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Curso de cultivo Curso de cultivo celularcelularCurso de cultivo Curso de cultivo celularcelular
Dr. Juan Carlos Munévar Niño
BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitroin vitro
LA CELULA
Las células son altamente complejas y organizadas.
Átomos moléculas polímeros biológicos
Complejos subcelulares organelos células
Cada célula tiene una apariencia compleja: localización y forma de los organelos y cada organelo tiene una
composición consistente y similar de macromoléculas.
Ej. Células epiteliales intestinales.
Cultivos celulares: células HELA
Las células poseen un programa genético y los mecanismos para utilizarlo.
Las células se reproducen por división, proceso en el cual una célula madre da origen a dos células hijas
BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES.
Juan Carlos Munévar N
BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES.
LA CELULA Las células adquieren y utilizan energía.
En los animales la glucosa se encuentra empacada.En los humanos la glucosa es liberada por el
hígado a la sangre para distribuirse a las células del cuerpo. ATP
Las células efectúan reacciones bioquímicas: necesita energía. Metabolismo
Actividades mecánicas: transporte de materiales, ensamble y desensamble de estructuras.
Cambios dinámicos y mecánicos dentro de la célula . Desplazamiento
Las células son capaces de responder a estímulosReceptores para hormonas, factores de
crecimiento etc. Vías de señalización en respuesta a estímulos: Actividades metabólicas, división celular, movimiento celular, apoptosis, envejecimiento.
Autorregulación: reparación del DNA, apoptosis, Juan Carlos Munévar N
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PROCARIOTAS- EUCARIOTAS SIMILITUDESSIMILITUDESMembrana plasmática de diseño similar
Presencia de ADN
Mecanismos de trascripción y transducción similares
Vías metabólicas compartidas: glicólisis, ciclo de krebs
Aparatos similares para la conservación de la energía química como ATP
PROTEOSOMAS
PROCARIOTAS- EUCARIOTAS DIFERENCIASDIFERENCIASDivisión de la célula en núcleo y citoplasma, separadas por una envoltura nuclear que
contiene un complejo de poros
Cromosomas complejos: ADN + proteínas asociadas
Complejos organelos membranosos citoplasmáticos: RER, Aparato de Golgi,Lisosomas, endosomas, peroxisomas, glioxisomas
Organelos citoplasmáticos especializados en la respiración aerobia
Sistema de citoesqueleto: Microfilamentos, filamentos intermedios, microtubulos
Flagelos y cilios
Endocitosis y fagocitosis
Paredes celulares que contiene celulosa
Diploidia. Meiosis
INTRODUCCION
Curso de cultivo celularCurso de cultivo celular
BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitroin vitro
BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro
INTRODUCCION ¿Validez de la célula cultivada como modelo de
la función fisiológica in vivo? Las células no expresan las
mismas propiedades in vitro que in vivo.
El ambiente celular se modifica:1. Proliferación celular2. Interacciones célula – célula, célula – matriz extracelular (M.E.C.)3. La arquitectura 3D y heterogeneidad in
vivo4. El medio nutricional y factores solubles (estímulos)(estímulos)
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50 µm
BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro
Se crea un microambiente in vitro que favorece la diseminación, migración, y proliferación de células no especializadas
pero no favorece la expresión de funciones diferenciadas.
LA INFLUENCIA DEL MEDIO AMBIENTE EN UN CULTIVO
CELULAR DEPENDE DE:
1. La naturaleza del sustrato o fase.2. La composición fisicoquímica y
fisiológica del medio de cultivo.3. La constitución de la fase
gaseosa.4. La temperatura de incubación.
Proveer el ambiente apropiado: adhesión al sustrato, nutrientes, factores solubles y sustrato es fundamental para la expresión de funciones especializadas.
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BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro
La regulación del fenotipo celular en cultivo esta influenciado por:
Interacciones célula – célula
Interacciones célula – M.E.C.
Factores solubles (hormonas,
factores de crecimiento,
nutrientes, iones inorgánicos)
Proveer el ambiente apropiado: adhesión al sustrato, nutrientes, factores solubles y sustrato es fundamental para la expresión de funciones especializadas.
