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Curso de Ciencias Básicas Aplicadas
Lic. Yaily Rivero
2017
Clase 4: Biomoléculas. Función de las proteínas y enzimas
Temas de la clase Unidad II: Biomoléculas
2.1- Principales moléculas orgánicas
- Proteínas - Función de las proteínas
Unidad III: Enzimas
• Definición • Acción enzimática • Estructura • Velocidad de acción • Inhibición y sus tipos • Desnaturalización.
-
Bibliografía Clase
Unidad II: Biomoléculas. AL Lehninger, DL Nelson, MM Cox, Principios de Bioquímica (4ª edición) - Capítulo 5 pg 157-186. Función de las proteínas. - Capítulo 6 pg 190-232- Enzimas
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas Características
- Las proteínas son polímeros de aminoácidos unidos por enlace covalente.
- Se pueden degradar (hidrolizar) hasta sus aminoácidos constituyentes mediante diversos métodos.
- Veinte son los aminoácidos comúnmente encontrados en las proteínas.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas Características estructurales de los aminoácidos
- Los 20 aminoácidos son α- aminoácidos.
- Tienen nombre comunes debido a la fuente de la que fueron aislados.
- Tienen todos un grupo carboxilo y un grupo amino unidos al mismo átomo de carbono (el carbono α).
- Difieren uno de otro en su cadenas laterales o grupos R, que varían en estructura, tamaño y carga eléctrica y que influyen en la solubilidad en agua de los aminoácidos.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas Características estructurales de los aminoácidos
- El C-1 de un aminoácido es el que corresponde al grupo carboxilo y el C-2 al carbono α.
- En todos los aminoácidos estándar excepto la glicina el carbono α está unido a cuatro grupos diferentes:
- Un grupo carboxilo - Un grupo amino - Un grupo R - Un átomo de hidrógeno -
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Aminoácidos Estereoisómeros en los α aminoácidos
La configuración absoluta de los azúcares sencillos y los aminoácidos se especifica mediante el sistema D, L. Los residuos de aminoácidos son exclusivamente L-estereoisómeros.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Aminoácidos Clasificación de los aminoácidos según su grupo R
- Se agrupan en 5 clases basados en las propiedades de polaridad del grupo R - La polaridad del grupo R es la tendencia a interaccionar con el agua a pH biológico (cerca
de pH 7,0) - Varia desde totalmente apolar o hidrofóbico (insoluble en agua) hasta totalmente polar o
hidrofílico (soluble en agua).
Grupos R apolares alifáticos
Apolares e hidrofóbicos
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Aminoácidos Clasificación de los aminoácidos según su grupo R
Grupos R aromáticos
Relativamente apolares e hidrofóbicas Tirosina: El OH puede formar puentes de hidrógeno.
Absorben la luz ultravioleta a 280 nm.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Aminoácidos Clasificación de los aminoácidos según su grupo R
Grupos R polares sin carga
Son más solubles en agua. Tienen grupos funcionales que forman puentes de hidrógeno con el agua.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Aminoácidos Clasificación de los aminoácidos según su grupo R
Grupos R polares cargados positivamente (básicos)
Son los aminoácidos más hidrofílicos junto a los cargados negativamente. Son los aminoácidos que en los que los grupos R tienen una carga neta positiva a pH 7,0.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Aminoácidos Clasificación de los aminoácidos según su grupo R
Grupos R polares cargados negativamente (ácidos)
Son los aminoácidos más hidrofílicos junto a los cargados negativamente. Son los aminoácidos que en los que los grupos R tienen una carga neta negativa a pH 7,0.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Aminoácidos Los aminoácidos pueden actuar como ácidos o como bases
- Cuando un aminoácido se disuelve en agua, se encuentra en solución en forma de ión dipolar o switterion.
- Un switterion puede actuar como ácido (dador de protones)
Las sustancias con naturaleza dual son anfóteras
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Aminoácidos Los aminoácidos pueden actuar como ácidos o como bases
- Cuando un aminoácido se disuelve en agua, se encuentra en solución en forma de ión dipolar o switterion.
