Post on 20-Apr-2022
Dr. D. Ángel Zúñiga Cabrera, Hospital Universitario La Fe
Dra. D. Arantxa Lafuente Sanchis, Hospital Universitario de la Ribera
CERTIFICAN:
Que la presente Tesis Doctoral titulada “Prevalencia alélica de las mutaciones
en los genes BRCA1 y BRCA2 en mujeres con cáncer de mama en el departamento de
salud de la ribera en la comunidad valenciana”, ha sido realizada por Dª Mª Montserrat
Ortiz Mengual bajo nuestra dirección, en el programa de Doctorado Investigación y
Desarrollo para la obtención del título de Doctor por la Universidad Católica de
Valencia San Vicente Mártir.
Para que así conste a los efectos legales oportunos, se presenta esta tesis
doctoral y se extiende la presente certificación en Valencia a 24 de julio de 2017.
Fdo.: Ángel Zúñiga Cabrera Fdo.: Arantxa Lafuente Sanchis
UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALENCIA
“San Vicente Mártir”
TESIS DOCTORAL
PREVALENCIA ALÉLICA DE LAS MUTACIONES EN LOS GENES BRCA1 Y BRCA2 EN MUJERES CON CÁNCER DE MAMA EN EL
DEPARTAMENTO DE SALUD DE LA RIBERA EN LA COMUNIDAD VALENCIANA.
ALELLIC PREVALENCE OF BRCA1 AND BRCA2 GENE MUTATIONS IN WOMEN WITH BREAST CANCER IN THE DEPARTMENT OF
HEALTH LA RIBERA IN THE VALENCIAN COMMUNITY.
Presentado por: Dª Montserrat Ortiz Mengual
Dirigido por:
Dr. Ángel Zúñiga Cabrera Dra. Arantxa Lafuente Sanchis
Valencia, a 7 de Abril de 2017
AGRADECIMIENTOS Me gustaría agradecer en estas líneas a todas esas personas que han ido apareciendo en este
arduo camino y se han quedado para darme su apoyo y han hecho posible llegar a la
finalización de esta tesis. Gracias a todos aquellos que formáis parte de mi camino por
hacerme crecer como persona día a día.
A mis directores de tesis, los doctores Ángel Zúñiga y Arantxa Lafuente, por su constante guía,
su plena dedicación, su gran profesionalidad y paciencia para ayudarme a finalizar mi trabajo.
Han sido importantes no solo en el desarrollo de la tesis, sino también en mi formación como
investigadora.
A mis compañeras y amigas Isabel y Ángela que han aportado la ayuda necesaria tanto a nivel
profesional como personal para recorrer todo el camino necesario hasta la finalización de la
tesis.
A todas esas amigas tan especiales que me han brindado la mano y su más sincero apoyo en
aquellos momentos en los que no veía luz.
A mis padres, porque sin ellos nada sería posible, por darme el apoyo moral, emocional y
económico necesario para adquirir todos los conocimientos, valores y filosofía de vida
necesarios para llegar a alcanzar el final de esta etapa. A mi hermana por su apoyo y valoración
incondicional, que hacen que siempre me esfuerce por superarme, seguir luchando y no
defraudarla.
A mi familia, que con sus ánimos y enseñanzas me han permitido aprender y crecer cada día
como persona y por lo tanto como profesional, porque una persona es lo que es también por
la gente que la rodea.
A Carles, que siempre me ha apoyado en los buenos y aún más si cabe en los malos momentos,
por ser siempre esa brisa de aire fresco cuando parece que no hay nada que hacer, por ser la
vela de este barco y ayudarme a navegar este mar, en algunos momentos, de mucho oleaje.
Gracias
El éxito en la vida no se mide por lo que has logrado, sino por los obstáculos que has tenido que
enfrentar en el camino.
Mahatma Gandhi
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RESUMEN
El cáncer de mama es la neoplasia más común en la mujer y una de las principales causas
de muerte entre los 45 y 50 años. El primer factor de riesgo es la edad, siendo el segundo
los antecedentes familiares, de modo que es necesario realizar un estudio molecular de
los genes BRCA1 y BRCA2 para determinar si se trata de cáncer de mama hereditario o
no.
En este estudio se han determinado las mutaciones presentes en los genes BRCA1 y
BRCA2 en pacientes de riesgo, así como la prevalencia de dichas mutaciones en el
Departamento de Salud de la Ribera en la Comunidad Valenciana. También se ha
realizado una caracterización de estas pacientes para conocer el perfil de las que acuden
a la Unida de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama.