Afectara:
La adhesión celular
La proliferación
La diferenciación
La morfología celular
La migración celular
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Percepción y Transducción de señales; Cross-talk
Las principales vías de señalización se intercomunican
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ADHESION CELULAR
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Membrana plasmática
Bicapa fosfolipídica: compartimentos, superficie para reacciones bioquímicas esenciales.
Integridad estructural de la célula
Control del paso de sustancias: permeabilidad selectiva
Regula las interacciones entre las células
Reconocimiento por medios de Rc de Ag, células extrañas y alteradas.
Interfase entre le citoplasma y el ambiente externo.
Sistema de transporte para moléculas específicas
Efectúa transducción de señales físicas, químicas, mecánicas en acontecimientos intracelulares.
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En la membrana celular existen otras moléculas anfipáticas: glucolípidos y colesterol.
Los ácidos grasos insaturados la fluidez de la membrana y el colesterol la disminuye: difusión lateral de proteínas de membrana y movilidad celular.
Proteínas Integrales: transmembrana que a menudo forman canales iónicos o sirven como transportadores. Proteínas de membrana multipaso. Receptores de membrana
Proteína de superficie: periféricas. Ubicadas sobre la cara citoplasmática de la membrana celular, en
ocasiones en la superficie extracelular. A menudo se relacionan con el sistema de segundos mensajeros o con el citoesqueleto.
COMPOSICION MOLECULAR Y BIOQUÍMICA
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GLUCOCALIZ Cubierta externa de la membrana celular.
Constituida por carbohidratos unidos covalentemente a las proteínas transmembranales y a los fosfolípidos de la cara externa.
Protegen contra la interacción con proteínas inapropiadas, lesiones químicas, físicas.
Reconocimiento y adhesión entre células.Neutrófilo-EndotelioCascada de coagulación sanguíneaProceso Inflamatorio
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Las células que provienen de tejidos sólidos crecen en MONOCAPA, después de la disgregación necesitan anclaje para diseminarse sobre el SUSTRATO, antes de comenzar a proliferar.
excepto las células transformadas (anclaje independientes)
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ADHESION CELULAR
La adhesión celular está mediada por receptores de superficie celular específicos para moléculas de la M.E.C.
la diseminación está precedida por la secreción de proteoglicanos y proteínas de la M.E.C.
Las células en cultivo adhieren a
1. Vidrio
(carga negativa)
2. Plástico (polistireno)(descarga eléctrica radiación ionizante)
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La superficie del vidrio o plástico puede condicionarse mediante:
Previo crecimiento celular
Pre - tratamiento del
sustrato
Al lograr la adhesión al sustrato las células comienzan a crecer y posteriormente proliferan.
Provee una superficie
adecuada para la
adhesión celular
Moléculas de la M.E.C.
Colágeno,Fibronectina,lam
inina, gelatina
Para las células semejantes a fibroblastos:Adhesión al sustrato
diseminaciónPara las células epiteliales:
Correcto contacto célula – célula
crecimiento
PRINCIPAL REQUISITO
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TIPOS DE PROTEINAS TRANSMEMBRANALES
MOLECULAS DE ADHESION CELULAR
Interacciones célula – célula y célula M.E.C. Moléculas de adhesión celular (CAM’s)
(Ca2+ independientes)
Cadherinas
(Ca2+ dependientes)
Integrinas.
(Receptores para M.E.C.)
Proteoglicanos
(Receptores para factores de crecimiento)
INTERACCIONES ENTRE
CELULAS HOMOLOGAS
Proteínas interactivas
INTERACCIONES CELULA
SUSTRATO
Motivo RGD.
INTERACCIONES CELULA SUSTRATO
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MOLECULAS DE ADHESION CELULAR
Familia de proteínas que permiten contacto célula-célula o célula-matriz extracelular.
GlicoproteínasGrupo COOH unido al citoesqueletoGrupo NH2 especificidad de unión al ligando .
MonoméricasMonoméricas (Cadherinas), diméricas,diméricas, heterodiméricasheterodiméricas (integrinas). Uniones homofílicasUniones homofílicas (Cadherinas),
heterofílicasheterofílicas (integrinas)
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Selectinas: LectinasL-selectina: Leucocitos, adhesión al endotelio en procesos inflamatorios.
E-selectina: Endotelio, permite la unión de neutrófilos
P-selectina: Plaquetas y endotelio.
MOLECULAS DE ADHESION CELULAR
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Funciones:Funciones: desarrollo tisular, migración celular, procesos inflamatorios e inmunológicos.
