Cryptococcus

Definición:Definición:Micosis de curso agudo, subagudo o crónico causada por un hongo levaduriforme oportunista denominado Cryptococcus neoformans. Afecta inicialmente los pulmones y posteriormente se disemina a piel y vísceras con una clara predilección hacia el SNC

San levadura encapsulada

lesión

Cutter

Establece la prioridad del

clínicos

Demuestra su asociación con

y F. Chung

1884 Felice Aisla del jugo de durazno una Saccharomyces neoformans

1884 Busse yBuschke

Aislan el mismo hongo de una Saccharomyces hominis

1901 Vuilleman Transfiere la levadura al géneroCryptococcus

1916 Stoddan y Describen los primeros casos Torula histolitica

1935 Benham Establece las diferencias conBlastomicosis

1952 Loddenombre

Cryptococcus neoformans

1955 Emmonslas excretas de palomas

1975 Kwong- Describe los estados perfectos Filobasidiella neoformansbacillispora

Sida.- Susceptibilidad del 5-10% en países desarrollados hasta 20- 30% en Africa y Tailandia1991 New York > 1200 casos meningitis. Desde 1989 Conferencia Internacional C/ 3

años. Solo en EU más de 15 grupos de trabajo.

Es la segunda micosis mas comun en personas infectadas con VIH

Antes 1981.- Enfermedad rara. Solo casos esporádicos.

• 45% Sistema Nervioso Central• 39% Limita a los pulmones, • 31% Cryptococemia, • 4% Cryptococemia sola• Masculino / femenino% 64:36

C. neoformans var neoformans

C.neoformans var gattiiC. gattii C. neoformans

COMPLEJO con 2

ESPECIES

Caracteristicas C, neoformansvar. neoformans

C. neoformansvar. gattii

DistribuciónFuente ambientalCápsulaSerotiposEstado perfectoAgar CGBPrevalencia SidaAsimilación D-Prolina

MundialExcreta aves*SíA,D, y ADF. n. var neoformansNo crecimientoComúnNo

Tropical y Subtropical*EucalyptusSíB y CF. n. var bacillisporaCrecimientoRaraSí

Distribución de los Aislamientos clínicos

Frecuencia de Serotipos (%)

A D B C

Pacientes no SIDA: E.U.(excepto California) California Mundial(clima templado) Mundial(clima tropical) Pacientes SIDA Mundial (excepto Francia) Francia

>80 >40

50-95 30-45

99 80

4

<1 3-70 <1

<1 17

4

37 5

55

<1 0

2

14 1

<15

<1 0

C. neoformans es un organismo de vida libre

¿Cómo ha desarrollado sus mecanismos de virulencia y su potencial patógeno para sobrevivir a un parasitismo accidental?

Leucemias Linfomas Sarcomas Enfermedad de Hodgkin Tratamientos con esteroides SIDA más del 90% de los casos en la actualidad.

PulmonarPulmonar

MeningitisMeningitisDel SNC MeningoencefalitisDel SNC Meningoencefalitis CriptococomasCriptococomas Cutánea PrimariaCutánea Primaria SecundariaSecundaria

ÓseaÓsea

DiseminadaDiseminada

Manifestaciones cutáneas de la criptococosis sistémicaPápulas de tipo molusco contagioso

Pápulas acneiformesVesículas de aspecto herpetiforme

PústulasLesiones de tipo piodermia gangrenosaNódulos subcutáneos con/sin ulceración

Placas eritematosas de tipo erisipeloide o celulitis

Úlceras tórpidas, fístulas (¿osteomielitis subyacente?)

Abscesos, que no suelen ser fluctuantesPápulas purpúricas de aspecto vasculíticoÚlcera genital (buscar al criptococo en la

orina)Ulcera oral o rectal

• No es única para los receptores de trasplante• Sospechoso en pacientes con celulitis que no

responden al tratamiento antibiótico convencional

• Sitios de participación incluyen extremidad inferior bilateral, el muslo y la extremidad superior. Las lesiones ulcerosas son comunes.

• El diagnóstico es sencillo: • piel biopsia, • antigeno de cryptococos positivo en suero

Lesiones cutáneas nodulares subcutáneasAusencia de adenopatía regional sugiere criptococosis sistémicaPresencia de lesiones cutáneas múltiplesLesiones cutáneas únicas en áreas corporales cubiertas de ropaPresencia de signos de afectación visceral

Datos clínicos que sugieren criptococosis visceral

• Pulmonar:

Manifestaciones clínicas y radiológicas:Manifestaciones clínicas y radiológicas:•Son inespecíficasSon inespecíficas•80% no desarrollan síntomas80% no desarrollan síntomas•Lesiones nodularesLesiones nodulares

Puerta de entradaPuerta de entradaEtapa temprana vidaEtapa temprana vidaReactivaciónReactivación

• Pulmonar:

Inmunodeprimidos:•Rápida diseminación SNCRápida diseminación SNC•Casos fulminatesCasos fulminates•Más frecuentes infiltrados Más frecuentes infiltrados Alveolares e intersticialesAlveolares e intersticiales

Es la más frecuente. Se origina a Es la más frecuente. Se origina a partir de un foco pulmonar . partir de un foco pulmonar .

• Sistema Nervioso Central:

Criptococoisis del sistema nervioso centralLos síntomas : cefalea frontal intermitente,

aumenta de intensidad Vomito, Vahído,

Vértigo, y Rigidez y dolor del cuello.

Trastornos mentales con depresión, desorientación, apatía, inquietud, irritabilidad,

delirio.Los signos físicos son: meningitis crónica que se

manifiesta con : rigidez en la nuca y signos de kernig y Brudzinski

positivos. La ambliopía en ocasiones aparece estrabismo, nistagmo, ptosis, diplopía, Ataxia y hemiplejia

Neurorretinitis y edema papilar. Perdida de peso y fuerzas

EstuporComa y

Muerte por insuficiencia respiratoria.

• Sistema Nervioso Central:

Las lesiones cutáneas , subcutáneas y glandulares suelen diagnosticarse por biopsia y cultivos sistemáticos.