- Un switterion puede actuar como ácido (dador de protones)
Las sustancias con naturaleza dual son anfóteras
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Péptidos
Los péptidos son cadenas de aminoácidos que pueden unirse de forma covalente a través de un enlace peptídico.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Péptidos
- Tripéptidos: tres aminoácidos unidos mediante enlaces covalentes.
- Tetrapéptidos – 4 aa - Pentapétidos – 5 aa
- Oligopéptidos: Pocos aminoácidos - Polipéptidos: Masa molecular inferior a 10 000
Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Péptidos
- Existen péptidos y polipéptidos biológicamente activos de una gran variedad de tamaños.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Péptidos
- Los péptidos tienen una composición de aminoácidos característica.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Proteínas
- Algunas proteínas contienen grupos químicos diferentes a los aminoácidos.
Grupo prostético: Se denomina a la parte no aminoácida de una proteína conjugada. - Lipoproteínas – contienen lípidos - Glucoproteínas – glúcidos - Metaloproteínas – metal
específico
- El grupo prostético juega un papel importante en la función de una proteína.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Niveles de estructura de las proteínas
Describe todos los enlaces covalentes que unen los residuos de aa de una cadena polipeptídica
Disposiciones particularmente estable de los aas.
Plegamiento tridimensional de un polipéptido.
Disposición en el espacio de dos o más subunidades polipeptídicas.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Son la base de procesos fisiológicos como: - El transporte de oxígeno - La función inmunitaria - Contracción muscular
• La función de muchas proteínas implica la unión
reversible de otras moléculas (Ligando – sitio de fijación).
• Son flexibles – Cambios conformacionales que permiten un encaje inducido entre la proteína y el ligando.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Las enzimas unen y transforman químicamente otras moléculas: catalizan reacciones.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Unión reversible proteína - ligando: proteínas de unión a oxígeno
- Mioglobina y hemoglobina – proteínas más estudiadas. - El oxígeno puede estar unido a un grupo prostético hemo.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• La mioglobina tiene un único grupo de fijación para el oxígeno - Es una proteína de unión a oxígeno
que está presente en casi todos los mamíferos, principalmente en tejido muscular. - Es una proteína de transporte.
- Polipéptido de 153 aa con un grupo hemos.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Respuesta inmunitaria
Sistemas complementarios
Sistema inmunitario humoral Sistema inmunitario celular
Está dirigido contra infecciones extracelulares (virus y bacterias)
Destruye las células propias infectadas por virus
Base proteica
Anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) 20% de las proteínas de la sangre y producidas por linfocitos B
Linfocitos T citotóxico
Receptores de las células T
Células T cooperadoras
Citoquinas - proteínas señalizadoras solubles
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Sistema complementario entre proteínas y ligandos: el sistema inmunitario y las inmunoglobulinas
- Acción inmunitaria : Leucocitos (glóbulos blancos de la sangre) Macrófagos Linfocitos
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Sistema complementario entre proteínas y ligandos: el sistema inmunitario y las inmunoglobulinas
Proteínas de reconocimiento del sistema inmunitario: - Anticuerpos – célula B - Receptor - célula T
- Unen de manera específica alguna estructura química concreta distinguiéndola de cualquier otra.
- Antígeno: Cualquier molécula o patógeno capaz de generar una respuesta inmunitaria .