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Súper familia de las Inmunoglobulinas ICAM, VCAM, pueden secretarse y anclarse a la MEC.
Integrinas: son GP de membrana, son heterodímeros, uniones covalentes.La unión del ligando-integrina resulta en reorganización del citoesqueleto, migración o división celular, apoptosis.
Β1 Integrinas: crecimiento, maduración, migración, proliferación, citotoxicidad y fagocitosis.
MOLECULAS DE ADHESION CELULAR
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Β2 Integrinas: quimiotaxis del fagocito. Adhesión al endotelio.
Β3 Integrinas: permiten la unión al MEC, su ligando es colágeno o fibronectina.
Proteoglicanos: Interactúan con las proteínas de MEC y factores de crecimiento.
MOLECULAS DE ADHESION CELULAR
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Tight junctions: (Zonula occludens)
Fusión de las membranas celulares como “cremallera”.Previenen el movimiento de material entre las células.
Adhering junctions: (Zonula / Macula)
- Se conserva un espacio de 20 nm entre membranas opuestas
- Ocupado por material filamentoso anclados al lado citoplásmico de la unión (Zonula adherens)
- Desmosomas, hemidesmosomas (Macula adherens)
Gap junctions: Región de unión de 2 membranas opuestas, en donde se
conserva un espacio de 3 nm. Permite el paso de iones / moléculas hidrofilicas
UNIONES INTERCELULARES
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Las uniones intercelulares se clasifican según su forma y extensión:Zonula (Zonula adherens, zonula occludens)Macula (Macula occludens, macula adherens)
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LA DISOCIACION ENZIMATICA DE UN TEJIDO O DE UNA MONOCAPAdigiere la M.E.C.dominios extracelulares de proteínas transmembranales
1. LAS CELULAS EPITELIALESSon resistentes a la disociación
enzimáticaPoseen fuertes uniones intercelulares
Desmosomas, uniones adherentes, uniones estrechas
Las células deben volver a sintetizar las proteínas de la M.E.C. antes de adherirse o debe incorporarse un sustrato revestido con M.E.C
2. LAS CELULAS MESENQUIMATOSASSon fáciles de disociar enzimáticamente
Dependen de interacciones con la M.E.C.Colágeno, fibronectina, entactina, laminina, nidogéno, etc.
Las moléculas de adhesión celular están unidas a elementos del citoesqueleto.
Red de filamentos proteicosRed de filamentos proteicos que presenta funciones mecánicas;
1. Mantener la forma celular, 2. Movimiento celular,3. Desplazamiento intracelular
organélos
CITOESQUELETO
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Sus estructuras principales son: Microtúbulos Filamentos intermedios Microfilamentos
CITOESQUELETO
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Integrinas.
Microfilamentos de ACTINA
CadherinasMicrofilamentos de ACTINA
Filamentos intermedios.
(Placa intracelular)
ADHERENS JUNCTIONS
Morfología celular
DESMOSOMAS
¿Estructural / Señalización?
SEÑALIZACION
Superficie celular - Núcleo
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MICROTUBULOS Se encuentran dispersos en el
citoplasma, o formando estructuras estables como cilios, flagelos o centríolos.
Pueden formarse y destruirse según las necesidades de la célula.
Tubulina, (a-tubulina y b-tubulina) protofilamento, y cada microtúbulo consta de 13 protofilamentos paralelos que forman un cilindro
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MICROTUBULOS Brindan rigidez y conservan la forma celular
Regulan el movimiento intracelular de organelas y vesículas
Contribuyen a formar los compartimentos intracelulares
Constituyen el huso mitótico, responsable de organizar el movimiento de los cromosomas durante la división celular
Distribuyen el retículo endoplásmico y aparato de Golgi en los lugares apropiados
Son los elementos estructurales y generadores del movimiento de cilios y flagelos (MOVIMIENTO CELULAR)
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FILAMENTOS INTERMEDIOS FUNCIONES:
° brindar sostén estructural a la célula. ° resistencia tensil.° protección celular contra las presiones y las tensiones.
Específicos de líneas celulares. (Marcadores)
ق Queratina (células epiteliales), ق Vimentina (células mesenquimatosas),ق Desmina (células musculares)ق Filamentos de la lámina nuclear (Refuerzan la
membrana nuclear)ق Neurofilamentos (ubicados en células nerviosas), etc.