En nuestro estudio, el perfil más frecuente son mujeres (92.67%) con antecedentes
familiares de cáncer de mama y ovario (70.14%), y pre-menopáusicas (82.37%). La
prevalencia poblacional encontrada en nuestro estudio mediante secuenciación de NGS
y Sanger para mutaciones patológicas en los genes BRCA1 y BRCA2 causantes de cáncer
de mama/ovario hereditario ha sido de un 7.37%. El análisis de dosis génica por técnica
de MLPA (P002 para BRCA1 y P045 para BRCA2; n=164) no detectó grandes
reordenamientos de los genes BRCA en ninguno de los pacientes estudiados. Además se
ha observado una prevalencia de mutación distinta entre ambos genes, siendo el BRCA2
de mayor prevalencia. De todas las mutaciones patológicas, la más prevalente en
nuestro entorno es la deleción de 5 nucleótidos del exón 23 (c.9026_9030delATCAT).
Palabras clave: cáncer de mama, BRCA1, BRCA2
6
ABSTRACT
Breast cancer is the most common form of cancer in women and the leading cause of
cancer death among women between the ages of 45 and 50. The first risk factor is age;
the second is the family history, therefore, it is necessary to do a molecular study of the
BRCA1 and BRCA2 genes to know if the breast cancer is hereditary or not.
In this study, the mutations presents in the BRCA1 and BRCA2 genes have been
determined at risk patients and the prevalence of these mutations in the Department of
Health of the Ribera in the Valencian Community too. It has also been done a
characterization of these patients to know which the women’s profile is coming to the
Family Risk Unit of Breast Cancer.
In our study, the most frequent profile were women (92.67%) with a family history of
breast and ovarian cancer (70.14%), and premenopausal women (82.37%). The
population prevalence for pathological mutations in BRCA1 and BRCA2 genes causing
hereditary breast/ovarian cancer that we found in our study was 7.37% and we have
used NGS and Sanger sequencing these. Genetic dose analysis by MLPA technique (P002
for BRCA1 and P045 for BRCA2; n = 164) did not detect large rearrangements of BRCA
genes in any of the patients studied. In addition, a distinct mutation prevalence has been
observed between both genes, and we have observed that the one with the highest
prevalence was the BRCA2 gene. The most prevalent mutation of all pathological
mutations in our environment is the deletion of 5 nucleotides of exon 23
(c.9026_9030delATCAT).
Key word: breast cancer, BRCA1, BRCA2
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INDICE
ABREVIATURAS
11
1. INTRODUCCIÓN 13
1.1. Cáncer de Mama. 13
1.1.1. Definición y clasificación 13
1.1.2. Incidencia 16
1.1.3. Biología Molecular del cáncer y Oncogénesis 16
1.1.4. Etiología 20
1.1.5. Cáncer de Ovario 25
1.2. Clínica en el cáncer de cama. 25
1.2.1. Diagnóstico 25
1.2.2. Pronóstico 27
1.2.3. Tratamiento 33
1.3. Cáncer de Mama hereditario. 34
1.3.1. Teoría de la doble mutación de Knudson. 34
1.3.2. Predisposición genética al cáncer de Mama. 35
1.3.3. Genes BRCA1/BRCA2. 37
8
1.3.4. Pérdida de función de los genes BRCA1/BRCA2. 42
1.3.5. Penetrancia de las mutaciones en genes
BRCA1/BRCA2.
43
1.4. Técnicas moleculares diagnósticas. 46
1.4.1. Estudios genéticos 46
1.4.2. Importancia clínica del estudio genético. 49
1.4.3. Asesoramiento genético y aspectos psicológicos y
éticos.
52
2. JUSTIFICACIÓN 53
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 54
3.1. Hipótesis de trabajo. 54
3.2. Objetivos Primario y Secundarios. 54
4. MATERIAL Y MÉTODOS 55
4.1. Ámbito de estudio. 55
4.2. Diseño de estudio. 55
4.3. Periodo de estudio. 55
4.4. Selección de pacientes. 55
4.5. Tamaño muestral. 56
4.6. Análisis genético. 56
4.6.1. Método de extracción de ADN a partir de sangre
periférica.
56
4.6.2. Medición de concentración de material genético 58
9
4.6.3. Estudio mutacional de los genes BRCA1 y BRCA2
por NGS (Next Generation Sequencing).
59
4.6.4. Análisis Bioinformático de los datos de NGS. 63
4.6.5. Estudio mutacional de los genes BRCA1 y BRCA2. 64
4.6.6.Estudio de dosis génica de los genes BRCA1yBRCA2 67
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 70
5.1. Características clínicas de los pacientes estudiados. 70
5.2. Aná lisis de grandes deleciones y reordenamientos de los
genes BRCA1/BRCA2 mediante técnica de MLPA.
