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INFORME DE ECOLOGÍA MICROBIANA EAP MICROBIOLOGÍA
INTRODUCCIÓN
Los ambientes naturales son extremadamente diversos y la mayoría contiene un amplio
rango de microorganismos que reflejan la naturaleza del hábitat y la habilidad individual
para competir exitosamente y coexistir en un ecosistema dado. Muchas veces el
microorganismo de interés se encuentra en una cantidad o concentración baja en el
ecosistema, por lo que es necesaria alguna forma de enriquecer el medio para favorecer el
crecimiento del organismo, antes del aislamiento. Este enriquecimiento deliberado de un
microorganismo a expensas de otro data del trabajo de Schloesing y Müntz (1877) que
demostraron que la oxidación de compuestos amoniacales a nitratos era un proceso
biológico, esta técnica de enriquecimiento llevaron a Winogradsky y Beijerinck a fundar la
ecología y fisiología de microorganismos.
La columna de Winogradsky es una demostración clásica de cómo los microorganismos
ocupan "microespacios" altamente específicos de acuerdo con sus tolerancias
medioambientales y sus necesidades vitales (requerimientos de carbono y energía) y que,
además, ilustra cómo diferentes microorganismos desarrollan sus ciclos, y la
interdependencia que llega a existir entre ellos (las actividades de un microorganismo
permite crecer a otro y viceversa). Esta columna es un sistema completo y autónomo de
reciclamiento, mantenido sólo por la energía de la luz.
La columna de Winogradsky provee de una extremadamente sencilla pero efectiva vía para
simular ambientes sedimentarios naturales en el laboratorio y provee la presión selectiva
necesaria para enriquecer un microorganismo específico a partir de una microflora inicial
diversa. En la columna evaluada en el laboratorio, columna plástica o de cristal se evaluaron
un gradiente de nutrientes y productos finales como resultado del metabolismo
fermentativo de los sedimentos, formándose un gradiente de oxígeno hacia la superficie de
la columna. Estos gradientes permiten que tipos individuales de bacterias, si se encuentran
en la columna, se desarrollen en puntos específicos de la misma en condiciones óptimas.
INFORME DE ECOLOGÍA MICROBIANA EAP MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
MARCO TEÓRICO
Entre los seres vivos hay varias formas de obtención de carbono y energía. Los animales
estamos restringidos a usar compuestos orgánicos preformados y respirar oxígeno, mientras
que los microorganismos despliegan una diversidad metabólica asombrosa. Las relaciones
que se establecen entre los distintos modos de “alimentación” microbiana constituyen
ecosistemas complejos pero se pueden observar, de forma sencilla, con una columna
Winogradsky.
En la naturaleza, las fuentes de carbono y energía fluyen en ciclos de tal manera que se
determinan complejas interacciones entre los organismos, tanto a escala macroscópica
como microscópica. Fueron Sergei Winogradsky y Martinus Beijerinck, a
finales del siglo XIX y en la primera mitad del XX, los fundadores de la ecología microbiana y
los ciclos biogeoquímicos. Y nos legaron la conocida columna Winogradsky que constituye
una forma de aislar microorganismos con metabolismos energéticos muy variables, además
de una estupenda práctica para comprobar cómo se establece un ecosistema microbiano.
La columna de Winogradsky consiste básicamente en un cilindro de vidrio de unos 5 cm de
diámetro y unos 30 cm de alto que se llena hasta un tercio de lodo de algún lago o río rico en
materia orgánica. Este lodo se mezcla con tiras de papel (celulosa), cáscara de huevo
(carbonato cálcico) y yema de huevo hervido (sulfato cálcico) y se compacta bien para que
no queden burbujas de oxígeno. Se termina de rellenar el cilindro con agua del mismo
lago/río y se tapa bien. La columna se deja expuesta a la luz (pero no al sol directo) durante
varias semanas para que se establezcan las relaciones entre distintos microorganismos y
cada uno se localice en su nicho. Desde fuera se podrá constatar una estratificación con
distintos colores.