Necesario para el diagnostico diferencial con linfoblastoma

Lesiones pulmonares : tuberculosisactinomicosisblastomicosiscoccidioidomicosiscandidiasis

Crytococosis del sistema nervioso central – meningitis encefalitis tumor cerebral absceso del cerebro psicosis demencial demencia paralítica

SUERO Y LCR

ORINA

Antígenos

Anticuerpos

(aglutinación de partículas de látex)

(anticuerpos fluorescentes indirectos)

Positivos en 77 a 99%

Fijación de complemento ELISA

LCR ALTERACIONES SON LEVES

•Incremento de la presión •Leucocitosis predominante linfocitaria•Aumento de proteínas•Hipoglucorraquia

Tinta china

Es positiva 50%

Aglutinación en látex

Es positiva 90%

1. Toma de muestras: Depende de la variedad clínica (esputos, LBA, LCR, exudados, biopsias).

2. Examen directo con Tinta China: El objetivo es resaltar la cápsula. Se observan células levaduriformes redondeadas rodeadas por una cápsula que puede variar en grosor. Es importante buscar levaduras gemantes.

Los cambios histologicos puede ser de dos tipos, y ambas pueden hallarse en la misma muestra. La reacción gelatinosa se caracteriza por la abundancia de esporas y la escasa reacción inflamatoria acompañante.La reacción granulomatosa, se caracteriza por un número escaso de organismos distribuídos en el seno de zonas de dermis necrótica, rodeadas de una empalizada de células epitelioides y multinucleadas

Granuloma con necrosis central rodeada de células epiteloides y

linfocitos.

Las blastoconidias de C. neoformans son redondas u ovoidales y miden entre 2 y 12 um en función del tamaño de la cápsula celularEl grosor de la cápsula es tanto mayor cuanto menor es la reacción inflamatoria circundante.

Tinción PAS en la que se aprecian estructuras redondeadas Eosinófilas correspondientes a C. neoformans.

Cryptococcus en LCR Test de tinta china

3. Cultivo: Colonias limitadas, mucoides, convexas, blanco amarillentas.

Medios de cultivo: ADS

Extracto de levadura

Agar BHI

nunca usar Micosel.

•Medios diferenciales con sustratos fenólicos

Agar ácido caféico Staib AESG Agar semillas de Niger

Colonias color café

Tubo germinativo

Filamentación

Crecimiento a 37ºC

4. Pruebas morfolológicas y fisiológicas:

Crecimiento en agar CGB (canavanina-glicina-azul de bromotimol), útil para diferenciar a los agentes etiológicos de la criptococosis: C. neoformans (Cn) y C. gattii (Cg).

5. Identificación bioquímica:

• Producción de ureasa Producción de ureasa

• Asimilación de azúcares (lactosa e inositol)Asimilación de azúcares (lactosa e inositol)

• Fermentación de azúcaresFermentación de azúcares

Criptococosis La detección de antígeno capsular en líquidos orgánicos y

especialmente en LCR ante la sospecha de meningitis criptocócica. Ello se debe en gran parte a la rapidez, sencillez técnica y

especificidad de la prueba. Permite el diagnóstico, en 10-15 min, de aproximadamente el 99%

de las meningitis criptocócicas y el 67% de las criptococosis diseminadas.

El aislamiento de C. neoformans puede requerir varios días. Se utilizan dos tipos de técnicas, una cualitativa y otra cuantitativa. La técnica cualitativa se emplea para diagnosticar nuevos casos de

criptococosis o para confirmar reinfección especialmente en el sida.

La técnica consiste en la detección de antígeno capsular criptocócico mediante anticuerpos monoespecíficos dirigidos frente a él y unidos a partículas de látex. La aglutinación de las partículas de látex tras la reacción antígeno-anticuerpo se detecta a simple vista..

La técnica cuantitativa se emplea habitualmente para el seguimiento

de la evolución de pacientes ya diagnosticados mediante el título de antígeno capsular presente en la muestra clínica, que generalmente es suero o LCR.

Es útil para conocer la eficacia del tratamiento antifúngico aplicado.

FUNDAMENTO Consiste en la precipitación de particulas de latex

sensibilizadas con anticuerpo anti-polisacarido capsular de C. neoformans en muestras de LCR, suero y orina.

Esta prueba posee una sensibilidad del 99% para LCR de pacientes con criptococosis meníngea.

El limite de detección es de 3.2 ng/ml a 12.5 ng/ml . Una reaccion negativa no descarta infección. La prueba tiene valor diagnostico y pronostico, un aumento

progresivo de titulo es de mal pronostico. Cuando la terapia es inadecuada se observa aumento o

mantenimiento de los titulos sobre muestras consecutivas. Para evitar falsos negativos se tratan los especimenes

clínicos con pronasa (DE) previa a la prueba, esta enzima cuya funcion es separar los complejos inmunes circulantes y destruir el factor reumatoideo, elimina los falsos positivos y aumentar la sensibilidad de la prueba.

LECTURA DE RESULTADOS La lectura es visual y se debe realizarse de la

siguiente manera: Negativo: suspensión granular muy fina con

ausencia de aglutinación Positivo +: suspensión con escasos grumos

contra un fondo homogeneo lechoso. Positivo ++: suspensión con escasos a

moderados grumos contra un fondo moderamente homogeneo.

Positivo +++: suspensión con moderados a abundantes grumos contra un fondo claro.

Positivo ++++: suspensión con abundantes grumos contra un fondo totalmente claro

CRYPTOCOCOSIS CRYPTOCOCOSIS LATEX LATEX

Cuando la prueba es positiva + o mas, se debe realizar titulaciones para el seguimiento de tratamientos.

Las diluciones recomendadas son: ◦ positivo ++ se recomienda comenzar al 1:2; ◦ positivo es +++ o ++++ se suguiere comenzar en 1:100

Posteriormente para muestras seriadas del mismo paciente se debe utilizar el mismo esquema de dilucion.

El seguimiento se debe realizar hasta la negativizacion de la aglutinación.

Cuando se realiza titulaciones para seguimiento de tratamientos es conveniente realizarlas con el mismo equipo para evita variaciones.