79
5.3. Análisis de secuencias. 81
5.4. Pacientes detectados con mutaciones patológicas. 86
6. CONCLUSIONES 100
7. BIBLIOGRAFÍA
8. ANEXOS
102
118
10
11
ABREVIATURAS
ABBI: Advanced Breast Biopsy Instrumentation
ACOG: Colegio Americano de Obstetricia y Ginecología
ADN/DNA: Ácido Desoxiribonucleoico
ARN/RNA: Ácido Ribonucleico
BAG: Biopsia con Aguja Gruesa
BIC: Breast Cancer Information Core
BRCA: gen/proteína de susceptibilidad para el cáncer de mama
BRCT: región genoma
CA: colección de amplicones
CaM: cáncer de mama
CaOv: cáncer de ovario
CDI: carcinoma ductal infiltrante
CDIS: carcinoma ductal in situ
CIIS: carcinoma intraductal in situ
CSE: cuadrante superior externo
CSI: cuadrante superior interno
Del.: deleción
dNTP: deoxinucleotidos-trifosfato
EDTA: Ácido Etilendiaminotetraacético
FAD: fibroadenoma
HPNCC: cáncer colorrectal hereditario no polipósico
IHQ: inmunohistoquímico
Ins.: inserción
mARN: ARN mensajero
MIDs: códigos de barras moleculares
MLPA: Amplificación Múltiple de Sondas Ligando-Dependientes
MD: mama derecha
MI: mama izquierda
MND: mutación nueva no descrita
MP: Mutaciones Patológicas
12
NGS: Secuenciación de Nueva Generación
NP: variantes no patológicas o benignas
PAAF: Punción Aspiración con Aguja Fina
PET o PET-TAC: Tomografía de Emisión de Positrones
PET-TAC: Tomografía de emisión de Positrones
PLMF: polimorfismo
PN: Mutaciones Nuevas (No descritas)
PP: probablemente patológica
PTT: Test de la Proteína Truncada
RMM: Resonancia Magnética de Mama
VSCD: variante de significado clínico desconocido
13
1. INTRODUCCIÓN
1.1. CÁNCER DE MAMA
1.1.1. Definición y Clasificación.
La mama es un tejido glandular con una gran cantidad de tejido adiposo, que la
constituye en un 90%, además se integran al tejido los conductos galactóforos y la
glándula mamaria, encargados ambos de la producción y secreción de leche materna.
Las glándulas mamarias se distribuyen por toda la mama, aunque las dos terceras partes
del tejido glandular se encuentran en los 30 mm más cercanos a la base del pezón. Estas
glándulas drenan en el pezón por medio de ductos, cada uno de los cuales tiene su
propia apertura o poro. La intrincada red formada por los ductos se ordena de forma
radial y converge en el pezón.
El cáncer se origina cuando las células saludables de la mama empiezan a cambiar y
proliferar sin control, formando una masa o un conglomerado de células denominado
tumor. Un tumor puede ser canceroso o benigno, siendo canceroso cuando tiene la
capacidad de crecer y diseminarse a otras partes del cuerpo.
El cáncer de mama (CaM) se disemina cuando crece en otras partes del cuerpo o cuando
las células cancerosas se desplazan a otros sitios del cuerpo a través de los vasos
sanguíneos y/o linfáticos, por un proceso denominado metástasis. El cáncer de mama
con mayor frecuencia se disemina a los ganglios linfáticos regionales. Los ganglios
linfáticos regionales se encuentran debajo del brazo, en el cuello, debajo del esternón o
inmediatamente arriba de las clavículas. Cuando el cáncer se disemina a otras partes del
cuerpo, con mayor frecuencia se ven afectados los huesos, los pulmones y el hígado.
Con menos frecuencia, el cáncer de mama puede diseminarse al cerebro.
Existen diversas clasificaciones anatomo-patológicas para el CaM de las cuales la
presentada por la Organización Mundial de la Salud (WHO, Lakhani y cols., 2016) es la
más reconocida e incluye:
Carcinoma invasivo no especializado
Carcinoma pleomórfico
Carcinoma con células estromales gigantes tipo osteoclastos
14
Carcinoma con características coriocarcinomatosas
Carcinoma con características melanocíticas
Tipos especiales:
Carcinoma lobulillar invasivo
o Carcinoma lobulillar clásico
o Carcinoma lobulillar sólido
o Carcinoma lobulillar alveolar
o Carcinoma lobulillar pleomórfico
o Carcinoma tubulolobulillar
o Carcinoma lobulillar mixto
Carcinoma tubular
Carcinoma cribiforme
Carcinoma mucinoso
Carcinoma con características medulares
o Carcinoma medular
o Carcinoma medular atípico
o Carcinoma invasivo NST con características medulares
Carcinoma con diferenciación apocrina
Carcinoma con diferenciación de células en anillo de sello
Carcinoma micropapilar invasivo
Carcinoma metaplásico sin tipo especializado
o Carcinoma adenoescamoso de bajo grado
o Carcinoma metaplásico tipo fibromatoso
o Carcinoma de células escamosas
o Carcinoma de células fusiformes
o Carcinoma metaplásico con diferenciación mesenquimal
Diferenciación condroide
Diferenciación ósea