En primer lugar se establece un gradiente de oxígeno. La zona más baja de la columna es la
zona anaerobia (sin oxígeno) y adquirirá un color negruzco. En esta zona se desarrollan los
anerobios estrictos como Clostridium que digiere la celulosa en glucosas y las usará
mediante fermentación produciendo compuestos orgánicos simples como el etanol, ácido
acéticos,… Éstos serán usados por bacterias del género Desulfovibrio como alimento
mientras respira anaeróbicamente usando el sulfato que le hemos suplementado. Esto
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generará H2S que, en parte, reaccionará con el hierro del sedimento dando sulfuro ferroso,
responsable del color negro. Otra parte del H2S difunde hacia arriba creando otro gradiente
que se superpone al del oxígeno.
Por encima de este nivel podemos encontrar bandas verdes y rojizas que se corresponden
con las bacterias verdes y púrpuras (respectivamente) del azufre. Estos microorganismos
tienen un metabolismo muy parecido al de las plantas (fotoautótrofos) pero no producen
oxígeno sino azufre elemental, ya que no usan agua sino el H2S proveniente del estrato
inferior.
Por encima de estas franjas empiezan a crecer los fotoheterótrofos como
Rhodospirillum y Rhodopseudomonas de color anaranjado. Estos
microorganismos no crecen bien en presencia de H2S por lo que su nivel coincidirá con la
menor concentración de éste. Y, por último, en la zona superior donde ya encontramos una
cantidad suficiente de oxígeno, podremos encontrar los microorganismos aerobios, desde
bacterias como Beggiatoa y Thiobacillus que oxidan el azufre a sulfato (cerrando el
ciclo) hasta diatomeas y cianobacterias.
Esta columna describe las relaciones que se dan en el ciclo del azufre pero si
modificamos los suplementos y el suministro de luz las relaciones que se establecen serán
distintas. Esto hace que sea ésta una herramienta magnífica en la enseñanza y la
investigación, que nos va a permitir desde una práctica sencilla en la que se constata cómo
se crean los distintos estratos, hasta el estudio microbiológico de cada estrato o el
aislamiento de un determinado tipo de bacteria partiendo desde una mezcla compleja como
es el lodo de un lago.
Microbiología de la columna de Winogradsky
Entre cuatro y seis semanas después de su instalación, la columna debe estabilizarse en tres
ambientes básicos distintos en los que se desarrollarán comunidades bacterianas específicas
en función de sus requisitos medioambientales. Comenzando desde la parte más profunda
de la columna:
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Zona anaerobia (sin Oxígeno)
Hay dos tipos de organismos que pueden crecer en condiciones anaerobias: los que
fermentan la materia orgánica o los que realizan la respiración anaerobia. La fermentación
es un proceso en el que los compuestos orgánicos son degradados de forma incompleta (por
ejemplo, las levaduras fermentan los azúcares a alcohol). La respiración anaeróbica es un
proceso en el que los sustratos orgánicos son completamente degradados a CO2, pero
usando una substancia distinta del oxígeno como aceptor terminal de electrones (Algunas
bacterias, por ejemplo, utilizan nitratos o iones sulfato en vez del oxígeno).
En el nivel más bajo de la columna, en un ambiente con alta concentración de SH2, aparecen
varios grupos diferentes de bacterias:
En el fondo de la columna, dependiendo del tipo de barro utilizado, puede aparecer una
capa de color rosado formada por bacterias púrpura del azufre portadoras de vesículas de
gas. Una especie característica es Amoebobacter.
En esta misma zona, en condiciones estrictamente anaerobias al cabo de unas semanas, y
utilizando la carga de celulosa aportada por los restos de papel incorporados en el
sedimento como fuente primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias del género
Clostridium.
Todas las especies de este género son anaerobias estrictas porque, aunque sus esporas
pueden sobrevivir en condiciones aerobias, las células vegetativas mueren si están expuestas
al oxígeno. Por eso no empiezan a crecer hasta que éste desaparece del sedimento. Estas
bacterias degradan la celulosa a glucosa y, a continuación, fermenta la glucosa para obtener
la energía que necesitan, produciendo una serie de compuestos orgánicos simples (etanol,
ácido acético, ácido succinico, etc) como productos finales de esa fermentación.