Ej: virus, pared celular bacteriana, proteína individual , etc . El antígeno puede unirse a una serie de anticuerpos diferentes
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Sistema complementario entre proteínas y ligandos: el sistema inmunitario y las inmunoglobulinas
Los anticuerpos poseen dos sitios idénticos de unión a antígeno
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Sistema complementario entre proteínas y ligandos: el sistema inmunitario y las inmunoglobulinas
Los anticuerpos poseen dos sitios idénticos de unión a antígeno
ESTRUCTURA DE UNA INMUNOGLOBULINA G
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Sistema complementario entre proteínas y ligandos: el sistema inmunitario y las inmunoglobulinas
Fagocitosis por un macrófago de un virus unido a anticuerpo
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Principales técnicas que utilizan anticuerpos
- Ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA): Cuantificación y caracterización de analitos específicos y/o interaciones moleculares en diversos fluidos biológicos. - Western blot Determinación de niveles relativos de proteínas entre muestras biológicas. Las proteínas provenientes de tejidos o lisados celulares son separadas por electrophoresis en gel de acuerdo a su masa, posteriormente transferidas a una membrana donde las proteínas de interés son reveladas con anticuerpos acoplados a alguna fuente de señal. - Inmunohistoquímica Elucidación de la localización subcellular y tejido-específica de un antígeno en una muestra. Menos cuantitativa que el western blot o el ELISA; sin embargo permite la caracterización de la expresión de proteínas en el contexto del tejido intacto.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Principales técnicas que utilizan anticuerpos
- Inmunocitoquímica Estudia la distribución subcellular de proteínas usando anticuerpos marcados con fluorescencia. Permite una major resolución especial que la inmunoistoquímica al realizarse en células en cultivo, que cuentan con un ambiente menos complejo que los tejidos. - Citometría de flujo Mide la fluorescencia emitida por anticuerpos marcados que se unen a células específicas dentro de una población compleja de células, permite determinar parámetros celulares como tamaño y expresión de marcadores intracelulares y de superficie. - Inmunoprecipitación Permite el aislamiento y purificación de proteínas y complejos proteicos utilizando anticuerpos inmovilizados en una fase sólida que capturan a los antígenos presentes en una muestra.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Diseños de ELISA
ELISA directo
Anticuerpo primario acoplado a una enzima (E) reacciona directamente con el antígeno (Ag)
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Diseños de ELISA
ELISA indirecto
Anticuerpo secundario acoplado a una enzima (E) tiene especificidad por el anticuerpo primario que reconoce al antígeno (Ag).
La señal es amplificable dado que a un anticuerpo primario se pueden unir varios secundarios marcados.
Es el formato más usado.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Diseños de ELISA
ELISA sándwich
El antígeno (Ag) se une a un anticuerpo de captura adsorbido a la superfice de la placa.
La detección puede ser directa o indirecta
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Algunas enfermedades animales que pueden diagnosticarse por ELISA
- Brucelosis - Diarrea Viral Bovina - Clamidiosis - Leptospirosis - Neosporosis - Paratuberculosis - Salmonelosis
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Leptospirosis
- Enfermedad altamente contagiosa y de distribución mundial - Afecta a animales y humanos - Resulta de la infección con la espiroqueta Leptospira - Dos especies: L.interrogans y L.biflexa. - Entres sus variantes la Leptospira interrogans serovar hardjo (L.hardjo) es la causa
de una alto número de casos de leptospirosis bovina. - La técnica de ELISA permite la detección precoz de manera sensible y específica de
la enfermedad a gran escala.
Micrografía de barrido de Leptospira interrogans.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Ejemplo de un protocolo de diagnóstico de Leptospirosis en bovinos
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Sistema complementario entre proteínas y ligandos: el sistema inmunitario y las inmunoglobulinas
Técnicas con anticuerpos
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Interacciones proteicas moduladas por energía química: actina, miosina y motores moleculares.
Las principales proteínas del músculo son la actina y la miosina.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Interacciones proteicas moduladas por energía química: actina, miosina y motores moleculares.
Las principales proteínas del músculo son la actina y la miosina.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Interacciones proteicas moduladas por energía química: actina, miosina y motores moleculares.
Contracción muscular
Los filamentos gruesos de miosina se deslizan a lo largo de los filamentos delgados de actina.
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Interacciones proteicas moduladas por energía química: actina, miosina y motores moleculares.
Mecanismo molecular de la construcción muscular
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Interacciones proteicas moduladas por energía química: actina, miosina y motores moleculares.
Mecanismo molecular de la construcción muscular
Unidad 2: Biomoléculas
Proteínas
Función de las proteínas
• Interacciones proteicas moduladas por energía química: actina, miosina y motores moleculares.
Mecanismo molecular de la construcción muscular
Unidad 3: Enzimas • Definición • Acción enzimática • Estructura • Velocidad de reacción • Inhibición y sus tipos • Desnaturalización.
Unidad 3: Enzimas
- La mayoría de las enzimas son proteínas
Si se desnaturaliza o disocia una enzima en sus subunidades.
Se suele perder la actividad catalítica
Siempre se destruye su actividad catalítica
Su actividad catalítica depende de la integridad de su conformación proteica nativa.