Otros tipos de diferenciación mesenquimal
Carcinoma metaplásico mixto
Carcinoma mioepitelial
15
Tipos raros
Carcinoma con características neuroendocrinas
o Tumor neuroendocrino bien diferenciado
o Carcinoma neuroendocrino poco diferenciado (carcinoma de células
pequeñas)
Carcinoma secretor
Carcinoma papilar invasivo
Carcinoma de células acinares
Carcinoma mucoepidermoide
Carcinoma polimórfico
Carcinoma oncocítico
Carcinoma rico en lípidos
Carcinoma de células claras ricas en glucógeno
Carcinoma cebaceo
Tumores de tipo anexos a glandula salival/ anexos cutáneos
o Cilindroma
o Hidroadenoma de células claras
Tumores epiteliales-mioepiteliales
Adenoma pleomorfico
Adenomioepitelioma
o Adenomioepitelioma con carcinoma
Carcinoma adenoide cistico
El cáncer, en general, es una situación médica multicausal en la que se producen
alteraciones del ADN. Cuando se hace referencia específicamente a la glándula mamaria,
ésta podría dar origen a un tumor maligno en cualquiera de las estructuras celulares que
la conforman. Sin embargo, los casos más frecuentes en cuanto a su origen histológico
y su localización son los originados en las estructuras glandulares. Dentro de éstos, los
tumores más frecuentes a nivel mundial son los de tipo ductal (alrededor del 85% de los
casos) y lobulillar. Cualquiera de estos, por su extensión microscópica, se clasifican en
no invasivos o in situ e invasivos o infiltrantes. El carcinoma lobulillar in situ no se
16
considera un verdadero cáncer, pero constituye un factor de riesgo de aparición de
cáncer invasor.
1.1.2. Incidencia.
El cáncer de mama es la neoplasia más frecuente en la mujer (con excepción del cáncer
de piel), y una de las principales causas de muerte entre los 45 y 50 años (Heredia AM y
cols., 2007). Durante las últimas décadas se ha registrado un aumento progresivo de la
incidencia de la enfermedad. El riesgo de desarrollar cáncer de mama a lo largo de la
vida es aproximadamente una de cada ocho mujeres. Entre las mujeres menores de 40
años es 1 cada 228; entre los 40 y los 59 años 1 cada 24; y entre las mujeres de 60 a 79
años 1 cada 14 (Jemal A y cols. 2004). Los hombres, aunque en una proporción muy
inferior a las mujeres, también son susceptibles de padecer cáncer de mama (Friedman
LSy cols., 1997; Volgestein B y cols., 2002; Antoniou A y cols., 2003). Más de la mitad de
los casos se diagnostican en los países desarrollados: 370.000 casos al año en Europa
(27,4%) y 230.000 en Norteamérica (31,3%). La prevalencia más baja la tienen países
como Japón, Tailandia, Nigeria e India (www.aecc.es).
La tasa ajustada mundial es de 37,4 casos/100.000 h/año.
Europa del Norte, de 82,5 casos/100.000 h/año
Europa del Sur, de 62,4 casos/100.000 h/año
España, de 50,9 casos/100.000 h/año
Norteamérica, de 99,4 casos/100.000 h/año
Países en desarrollo, de 23,8 casos/100.000 h/año.
1.1.3. Biología Molecular del cáncer y Oncogénesis.
Para el desarrollo de una célula normal a una célula tumoral, pueden acontecer dos
sucesos vitales: que se produzca un daño o lesión a nivel del ADN o que este esté
alterado por mutaciones hereditarias y que no permitan una correcta reparación del
ADN o bien no se repare. Esta célula tumoral deberá sobrevivir y multiplicarse sin
17
control, escapando a los mecanismos reguladores del organismo, para desarrollar el
tumor (Haagensen C, 1973). Así pues, el cáncer es una enfermedad debida a una
mutación en el ADN que conlleva mutaciones genéticas, y que pueden producir:
• Activación de los oncogenes, como los factores de crecimiento, receptores de los
factores de crecimiento, señales de transducción o factores reguladores de la
transcripción.
• Inactivación de genes supresores, como Rb1, p53, APC, NF1, WT1, DCC, p16, BRCA,
PTEN, etc...
• Alteración en los genes responsables de la estabilidad del genoma, como los genes
reguladores de la apoptosis (Bcl2, Bad, Bax, Bak) o genes reparadores del ADN.
Actualmente, se sabe que es más bien la acumulación de cambios genéticos y
epigenéticos los que van a hacer que una célula adquiera características cancerígenas.
Las alteraciones epigenéticas hacen referencia a cambios en la expresividad de genes
estructuralmente normales. La mayor o menor metilación de los genes hacen que estos
se expresen más o menos. Así, la metilación de un gen con función supresora
comportará que este no se exprese y así que no efectúe su acción supresora, resultando
en una mayor activación del ciclo celular (Esteller M, 2008).