La sensibilidad varía entre el 93% y el 100% con un 93-98% de especificidad. Puede haber falsos positivos:Presencia de factor reumatoidePacientes con lupus Pacientes con sarcoidosis,Arrastre medio de cultivo de agar chocolate, Asas de platino o desinfectantes. Infección sistémica por Trichosporon ashaii

Desaparecen los falsos positivos al tratar el suero con pronasa o2-mercaptoetanol.

6. Serología:

• IFI (detección de Ac)IFI (detección de Ac)

• Aglutinación al Látex (detección de Ag)Aglutinación al Látex (detección de Ag)

• ELISAELISA

Es una infección micótica primaria o secundaria causada por miembros del género Candida. Las manifestaciones clínicas pueden ser aguda, subaguda o crónica a episódica. Participación puede estar localizado en la boca, garganta, piel, cuero cabelludo, la vagina, los dedos, las uñas, los bronquios, pulmones, o el tracto gastrointestinal, o convertirse en sistémica como en la septicemia, endocarditis y meningitis.Distribución: En todo el mundo.Agentes etiológicos: Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei. C. parapsilosis, C. guilliermondii y C. pseudotropicalis. Todos están en todas partes y se producen de forma natural en los seres humanos.

Cutaneas:Localizadaas: grandes pliegues, interdigitales y uñasDifusas: amplias superficialesProfundas: granulomas candidiasicos

Mucocutaneas:Mucosa oral: muguet, queilitis, glositisMucosa genital: vaginitis, balanitisMucosa digestiva: esofagitis, enteritisMucosa respiratoria: bronquial , pulmonarCandidiasis mucocutanea cronica

LocalizadasSistema nervioso centralEndocarditisTracto urinarioArtritis y osteitisPeritoneo, higado, bazo y vesicula biliarDiseminadasCandidiasis diseminada cronica o hepatoesplenicaCandidiasis diseminada aguda

CUANDO DEBE SER CONSIDERADA UNA LEVADURA PRODUCTORA DE UNA MICOSIS

Se debe establecer si la levadura aislada está causando infección, esta colonizando o es sola una contaminación.Es necesario una correlación entre el examen directo y el aislamiento de la levadura.

C. neoformans. Tinta china positiva o recuperada de cultivo es significativo.

C. albicans aisladas de esputos o de orina (chorro del medio), rara vez patógena.

En pacientes inmunosuprimidos las levaduras aisladas de sitios estériles es indicativo de infección diseminada con probable fungemía

El diagnóstico se refuerza si en el examen directo o coloraciones se observan pseudohifas (p/micelio) o blastosporas (b/conidias) aisladas o gemantes.Hemocultivos positivos (25-50%) pueden indicar:Candidemia transitoria debida a colonización de catéteres.Candidemia profunda o una invasivaHemocultivos negativos no descarta fungemia

Aumento de pacientes imunocomprometidosMayor utilizacion de procedimientos medicos invasivosMayor uso de fluconazolSobrevida de pacientes críticosMejoramiento de recursos diagnósticos

RICHARDS et al.(EUA)

1993

1o S. coag. neg.2º Enterobacterias3o S. aureus4o Candida sp5o Enterococcus sp.6º Outras

Variáveis AUTOR

Ano

AGENTES

SériesVINCENT et al.(EUROPA)

1995

1ºEnterobacterias 2o S. aureus3o P. aeruginosa4o S. coag. neg.5o Candida sp.6o Outras

PFALLER et al.(EUA)

1999

1o S. coag. neg.2o S. aureus 3o Enterococcus sp4o Candida sp5o Outras

Leucemia agLeucemia agTransplantesTransplantesQuemadosQuemadosCirugia GICirugia GIPrematurosPrematuros

Alto riesgoAlto riesgo

Total - admisiones

Factor de riesgoFactor de riesgoAntibioticos 1.7Antibioticos 1.7Cateter IV Cateter IV 7.27.2Colonizacion Colonizacion CandidaCandida 10.4 10.4Hemodialisis Hemodialisis 10.4 10.4

Óbito p/ Óbito p/ candidíasicandidíasiss

Óbito p/ Óbito p/ enfermeda enfermeda de basede base

Candidemia

Candidemia hospitalariaCandidemia hospitalariaIndicadores de gravedadIndicadores de gravedad

Wenzel. Wenzel. Clin Infect Dis 1995;20:1531-4.Clin Infect Dis 1995;20:1531-4.

SobrevivenSobreviven

Etiologia de la candidemia: relevancia de las espécies “no-albicans”

Europa (170)

5321126413

Espécie

C. albicans C. parapsilosis C. glabrata C. tropicalis C. guilliermondii C. krusei Candida spp

USA (203)

566197126

Canadá (61)

5323118--23

• Espécies Número (%)

C. albicans 43 (42)C. parapsilosis 22 (21,3)C. tropicalis 25 (24,2)C. glabrata 8 (7,7) Outras 5 (4,8)

Predomina en candidiasis genital, oral y cutánea (>90%).En candidemias y enfermedad invasora continúa siendo la causa más frecuente, pero se ha observado una disminución del 7%-10% (1997-2005) en su prevalencia. También se ha notado disminución de acuerdo con el incremento en la edad, después de la exposición a los azoles y en las UCI

Se ha incrementado desde 1993, su frecuencia como causa de candidemia en Norte América.Se ubica como la segunda especie más frecuente.La cataloga como un importante oportunista emergente con gran potencial para desarrollar resistencia a los antimicóticos, especialmente al fluconazol. Se la asocia a pacientes mayores de 60 años, trasplantados de órganos sólidos o con cáncer.La profilaxis con fluconazol es un factor predisponente. En latinoamerica esta especie tiene una baja incidencia (4-6%).

