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Dpto. Biología Vegetal FACULTAD DE AGRONOMÍA
Micropropagación y proyectos de producción
Protoplastos:
Cultivo y aplicaciones
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Micropropagación y proyectos de producción
Protoplasto :
Célula vegetal desprovista de pared celular, por proceso mecánico o enzimático.
Membrana plasmática completamente expuesta.
Estado transitorio, permite manipulación de esas células.
Mantiene potencialidades de células vegetales completas.
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Micropropagación y proyectos de producción
1892 Primer aislamiento de protoplastos vivos de
cebolla por métodos mecánicos.
1919 Primer aislamiento enzimático, células de
levadura.
1960 Aislamiento de protoplastos de plantas superiores
con degradantes de pared celular.
1971 Regeneración de plantas a partir de protoplastos
de Nicotiana tabacum.
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Aplicaciones
�Producción de híbridos por fusión de protoplastos.
�Manipulaciones genéticas.
�Estudio de procesos fisiológicos y bioquímicos.
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Micropropagación y proyectos de producción
Metodología
1. Aislamiento y factores que lo afectan
2. Purificación
3. Determinación de viabilidad
4. Cultivo
5. Regeneración
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Micropropagación y proyectos de producción
1) Factores que afectan la producción y viabilidad de los protoplastos
�Fuente de material
�Tratamientos pre-enzimáticos
�Tratamientos enzimáticos
�Osmolaridad
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2) Purificación
3) Viabilidad
Toma de oxígeno
Actividad fotosintética
Tinciones
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4) Cultivo
Medio de cultivo: MS, B5 (líquido o sólido)
Osmolaridad
Densidad de plaqueo
Condiciones de almacenamiento
Material vegetal
5) Regeneración
Organogénesis/Embriogénesis somática
Eficiencia generalmente baja
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Micropropagación y proyectos de producción
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Micropropagación y proyectos de producción
Protoplastosaislados de hipocótilo de arroz.
Regeneración de plantas de arroz por cultivo de protoplastos.
Primer división de un protoplasto, a los 4 días de cultivo.
Grupos de protoplastoscreciendo en agarosa.
Bloques de agarosa flotando sobre medio de cultivo.
Plántula derivada de protoplasto, en tubo de ensayo.
Debergh et al.
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Micropropagación y proyectos de producción
Hibridación somática
Aislamiento de protoplastos
Fusión de protoplastos (fases)
Selección células híbridas
Cultivo de células híbridas
Regeneración de plantas
Caracterización de las planas híbridas
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Hibridación somática
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Micropropagación y proyectos de producción
Mecanismo de fusión
Tres fases: Aglutinación
Fusión de membranas
Redondeamiento de protoplastos fusionados
Tratamienos: PEG
alto pH
Ca+2
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Micropropagación y proyectos de producción
PROTOPLASTO A PROTOPLASTO B
AGREGACIÓN
FUSIÓN
DIVISIÓN CELULAR
CÉLULAS HÍBRIDAS
HIBRIDACIÓN SOMÁTICA
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Micropropagación y proyectos de producción
Hibridación somática en Dianthus.
D. chinensis D. barbatus
Masahiro, 2004.
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Micropropagación y proyectos de producción
Hibridación somática en Dianthus.
Masahiro, 2004.
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Hibridación somática entre D.chinensis y D. caryophyllus.
Masahiro, 2004.
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Micropropagación y proyectos de producción
Problemas de la hibridación somática
�La regeneración de plantas a partir de protoplastos es difícil, y a partir de productos de fusión aún más.
�Ploidía de los híbridos es impredecible.
�Dificultades para recobrar la ploidía normal.
�Híbridos con frecuencia presentan problemas de esterilidad.
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Micropropagación y proyectos de producción
Logros de la hibridación somática
�Transferencia de esterilidad masculina de coliflor (Brassica oleracea) a rábano (B. rapa) y a colza (B. napus). Earle y Dicson, 1994).
�Transferencia de resistencia a atrazina en Brassicas(Christey et al. 1991).
�Transferencia de esterilidad masculina en Nicotiana(Zelcer et al. 1978).
�Diversos híbridos somáticos en especies ornamentales y flores de corte.
Dpto. Biología Vegetal FACULTAD DE AGRONOMÍA
FIG. 2. Soybean protoplast cultures. A, Freshly isolated protoplasts; B, first cell divisions in protoplast culture 4 d after isolation; C, microcalliformation in 10 d old culture; D, microcalli in 15 d old culture; E, 25 d old culture; and F, 1 month old culture.
Lin et al, 1987