

celular Acción de hormonas

Metabolismo celular Transducción de señales Lesión celular

Caracterización población celular

Interacciones célula-célula Resistencia a fármacos

Activación celular Interacciones célula-célula Diferenciación celular

¿COMO FUNCIONA EL CITOMETRO DE FLUJO?

IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell

¿Qué es un fluorocromo?

488 nm

LuzIncidente

HO O

CO2H

Molécula de

Fluoresceína

530 nm

LuzFluorescente

Emitida

• El fluorocromo absorbe la luz del láser

• El fluorocromo emite un rayo luminoso dediferente longitud de onda

PRINCIPALES FLUOROCROMOS UTILIZADOS EN CITOMETRÍA DE FLUJO

DATOS OBTENIDOS

1. PARAMETROS ESTRUCTURALES• El tamaño relativo (Forward scatter-FSC)• La granularidad o complejidad citoplasmática. (Side scatter-SSC)

2. CD (antigenos de superficie): La intensidad de fluorescencia (Identidad)• Linaje• Recuento • Activación

4. ALTERACION EN EL INMUNOFENOTIPO• Inmunoproliferacion/inmunodeficiencia

5. ALTERACION EN EL GENOTIPO• Cambios en contenido DNA• Cambio en la expresion de genes

PRESENTACION DE LOS DATOS

• Histograma

• Gráfico de Puntos (Dot Plot)

• Gráfico de Contorno (Countour Plot)

• Gráfico de Densidad (Density Plot)

REGISTRO PRIMARIO

IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell

IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell

Granulocitos

DetritosLinfocitos

Monocitos

DISPERCION NORMAL

Countour Plot Density Plot

IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell

APLICACIONES CLINICASINMUNOFENOTIPIFICACIONi

PLAQUETASi TRANSPLANTES

CANCERi

o LEUCEMIAS Y LINFOMASo ENFERMEDAD MINIMA RESIDUALo SUBPOBLACIONES LINFOIDES

(INMUNODEFICIENCIAS)o RAZON LtCD4/CD8(VIH-SIDA)

o CONTENIDO DE DNA (ploidia DNA)o FASES DEL CICLO CELULARo PROTEINAS DEL CICLO CELULARo ONCOGENES (p53 y otros)

o GLICOPROTEINAS (TROMBASTENIA DE GLANZMANN)

o FISIOLOGIA PLAQUETARIAo Igs ASOCIADAS A PLAQUETAS

(PURPURA TROMBOCITOPENIA INMUNE)

o CELULAS PROGENITORAS(CD34, CD117)

o CROSS MATCH

ESTUDIOS FUNCIONALES

CUANTIFICACION DE MOLECULAS

DETECCION DE CITOQUINAS

SOLUBLES

• Citocinas Intracelulares• Fagocitosis• Estallido respiratorio• pH intracelular• Potencial de membrana

• En base a partículas cubiertas con Ig anticitocinas

• Recuento absoluto de células• CD 64 en granulocitos(infeccion)

APLICACIÓN DE LA CITOMETRIA EN HEMATOLOGIA

VENTAJAS EN HEMATOLOGIA Análisis multiparamétrico

Acceso mínimamente invasivo a parámetros celulares

Analiza grandes cantidades en poco tiempo. Aprox: 500-4000 cel/seg.

Resolución de heterogeneidad celular

Selección fenotípica de subpoblaciones

Selección manual de marcadores: Permite separar subpoblaciones celulares. (Clasificación de patologías).

INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS

“Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías resultantes de una proliferación descontrolada de una o más tipos celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea como sangre periférica”

RETENCION DE ANTIGENOS

Células malignas frecuentemente conservan antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados. Ejm:

CD10CD34CD8

HLA-DR

TIMOCITOLINFOCITOPRE B

CD10CD19CD34CD38

LINFOCITO BCD19CD20CD22IgM

LINFOCITO TCOOPERADOR

CD4 CD3CD28 TCRCD5

CD1 CD8CD2 CD71CD3 CD38CD4 TCR

LINFOCITO TCITOTOXICO

CD8CD3CD28CD5

NK MADUROCD2CD8+/-CD16CD56CD57

MADURACION DE LINEA LINFOIDE

BIBLIOGRAFIA1. BARRERA RAMÍREZ LOURDES MARÍA, DRAGO SERRANO MA. ELISA, PÉREZ RAMOS

JULIA, SAINZ ESPUÑES TERESITA DEL ROSARIO, ZAMORA ANA CECILIA, GÓMEZ ARROYO FABIOLA et al . CITOMETRÍA DE FLUJO: VÍNCULO ENTRE LA INVESTIGACIÓN BÁSICA Y LA APLICACIÓN CLÍNICA. Rev. Inst. Nal. Enf. Resp. Mex. [revista en la Internet]. 2004 Mar [citado 2012 Mar 12] ; 17(1): 42-55. Disponible en: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-75852004000100007&lng=es

2. Statistical file matching of flow cytometry data, ELSEIVER, Journal and biomedical Informatics, Gyemin Lee a, William Finn, Clayton Scott

3. Maryalice Stetler-Stevenson. Flow cytometry in lymphoma diagnosis and prognosis: useful? Best Practice & Research Clinical Haematology Vol. 16, No. 4, pp. 583–597, 2003

4. Diagnosing PNH with FLAER and Multiparameter Flow Cytometry, D. Robert Sutherland,1 Nancy Kuek, Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 72B:167–177 (2007)