Está conformado por tres especies: C. parapsilosis, C. orthopsilosis y C. metapsilosis. El complejo es considerado patógeno exógeno y se encuentra como colonizador transitorio de piel-uñas y, ocasionalmente, de mucosas. Se asocia a infecciones adquiridas a través de las manos y de los ambientes hospitalarios e, igualmente, también con nutrición parenteral, cirugías recientes que requieran catéteres intravenosos y uso de caspofungina en pacientes con trasplante de células madre. En Latinoamérica esta especie está distribuida en todos los rangos de edad, incluyendo neonatos, grupo que es el más frecuentemente afectado por esta especie en Norteamérica y otras regiones del mundo

Es considerada una causa importante de candidiasis invasora en pacientes con cáncer, especialmente con leucemia, neutropenia y en trasplante de células madre. Se ha observado disminución de candidemias por esta especie con el uso profiláctico de fluconazol en pacientes con cáncer. Esta especie disminuyó como agente de las candidemias en Norteamérica del 10%-12% en los años noventa a 7%-8% en el año 2000. En América Latina y Asia, su incidencia en candidemia es mayor del 15%.

Es una especie considerada emergente debido al uso profiláctico con fluconazolEstá asociada a pacientes con neutropenia. La colonización por esta especie es un predictor de candidemia. Se trata de un microorganismo multidrogo-resistente debido a que tiene una resistencia intrínseca al fluconazol,Tiene una susceptibilidad disminuida a la anfotericina y la fluocitosina que está además, asociada a alta mortalidad (80%-40%)

Genero Candida: mas de 163 espécies - 15 patógenasRelevancia epidemiológicaDiversidad de susceptibilidad los antifúngicos Base para definicion de la terapeuticaNecesidad de identificacion correcta y rápida

Importancia de la definicion de la espécie

Para un diagnóstico correcto es necesario seleccionar,obtener y enviar la muestra adecuada.Existen condiciones importantes para tener en cuenta, como sigue: las muestras deben ser recolectadas asépticamente en frasco estéril con tapa rosca y se deben enviar al laboratorio a la menor brevedad posible. Su recolección y transporte varían de acuerdo con el espécimen y sitio de la infección. Además, cada espécimen debe estar bien rotulado, debe ir acompañado de los datos del paciente (nombre completo, sexo, edad) y datos clínicos (factores de riesgo, tratamiento con antibióticos o antimicóticos, sospecha clínica), examen solicitado y nombre, dirección y otra información de contacto del médico que lo solicita

Los aislamientos de Candida spp. provenientes de sitios corporales no estériles (orina, secreciones respiratorias) presentan dificultades en su valoración pues no permiten establecer un diagnóstico de candidiasis invasora y aun los cultivos cuantitativos no logran diferenciar entre colonización e infección; no obstante, tienen importancia como factor de riesgo.

Criterios morfológicos:

Macroscópicos:morfología de la colonia

Microscópicos:Presentación de las levaduras (Blastoconidias, artrosporas y de pseudomicelios)Producción de Clamidosporas (Bilis Agar, Agar harina de maiz)Tubo germinal

•Método clássico•Métodos comerciales

Métodos disponíbles

Kreger-van Rij, 1984Kreger-van Rij, 1984

En medio líquido: Formación de sedimento, anillo o película. En medio sólido: Textura: cremosa, mucosa.Color: blanco a beige; con pigmento carotenoide , naranja a rojo (Rhodotorula sp., Sporobolomyces sp.), sin pigmento carotenoide (Metschnikowia pulcherrima). Superficie : lisa, rugosa, cerebriforme, etc.Con filamentos o pseudofilamentos : in vitro : en función del medio utilizado.in vivo : Cándida spp. (de saprófito a patógeno).Pseudofilamentos :los brotes se alargan y producen cadenas ramificadas, sin separación.Filamentos verdaderos : el brote crece continuamente.

Examen microscópico directoExamen microscópico directofrescofresco

Examen microscópico directoExamen microscópico directofrescofresco

Examen microscópico directoExamen microscópico directofrescofresco

Artrosporas: Esporas formadas por ciertos tipos levaduras con filamentos verdaderos. Trichosporon.Clamidosporas: C. albicans, esporas grandes, redondas, de pared gruesa.Balistosporas: Sporobolomyces esporas producidas de una protuberancia de la célula madre, son expulsados a gran distancia.

ColoniaColonia

RugosaRugosa MucoideMucoide AnaranjadaAnaranjadaBlanca/BiegeBlanca/BiegeCremosaCremosa

SecaSecaAchatadaAchatada

Macromorfologia en SGAMacromorfologia en SGA

CandidaCandida TrichosporonTrichosporonGeotrichumGeotrichumC. rugosaC. rugosa

CryptococcusCryptococcus RhodotorulaRhodotorula C. kruseiC. krusei

Aspecto del cultivo en ágar Sabouraud-dextroseAspecto del cultivo en ágar Sabouraud-dextrose

Tubo germinativoTubo germinativoC. albicans: Formacion de tubo germinativo en blastoconídios expuestos a suero humano o animal, luego de 2-3 h de incubacion a 37oC

Tubo germinativoTubo germinativo

NegativoNegativo PositivoPositivo

Outras espécies de Outras espécies de leveduralevedura

C. albicansC. albicans

C. DubliniensisC. Dubliniensis

Crece a 42ºCCrece a 42ºC

MicrocultivoMicrocultivoTécnica de cultivo en lamina o placa de Petri sobre medio ágar-harina de maiz con Tween 80Estímula la formacion de pseudohifas a baja tension de O2

Visualizacion de: artroconídios, blastoconídios, clamidoconídios, pseudohifas e hifas verdaderasPresencia y disposicion entre 48 a 96 horas de incubacion

MicrocultivoMicrocultivo

Examen microscópico directoExamen microscópico directo

HemocultivoHemocultivoGiemsaGiemsa

Examen microscópico de Examen microscópico de colonias levaduriformescolonias levaduriformes

Cryptococcus sp

Saccharomyces cerevisiae

Pichia membranifaciens Candida globosa

Saccharomyces cerevisiae

Examen microscópico de Examen microscópico de colonias levaduriformescolonias levaduriformes

Candida krusei

Examen microscópico de colonias levaduriformes

Trichosporon spp Trichosporon cutaneum

Blasto-artroconidios

Examen microscópico de Examen microscópico de colonias levaduriformescolonias levaduriformes

Examen microscópico de Examen microscópico de colonias levaduriformescolonias levaduriformes

