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CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN
Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012
Centro Nacional de Alimentación
Detección de Alérgenos en Alimentos. Actuaciones del Centro Nacional de
Alimentación
DetecciDeteccióón de Aln de Aléérgenos en Alimentos. rgenos en Alimentos. Actuaciones del Centro Nacional de Actuaciones del Centro Nacional de
AlimentaciAlimentacióónn
Mª Isabel Prieto SantosServicio de BiotecnologíaMMªª Isabel Prieto SantosIsabel Prieto SantosServicio de BiotecnologServicio de Biotecnologííaa
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Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012
Los alLos aléérgenos alimentarios son rgenos alimentarios son proteproteíínas o glicoprotenas o glicoproteíínas nas presentes de forma natural en presentes de forma natural en los alimentos, tanto de origen los alimentos, tanto de origen vegetal como animalvegetal como animal
ALALÉÉRGENOS ALIMENTARIOSRGENOS ALIMENTARIOS
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PROTEPROTEÍÍNAS ALERGNAS ALERGÉÉNICAS NICAS
Alimento Proteínas Totales Proteína Alergénica PM
Cacahuete 29% Ara h1 Ara h2 Otras (arah3 a arah8)
63‐64 kD 17 kD
20% (proteínas del suero)
β‐lactoglobulinas α‐ lactoglobulinas
18 kD 13‐14 kD Leche
80% caseína α, β,κ,γ caseínas 19‐33kD
Huevo 11‐13%
Ovomucoide (Gal d 1) Ovoalbumina (Gal d 2) Ovotransferrina (Gal d 3) Lisozima
Trigo (Gluten)
10‐15 % α, β,γω Gliadinas y Gluteninas
Nuez
Ber e 1 9‐ 3 kD
Soja 70% Glicinina β‐Conglicinina Inhibidor de la tripsina
13‐14 kD 22‐25 kD
Mostaza Sin a 1 Bra j 1
15 kD 16 kD
Crustáceos Tropomiosina (Pen a1, Met e 1, Sa I y Sa II)
36 kD
Pescado Parvalbúmina (Gad c1 o alergeno M) 12 kD
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A) MA) Méétodos Inmunoltodos InmunolóógicosgicosDetección de las proteínas alergénicas mediante anticuerpos específicos
B) MB) Méétodos basados en Biologtodos basados en Biologíía Moleculara MolecularDetección de secuencias diana de ADNmediante PCR
C) MC) Méétodos todos cromatogrcromatográáficosficosUtilizados en investigación
ANANÁÁLISIS DE ALLISIS DE ALÉÉRGENOS EN ALIMENTOSRGENOS EN ALIMENTOS
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Métodos basados en la detección de una o más proteínas o fragmentos proteicos (alérgeno), mediante la unión especifica antígeno‐anticuerpo
A) MA) MÉÉTODOS INMUNOLTODOS INMUNOLÓÓGICOS GICOS
a) Enzimoinmunoensayo ELISAELISA sandwichELISA competitivoELISA directo
b) Métodos rápidos (tiras inmunocromatográficas)
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SISTEMAS DE FLUJO LATERAL (LFD) o TIRAS REACTIVASSISTEMAS DE FLUJO LATERAL (LFD) o TIRAS REACTIVASSISTEMAS DE FLUJO LATERAL (LFD) o TIRAS REACTIVAS
•Sistemas cualitativos (puede ser utilizados como semicuantitativoscon precaución) •Utilidad para muestreo ambiental, verificación zonas de limpieza, screening•Disponibles para muchos alérgenos•Rápidos•Sencillos•Sensibilidad declarada (5 mg/kg (ppm))
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MMéétodo ELISA todo ELISA SandwichSandwich : Etapas: EtapasExtracto de laExtracto de lamuestramuestra
IncubaciónAnticuerpo Anticuerpo conjugadoconjugado
lavado
SustratoSustrato
FrenadoFrenado
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TEPNEL BIOKITS
SISTEMAS ELISASISTEMAS ELISASISTEMAS ELISA
AgraQuant®Métodos directos :DETECTAN LAS PROTEDETECTAN LAS PROTEÍÍNASNAS
ALERGALERGÉÉNICASNICAS
Cuantitativos
RápidosNo requiere equipos demasiado
complejos (lector de placas)
ALTA SENSIBILIDADALTA SENSIBILIDAD: La mayoría de los ELISA declaran una sensibilidad suficiente para detectar concentraciones relativamente pequeñas de alérgenos (adecuados para proteger al consumidor)
(Límite de detección : entre 0,5 mg/kg (ppm) a 5mg/kg (ppm))