Estas células tumorales van a ser capaces de eludir los mecanismos fisiológicos de
diferenciación a la vez que generan señales de crecimiento propio y utilizan los factores
de crecimiento. Además, pueden evitar los factores inhibidores del crecimiento y van a
anular los sistemas de muerte celular programada o apoptosis.
Por lo tanto, sus características principales van a ser:
• Inmortalidad
• Inestabilidad genética
• Proliferación independiente de nutrientes y GF
• Pérdida de inhibición por contacto
• Metástasis.
18
Hanahan D y Weinberg RA (2000) describieron que las células tumorales han de
presentar 6 alteraciones esenciales en su fisiología que conjuntamente comportarán
crecimiento maligno:
1. Autosuficiencia en la producción de señales de crecimiento.
2. Insensibilidad a las señales anticrecimiento.
3. Evasión de la apoptosis.
4. Pérdida de la limitación al potencial reproductivo.
5. Estimulación de la angiogénesis.
6. Invasión de tejidos y metástasis.
En una revisión posterior de los mismos autores (Hanahan D y cols., 2011), exponen que
subyacente a estas seis características se encuentra la inestabilidad genómica, la cual
genera la diversidad genética, y la inflamación que fomentan estas funciones distintivas.
El avance conceptual que se ha dado en la última época ha añadido dos marcas
distintivas más a la lista: la reprogramación de la energía metabólica y la evasión de la
destrucción por el sistema inmune. Además de las células cancerígenas, los tumores
presentan otra dimensión de complejidad: contienen un repertorio de células normales
que constituyen un microambiente tumoral. De la misma manera, se conoce que para
el proceso de invasión y metástasis es imprescindible una relación continua entre el
tumor y el tejido sobre el que este asienta. El reconocimiento de la aplicabilidad
generalizada de todos estos factores afectará de manera creciente al desarrollo de
nuevas terapias contra el cáncer.
En cuanto a las metástasis, son la causa del 90% de las muertes producidas por el cáncer.
En el desarrollo de éstas tienen un protagonismo esencial las moléculas de adhesión de
la superficie de las células tumorales. Entre ellas, las cadherinas, responsables de las
interacciones célula-célula, y las integrinas, responsables de las interacciones matriz
extracelular-célula. También las proteasas extracelulares que degradan la matriz
extracelular y que son producidas por células del estroma y células inflamatorias, son
necesarias para el proceso de invasión y metástasis.
19
Actualmente las teorías de mecanismos de metástasis son:
•”Soil and seed”: cada órgano ofrece unas condiciones distintas para anidar y crecer
“friendly environment” para determinados tumores.
•”Homing”: cada órgano posee factores quimotácticos que atraen y facilitan la
extravasación y anidamiento de células malignas circulantes (Quimokinas).
•Barrera Física: el tamaño de las células determina su localización.
•Firma genética: en el tumor primario ya existen las células “metastatizantes” (una en
1 millón).
•“Pre-niche”: Células derivadas de la médula ósea que expresan VEGFR 1 (FLT1) se
asientan en sitios “pre-metastásicos específicos” y forman agrupaciones celulares antes
de que acudan las células cancerígenas.
Mención especial tienen también las células madre o stem cells tumorales, ya que cada
vez hay más datos que defienden la existencia de estas células. Tienen una capacidad de
autorenovación constante y han perdido la capacidad de regulación del crecimiento,
pero tienen capacidad de diferenciación. Así se convertirían en las proveedoras de
nuevas células tumorales para el tejido canceroso. Parece que las stem cells tumorales
se mantienen en general en estado quiescente, explicando la resistencia a los
tratamientos antineoplásicos y la recidiva tumoral.
Historia natural:
Hay muchos modelos que explican la capacidad de crecimiento y división celular, pero
es cierto que básicamente se dividen en dos: el de crecimiento exponencial, en el que la
lesión mamaria sigue una tasa de multiplicación exponencial; y el modelo de crecimiento
Gompertziano, en el que el tumor crecería más rápidamente en fases iniciales
disminuyendo la velocidad paulatinamente a medida que es de mayor tamaño (Collins
V y cols., 1956; Gilewski T y cols., 1996).
El tiempo que tarda el cáncer de mama en duplicar su tamaño es muy variable, pero en
general, el tamaño de los tumores se duplica cada 100 días. Por tanto, una sola célula
maligna tarda unos 10 años en convertirse en una masa clínicamente detectable de 1cm,
20
si bien en este mismo período un tumor de 1cm ya ha experimentado 30 de las 40
duplicaciones de tamaño que, según los cálculos, se asocian a enfermedad mortal. Es
más, el tamaño medio que tiene el tumor cuando se detecta (antes de la mamografía)
es de 2.5cm, un tamaño que se asocia a una incidencia de afectación linfática del 50%
(Wertheimer MD y cols., 1986).