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MICROFILAMENTOS Filamentos delgados
(microfilamentos)
Formados por dos cadenas de subunidades globulares, actina G, enrolladas entre sí para formar una proteína filamentosa o actina F.
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ACTINA Contracción muscular, al asociarse a
filamentos de miosina y otras proteínas.
Fagocitosis mediante la formación de seudópodos
Citocinesis: forman el anillo contráctil que finalmente da lugar a la separación de las células hijas durante la mitosis
Refuerzan la membrana plasmática, formando justo por debajo de la misma una densa red de filamentos conocida como cortex celular
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PROLIFERACION CELULAR
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G1
G0
6-8 h
ADN, ARN, Proteína
3-4 h
ARN, Proteína
1 h
Mitosis, Cytocinesis
S
G2 Cyc D’sCDK4,6
Cyc B/ACDK1
Cyc ACDK2
M
Cyc ECDK2
6-12 h ARN, Proteína
p53pRb
LaminaH1Abl
CICLO CELULAR
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pRbpRb
CDK2
CE
E2FEnzimas para síntesis DNA
Paso de G1 a S
Daño al DNA
1. fosforilación CDC
2. Degradación ciclinas
3. C & CDK síntesis
4. Inhibición CDC
pRbpRb
P
Activa p53
p21
pRb
REGULACION DEL CICLO CELULAR
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CICLO CELULAR
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La capacidad de renovación celular está relacionada con su potencial de diferenciación.
Clasificación de acuerdo a la capacidad
de PROLIFERACIÓN
1. CELULAS LABILES.
2. CELULAS ESTABLES.
3. CELULAS PERMANENTES.
DIFERENCIACION CELULAR
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DIFERENCIACIÓN CELULAR
La expresión de propiedades diferenciadas en cultivo celular a menudo depende de la promoción de la proliferación celular.
* Necesario para propagar la línea celularNecesario para propagar la línea celular
* La expansión de stocks para el laboratorio* La expansión de stocks para el laboratorio
Condiciones para inducir diferenciación in vitro:* Elevada densidad celular* Elevada densidad celular
+ Promoción de interacciones célula – célula / célula – + Promoción de interacciones célula – célula / célula – M.E.C.M.E.C.
* Factores de diferenciación.* Factores de diferenciación.
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CONDICIONES REQUERIDAS PARA LA DIFERENCIACION
1. Optimizar la proliferación celular
2. Optimizar la diferenciación celular
CONDICIONES REQUERIDAS PARA LA DIFERENCIACION
1. Optimizar la proliferación celular
2. Optimizar la diferenciación celular
DIFERENCIACIÓN CELULARMecanismo por el cuál una célula
adquiere un fenotipo específico.La morfología de una célula varia, pero el
material genético permanece intacto.Las células madre primordiales o Stem
cells definidas como células clonogénicas + capaces de auto-renovarse
+ de diferenciarse en múltiples líneas celulares según el estímulo recibido
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Thomson y col. 1998. Embryonic stem cells lines derived from human
blastocysts. SCIENCE.
Autorenovación ilimitada. Potencial de diferenciación
Stem cells: Scientific progress and future research directions. NIH, 2001
In situ. In vitro.
Las células madre responden a señales externas
Células vecinas
Factores solubles
CELULAS MADRE BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro
CELULAS MADRE
TOTIPOTENCIALES: es decir, que pueden dar lugar a todo un individuo
PLURIPOTENCIALES: capacidad de una célula para convertirse en todas las posibles líneas celulares.
MULTIPOTENCIALES: capacidad de generar células, pero sólo del tipo celular del tejido al que pertenecen o en donde residen
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Embrionarias
Germinales Embrionarias
Adultas
Stem cells: Scientific progress and future research directions. NIH, 2001
STEM CELLS BIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro
DIFERENCIACIÓN El citoplasma de una célula puede contener moléculas
que controlen los genes expresados en el núcleo. Generar señales para la síntesis de diferentes clases de
proteínas y factores de transcripción.
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Proteínas intracelulares
Destino celular Auto-renovación
Factores de transcripción
Expresión individual.
