Post on 16-Oct-2015
ACTIVIDAD ENZIMTICA
Cuntos moles de sustrato son convertidos en producto por
unidad de tiempo?
setiembre 2012 1enzimas III
FACTORES QUE AFECTAN
Temperatura
pH
[sustrato]
[enzima]
Buffers (kits comerciales)
Efectores (activadores e inhibidores)
Agentes estabilizantes (detergentes,
sales, agentes reductores, etc)??
setiembre 2012 2enzimas III
ACTIVIDAD ENZIMTICA
UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMATICA (U): mol de sustrato transformado en un minuto
ACTIVIDAD ESPECIFICA: unidades de enzima por
miligramo de protena (U/mg protena o mol min-1
mg protena-1)
CONSTANTE CATALITICA O NUMERO DE
RECAMBIO (TURNOVER): unidades de actividad
enzimtica por mol de enzima ( mol min-1 mol de enzima-1). Catalasa y alfa amilasa 5x106 y 1.9 x 104
setiembre 2012 3enzimas III
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA
setiembre 2012 4enzimas III
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
[E]constante y [S]
diferentes
La velocidad de
reaccin permanece
constante cuando la
enzima se satura
setiembre 2012 5enzimas III
Cmo se mide la velocidad de reaccin?
(sustrato producto en el tiempo)
Debemos hacer la reaccin in vitro ?
1. Determinar el sustrato y anlogos
2. Determinar los parametros cinticos de
reaccin (pH, T, [S], [E], [Ef])
3. Disear un ensayo para visualizar la reaccin
4. Medir la velocidad de reaccin
setiembre 2012 6enzimas III
Ejemplo de actividad enzimtica
-galactosidasa
-enlace
Nitrofenilglucosa nitrofenol + glucosa
(incoloro) (amarillo)
Medir la velocidad de aparicin de color amarillo
(sustrato) (productos)
setiembre 2012 7enzimas III
Alcohol Deshidrogenasa (ADH)
CH3CH2OH + NAD+ CH3CH2O + H
+ + NADH
Catalisa la conversin de etanol a
aldehido usando la co-enzima NAD+
NAD+ oxidado a NADH reducido
NADH SE LEE A 340 NM
setiembre 2012 8enzimas III
Efecto de la concentracin de enzima (relacin
lineal)
v
[E]
. . .. . .
. . .. .
setiembre 2012 9enzimas III
v[s]
Efecto de la concentracin de substrato
..
.. . . .
.
setiembre 2012 10enzimas III
E + S ES E + Pk+1
k-1
k+2
Una cintica hiperblica implica un proceso
saturante:
nmero limitado de sitios en la enzima
para fijar substrato; una vez que estn ocupados
todos, por mucho que aumente la concentracin
de substrato, la velocidad permanecer constante
tendiendo un valor asinttico
setiembre 2012 11enzimas III
Se considera la reaccin en el equilibrio:
E + S ES E + P
setiembre 2012 12enzimas III
Velocidad inicial (Vo)
Iniciar con [S] bajas e incrementar
Mantener la [E] saturante
Medir la velocidad de reaccin Vo hasta que la
velocidad sea constante Vmax
Cuando la enzima se mezcla con altas [S]
estado estacionario no permite caracterizacin
setiembre 2012 13enzimas III
Velocidad inicial (Vo)
setiembre 2012 14enzimas III
E + S ES E + Pk1 k2
k-1k-2
1. Enzima y sustrato se combinan para formar el complejo ES
2. Las reacciones son reversibles k-2, es despreciable
3. Asume que [ES] esta constante, estado estacionario :
d[ES]/dt = 0
4. [E]
E + S ES E + Pk1 k2
k-1
V0 = K2 [ES]
K2 [Et] [S]
= ------------------
[S] + km
velocidad mxima (Vmax) ocurre cuando [ES] = [Et]
As, Vmax = K2 [Et]
Vmax [S]
V0 = ------------------ (Ecuacin Michaelis-Menten)
km + [S]
setiembre 2012 16enzimas III
E + S ES E + Pk1 k2
k-1
Vmax [S]
V0 = ------------------
km + [S]
Cuando V0 = 1/2 Vmax
Vmax Vmax [S]
--------------- = ------------------
2 km + [S]
Km = [S] cuando V0 = 1/2 Vmax
setiembre 2012 17enzimas III
E + S ES E + Pk1
k2k-1
Km = [S] a 1/2 Vmax
Concentracin de substrato a la cual se alcanza
la mitad de la velocidad mxima
El Km ms bajo (menor sustrato para alcanzar la 1/2 Vmax)
El Km mide la afinidad de la enzima por el sustrato. A
bajo Km alta afinidad.
Una enzima con un Km de 10-6 M tiene mayor afinidad
por su sustrato que otra que tiene Km de 10-4 M
setiembre 2012 18enzimas III
Cmo determinar Km y Vmax?
setiembre 2012 19enzimas III
La ecuacin de Michaelis-Menten genera una
parbola .- no permite extrapolar los valores de
Km y Vmax facilmente
Convertir la ecuacin de Michaelis-Menten a su
inversa.- grfico de Lineweaver-Burk
setiembre 2012 20enzimas III
Vmax [S]
V0 = ------------------ (ecuacin de Michaelis-Menten )
km + [S]
1 km + [S]
--------- = ------------------
V0 Vmax [S]
1 km [S]
---------- = ------------ + ------------
V0 Vmax [S] Vmax [S]
1 km 1 1
---------- = ------ ------ + ------ (ecuacin de Lineweaver-Burk)
V0 Vmax [S] Vmax
setiembre 2012 21enzimas III
En el caso de la ecuacin Lineweaver-Burk
y = mx + c 1 km 1 1---------- = ------ ------ + ------
V0 Vmax [S] Vmax
Variables: y = 1/ V0 , x = 1 / [S]
Constante: c = 1 / VmaxPendiente: m = km / Vmax
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Determinacin del Km
setiembre 2012 23enzimas III
Determinacin de la Km
setiembre 2012 24enzimas III
Determinacin de Vmax
setiembre 2012 25enzimas III
Representacin recproca doble(Lineweaver - Burk)
1/s
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
1 1 1
v
K
V s Vm
mx mx
-1/Km
1/Vmax
setiembre 2012 26enzimas III
Representacin s -s/v(Eadie - Hofstee)
s
-20 0 20 40 60 80 100 120
s/v
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
s
v Vs
K
Vmx
m
mx
1-Km
setiembre 2012 27enzimas III
Representacin v/s - v(Wong - Hanes)
v/s
0 2 4 6 8 10 12 14 16
v
0
20
40
60
80
100
v Kv
sVm mx
Vmax
setiembre 2012 28enzimas III
Km de algunas enzimas
setiembre 2012 29enzimas III
setiembre 2012 30enzimas III