En un principio el carcinoma mamario crece limitado a la mama, ya sea intraductalmente
o infiltrando el parénquima. Esta infiltración tiende a producirse siguiendo estructuras
mamarias, como los conductos, fascias y el tejido graso menos resistente por lo que
adquiere una forma estrellada e irregular en vez de un contorno redondeado. Además
de esta diseminación y crecimiento locales, el cáncer de mama se disemina a distancia
por los conductos linfáticos. Los ganglios más frecuentemente afectados son los axilares,
seguidos de los de la mamaria interna y en tercer lugar los supraclaviculares. Por último,
cabe mencionar la posibilidad de diseminación hemática, preferentemente en hueso,
pulmón e hígado, pero suele ocurrir en estadios muy avanzados que previamente ya han
dado algún síntoma local o axilar (González-Merlo J y cols., 2000).
1.1.4. Etiología.
El cáncer de mama ha sido objeto de infinidad de estudios acerca de los posibles factores
de riesgo que influyen en su aparición. Aunque se desconoce la causa desencadenante,
cada día se sabe más acerca de la multitud de factores que influyen en su promoción.
Hay que tener en cuenta que la gran mayoría de mujeres (85%) que presenta cáncer de
mama no tienen ningún factor de riesgo identificable además de la edad, por lo que
debemos considerar que todas las mujeres corren riesgo (Volgestein B y cols., 2002;
Narod SA y cols., 2004).
Existen diversos modelos matemáticos para realizar una valoración individual del riesgo
inmediato y a largo plazo, aunque el más ampliamente utilizado es el “Índice de Gail”
que se basa en la cuantificación de cinco variables en un programa de cribaje. Los riesgos
relativos se multiplican, obteniendo un riesgo sumatorio. Además, los oncólogos pueden
calcular el riesgo de una paciente usando el algoritmo de la página web del National
Cancer Institute: http://bcra.nci.nih.gov/bcr/. En ella, se analizan distintos factores
como la edad, raza-etnia, edad de la primera menstruación, edad en el primer
21
embarazo, historia previa de lesiones “in situ”, biopsias anteriores y antecedentes
familiares que se trata del factor más importante.
- Edad: Es el factor de riesgo individualmente más importante, ya que a medida que
aumenta la edad, el riesgo relativo de muerte por cáncer de mama va incrementándose.
Alrededor del 94% de todos los cánceres de mama afectan a mujeres mayores de 40
años (Han W y cols., 2004). Sin embargo, los tumores diagnosticados en mujeres de
menos de 35 años, tienen peor pronóstico, tanto en intervalo libre de enfermedad como
en supervivencia global, debido a que suelen ser más proliferativos, considerando esto
un factor de mal pronóstico independiente (Park BW y cols., 2002). Este último punto
sigue siendo controvertido ya que otros autores no encuentran diferencias cuando
analizan estadio por estadio y creen que el peor pronóstico sería por un retraso
diagnóstico, como pasa en el cáncer de mama en la paciente gestante (Hickey M y cols.,
2009).
- Raza: La raza y la etnia modifican el riesgo de cáncer de mama. Así el cáncer de mama
es más frecuente en las mujeres afroamericanas con menos de 50 años con respecto a
las mujeres blancas, se presenta en estadios más avanzados y la mortalidad es 1.41
veces mayor. Estas diferencias no son explicables y no son atribuibles a las diferencias
socioeconómicas ni al acceso a los recursos sanitarios (Lannin DR y cols., 1998). Se
observa un cambio de riesgo que experimentan las mujeres que emigran, de países de
baja prevalencia a otros de mayor prevalencia
(http://www.cdc.gov/spanish/cancer/breast).
- Historia ginecológica: Las tres fechas de la vida de la mujer que ejercen un impacto importante
sobre la incidencia del cáncer de mama son la edad de la menarquia, la edad del primer
embarazo a término y la edad de la menopausia (Cnattingius S y cols., 2005; Eden JA, 2010)). De
hecho, estos tres factores pueden ser responsables de 70 a 80 % de la variabilidad de frecuencia
del cáncer de mama que se observa en países diferentes. La lactancia materna es aún en la
actualidad un tema de debate (Yang L y cols., 2008) aunque un metaanálisis reciente
indicó que la lactancia materna disminuía el riesgo de cáncer de mama en un 10-20%
aproximadamente y que el efecto se limitaba a las mujeres premenopáusicas (Martin
RM y cols., 2005).
22
- Patología mamaria benigna: El antecedente de patología mamaria benigna ha sido
considerado como un factor de riesgo especialmente en aquellas que habían requerido
una biopsia (Gail MH y cols., 1989). La clasificación más utilizada sigue siendo la de Page
y Dupont (Dupont WD y cols., 1985; Fizgibbons PL y cols., 1998). En ésta, las lesiones
benignas de tipo no proliferativo no están asociadas con riesgo de cáncer de mama
subsecuente, las lesiones proliferativas sin atipias tienen un RR de 1.5-2 y las lesiones
proliferativas con atipias tienen un RR de 4-5 para cáncer de mama. En este caso, si en
la paciente existe historia familiar de cáncer de mama el riesgo estimado se eleva con
un RR de 11 (Voguel VG y cols., 1998). El carcinoma lobulillar in situ es un marcador de
riesgo de la neoplasia con un aumento del riesgo de 8-10. También se incluye en esta
categoría al carcinoma ductal in situ pero solo aquellas lesiones de pequeño tamaño, de
bajo grado, sin fenómenos de comedonecrosis y en las que se ha descartado la
microinvasión.