RELOJES
(+) cul-1 C. elegans
(-) CDK inhibidor p27/Kip1
Act. telomerasa
FACTORES DE TRANSCRIPCION
Ovario de Drosophila: Ovario de Drosophila:
incs, espectrosoma (espectrinas y ciclina A)incs, espectrosoma (espectrinas y ciclina A)Mamíferos: CSL/tal-1, Tcf/Lef. Mamíferos: CSL/tal-1, Tcf/Lef.
CONTROLES EXTERNOSCONTROLES EXTERNOS-Factores secretados: TGFß y Wnts-Interacciones célula - célula-Integrinas y matriz extracelular
CONTROLES INTERNOSCONTROLES INTERNOS
M. Fiona, y col. Out of Eden: Stem cells and their niches. Science 2000 287: (25). 1427-1430
MECANISMO INVARIANTE
División asimétrica
Células Stem Progenitores
M. Fiona, y col. Out of Eden: Stem cells and their niches. Science 2000 287: (25). 1427-1430
DIFERENCIACIÓNAUTORENOVACIO
N
MECANISMO REGULADO
Células Stem Progenitores
División simétrica
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IMPLICACIONES CLINICAS
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Resultado
Obtener células madre
para la investigación y
terapia
Obtener células madre
para la investigación y
terapia
Obtener células madre
genéticamente compatibles con un receptor para la investigación
y terapia
Producir embriones
para implantarlos
in utero
Aislar células madre de
tejidos fetales y adultos
Células de embriones o estado de
blastocisto de fertilización in
vitro
Células de un blastocisto
desarrollado de un cigoto enucleado
suplementado con un núcleo de una célula somática del pcte (SCNT)
Cigoto enucleado
con núcleo de una célula
somática del donante(SCNT)
Células producidas en cultivo para repoblar un
tejido enfermo o lesionado
Células producidas en cultivo para repoblar un
tejido enfermo o lesionado
Células producidas en cultivo para repoblar un
tejido enfermo o lesionado
Embriones derivados de
un cigoto, implantado y
evaluado
Uso
Fuente
Células madre
fetales y adultas
Células madre
embrionarias
Células madre embrionarias producidas por técnica SCNT
Clonación: embriones producidos por técnica
SCNT
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DESDIFERENCIACION
La incapacidad de las líneas celulares de expresar el fenotipo in vivo de las células de donde derivan:
Las células diferenciadas pierden sus propiedades especializadas in vitro.
Las células indiferenciadas de la misma línea originan células terminales diferenciadas con capacidad proliferativa reducida.
La ausencia de estímulos apropiados causan desadaptación.
•La continua proliferación selecciona los precursores indiferenciados.
•En ausencia de un microambiente inductor adecuado no se diferencian.
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DESDIFERENCIACION Desdiferenciación
Pérdida irreversible de las propiedades especializadas de la célula
Hepatocito pierde enzimas características (aminotransferasas) y no
almacena glicógeno ni secreta proteínas séricas.
Desadaptación
Síntesis de productos específicos o la expresión de funciones
especializadas reguladas pueden reinducirse si se crean las
condiciones adecuadas.
Presencia de una matriz de colágeno induce la tirosina
aminotransferasa en hepatocitos
El Matrigel estabiliza el fenotipo diferenciado de los hepatocitos.
Selección.Establecer las condiciones adecuadas para favorecer la proliferación
de un tipo celular específico.
Incapacidad de expresar las propiedades de los hepatocitos por
crecimiento de fibroblastos o endotelioJuan Carlos Munévar N
METABOLISMO ENERGETICO
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La mayoría de los medios de cultivo contienen 4 a 20 mM de glucosa, utilizado como la principal fuente de carbono para la glicólisis.
genera ácido láctico como producto final.
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METABOLISMO ENERGETICO
En ausencia de un transportador apropiado (hemoglobina) que mantenga la tensión de O2
Se generan ROS tóxicos para la célula
En condiciones normales de
cultivo
1. Oxígeno atmosférico
2. Cultivo sumergido
El O2 se conserva a niveles atmosféricos, generando condiciones anaeróbicas y la glicólisis para el metabolismo energético.
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El uso de dipéptidos (glutamil-alanina / glutamil–glicina)Minimiza la producción de amoníaco Es más estable en el medio de cultivo.
El ciclo del ácido cítrico permanece activo
Los aminoácidos
Glutamina; Pueden
utilizarse como fuente de
carbono
Oxidación de glutamato por la glutaminasa.