Un poco por encima, las bacterias reductoras del azufre, que se visualizan como una
profunda capa negra y están representadas por Desulfovibrio, pueden utilizar estos
subproductos de la fermentación para su respiración anaerobia, usando sulfato, u otras
formas parcialmente oxidadas de azufre como el tiosulfato, generando grandes cantidades
de SH2 en el proceso. Este SH2 reaccionará con cualquier hierro presente en el sedimento,
produciendo sulfuro ferroso, que da color negro. Es por esto que los sedimentos acuáticos
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son frecuentemente negros.
Sin embargo, no todo el SH2 es utilizado. Como veremos un poco más adelante, ciertas
cantidades difunde hacia arriba a lo largo de la columna de agua y son utilizados por otros
organismos que crecen en las zonas superiores.
Este crecimiento se visualiza bajo la forma de dos bandas estrechas, brillantemente
coloreadas, inmediatamente por encima del sedimento: en una primera franja, las bacterias
verdes del azufre (como Chlorobium) procesan los sulfatos a azufre y aparecen en una franja
verdosa. En otras zonas cercanas, bacterias como Gallionella procesan el Hierro formando
una capa negra que se forma justamente por debajo de la anterior. Un poco más arriba, algo
más alejadas por tanto de las altas concentraciones de sulfídrico se desarrolla una zona de
bacterias púrpuras del azufre, como Chromatium, caracterizada por su color rojo-púrpura.
6CO2 + 6H20 C6H12O6 + 6O2 (fotosíntesis de las plantas)
6CO2 + 6SH2 C6H12O6 + 6S (fotosíntesis de las bacterias anaerobias)
Estas bacterias del azufre, verdes y púrpuras, obtienen energía de las reacciones luminosas y
producen sus materiales celulares a partir de CO2. En gran medida, de manera muy similar a
como lo hacen las plantas aunque, sin embargo, hay una diferencia esencial: no producen
oxígeno durante la fotosíntesis porque no utilizan H2O como elemento reductor sino SH2.
Las ecuaciones simplificadas que siguen muestran el paralelismo de ambos procesos:
Un poco por encima de esta zona nos encontramos una franja de bacterias púrpuras no del
azufre, como Rhodospirillum y Rhodopseudomonas, que adquiere un color rojo-anaranjado.
Su mayor o menor abundancia dependerá de la cantidad de sulfhídrico que se haya
producido y de la cantidad que, no utilizada por otros organismos, difunda hacia arriba, ya
que su presencia inhibe a estas bacterias. Son anaerobios fotoorganotrofos que sólo pueden
realizar la fotosíntesis en presencia de una fuente de carbono orgánico.
Zona aerobia (rica en Oxígeno)
La parte superior de la columna de agua puede contener abundantes poblaciones de
bacterias de diferentes tipos. Son organismos aerobios que se encuentran habitualmente en
los hábitats acuáticos ricos en materia orgánica (estanques poco profundos, arroyos
contaminados, etc). Suelen ser flagelados, lo que les permite moverse y establecerse en
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nuevas áreas. Puede desarrollarse también microorganismos fototróficos variados
procedentes directamente del agua o del barro utilizado originalmente en el montaje de la
columna. La superficie del barro puede presentar en esta zona un ligero color castaño. Esta
es la parte de la columna más rica en oxígeno y más pobre en azufre.
Sin embargo, también aquí llegarán por difusión, procedentes del barro de zonas inferiores,
ciertas cantidades de SH2 que será oxidado a sulfato por bacterias que oxidan azufre (como
Beggiatoa y Thiobacillus). Estas bacterias obtienen energía oxidando el SH2 a azufre
elemental y sintetizan su propia materia orgánica a partir de CO2. Por esto se les llama
quimoautótrofas.
En las zonas superiores pueden crecer también cianobacterias fotosintéticas, lo que se
visualizaría cómo un tapete de césped de color verde. Éstas bacterias se caracterizan por ser
las únicas que realizan una fotosíntesis similar a la de las plantas. De hecho, hay poderosas
evidencias de que los cloroplastos de las plantas proceden de cianobacterias ancestrales que
se establecieron como simbiontes dentro de células de algún eucariota primitivo. De forma
paralela hay también evidencias igualmente fuertes de que las mitocondrias de los
eucariotas actuales se derivaron de bacterias púrpuras ancestrales por un similar sistema de
endosimbiosis.