- Historia familiar: Sólo el 10% de los casos de cáncer de mama en el ser humano
guardan relación directa con mutaciones de la línea germinal, aunque este porcentaje
aumenta hasta el 30% en pacientes diagnosticadas antes de los 30 años. Sólo 1 de cada
9 mujeres que contraen cáncer de mama tiene un pariente de primer grado afectado y
la mayoría de las mujeres con un pariente afectado nunca tendrán cáncer de mama.
Diversos genes participan en los casos familiares siendo los dos genes que más se
relacionan con la herencia familiar del cáncer mamario el BRCA1 y el BRCA2, ambos de
alta penetrancia como se explicará más adelante (Olopade OI y cols., 2008). Diversos
estudios demuestran una relación significativa entre la edad temprana del diagnóstico
y la frecuencia de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2, lo que además se asocia
también a receptores hormonales y HER2/neu negativos (Musolino A y cols., 2007). Más
importante todavía que la participación que tengan estos genes en las formas
hereditarias de cáncer de mama es su implicación en el cáncer de mama esporádico.
Cerca del 40% de los cánceres de mama en el ser humano presentan una mutación de
p53 como defecto adquirido.
- Patrón mamográfico: Aunque sigue siendo un tema controvertido, el patrón o
densidad mamográfica es considerado por múltiples autores como un factor
independiente de riesgo (Martin LJ, 2008; Boyd NF, 2009). Un estudio reciente relaciona
23
el hábito alcohólico con un aumento en la densidad mamográfica, así como el efecto del
alcohol sobre la mama que puede ser modificado por el tabaco (Cabanes A y cols., 2011).
- Hormonas exógenas: Los metaanálisis más fiables respecto a la utilización de
anticonceptivos orales sugieren que estos fármacos sólo tendrían cierto interés
epidemiológico en mujeres jóvenes y con uso prolongado en las cuales podría haber un
mínimo aumento del riesgo con un muy bajo riesgo global (Nyante SJ y cols, 2008). Más
controvertidos son los datos en torno a la hormonoterapia sustitutiva (TSH) (Lyytinen H
y cols., 2009). El estudio WHI, demostró un aumento en el riesgo de cáncer de mama e
incidentes cardiovasculares adversos, aunque disminuían las fracturas óseas y el cáncer
colorectal (Rossouw JE y cols., 2002). Un estudio reciente, revela que en EEUU hubo una
disminución en el uso de la THS posterior al estudio WHI y también cayó la incidencia de
cáncer de mama en estas pacientes, aunque la relación causa-efecto es controvertida
(Chlebowski RT y cols., 2009).
- Factores alimentarios, peso y ejercicio: La variación geográfica en la incidencia del
cáncer de mama es considerable y se ha relacionado con la cantidad de grasa animal de
la dieta, sobretodo en la mujer postmenopáusica (Thiébaut AC y cols., 2007). No hay
discusión en que hay una mayor incidencia de cáncer de mama en los países que
consumen dietas abundantes y poco favorables (rica en grasas) y que no practican
ejercicio físico (Zaridze DG y cols., 2002). Sin duda, la mayor actividad física reduce el
riesgo de cáncer de mama en las mujeres posmenopáusicas (McTiernan A y cols., 2003;
Friedenreich CM y cols., 2008).
- Alcohol: La asociación entre el consumo de alcohol y el incremento del riesgo de
padecer cáncer de mama está firmemente demostrada, probablemente por el aumento
de los niveles de estradiol en la fase periovulatoria (Tjonneland A y cols., 2007), y esta
asociación parece más fuerte en el cáncer de mama hormono sensible (Li CI y cols.,
2010).
- Tabaco: Los resultados son muy dispares en cuanto al hábito tabáquico, aunque hay
más estudios a favor (Boffeta P y cols., 2011) que en contra de este incremento del
riesgo (Magnusson C y cols., 2007).
24
- Radiaciones: La exposición a las radiaciones ionizantes ha sido claramente establecida
como uno de los factores de riesgo para el desarrollo de cáncer de mama (Ng AK y cols.,
2009).
- Xenoestrógenos: Tienen un efecto similar a los estrógenos producidos naturalmente
(Buteau-Lozano H y cols., 2008). Un estudio reciente evidencia que el bisfenol A, es capaz
de inducir la transformación neoplásica de las células epiteliales de la mama (Fernandez
SV y cols., 2010).