Entrada en el ciclo de Krebs por transaminación a 2- oxoglutarato
La desaminación de la glutamina produce amoniaco
tóxico para la célula,
limitando el crecimiento celular
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Las células normales tienen un número limitado de mitosisLas líneas celulares derivadas de tejidos normales mueren
después de un número limitado de divisiones
Evento determinado genéticamente:
SENESCENCIA
EXCEPCIONES:1.1. LAS CELULAS GERMINALESLAS CELULAS GERMINALES2.2. LAS CELULAS MADRE (STEM CELLS)LAS CELULAS MADRE (STEM CELLS)3.3. LAS CELULAS NEOPLASICAS.LAS CELULAS NEOPLASICAS.
Determinado por la incapacidad de replicarse las secuencias terminales del ADN en el TELOMERO en cada división celular
Acortamiento progresivo del TELOMERO
Finalmente la célula no puede dividirse
SENESCENCIA
Actividad Telomerasa +
Los telómeros representan secuencias repetitivas de ADN que se encuentran en los extremos de los cromosomas.
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Humanos ATTAGGG Estabilidad a los cromosomas “Antipegajoso"
TELOMERASA Ribonucleoproteína
Función:
Síntesis y adición de secuencias teloméricas.
SENESCENCIABIOLOGIA DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro
CONCLUSIONES
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CONCLUSIONESTrabajar en condiciones estándar (componentes celulares)(componentes celulares)
Células finitasCélulas finitasLíneas celulares de proliferación continúa.Líneas celulares de proliferación continúa.
Capacidad de expresar marcadores de diferenciación celular bajo la influencia de condiciones inducidas puede significar:
Las células cultivadas son maduras
Requieren inducción para sintetizar proteínas especializadas
Las Stem cells o células precursoras.
Proliferan indefinidamente permaneciendo indiferenciadas hasta aplicar las condiciones inductoras adecuadas para adquirir un fenotipo especifico En un cultivo celular se mantiene un equilibrio entre
Células madre multipotentesCélulas madre multipotentesCélulas precursoras comprometidas pero Células precursoras comprometidas pero
indiferenciadas.indiferenciadas.Células maduras diferenciadasCélulas maduras diferenciadas
Condiciones ambientales
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CONCLUSIONES Subcultivos en serie a bajas densidades celularesSubcultivos en serie a bajas densidades celulares Promueven la proliferación celularPromueven la proliferación celular
Restringen la diferenciación celular.Restringen la diferenciación celular.
LA IDENTIDAD DE LAS CELULAS EN CULTIVO DEPENDE DE:Línea celular in vivo
(hepatocitos, epidermis, cartílago)La posición dentro de la línea celular
(Stem cell, célula precursora, célula madura)
Subcultivos en serie a elevadas densidades celulares, < Subcultivos en serie a elevadas densidades celulares, < [suero]°[suero]°
Promueven la diferenciación celularPromueven la diferenciación celularInhiben la proliferación celular.Inhiben la proliferación celular.
La fuente del cultivo determina los componentes celulares presentes: EmbriónEmbrión Células madre y precursoras AUTORENOVACION Células madre y precursoras AUTORENOVACION TejidosTejidos Células lábiles / estables Células lábiles / estables RENOVACION LIMITADA RENOVACION LIMITADA
Células precursoras comprometidasCélulas precursoras comprometidas
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CONCLUSIONES
LAS CELULAS TRANSFORMADAS: (Neoplásicas)Hepatoma (rata)
Proliferan in vitroExpresan aspectos de diferenciación.
A mayor similitud con células de fenotipo normalMayor grado de diferenciación inhibirá la proliferación
No es probable que las células se transdiferencienPosiblemente cambian de posición en la línea celular.
(reversiblemente)
EL ÉXITO EN EL MANEJO DE LOS PROTOCOLOS DE CULTIVO CELULAR EL ÉXITO EN EL MANEJO DE LOS PROTOCOLOS DE CULTIVO CELULAR DEPENDE EN GRAN PARTE DE LA COMPRENSION DEPENDE EN GRAN PARTE DE LA COMPRENSION DE LA BIOLOGIA DE LA BIOLOGIA
DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro.DE LAS CELULAS ANIMALES in vitro.
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¡GRACIAS!¡GRACIAS!
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