Post on 10-Mar-2020
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Desplegamiento térmico de
proteínas: análisis de
transiciones
bajo control cinético
2
Desde hace varios años, y hasta la fecha, una práctica
común en la Biología Molecular y la Bioquímica ha sido
la determinación comparativa de la estabilidad de
proteínas con cierto grado de similitud estructural
(mutantes de una misma molécula silvestre, enzimas
termófilas vs. mesófilas, etc.)
3
Los métodos más usados para este propósito son:
1. Inducción del desplegamiento (unfolding) de las
proteínas, a baja temperatura, mediante la adición
de urea o GuHCl.
2. Desplegamiento inducido por aumento de la
temperatura. Con proteínas de gran tamaño se
encuentra frecuentemente que el desplegamiento
térmico es irreversible.
4
A pesar del problema de irreversibilidad, el método de
desplegamiento térmico tiene la ventaja de ser
fácilmente efectuado con los instrumentos
espectrofotométricos modernos (CD, fluorescencia,
absorción de luz) que están equipados con
portaceldas tipo Peltier.
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Análisis de transiciones inducidas por cambio en la temperatura
(barridos térmicos con una velocidad de calentamiento o
enfriamiento constante): ¿Es reversible el proceso?¿Cercano al
equilibrio?
20 30 40 50 60 70 80
-12
-11
-10
-9
-8
-7
[θ] x 1
0-3
Temperature (°C)
lisozima de huevo,
pH 3.0, 2.0 °C/min,
10 µg/mL
6
En este caso, el uso de las ecuaciones del equilibrio
termodinámico está justificado. En particular, para una transición
de dos estados (N ↔ U), después de transformar datos a
fracción de proteína desplegada (fU) vs temperatura:
fU = K / (1 + K)
K = exp(−∆G0/RT)
∆G0 = ∆H − T∆S
7
Si se emplea calorimetría diferencial de barrido (DSC), el trazo de la
capacidad calorífica de exceso (Cp) se obtiene restando una línea
base que representa ∆Cp
4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
3 0 0
4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5
Cp (
kJ [m
ol K
]-1
)
te m p e ra tu re (°C )
8
4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
te m p e r a tu r e ( °C )
Cp
,ex (
kJ [m
ol K
]-1
)
∆ H ( k J /m o l)
La integral bajo la curva, hasta diferentes temperaturas, da
la función de entalpía de exceso, <H>
Esas dos funciones se relacionan con fU:
<H> = fU ∆H , y Cp = d<H>/dT
9
En muchos casos, sin embargo, las transiciones térmicas
ocurren bajo control cinético porque son operativamente
irreversibles
←→
r
u
k
k
N → dkU D (kd >> kr)
o son reversibles pero lejanas del equilibrio, como en el
ejemplo siguiente
10
Triosafosfato isomerasa de levadura (TIM o TPI)
Proteína dimérica, aprox. 52,000 Da
11
20 30 40 50 60 70
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
[θ] x 1
0-3
temperature (°C)
yTIM, pH 8.4, 10 µg/mL
2.0 °C/min (líneas continuas); 0.5 °C/min (líneas de puntos)
Benítez-Cardosa et al. Biochemistry 40, 9049-9058 (2001).
12
Para el análisis de transiciones térmicas lejanas del
equilibrio se recurre a plantear las ecuaciones
diferenciales apropiadas.
Para una transición irreversible sencilla (de dos estados):
→kdN U
dfU/dt = kd fN = kd (1 − fU)
Y, como dT/ dt = v, donde v es la velocidad de barrido, se
obtiene
13
dfU/dT = (kd / v) (1 − fU) ……...........(1)
La variación de kd con la temperatura se expresa, como es
común, por medio de
kd = A exp(−Ea/RT)
o de
kd = E exp(−∆G‡ / RT)
∆G‡ = ∆H‡ − T∆S‡
14
fU = 1− exp [(1/v) ∫ A exp(−Ea/RT) dT ]
fU puede calcularse por integración numérica:
Donde el límite inferior es una temperatura baja (T0) a la
cual fU = 0
Alternativamente, fU puede obtenerse resolviendo
numéricamente la ecuación (1), usando métodos Runge-
Kutta implementados en paquetes de software.
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La resolución numérica de ecuaciones diferenciales permite
tratar mecanismos más complejos
→ 1k →2kIN U
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En cualquier caso, para simular perfiles térmicos de fU o
trazos de Cp es necesario conocer la dependencia de la
temperatura de las “constantes” de velocidad. Esta
información puede ser obtenida de estudios cinéticos clásicos
realizados a diferentes temperaturas.
17
20 30 40 50 60 70 80
-0 .2
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1 .0
1 .2
fu
tem pera ture (°C )
Desplegamiento/replegamiento (unfolding/refolding) de yTIM:
dfU/dT = (ku/v) (1 −fU) − 2(kr/v) C0 fU2
18
¿Cómo proceder si no hay información
cinética disponible?