25ºC por 25ºC por 2 a 7 días2 a 7 días

en agar harina de maíz - Tween 80 agar arroz - Tween 80

MicrocultivoMicrocultivo ( Dalmau, 1929 ) Estudio micromorfológico de levaduras

Pseudohifas + BlastoconídiosPseudohifas + Blastoconídios

Sin clamidoconídiosSin clamidoconídios Con clamidoconídiosCon clamidoconídios

Otras espécies de Otras espécies de levaduralevadura

C. albicansC. albicans

C. dubliniensisC. dubliniensis

Microcultivo:Microcultivo:

Pseudohifas, blastoconídios, Clamidoconídios

C. albicansC. albicansC. dubliniensisC. dubliniensis

Termotolerancia (42 - 45Termotolerancia (42 - 45ooC)C)C. albicans C. albicans (+) (+) C. dubliniensisC. dubliniensis (-) (-)

Caldo NaCl hipertonicoCaldo NaCl hipertonico C. albicans (+)C. albicans (+) C. dubliniensisC. dubliniensis (-) (-)

C. albicans C. albicans C. dubliniensisC. dubliniensis

Alves SH, Milan EP et al, Diagn Microbiol Infect Dis, 43:85-86, 2002.

Pseudohifas Pseudohifas BlastoconídiosBlastoconídios

Sin clamidoconidiosSin clamidoconidios

CandidaCandida spp spp

Pruebas bioquímicasPruebas bioquímicas

Microcultivo:Microcultivo:

Blastoconídios sin pseudohifas o c/ pseudohifas rudimentares

Microcultivo: ausencia de pseudohifa

Sin cápsula y urease (-)Sin cápsula y urease (-) Con cápsula y urease (+)Con cápsula y urease (+)

C/ ascosporasC/ ascosporas S/ ascosporasS/ ascosporasCryptococcusCryptococcus

RhodotorulaRhodotorula

Candida glabrataCandida glabrata

PichiaPichia

HansenulaHansenula

SaccharomycesSaccharomyces

Busqueda de cápsula

Cryptococcus spp

Produccion de ureasa Uréa de Christensen lectura de 24-48h Interpretacion:Trichosporon spp variáble Cryptococcus spp positivoCandida spp negativo (exceto C. lipolytica e eventualmente C. krusei)

Reproduccion sexuadaEstruturas de reproduccion sexuada = ascosporosMedios que estimulan la produccion de ascosporos V8: 7-10 dias Ágar extrato de malte,

ágar acetato de sódioInoculacion de levadura en medio de cultivo apropriadoFrotis de cultivo teñido por la técnica de ácido-resistencia visualizacion de los ascos que se colorean de verdeGeneros: Saccharomyces, Pichia, Hansenula, etc.

ArtroconídiosArtroconídios

ArtroconídiosArtroconídios

C/ blastoconídiosC/ blastoconídiosy ureasa (+)y ureasa (+)

S/ blastoconídiosS/ blastoconídiosy ureasa (-)y ureasa (-)

GeotrichumGeotrichumTrichosporonTrichosporon

Microcultivo:Microcultivo:

Esquema de IdentificacionEsquema de IdentificacionLeveduras

Crescimento rápido no estimulado por lipídios

Colônias alaranjadasMalassezia spp.

Crescimento lento estimulado por lipídios

Colônias blancas

Rhodotorula spp. Blastoconídios Artroconídios

Ascosporas (-)

Cápsula (+)

Ascosporas (+)

Urease (+) Urease (-)Cápsula (-)

Leveduras sexuadas Saccharomyces spp.Pichia spp.

Candida spp.Identificação baseada emAssimilação Fermentação

Cryptococcus sppTrichosporon spp. Geotrichum spp.

Caracteres bioquímicosCaracteres bioquímicos Permite la diferenciaccion el nível de espécieCaracterísticas metabólicas inherentes a cada espécie de levadura

Cryptococcus

Rhodotorula

Trichosporon Geotrichum SacharomycesPichiaHansenulaCandida

Asimilacion de carbohidratos (Auxanograma)

Capacidad de asimilar determinado carbohidrato como única fuente de carbono para mantener la viabilidad celularMedio sólido sin fuentes de carbono, con inóculo a ser testadoAdicionarse el azúcar que se desea testar 15 azúcares Despues incubacion (24 - 72h), la presencia de crecimento visíble (turvidez) indica asimilacion (+)

Capacidad de utilizar determinado azúcar para producion de energia en baja tension de O2 con producion de etanol y gás (CO2) Medio basal líquido conteniendo solucion de un azúcar + inóculo 6 azúcares Visualizacion de la formacion de CO2 en tubos de Durham invertidosLectura: 24h - 14 dias

Asimilacion de nitrogeno

Algunas levaduras poseen capacidad de asimilar nitrogeno inorganico a forma de nitrato (lectura: 24-48h) Medio sólido basal conteniendo fuente de C, mas sin fuente de N + inóculoAgreguese nitrato de potássio en el campo y peptona (control positivo) en otro campo - presencia de crecimiento visíble (turbidez) indica asimilacion (+)

Identificacion de las principales levaduras de interes clínico

Ph=pseudo-hifa; Gli=glicose; Sac=sacarose; Gal=D-galactose; Raf=rafnose; Xil=D-xilose; Cel=celobiose; Tre=trealose; Dul=dulcitol; Mal=maltose; V=variáble

-

-

+

+

+

+Mal

-+-----+Ph (-)C.glabrata

-------+Ph/blastoc. alongados

C. krusei

++++++++Ph finas Blastocon.

C. guilliermondii

-+-+-+++Ph curvas/células gigantes

C. parapsilosis

-+V+-+++Ph/Blastoc en cadenas

C. tropicalis

-+-+-+V+Clamidoc.