Las estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas enzimáticas son esenciales para su actividad catalítica
Si se descompone una enzima en sus aminoácidos constituyentes
Unidad 3: Enzimas
Definición
Proteínas formadas por células
Aceleran velocidad de reacciones
Disminuyen energía de activación
Específicas con el sustrato
No sufren modificación durante la reacción
ENZIMAS
Unidad 3: Enzimas
- La mayoría de las enzimas son proteínas
- Tienen masas moleculares igual que otras proteínas que van desde 12000 hasta 1 millón.
- Algunas enzimas requieren para su actividad cofactores o coenzimas
Cofactores
Iones inorgánicos
Unidad 3: Enzimas
- La mayoría de las enzimas son proteínas
- Algunas enzimas requieren para su actividad tanto una coenzima como uno o varios iones metálicos.
Moléculas orgánicos o metalorgánicas
Coenzimas
Unidad 3: Enzimas
- La mayoría de las enzimas son proteínas
Grupo prostético: una coenzima o ión metálico unido covalentemente o de manera muy fuerte a la proteína enzimática.
Unidad 3: Enzimas
Nomenclatura
Agregando el sufijo - ASA al sustrato sobre el que actúa la enzima Ej. Ureasa Urea → 2NH3 + CO2
ADN polimerasa → polimerización de nucleótidos en la síntesis de ADN
Unidad 3: Enzimas
- Clasificación internacional de las enzimas
Cada enzima tiene : - Un número clasificatorio de cuatro apartados - Nombre sistemático que identifica la reacción catalizada
Ej. ATP + D-glucosa → ADP + D-glucosa 6-fosfato ATP:glucosa fosfotransferasa 2- nombre de la clases (transferasa)
7- subclase (fosfotransferasa) 1- fosfotransferasa con un grupo hidroxilo como aceptor 1- D-glucosa como aceptor del fosfato
EC: 2.7.1.1
(transferencia de un grupo fosfato del ATP a la glucosa)
Unidad 3: Enzimas
- Clasificación internacional de las enzimas
Comité de Nomenclatura de la Internacional Union of Biochemistry and Molecular Biology
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
Unidad 3: Enzimas
Cómo funcionan las enzimas?
- Una enzima proporciona un ambiente específico dentro del cual una reacción determinada puede transcurrir a mayor velocidad.
Fijación de un sustrato al sitio activo de una enzima. La mancha roja en la superficie de la enzima corresponde a algunos aminoácidos claves del sitio activo
La reacción catalizada enzimáticamente tiene lugar en el sitio activo.
- La molécula fijada en el sitio activo y sobre la que actúa la enzima se denomina sustrato.
- La superficie del sitio activo de la enzima está revestida con residuos aminoácidos cuyos grupos sustituyentes se unen al sustrato y catalizan la transformación química.
Unidad 3: Enzimas
Cómo funcionan las enzimas?
Las enzimas alteran la velocidad de reacción pero no los equilibrios
E+S ↔ ES ↔ EP ↔ E+P
REACCIÓN ENZIMÁTICA SENCILLA
Unidad 3: Enzimas
Cómo funcionan las enzimas?
Las enzimas alteran la velocidad de reacción pero no los equilibrios
Equilibrio de reacción
Velocidad de reacción
≠
Un catalizador, aumenta la velocidad de reacción
No modifica el equilibrio
Unidad 3: Enzimas
Cómo funcionan las enzimas?
Las enzimas alteran la velocidad de reacción pero no los equilibrios
Cualquier reacción se puede describir mediante un diagrama de coordinación de reacción
S↔P Describe los cambios energéticos durante la reacción en forma de energía libre G
El punto de partida se denomina estado basal
Es la contribución a la energía libre del sistema de una molécula promedio (S o P) bajo un conjunto de condiciones dadas.
Unidad 3: Enzimas
Cómo funcionan las enzimas?
Las enzimas alteran la velocidad de reacción pero no los equilibrios
Cualquier reacción se puede describir mediante un diagrama de coordinación de reacción
S↔P
Energía de activación: Es la diferencia entre los niveles de energía del estado basal y del estado de transición.
Estado de transición: Es una barrera energética entre S y P requerida para que la reacción tenga lugar en cualquiera de las dos direcciones.
Unidad 3: Enzimas
Cómo funcionan las enzimas?