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PRIMERA LECTURA
TABLA N°1. CARACTERÍSTICAS DE COLORACIÓN Y GAS DE LA COLUMNA EN REGIONES SUPERIOR Y PROFUNDA.
CaracterísticasRegión
SuperiorRegión
IntermediaRegión
Profunda
Hora :
10:00am
Fecha:
Coloración: Zona negra Zona negra Zona negra
Gas: - - -
Otros: - - -
Coloración Gram Observación en fresco
Región Superior
gram negativos (bacilares y otras bacterias en cadena, microalgas)
protozoarios (paramecios y otros); espirilos
Región Profunda
Zona negra
Gram positivos (pocos en forma bacilar) y gram negativos (bastante
en forma bacilar), diplococos positivos.
NR
TABLA N°2. CARACTERISTICAS EN LAMINILLA DE LA COLUMNA DE WINOGRADSKI.
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SEGUNDA LECTURA
TABLA N°3: CARACTERÍSTICAS DE COLORACIÓN Y GAS DE LA COLUMNA EN REGIONES SUPERIOR, INTERMEDIA Y PROFUNDA.
Características:Segunda Lectura
Coloración Gram Observación en fresco
Región SuperiorInterfase
NDRestos vegetales,
protozoarios y diatomeas
Región IntermediaZona verde
NDCianobacterias, diatomeas,
protozoarios y pocos espirilos
Región ProfundaZona púrpura
Bacilos Gram positivos Numerosos Espirilos y pocos protozoarios
Zona negra ND NDND: No determinado
TABLA N °4: CARACTERISTICAS EN LAMINILLA DE LA COLUMNA DE WINOGRADSKI.
Características:Segunda Lectura Coloración Gram Observación en fresco
Región SuperiorInterfase
NDRestos vegetales,
protozoarios y diatomeas
Región IntermediaZona verde
ND Cianobacterias, diatomeas, protozoarios y pocos espirilos
Región ProfundaZona púrpura
Bacilos Gram positivos Numerosos Espirilos y pocos protozoarios
Zona negra ND NDND: No determinado
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SEGUNDA OBSERVACIÓN
Fig.1. Columna de Winogradsky. En la segunda
lectura se observó la presencia de gas en superficie y una gruesa capa negra en la
base En contraste con la delgada capa púrpura.
Fig.3. En región superior se observaron protozoarios, diatomeas y algunos espirilos.
Fig.4. En región intermedia se observaron mayor cantidad de diatomeas, cianobacterias y algunos protozoarios.
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TERCERA LECTURA
TABLA N°5. CARACTERÍSTICAS DE COLORACIÓN Y GAS DE LA COLUMNA EN REGIONES SUPERIOR, INTERMEDIA Y PROFUNDA.
Características Región SuperiorRegión
Intermedia Región Profunda
Coloración: Verde claro Verde claro Rojo purpura y zona negra
Gas: No No No
Otros: -Ligero color
verde oscuro
Presencia de tonos rojos ingresando a la banda verde
y a la profundidad
TABLA N °6: CARACTERISTICAS EN LAMINILLA DE LA COLUMNA DE WINOGRADSKI.
OBSERVACIÓN DE LAMINILLAS
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Características:Tercera Lectura
Coloración Gram Observación en fresco
Región SuperiorInterfase
NRRestos vegetales, pocos
protozoarios y algas
Región IntermediaRegión verde
Región púrpura
Bacterias pleomórficas Algas, protozoarios y pocas diatomeas
NR Numerosos Espirilos
Región Profunda
Zona negraNR NR
NR: No hubo resultados
SEGUNDA OBSERVACIÓN
OBSERVACIÓN DE LAMINILLAS
GRAM
Protozoarios
Algas
Bacterias
FRESCO
Fig.5. Columna de Winogradsky. En la tercera
lectura no se observó la presencia de gas en superficie
y la presencia de microorganismos que están
haciendo virar en la zona inferior
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CUARTA LECTURA
TABLA N°7. CARACTERÍSTICAS DE COLORACIÓN Y GAS DE LA COLUMNA EN REGIONES SUPERIOR, INTERMEDIA Y PROFUNDA
Características Región Superior Región Intermedia Región Profunda
Coloración:Amarilla mostaza Verde y Rojo purpura zona negra
Gas: No Si Si
Otros:
La región próxima la región purpura presenta gas. En la
zona roja se observan partes blanquecinas, hay mayor
área roja en la zona expuesta a la luz.