C. albicans

DulTreCelXilRafGalSacGli

AssimilacionMorfologiaLevaduras

Limitaciones del método clásicoLimitaciones del método clásico

Técnica laboriosa

Consumo de tiempo

Requiere profesional experimentado

Requisitos• Padronizados• Simples• Rápidos• Fácil lectura e

interpretacion• Bibliografía• C0sto-beneficio

Métodos comercialesMétodos comercialesObjetivos• Facilitar el trabajo

de laboratório• Ampliar el

espectro de diagnóstico

• Mejorar el diagnóstico

• Identificacion precoz

• Apoyar al clínico

Crecimiento en CHROMAgar Candida :

C. albicans (verde) C. tropicalis (azul)C. krusei (rosa y rugosa) C. parapsilosis (rosácea-lisa) Prototheca wickerhamii (crema)

CHROMAgar CandidaCHROMAgar Candida

1.Enzimáticos

Medios cromogénicos:CHROMagar Candida®Cromogen Albicans ®Candida ID ®Albicans ID2 ®CandiSelect ®Fluoroplate Candida ®Agar SDCA-MUAG ®

Métodos Métodos VantajasRapidez en la identificacion de espécie o

espécies mas freduentes en la rutinaPosibilidad de aislamiento en cultivos

mixtosFacilidad de lectura y simplicidad de

procedimiento

LimitacionesEspecificidad (variáble conforme o

método)Costo (kit e leitura UV)Necessidad de identificacion de espécies

no albicans

Galerias API:Galerias API:ID 32CID 32CAPI 20C AUXAPI 20C AUX

RapID Yeast Plus RapID Yeast Plus SystemSystem

AuxacolorAuxacolor Fungifast I TwinFungifast I Twin CandifastCandifast

Métodos manuales de Métodos manuales de identificacionidentificacion::

J Med Microbiol,50:1105-10,2001; Med Mycol,37(2):11-7,1999;J Clin Pathol,52(4):271-3,1999

ID32C

Métodos Manuais Métodos Manuais

AUXACOLOR® C.Neg GLU MAL. SAC. GAL. LAC. RAF. INO.

CEL. TRE. ADO. MEL. XYL. ARA. ACT. POX.

Pruebas adicionalesPruebas adicionales

MicrocultivoMicrocultivo

CápsulaCápsula

PigmentaçãoPigmentação

Sistemas semi-automáticos:

API 20C AUX®Galería ID 32C®Sistema Vitek ®

Asimilación de azúcares ID 32C (API)Asimilación de azúcares ID 32C (API)

MicroscanMicroscanWalkAway - 40WalkAway - 40WalkAway - 96WalkAway - 96

Vitek YBCVitek YBCVitek 2 ID-YSTVitek 2 ID-YST

Clin Microbiol Rev, 5(3):302-27,1992; JCM,34(10):2408-10,1996; JCM,36(5):1197-200,1998; J Clin Pathol,52(4):271-3,1999; JCM,37(6):1967-70,1999

Métodos automatizados de Métodos automatizados de identificacionidentificacion

•Sistemas automáticos:•Sistema Vitek 2 ID-YST Sistem ® (Identificación y sensibilidad)

•Sistema Biolog YT Microplate®•Rapid Yeast Identification Panel Micro Scan®

VitekVitek

VITEK YBC system (bio Mérieux.Vitek)VITEK YBC system (bio Mérieux.Vitek)

Pruebas Rápidas

RapID Yeast Plus System®Fongiscreen 4H®

Criterios Inmunológicos:

Bichro-latex albicans® Krusei-color®

Cuidados en la utilizacion de sistemas comerciales manuales y automatizados para la identificacion de levaduras

Evaluar costo x benefício antes de adotar el método comercialEvaluar la correlacion del sistema comercial con el método clásicoGuardar los kits a temperatura adequada, respetando su plazo de validezRealizar adecuado mantenimiento del equipoFamiliarizarse com los procedimientos y patrones de lectura

Cuidados en la utilizacion de sistemas comerciales manuales y automatizados para la identificacion de levedurasCertificarse sobre cuales espécies son identificadas por cada métodoCuidado para obtener inóculos puros e viáblesUtilizar siempre microcultivo y otros testes adicionales.Realizar control de calidad con organismos controle.Conocer las espécies problema.

SUCEPTIBILIDAD SUCEPTIBILIDAD ANTIFUNGICAANTIFUNGICA

METODO DE DIFUSION EN AGAR CON METODO DE DIFUSION EN AGAR CON LECTURA AUTOMATIZADALECTURA AUTOMATIZADA

Presionar el hisopo contra el borde interno del tubo para remover el exceso de líquido antes de inocular

Asegurese de usar hisopos de algodón y no de dacrón.

Después de 15 mínutos de haber ajustado el inoculo cubrir el agar completamente con el hisopo en 3 diferentes direcciones. No presione el hisopo sobre el agar.

Deje desaparecer la humedad de la superficie del agar antes de colocar los discos. Asegurese que cada disco quede firme sobre el agar. Use un dispensador de discos si es posible.

Incube los placas por 18 horas a 35°C. El crecimiento sobre el agar debe ser uniforme, formando una capa confluente. Para C

neoformans incubación por 72 horas.

TECNOLOGIATECNOLOGIA

Sistema lector de placas mediante análisis digital Sistema lector de placas mediante análisis digital de imagende imagen

CámaraCámaraTarjeta de VídeoTarjeta de VídeoComputadorComputador

BIOMIC®

Como realizar y leer pruebas de difusión en Agar con BIOMIC®

Método M27-A de los NCCLS Método propuesto por el EUCAST Métodos alternativos y comercializados

◦ Sensititre YeastOne◦ Etest◦ Fungitest◦ Difusión de disco

No hay tecnología y no hay máquina que substituyan al conocimiento, la experiencia y

la sensibilidad del ser humano. Solo él es capaz de interpretar, analizar y juzgar

correctamente.