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Limitaciones analLimitaciones analííticas en el control de alticas en el control de aléérgenos: rgenos:
A) Extracción de proteínas alergénicas
B) Diferencias en los distintos sistemas ELISA
C) No disponibilidad de MR certificados
A)A) ExtracciExtraccióón de proten de proteíínas alergnas alergéénicasnicas
B)B) Diferencias en los distintos sistemas ELISADiferencias en los distintos sistemas ELISA
C)C) No disponibilidad de MR certificadosNo disponibilidad de MR certificados
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A)Dificultad de la extracción de proteínas alergénicas en los alimentos
A)A) Dificultad de la extracciDificultad de la extraccióón de proten de proteíínas alergnas alergéénicas nicas en los alimentosen los alimentos
a) Influencia del procesado en las propiedades de las proteínas alergénicas
b) Complejidad de la matriz que contiene el alérgenoPolifenoles y taninosGrasaspH
c) Distribución en el alimento
a) Influencia del procesado en las propiedades de las proteínas alergénicas
b) Complejidad de la matriz que contiene el alérgenoPolifenoles y taninosGrasaspH
c) Distribución en el alimento
La facilidad y/o dificultad de la extracción depende:
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Desarrollo de adecuadosprocedimientos de extracción
Kits comerciales suministran sus propios tampones de extracciónProcesos rápidos y fáciles de realizar
•Composición desconocida (PBS, Tris/ClNa,....)•Similares para todos los alérgenos
Necesidad de aditivos especiales:• gelatina de pescado• leche en polvo• sustancias reductoras ( β-mercaptoetanol)• urea 6 mol/litro• agentes surfactantes (1% Tween 20® 0,4% Triton X-100®,
4% SDS)Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012
RETORETO
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ESTUDIOS SOBRE EL EFECTO MATRIZ ( CNA)ESTUDIOS SOBRE EL EFECTO MATRIZ ( CNA)
Efecto de la matriz en alimentos ricos en taninos y polifenoles
• Cacao, chocolate y derivados• Café y Té• Frutas ricas en taninos: • Uvas, platano, manzana, pera…• Frutos secos con piel:
castaña…..
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““Efecto de matriz rica en taninos (muestras con alto contenido eEfecto de matriz rica en taninos (muestras con alto contenido en chocolate) n chocolate) en la deteccien la deteccióón de gluten en alimentos.n de gluten en alimentos.
OBJETIVOOBJETIVO: Mejorar el rendimiento de la extracciMejorar el rendimiento de la extraccióónn
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Valor esperado 20 Valor esperado 20 mgmg//kgkgde glutende gluten
Muestra extraMuestra extraíída con da con ““solucisolucióón n cocktailcocktail””RecuperaciRecuperacióón < 80%n < 80%
Muestra extraMuestra extraíída con da con ““solucisolucióón n cocktailcocktail”” con leche con leche desnatadadesnatada
RecuperaciRecuperacióón > 80%n > 80%
mg/
kgde
Glu
ten
Datos : Procedentes de los Estudios de ValidaciDatos : Procedentes de los Estudios de Validacióón del procedimiento de n del procedimiento de ““DeterminaciDeterminacióón de glutenn de glutenen alimentosen alimentos”” realizados en el CNA realizados en el CNA
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““La influencia de los polifenoles en la detecciLa influencia de los polifenoles en la deteccióón de gluten en alimentos infantiles n de gluten en alimentos infantiles hidrolizados a base de fruta . Efectos de la matriz en la extrachidrolizados a base de fruta . Efectos de la matriz en la extraccicióón de las proten de las proteíínas del nas del glutengluten””
OBJETIVOOBJETIVO: Comprobar el efecto inhibidor de los polifenoles presentes en alComprobar el efecto inhibidor de los polifenoles presentes en alimentos con imentos con alto contenido en fruta en la extraccialto contenido en fruta en la extraccióón de gluten.n de gluten.