Las enzimas alteran la velocidad de reacción pero no los equilibrios
Cualquier reacción se puede describir mediante un diagrama de coordinación de reacción
S↔P La velocidad de una reacción refleja esta energía de activación: una energía de activación más elevada corresponde a una reacción más lenta. La velocidad de reacción puede aumentarse: - incrementando la
temperatura. - Adición de un catalizador
Unidad 3: Enzimas
Cómo funcionan las enzimas?
Las enzimas alteran la velocidad de reacción pero no los equilibrios.
Reacción catalizada por enzima y sin catalizar
La catálisis aumenta las velocidades de reacción disminuyendo las energías de activación
Unidad 3: Enzimas
Cómo funcionan las enzimas?
Las enzimas alteran la velocidad de reacción pero no los equilibrios.
Cualquiera enzima que cataliza la reacción S→P también cataliza la reacción P→S. Su única misión es acelerar la interconversión de S y P. La reacción alcanza el equilibrio de una manera mucho más rápida, cuando está presente la enzima adecuada, ya que incrementa la velocidad de la reacción
Unidad 3: Enzimas
Cómo funcionan las enzimas?
Las velocidades de reacción y los equilibrios tienen definiciones termodinámicas.
S↔P El equilibrio viene descrito por una constante de equilibrio, Keq
Keq = [P] [S] ΔG´°=-RTlnKeq
- R: Constante de los gases (8,315J/mol*K) - T: Temperatura absoluta , 298K (25°C)
La constante de equilibrio es un reflejo directo de la variación de energía libre estándar global de la reacción.
Unidad 3: Enzimas
Cómo funcionan las enzimas?
Las velocidades de reacción y los equilibrios tienen definiciones termodinámicas.
S↔P
La velocidad de una reacción viene determinada por la concentración de reactivo y por la constante de velocidad representada como k
V=k[S]
Ecuación de velocidad
Reacción de primer orden
En esta reacción de primer orden, la velocidad sólo depende la concentración de sustrato.
K: (s-1)
Unidad 3: Enzimas
Cómo funcionan las enzimas?
Las velocidades de reacción y los equilibrios tienen definiciones termodinámicas.
V=k[S1] [S2]
Reacción de segundo orden – depende de la concentración de dos compuestos
K: (M-1S-1)
Unidad 3: Enzimas
Cinética enzimática
La concentración del sustrato afecta a la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas
Curva de saturación de una reacción enzimática donde se muestra la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción.
Unidad 3: Enzimas
Cinética enzimática
La concentración del sustrato afecta a la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas
constante de Michaelis-Menten (Km), que viene a ser la concentración de sustrato necesaria para que una enzima alcance la mitad de su velocidad máxima.
Para encontrar la máxima velocidad de una reacción enzimática, la concentración de sustrato se incrementa hasta que se obtiene una tasa constante de formación de producto . La saturación ocurre porque, cuando la concentración de sustrato aumenta, disminuye la concentración de enzima libre, que se convierte en la forma con sustrato unido (ES). A la máxima velocidad (Vmax) de la enzima, todos los sitios activos de dicha enzima tienen sustrato unido, y la cantidad de complejos ES es igual a la cantidad total de enzima
Vmáx: punto más allá del cual se dan incrementos pequenísimos de velocidad con el incremento de la [S]
Unidad 3: Enzimas
Las enzimas catalizan la reacción bajando la energía requerida para pasar de sustrato a producto
Unidad 3: Enzimas
Factores que afectan la actividad enzimática
* TEMPERATURA
T óptima en humanos = 37°C – 37,5°C
T óptima= T en la que se obtiene la máxima actividad enzimática
Unidad 3: Enzimas
Factores que afectan la actividad enzimática
* pH
pH óptimo para enzimas intracelulares = 7,0
pH = 1-6 : enzimas digestivas - Pepsina
pH = 8- 12: enzimas de la cavidad oral - amilasas
Unidad 3: Enzimas Inhibidores
Reducen o detienen la actividad catalítica de una enzima, bloqueando o distorsionando el sitio activo.
Unidad 3: Enzimas
Inhibición de la actividad enzimática
INHIBICIÓN COMPETITIVA
El inhibidor tiene estructura similar al sustrato.
Los dos compiten por el sitio activo de la enzima.