Armando Fonseca Presidente - SBPC/ML

Malasseziosis: Afecciones producidas por Malassezia

Zona del Palmar

Dermatitis seborreica Chaco- Zona del palmar

Dermatitis seborreica

la relación entre DS y Malassezia fue ya sugerida por Saboraud en 1932

Malassez en 1874 fue el primero en asociar a Malassezia con descamaciones del cuero cabelludo

• observación del alto numero de estos agentes en los materiales obtenidos de DS• efectividad de los tratamientos antimicóticos• la recolonización en los casos de recurrencia

Malassezia

considerado importante en la etiología de la DS

Actualmente

Clínicamente se presenta como descamación e inflamación en áreas del cuerpo ricas en glándulas sebáseas

Frente y surcos nasolabiales

pecho

espalda

oídos

también en axilas e ingle

cuero cabelludo

Las lesiones son rojizas y cubiertas de escamas aspecto grasoso

mecanismo por el cual Malassezia puede generar una inflamación

el debate sobre el verdadero rol patogénico continua en estudio

MalasseziaProduce fosfolipasas

Liberación de ac. araquidónico

Metabolitos involucrados en la inflamación en la piel

Individuos con DS Mayor cantidad de lípidos sobre la piel

DERMATITIS

CUERO CABELLUDO

CARA:Frente, surco nasolabial, zona de la barba

PECHO AXILAS

ESPALDA

OIDO

Incidencia en inmuno-competentes

después de la pubertad

crónica con exacerbaciones frecuentes

Estados inmunológicos deprimidos stress físico o mental

La DS infantil generalmente remite espontáneamente después de los 6 meses. Raramente persiste pasado el año de vida

BAJA en personas normales

Es una forma descamativa no inflamatoria de la DS confinada al cuero cabelludo

Caspa

Dermatitis atópica

La etiología de la DA es considerada como una reactividad cutánea anormal a alergenos, con una predisposición genética

Dermatitis atópica

en lesiones de DA en zonas seborreicas

Malassezia

factor exacervadorAlergeno

barrera cutánea afectada

contacto con sistema inmune

Inflamación crónica de la piel, de etiología a veces discutida.

Dermatitis atópica

Lesiones de DA donde Malassezia se encuentra gralmente involucrada

Lesiones eczematosas, inflamativas, descamativas y pruriginosas

en lesiones de DA en zonas seborreicas• Cuero cabelludo• Cara• Cuello• Espalda

Dermatitis atópicaY

Malassezia

Cara y cuello Cuello y axila

Cara y Cuero cabelludo

ChacoHumedales

Foliculitis

Produce oclusión folicular

Malassezia

Sobrecrecimiento en el folículo piloso

Favorecido por factores externos y/o a la reducida resistencia por parte del hospedador

productos de la levadura y a los ác.grasos libres producidos como resultado de la actividad lipasa

Inflamación

pápulas foliculares y pequeñas pústulas (granos) pruriginosas (erupciones tipo acné)

Presentación clínica

Pecho

Foliculitis

Espalda

Ocurre principalmente enPechoEspaldaBrazos Cara

• Calor y humedad ambiente• Aplicación de sustancias grasas, emolientes oleosos (aceites)• Oclusión (impide la aireación) Uso de ropas sintéticas

Factores favorecedores

FACTORES EXÓGENOS:

favorecen la proliferación de Malassezia

• Piel grasa• Stress y fatiga• Diabetes• Tratamientos con esteriodes orales (Ej: prednisona)• Tratamientos inmunosupresivos• Anticonceptivos• Elevado peso, que resulta en más sudoración y zona ocluidas.• Antibioticoterapia oral, como tetraciclinas, eliminan la capacidad de competición entre bacteria y levaduras saprofitas de la piel, favoreciendo el desarrollo de estas últimas

FACTORES ENDOGENOS:

Malassezia contribuye a la inflamación presente en las lesiones de acné.

Otras asociaciones

Acné vulgaris

La foliculitis por Malassezia puede coexistir con casos de acné

Favorecido por el incremento de aceite en la piel

Pacientes con acné verdadero pueden estar acompañados de MalasseziaEn estos casos hay un sobrecrecimiento tanto de bacteria como de levaduras

Se ha comprobado que la foliculitis por Malassezia a veces resulta ser la razón de los casos de acné que no mejoran con tratamientos antibióticos

prolongados ya que ambas pueden coexistir

Asociaciones con otras afecciones superficiales

• Psoriasis• Acne vulgaris• Dacriocistitis• Blefaritis seborreica• Pustulosis neonatal• Papilomatosis confluente y reticulada• Onicomicosis

Ha sido comprobada la asociación de Malassezia con otras afecciones superficiales, entre ellas:

Psoriasis La sobre infección por Malassezia de la psoriasis pueden causar una exacerbación

el tratamiento de ella resulta en un

mejoramiento de la afección

Probablemente contribuye con la inflamación asociada con esta enfermedad.

Diagnóstico

Chaco -Zona del Palmar

Toma de muestra

KOH - NaOH20 – 40X

+Tinta Parker

RASPADO

Diagnóstico

Examen directo

Blanco de Calcofluor como método más selectivo (mejor visualización), especialmente en DS y otras afecciones de piel

Elementos levaduriformes y micelios

Abundantes elementos levaduriformes

M. globosa

DS - DA

Abundantes elementos levaduriformes

DS - DA

M. restricta

M. obtusa

Los exámenes microscópicos directos y la histopatología muestra la presencia de abundante Malassezia en el folículo pilosebaseo.

Malassezia en folículo piloso

Foliculitis - acne vulgaris

Cultivo No de rutina

Requiere de ácidos grasos para su desarrollo

Medios de cultivos especiales

Medio de Dixon modificadoMedio de Leeming y Notman

Medio de Sabouraud + aceite de oliva• poco rendimiento• no desarrollan todas las especies

Temp: 31º y 35º, ideal 32ºC.