PROCEDIMIENTO: PROCEDIMIENTO: ComprobaciComprobacióón del Rendimiento de extraccin del Rendimiento de extraccióón de diferentes tipos de n de diferentes tipos de soluciones en alimentos infantiles ricos en fruta (papillas infasoluciones en alimentos infantiles ricos en fruta (papillas infantiles de frutas):ntiles de frutas):
1.1.‐‐ SoluciSolucióón n CocktailCocktail con Etanol al 80%con Etanol al 80%2.2.‐‐ SoluciSolucióón de n de GuanidinaGuanidina / / ββ‐‐mercaptoetanolmercaptoetanol / / IsopropanolIsopropanol3.3.‐‐ SoluciSolucióón 1 con Gelatina de pescadon 1 con Gelatina de pescado4.4.‐‐ SoluciSolucióón 1 con leche desnatadan 1 con leche desnatada
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RESULTADOSRESULTADOS:
1.1.‐‐ SoluciSolucióón n CocktailCocktail con Etanol al 80% con Etanol al 80% ‐‐‐‐ 2.2.‐‐ SoluciSolucióón de n de GuanidinaGuanidina / / ββ‐‐mercaptoetanolmercaptoetanol / / IsopropanolIsopropanol‐‐‐‐3.3.‐‐ SoluciSolucióón 1 con Gelatina de pescadon 1 con Gelatina de pescado‐‐‐‐ 4.4.‐‐ SoluciSolucióón 1 con leche desnatadan 1 con leche desnatada
Muestras adicionadas con 40 Muestras adicionadas con 40 mgmg//kgkg de Glutende Gluten
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Detectan diferentes proteínas(Diferente sistemas antígeno‐anticuerpo)
Utilizan diferentes calibrantes
Diferentes unidades de expresión de resultados
B) Diferencia de resultados entre distintos sistemas ELISAB) Diferencia de resultados entre distintos sistemas ELISA
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ESTUDIOS SOBRE EL COMPORTAMIENTO DEESTUDIOS SOBRE EL COMPORTAMIENTO DELOS DISTINTOS SISTEMASLOS DISTINTOS SISTEMAS
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ESPECIFICACIONES DE LOS KITS DE DETECCIESPECIFICACIONES DE LOS KITS DE DETECCIÓÓN DE PROTEN DE PROTEÍÍNAS DE HUEVONAS DE HUEVO
SISTEMA ELISA ESPECIFICIDADUNIDADES DE
MEDIDACALIBRANTE
RANGO DE CUANTIFICACIONmg/kg (ppm)
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
LCmg/kg (ppm)
AAnticuerpo policlonalOvomucoide(Gald1)
Proteína blanca de huevo (EWP)
NIST SRM8445(Huevo seco entero en polvo)
0,5 – 10 0,5
B ‐Huevo entero en polvo
Proteína total de huevo 2,5 ‐ 25 2,5
CAnticuerposOvomucoide(Gald1)
Huevo entero en polvo
‐ 1‐ 10 1
DOvoalbúmina y ovomucoide(Gald 1 y Gald 2)
Huevo entero en polvo
NIST SRM8445(Huevo seco entero en polvo)
0,5‐ 13,5 0,5
DIFERENTES
PROTEIN
AS
DIFERENTES
PROTEIN
AS
DIFERENTES
UNIDA
DES D
E MEDIDA
DIFERENTES
UNIDA
DES D
E MEDIDA
DIFERENTE CALIB
RANTE
DIFERENTE CALIB
RANTE
DIFEREN
TE LC
DIFEREN
TE LC
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Preparación de muestras cargadas con NIST SRM 8445 ( Huevo entero enPolvo , Valor de referencia 48% ± 1% Proteína total de Huevo)
1 2 3 4MUESTRAS
Valor Esperado
mg/kg (ppm) proteína blanca de
huevo
mg/kg (ppm)Huevo entero en
polvo
mg/kg (ppm)Huevo entero en
polvo
mg/kg (ppm)Huevo entero en
polvo
Galleta 3 mg/kg huevo entero en polvo 1,1 5,6 3,15 4
Pasta 6 mg/kg huevo entero en polvo 2,6 8,2 5,58 8
Bollo 3 mg/kg huevo entero en polvo 1,21 6,8 3,05 3
Helado1,5 mg/kg huevo entero en polvo 0,53 3,4 1,72 1,6
Vino 1,5 mg/kg huevo entero en polvo 1, 35 2,4 1,7 1,6
Estudio Comparativo kits ELISA determinaciEstudio Comparativo kits ELISA determinacióón de proten de proteíínas de huevonas de huevo
Resultados con muestras de valor conocido Resultados con muestras de valor conocido
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Valor esperado en mg/kg de huevo entero en polvo1234
Resultado expresado en mg/kg de huevo entero en polvo
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Estudio Comparativo kits ELISA determinaciEstudio Comparativo kits ELISA determinacióón de Avellanan de Avellana
Sistema ELISASistema ELISA ExpresiExpresióón de resultadon de resultado Limite de Limite de cuantificacicuantificacióónn
1 Proteína de avellana 0,5 mg/kg