También se observo la presencia de gas.
TABLA N °8: CARACTERISTICAS EN LAMINILLA DE LA COLUMNA DE WINOGRADSKI.
Características:
Cuarta Lectura
Coloración Gram Observación en fresco
Región Superior
Interfase
NRRestos vegetales, pocos
protozoarios y algas
Región Intermedia
Región verde
Región púrpura
Gram negativos, forma cocoide, también se
observo bacterias con forma esféricaPocos protozoarios y pocas
diatomeas
Gram negativas , cocobacilos formando monocapa
Numerosos espirilos y pocas diatomeas.
Región Profunda
Zona negra
NR NR
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Región superior(Zona de aerobiosis)
Región intermedia(Zona de microaerofilia)
Región inferior(Zona deanaerobiosis)
CUARTA OBSERVACIÓN
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DISCUSIONES
En un inicio las características de las columnas fueron son similares (una de cada subgrupo),
el lodo mezclado con el material orgánico (tira de papel, huevo, carne) en el fondo, y en la
superficie el agua estancada (para que puedan desarrollar posteriormente los
microorganismos aerobios estrictos fotosintetisadores). Con el paso de los días se fue
evidenciando las relaciones que se establecen entre los distintos modos de “alimentación”
microbiana, los microorganismos ocupan microespacios a los largo de la columna, de
acuerdo a sus requerimientos nutricionales y ambientales, un tipo de organismo permitirá
crecer al otro, en una especie de ciclo.
Primera lectura (Tabla 1 y 2):
No se observo la presencia de gas esto debido probablemente a que los
microorganismos reductores del azufre todavía se están adaptando al medio donde se
encuentran; pero si se evidencia en la zona de la interfase un escaso cambio de color
negro por lo que estaría evidenciando que los microorganismos sufurados estuvieron
desarrollando.
Segunda lectura (Tabla 3 y 4):
Se observó una pequeña variación en la columna, la capa superficial (zona aeróbica)
tenía una coloración verde claro, esto se debe a la presencia de microorganismos
fototróficos variados como, algas, diatomeas y algunas cianobacterias. El oxígeno
producido por estos microorganismos mantiene la zona aeróbica donde pueden
desarrollarse bacterias heterótrofas aerobias y algunos protozoarios flagelados que se
evidenciaron en las muestras en fresco. Otra característica observada fue la presencia
de burbujas en superficie lo que indica producción de gas. Además de ello, en menor
proporción se podría encontrar algunas bacterias que oxidan el SH2 a sulfato
como Beggiatoa y Thiobacillus ya que el SH2 llega por difusión desde el sedimento
hasta interfase, sin embargo al realizar coloración gram no se pudieron evidenciar
dichos microorganismos. En la región intermedia se observa una capa delgada de color
verde intenso, esto se debe probablemente a la presencia de cianobacterias
(probablemente pertenecientes al género Spirulina y Anabaena, como se observaron en
láminas en fresco), diatomeas (como Navícula y Pinnularia) y protozoos. En la fina capa
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púrpura (zona microaerófila) se pudo evidenciar la presencia de bacterias púrpuras no
del azufre ya que en esta región la cantidad del oxígeno es menor y la gradiente de
azufre aumenta, sin embargo la presencia de estos microorganismo no es tan marcada,
al realizar tinción gram se pudo observar microorgasnimos gram negativos lo que hace
presumir se trate de géneros como Rhodospirillum y Rhodopseudomona. En la muestra
en fresco se observaron numerosos espirilos y pocos protozoarios.