Estudio Macro yMicro-morfológico

Cultivo

Métodos convencionalesTipificación

Pruebas bioquímicas y fisiológicas

No satisfactorio

Crecimiento a diferentes temperaturas Test de catalasaProducción de pigmento (Triptofano)Hidrólisis de la esculinaAsimilación de Tween 20,40,60,80

M. pachydermatis

Pruebas bioquímicas y fisiológicas

Identificación

M. obtusa puede distinguirse por su morfología

M. obtusa

M. restricta

M. restricta: catalasa negativa

M. dermatis y M. furfur solo difieren en el mol %

G+C

Las nuevas especies tienen características fisiológicas similares

a las ya estudiadas

Patrones de asimilación semejantes

Colonias no diferenciables – variación en las colonias Micromorfología: difícil observación Identificación por cultivo en medios adicionados con Tween para ver

asimilación :◦ Necesita experiencia en la interpretación de las zonas de crecimiento

(asimilación) Resultados poco claros e inespecíficos.◦ M. furfur – M. sympodialis – M slooffiae son fisiológicamente similares,

por lo tanto tienen patrones de asimilación semejantes◦ Lo mismo ocurre con M. globosa – M. obtusa y M. restricta. M. obtusa puede distinguirse por su diferente morfología y M. restricta por

ser la única especie catalasa negativa.◦ Las nuevas especies tienen características fisiológicas semejantes M. dermatis y M. furfur solo difieren en el mol % G+C◦ NO permite detectar asociaciones

Desventajas

Identificación

Métodos de Biología molecular

PFGE (Electroforesis de campo pulsante)RAPD (Amplificación randomizada del DNA nuclear) PCR – RFLP (PCR – fragmentos de restricción de largo polimórfico)PCR – REA (PCR – análisis de restricción enzimática)

Caracterización genotípica

PCR - REA• Es precisa. Analiza solo 1 región

genómica LSU rRNA.• Es práctica y por lo tanto rápida.• Menor costo• Detección de asociaciones

Epidemiología

Incidencia y frecuencia de especies de Malassezia Diferentes regiones geográficas Distintas patologías Sitios anatómicos de las lesiones

Metodología de Recolección de muestra Aislamiento y cultivo Tipificación

Pitiriasis versicolor

FoliculitisDermatitis Seborreica

Dermatitis Atópica

M. globosa, M. sympodialis y M. furfur

Infecciones sistémicas

Papilomatosis Psoriasis

2ria a otras afecciones de piel

50%

25%16,6%

8,4%

0102030405060708090

100

M. glob

osa

M. sympo

dialis

M. furfu

r

M. sloo

ffiae

Pitiriasis versicolor

n= 126n

5836 27

5

46%

12%19%

7% 14%

2%

05

101520253035404550

Dermatitis seborreica

43%

33%

14% 10%

05

101520253035404550

M. glob

osa

M. sym

podia

lis

M. sloo

ffiae

M. furfu

r

Foliculitis 50%

25% 21%

4%

0

10

20

30

40

50

60Dermatitis atópica

n= 24

n= 21

n= 57

AUTOR Y AÑOAUTOR Y AÑOKuchenmeister & Rabenhorst Kuchenmeister & Rabenhorst (1867)(1867)Behrend (1890)Behrend (1890)Unna (1896)Unna (1896)Unna (1896)Unna (1896)(Kuchenm. & Rabenh.) Vuillemin (Kuchenm. & Rabenh.) Vuillemin (1902)(1902)

Castellani (1908)Castellani (1908)Castellani (1908)Castellani (1908)de Beurmann et al. (1909)de Beurmann et al. (1909)Kambavashi (1922)Kambavashi (1922)Kambavashi (1922)Kambavashi (1922)Lambachi (1926)Lambachi (1926)

(de Beurmann et al.) (de Beurmann et al.) Ota (1926)Ota (1926)

(Kambayashi) Ota (1928)(Kambayashi) Ota (1928)(Kambayashi) Ota (1928)(Kambayashi) Ota (1928)Mazza & Nino (1933)Mazza & Nino (1933)de Arêa Leão (1940de Arêa Leão (1940))

NOMBRENOMBREPleurococcus beigeliiPleurococcus beigelii

T. ovaleT. ovaleT. ovaleT. ovaleT. giganteumT. giganteum

T. beigeliiT. beigelii

T. foxiT. foxiT. krusiT. krusiOidium cutaneum Oidium cutaneum Oospora granulosaOospora granulosaO. cerebriformisO. cerebriformisT. equinumT. equinum

T. cutaneumT. cutaneum

T. granulesumT. granulesumT. cerebriformeT. cerebriformeT. humahuaquenseT. humahuaquenseT. minusT. minus

CUADRO CLÍNICOCUADRO CLÍNICOPiedra humanaPiedra humana

Piedra humanaPiedra humanaPiedra humanaPiedra humanaPiedra humanaPiedra humana

Piedra humanaPiedra humanaPiedra humanaPiedra humanaFerida de peleFerida de pelePiedra humanaPiedra humanaPiedra humana Piedra humana Piedra animalPiedra animal

Piedra humanaPiedra humanaPiedra humanaPiedra humana

 

T asahii T mucoides

T asteroides T cutaneum T inkin T ovoides

Desde 1992 no se acepta màs la especie Trichosporon beigelii

Levaduras con micelio que se desarticula en artroconidiosGemación ausente o presente. Colonias inicialmente levaduriformes, secas.Forman a menudo apresorios o células meristemáticas.Fermentación ausente. Asimilan diversos H de C.Nitrato (-), Ureasa (+), Doliporos.Dg diferencial: Geotrichum ureasa negativo.Filogenia molecular: género relacionado con Cryptococcus.Algunas especies psicrofílicas. Varias especies crecen a 37ºC y son consideradas como posibles patógenos. Seis especies de interés clínico

Localizaciones más frecuentes:PulmónHígadoBazoPiel

Menos frecuentes:HuesoMédula óseaAparato digestivo

T asahii (sol naciente)

T mucoidesT asteroidesT cutaneumT inkinT ovoides

T. asteroides

T. cutaneum

T. inkin

1 Colonizacion de la piel - region perigenital.2 Contaminacion en ambiente hospitalario.3 Infeccion superficial - pelo, piel u uñas.4 Infecciones sistemicas --> localizada -->

diseminada

Septicemias, meningitis crónica, infección diseminada en SIDA, fungemia en quemados, infección relacionada a catéter o

en pacientes onco-hematológicos.•T asahii y T mucoides: Infecciones sistémicas diseminadas o localizadas, especialmente en leucémicos.

Trichosporon spp

ArtroconídiosArtroconídios

C/ blastoconídiose urease (+)

S/ blastoconídios

e urease (-)

GeotrichumTrichosporon

MicrocultivoMicrocultivo

A B C

A B

A B