2 Avellana 1 mg/kg
3 Avellana 2,5 mg/kg
4 Avellana 2,5 mg/kg
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Nº de Muestras DETECTADO NO DETECTADO
Puede contener trazas de avellana….Rastros de avellana……….Trazas de frutos secos…..Frutos de cascara…….No Figura Avellana entre sus ingredientes No contiene Frutos secosContiene avellanasCon un x% de avellanaPasta de avellana
ETIQUETADO PRESENCIA DE AVELLANA
10 2 8
10 9 1
10 6 4
DUDOSA
SDUDOSA
SNEG
ATIVAS
NEG
ATIVAS
POSITIVAS
POSITIVAS
RESULTADOS INICIALES CON UN RESULTADOS INICIALES CON UN ÚÚNICO KITNICO KIT
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DISTINTOS SISTEMAS ELISA
1 2 3 4
LC 0,5 mg/kg (ppm) de Proteína de
avellana
LC 1 mg/kg (ppm) de Avellana
LC 2,5 mg/kg (ppm) de Avellana
LC 2,5 mg/kg (ppm) de Avellana
MUESTRAS POSITIVAS /NO ETIQUETADAS
Galleta con chocolateNo figura avellana entre sus ingredientes > 5 mg/kg 35 mg/kg 15,5 mg/kg > 20 mg/kg
Galleta multivitaminada
No figura avellana entre sus ingredientes 0,7 mg/kg 2,9 mg/kg 4,9 mg/kg 8,3 mg/kg
MUESTRAS POSITIVAS / ETIQUETADAS
Pastel Avellana 2% NO DETECTADO NO DETECTADO 3,6 mg/kg NO DETECTADO
MUESTRAS ETIQUETADO DUDOSO
Chocolate Rastros de avellana NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
BarquilloPuede contener trazas de nueces, almendras y soja
NO DETECTADO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
Turrón Trazas de frutos secos NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
ChocolateRastros de cacahuete,avellana y almendra
NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
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RecuperaciRecuperacióón con muestras fortificadas con 5 n con muestras fortificadas con 5 mgmg//kgkg de avellanade avellana
Preparación de muestrasfortificadas, mediantemezcla de variedades de avellana
PreparaciPreparacióón de muestrasn de muestrasfortificadas, mediantefortificadas, mediantemezcla de variedades mezcla de variedades de avellanade avellana
C) No Disponibilidad de Materiales de Referencia C) No Disponibilidad de Materiales de Referencia
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Detección mediante PCR de secuencias de ADN :especificas del alimento alergénicosecuencias de ADN que codifican la proteína alergénica
Desarrollo de kits comerciales (Límite de sensibilidad declarado menos de 2,5 ppm de alimento alergénico )
B) MB) MÉÉTODOS BIOLOGTODOS BIOLOGÍÍA MOLECULAR A MOLECULAR –– ReacciReaccióón de la n de la Polimerasa en Cadena Polimerasa en Cadena ‐‐ PCRPCR
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VENTAJASVENTAJAS
Gran sensibilidadGran especificidadFácil de usarMayor estabilidad
Cumple con el Reglamento (UE) 1169/2011Útil si no existe ELISAVerificar resultados
cuestionables (ej: proteínas hidrolizadas)Bueno como método confirmativo
INCONVENIENTESINCONVENIENTES
No detectan la proteNo detectan la proteíínanaalergalergéénicanicaNo relaciNo relacióón constanten constante
entre presencia deentre presencia deADN y ProteADN y ProteíínanaCualitativo o Cualitativo o
semicuantitativosemicuantitativo( no se puede comparar( no se puede compararunidades de medida)unidades de medida)
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Alcance actual de acreditación del CNA bajo la Norma UNE‐EN ISO 17025, en el campo de alérgenos
Gluten, en 2009Cacahuete, en 2010Proteínas lácteas, en 2010
β‐lactoglobulinaCaseína
Proteínas de huevo, en 2012Ampliación de alcance de Acreditación ( Próxima
auditoria de ENAC, 2013) Detección de avellana
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Muchas Gracias Muchas Gracias
Directora del CNADirectora del CNAMMªª Teresa LTeresa Lóópez Esteban pez Esteban mlopeze@msssi.esmlopeze@msssi.esServicio de BiotecnologServicio de BiotecnologííaaMMªª Isabel Prieto Santos Isabel Prieto Santos mprietos@msssi.esmprietos@msssi.es