Detección Molecular de Resistencia a Antimicrobianos.

D en C. Verónica Jiménez

Laboratorio de Infectología

Resistencia antimicrobiana “Un problema mundial”

Impacto

•Salud

•Social

•Económico

La resistencia a los

antimicrobianos

Cada vez que se ha puesto en uso un nuevo agente

antimicrobiano se han detectado a continuación

cepas de microorganismos resistentes al mismo.

Pérdida de la sensibilidad de un

microorganismo a un antimicrobiano al que

originalmente era susceptible.

Es un fenómeno biológico natural.

Capacidad de las bacterias de desarrollar

mecanismos para evadir el efecto de los

antibióticos a los cuales eran previamente

susceptible.

La Resistencia

Bacteriana

Natural Adquirida Presión selectiva

Cambio genético

Mutaciones

cromosomales

Elementos genéticos

extracromosomales Plásmidos

Transposones

Integrones

Desvío metabólico

Enzima que degrada antibiótico Enzima alteradora

de antibiótico

Plásmido con genes de resistencia a antibióticos

Sobreproducción de enzima blanco

Bomba de eflujo

Antibiótico

Antibiótico

Antibiótico

Reducción de absorción

Mecanismos de

Resistencia Bacteriana

Mecanismos de

Resistencia Bacteriana

Mecanismos de

Transferencia genética

Transformación

Conjugación

Transducción

La determinación genética de los mecanismos de resistencia ha

permitido el uso de métodos de Biología Molecular.

La biología molecular ha sido el gran responsable de una profunda revolución en el entendimiento del comportamiento de las poblaciones bacterianas teniendo un

directo impacto en el diagnóstico y tipificación de agentes infecciosos.

Identificación rápida de agentes infecciosos en pacientes críticos.

Identificación rápida de agentes infecciosos fastidiosos o de lento cultivo

en que los métodos tradicionales no presentan un buen desempeño

(microbiológicos y/o serológicos)

Identificación de agentes no viables o no cultivables.

Determinación rápida de resistencia antimicrobiana.

Diagnóstico de agentes infecciosos de alto riesgo biológico.

Áreas de desarrollo de la Biología Molecular en el diagnóstico de agentes infecciosos bacterianos.

Hibridación

Amplificación, Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)

PCR en Tiempo Real

Métodos Basados en secuenciación

Espectrometría de Masas MaldiTof

Técnicas de biología molecular aplicadas al diagnóstico bacteriano

Sondas de

ácidos nucléicos

Sondas: segmentos de DNA

o RNA que han sido marcados

y que pueden unirse con una

alta especificidad a secuencias

complementarias de DNA o

RNA

Detección a resistencia

a Rifampicina

M 1 2 3 4 5 6

pb

pb

450

1353

872

603

271

mef

Amplificación de ácidos nucléicos

PCR

Detección de BLEEs y

carbapenemasas mediante

PCR

TEM

SHV

CTX-M

OXAs

KPC

PCR en Tiempo

real

PCR en Tiempo

real

PCR en Tiempo real

Pol

Pol

Pol

DNTPs

DNA blanco

Sonda Iniciadores

Taq polimerasa

Pol

Pol

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

Pol

Pol PCR en Tiempo real

PCR en Tiempo real

Pol

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo real

Pol

PCR en Tiempo

real

Detección de patógenos

Genotipificación

Resistencia:

En algunos casos el aumento de resistencia se debe a:

Un incremento de la expresión de la beta-lactamasa

Sobreexpresión de bombas de eflujo

Disminución de la expresión de porinas.

PCR en Tiempo

real

Detección y cuantificación del producto

amplificado

Alta especificidad y sensibilidad.

No requiere análisis posterior.

El procesamiento y análisis de resultados

se realiza en aproximadamente 30-40 min.

Representa una oportunidad para optimizar

el diagnóstico temprano y tratamiento

específico de la enfermedad (Desescalado)

Falsos positivos (flora normal)

PCR en Tiempo

real

Penicilina en Streptococcus pneumoniae

Tetraciclina

Carbapenems en Klebsiella pneumoniae

Identificación de CTX_M en B-lactamasas de

espectro extendido

15.Detection of gyrA and gyrB mutations in Clostridium difficile isolates by real-time PCR.

Spigaglia P, Carattoli A, Barbanti F, Mastrantonio P. Mol Cell Probes. 2010 Apr;24(2):61-7. doi: 10.1016/j.mcp.2009.10.002. Epub 2009 Oct 21.

Real-time PCR and high-resolution melt analysis for rapid detection of Mycobacterium leprae

drugresistance mutations and strain types.

Li W, Matsuoka M, Kai M, Thapa P, Khadge S, Hagge DA, Brennan PJ, Vissa V.

J Clin Microbiol. 2012 Mar;50(3):742-53. doi: 10.1128/JCM.05183-11. Epub 2011 Dec 14.

PCR en Tiempo

real

Secuenciación

Nos permite determinar el

orden de los nucleótidos

en un fragmento de DNA

Secuenciación

Secuenciación

Espectrometría de Masas

MaldiTof

Identificación bacteriana

basada en el espectro de

masas de proteínas:

Una nueva mirada a la

microbiología del siglo XXI

Espectrometría de Masas

MaldiTof

Alta sensibilidad, especificidad y bioseguridad. (Este ultimo aspecto se

fundamenta en que estas metodologías no requieren la presencia del agente

infeccioso vivo, ya que las pruebas moleculares se pueden realizar en muestras o

extractos sometidos a procesos químicos de inactivación).

Se pueden realizar directamente sobre muestras clínicas.

Determinación genotípica mas veloz que la fenotípica (organismos de

crecimiento lento).

Utilidad en agentes no cultivables.

Ventajas de los métodos

moleculares

Falta de sensibilidad si concentración de organismos es baja en la muestra.

Diferentes pruebas son requeridas para cada antimicrobiano.

Resistencia a un determinado antimicrobiano puede ocurrir por varios

mecanismos asociados involucrando diferentes genes de resistencia.

Para algunos agentes, los mecanismos genéticos son aún desconocidos.

Desventajas de los métodos

moleculares

Epidemiología molecular

En epidemiología es muy importante la identificación no solo del microorganismo en

cuestión sino que muchas veces la identificación a nivel de cepas ayuda a:

1.- Determinar el causante del brote infeccioso,

2.- Detectar la transmisión cruzada de patógenos,

3.- Determinar la fuente de infección,

4.-Reconocer cepas particularmente virulentas de organismos y

5.- Monitorear los programas de vacunación (Olive y Bean, 1999).

Gracias

verozenemij@himfg.edu.mx