Desconvolución de trazos de Cp y
perfiles de fU
19
Transición irreversible de dos estados:
310 315 320 325 330 335 340 345 350 355
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
fU
T (K)
dfU/dT
Datos de inicio: un
perfil térmico de fU
20
→kdN U
dfU/dT = (kd / v) (1 − fU)
(dfU/dT)/(1 − fU) = (kd / v)
kd = v (dfU/dT)/(1 − fU) …..(3)
For a Cp curve, the equivalent expression is:
kd = v Cp/(∆H − <H>) …..(4)
Eq (4) was first derived by Sánchez-Ruiz et al. (1988) Biochemistry
27: 1648−1652
21
Entonces, construyendo la función V (dfU/dT)/(1 − fU) a partir
de datos experimentales se obtiene kd como función de T
315 320 325 330 335 340 345 350
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
kd
T (K)
k(T)
22
0.0029 0.0030 0.0031 0.0032-18
-16
-14
-12
-10
-8
ln (k/T)
1/T
Los parámetros de activación (∆H‡ and ∆S‡) son
determinados de un gráfico de Eyring:
ln(kd/T) = ln(E) − (∆H‡ / R)(1/T)
∆H‡/R = 27 973 ± 10
∆S‡/R + ln E = 71.7 ± 0.04
23
En situaciones más complejas, por ejemplo, moléculas de
proteína que tienen dominios que se despliegan
independientemente
24
los trazos de Cp pueden sugerir mecanismos de tres o más
estados
3 1 0 3 2 0 3 3 0 3 4 0 3 5 0
0
5
1 0
1 5
2 0
Cp
T (K )
Kcal/mol
datos sintéticos
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N → I → U
dfI/dT = k1 fN − k2 fI
dfU/dT = k2 fI
<H> = fI HI + fU HU ..... (5)
Cp = (dfI/dT) HI + (dfU/dT) HU ….. (6)
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Usando la ecuación (4), se construye una función T
llamada, por ejemplo kap
kap = v Cp/(∆H − <H>)
donde ∆H es la entalpía total de la desnaturalización
0 .0 0 2 9 0 .0 0 3 0 0 .0 0 3 1 0 .0 0 3 2
- 1 8
- 1 6
- 1 4
- 1 2
- 1 0
- 8
- 6
ln (
kap/T
)
1 /T
Gráfico de Eyring
27
A partir del gráfico anterior:
Ajuste de la zona de baja temperatura (k1):
∆H‡/R = 26,574 ± 95.4
∆S‡/R + ln E = 68.70831 ± 0.29914
k1 = 0.509 at 80 °C (69% de error)
Ajuste de la zona de alta temperatura (k2):
∆H‡/R = 56,604 ± 153
∆S‡/R + ln E = 155.0 ± 0.44879
k2 = 1.79 at 80 °C (7% de error)
28
310 320 330 340 350
0
50
100
150
200
<H>
T (K)
Afinamiento de k1. El gráfico de <H> indica que la entalpía del
intermediario (HI) es cercana a 100 kcal/mol (con respecto a N)
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A baja temperatura, donde el estado final U no está
poblado apreciablemente, una función más adecuada
para determinar k1 es:
k1 ≅ v Cp /(HI − <H>) ……(7)
30
0.00300 0.00305 0.00310 0.00315 0.00320 0.00325-17
-16
-15
-14
-13
-12
-11
-10
ln (
k1/T
)
1/T
Gráfico de Eyring, de la nueva función calculada
según ecuación (7)
31
Recálculo de los parámetros de
activación para k1:
∆H‡/R =28 070 ± 31
∆S‡/R + ln E = 74.2 ± 0.1
k1 = 1.70 s-1 at 80 °C (2% de error)
32
Un caso difícil para la desconvolución. Dos reacciones
secuenciales
N → I → U
pero k1 determina la velocidad dentro de la mayor parte
del intervalo de temperatura donde ocurren las
transiciones.
33
320 325 330 335 340 345 350
0
5
10
15
20
25
30
Cp
T (K)
34
320 325 330 335 340 345 350
0
50
100
150
200
<H>
T (K)
kcal/mol)
35
Como se observa en las dos figuras anteriores, no
hay indicio evidente de que exista un estado
intermediario
Procediendo como en el caso anterior, se calcula una
kap, en función de T:
kap = v Cp/(∆H − <H>)
36
0.0029 0.0030 0.0031
-18
-16
-14
-12
-10
-8
ln (
ka
p/T
)
1/T
Gráfico de Eyring de kap
37
Alta temperatura:
∆H‡/R = 28 231 ± 39
∆S‡/R + ln E = 72.5 ± 0.1
Baja temperatura:
∆H‡/R = 28 076 ±143
∆S‡/R + ln E = 71.4 ± 0.4
Ajustes de las zonas de baja y alta temperatura dan juegos de
parámetros de activación muy parecidos
38
310 320 330 340 350
0
4
8
12
16
20
24
28
C p
T (K )
Cp,ca lc
C p, exp
Sin embargo, la simulación llevada a cabo con los
parámetros de activación obtenidos de la
desconvolución da un trazo de Cp que no coincide con
el trazo experimental
39
En casos como el anterior, el procedimiento a seguir
consiste en un proceso iterativo en el que se calculan las
fi, resolviendo las ecuaciones diferenciales apropiadas, y
con éstas se ajusta la curva de <H> para encontrar
valores de Hi más adecuados.
40
Gracias por su atención
aha@xanum.uam.mx