Por último en la zona de anaerobiosis nos indicaría la producción de H2S por bacterias
reductoras del azufre, esto debido a la coloración negra característica en
sedimentoproducidos por los sulfuros metálicos como el sulfuro ferroso, en este
microespacio se podría encontrar al género Clostridium sin embargo no se obtuvo
resultados para la coloración Gram, esto probablemente a que necesitan mas tiempo
para que se adecuen a su ambiente y utlizen su fuente de carbono o que en el ambiente
esté presente en concentraciones muy bajas el oxígeno lo que inhibiría su crecimiento
ya que se tratan de microorganismos anaerobios estrictos
Tercera lectura (Tabla 5 y 6)
Se observó una notable variación en toda la columna, la capa superficial (zona aeróbica)
un tanto verdosa, debido a la presencia posiblemente de microorganismos fototróficos
variados, procedentes directamente del agua o del barro utilizados originalmente en el
montaje de la columna. Seguidamente se notó una zona verde muy marcada e intensa
en este color, para la cual se registró un gran número de protozoarios algunas
diatomeas y algas. En la franja medio púrpura en la zona microaerófila, probablemente
había la presencia de bacterias púrpuras no del azufre (ya que esta región el gradiente
de azufre disminuye y aumenta el oxígeno), al microscopio para la muestra en fresco se
observaron numerosos espirilos en tanto para la coloración gram no obtuvimos
resultados, más abajo, el área de color negro, nos indicaría la producción de H2S por
bacterias reductoras del azufre, sin embargo no se obtuvo resultados para las muestras
en fresco ni para la coloración Gram. Con respecto al fondo (zona anaeróbica), no se
evidenciaron microorganismos para esta lectura, sin embargo cabe la posibilidad de
encontrar a bacterias del género Clostridium que están fermentando la celulosa(aserrín)
colocado en el fondo de la columna, quizás se puedan evidenciar en unos días más
cuando se elimine el oxígeno restante en esa zona.
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CONCLUSIONES
La columna de Winogradsky es un buen método para simular ambientes
sedimentarios naturales en el laboratorio, pues provee la presión selectiva necesaria
para enriquecer un microorganismo específico a partir de una microflora inicial diversa.
El ambiente generado dentro de la columna al cabo de algunas semanas se estabiliza,
formando en la mayoría de los casos 3 zonas: zona aerobia, zona microaerofila y zona
anaerobia. En la zona aerofila predominan generalmente microorganismos aerobicos
fotosintéticos (microalgas, cianobacterias, etc.) En la zona microaerofila predominan los
microorganismos anaerobios facultativos con capacidad sulfo-oxidativa En la zona
anaerobia predominan los microorganismos sulfatoreductores y los fermentadores de
celulosa.
Los gradientes de nutrientes y de productos metabólicos generados en la columna de
Winogradsky permiten que tipos individuales de bacterias, se desarrollen en puntos
específicos de la misma en condiciones óptimas.
Se pudo comprobar los microespacios que ocupan los microorganismos de acuerdo a
su medio ambiente, tolerancia del carbono, oxígeno y sus necesidades de energía.
También se comprobó la interacción que tienen estos microorganismos en la
columna siendo en la zona inferior de lodos organismos que desarrollan procesos
fermentativos que producen alcohol y ácidos grasos como subproductos de su
metabolismo. Estos productos de "desecho" son a su vez el sustrato para el desarrollo
de bacterias reductoras de sulfato. Como resultado se liberan sulfuros que difunden a la
zona superior oxigenada creando un gradiente en el que se desarrollan bacterias
fotosintéticas que utilizan el azufre. Por encima de esta zona pueden desarrollarse las
bacterias púrpura que no utilizan el azufre. Cianobacterias y algas crecen en la parte
superior y liberan oxígeno que mantiene aerobia esta zona lo que facilita el desarrollo
de organimos heterotróficos.
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Siendo la muestra tomada de los humedales de ventanilla se pudo encontrar que en
la zona negra presuntivamente se encontraban géneros como Clostridium,
Desulfovibrio, Desulfotomaculum o Desulfomonas. En región púrpura pertenecientes al
género Rhodopseudomonas. En zzona intermedia pertenece a bacterias verdes del
azufre y bacterias purpuras del azufre pertenecientes al género Chlorobium,
Chromatium o Thiocapsa y en superficie predominaron Cianobacterias, diatomeas,
protozoarios y algunos espirilos.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Educación S.A. España.
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Rojas, F.2008. Densidad de los microorganismo edáficos en suelos.pdf
http://www.cbm.uam.es:8080/mfresno/Clases2Micro2007a.pdf
http://danival.org/600%20microbio/6000notasmicro/micro_winogradsky2.html