1.1.5. Cáncer de ovario.
A diferencia del cáncer de mama, el cáncer de ovario representa solamente el 4% de los
tumores en la mujer, pero a pesar de ello es la quinta causa de muerte. Se ha observado
que la supervivencia al año es del 76% mientras que a los 5 años es del 46%. Uno de los
principales problemas para un diagnóstico precoz es que en su estadio inicial no produce
sintomatología por lo que únicamente un 24% es detectado de forma localizada.
Los factores de riesgo en el cáncer de ovario son similares a los del cáncer de mama,
siendo la edad el principal factor de riesgo seguida de la historia familiar de cáncer de
mama, de ovario o cáncer colorrectal. Cuando mediante un estudio genético se
determina la presencia de mutación en los genes BRCA1, BRCA2 o HNPCC, el riesgo de
desarrollar cáncer de ovario a lo largo de la vida del paciente poseedor de la mutación
es del 40-60% (Ford D y cols., 1998).
Los pacientes portadores de mutación en BRCA1 presentan una mayor predisposición
de desarrollar cáncer de ovario. Existen estudios que muestran una asociación entre la
localización de la mutación en el gen BRCA1 y el riesgo de padecer cáncer de mama u
ovario de modo que mutaciones localizadas en el extremo 5’ del gen se correlacionan
con un mayor riesgo de cáncer de ovario, mientras que mutaciones en el extremo 3’
confieren una mayor susceptibilidad al cáncer de mama. En la zona central del gen, entre
los codones 145 y 1433, existe una región donde cualquier mutación tiene una
implicación similar para el desarrollo de ambos tipos de cáncer (Trimble EL y cols., 2010).
Las mutaciones presentes en el gen BRCA2 están menos relacionadas con el cáncer de
ovario, solamente hay un dominio OCCR (Ovarian Cancer Cluster Region) cuyas
25
mutaciones parecen conferir mayor riesgo a desarrollar cáncer de ovario (Rebbeck TR y
cols., 2015).
La mayoría de familias con cáncer de ovario hereditario presentan mutaciones en el gen
BRCA1, solamente una pequeña proporción las presenta en el BRCA2. La probabilidad
de cáncer de ovario en familias con mutaciones en BRCA1 es de 28-44%, mientras que
para el BRCA2 es del 27% (Ben-David Y y cols., 2002). El cáncer de ovario hereditario
asociado a BRCA1 aparece de 10 a 15 años antes que el cáncer de ovario asociado al
BRCA2 que se diagnostica a las mimas edades que el esporádico (Rebbeck TR y cols.,
2015).
1.2. CLÍNICA EN EL CÁNCER DE MAMA
1.2.1. Diagnóstico.
El signo más frecuente y principal para el diagnóstico del cáncer de mama es la
tumoración, pero existen otros signos como son la retracción del pezón, la “piel de
naranja” o la secreción sanguinolenta por los pezones.
El diagnóstico se va a realizar en varias fases y presenta diversos algoritmos de actuación
que podemos seguir en función de los resultados se vayan determinando para cada
prueba realizada al paciente (Oncoguía CV, 2012). Se encuentra la fase de diagnóstico
clínico que consiste en la inspección y palpación de la mama y regiones ganglionares de
la paciente por parte del profesional de la salud, ya que la sensibilidad de la mamografía
es del 85-90% en mujeres mayores de 50 años, del 75% en mujeres entre 40-50 años y
menor en pacientes menores de 40 años. En estos casos el resultado de la exploración
es el que hace continuar con el proceso diagnóstico, ya que hay cánceres que no se
detectan mediante mamografía (Carney PA, 2003).
En segundo lugar se encuentra el diagnóstico radiológico, en esta etapa las técnicas que
se usan son principalmente la mamografía que es la técnica principal utilizada en la
exploración radiológica de la mama y ésta puede ser suficiente para el diagnóstico por
si sola o requerir el complemento con otras técnicas como son la ecografía, resonancia
magnética y la punción. Pero en cualquier caso se trata del estudio inicial que permite
26
elaborar un informe, describir una lesión, localizar con exactitud, valorar el grado de
sospecha para el cáncer y recomendar la confirmación diagnóstica (Vizcaino I y cols.,
2001). La ecografía mamaria es un método complementario a la exploración clínica o
mamográfica y en ningún caso sustituye a la mamografía para el cribado de cáncer de
mama debido a sus limitaciones (Metha TS, 2003). También se encuentran
procedimientos intervencionistas de mama cuyo objetivo es la obtención de muestra
para poder realizar el estudio citológico, histológico, inmunohistoquímico o para
resolver un problema clínico mamario y disminuir así el número de procedimientos
quirúrgicos, pero con una seguridad diagnóstica similar (Rutgers EJT, 2005). También se
utilizan la galactografía establecida para la detección de una masa intraductal
permitiendo la señalización de la misma y se realiza cuando la paciente presenta
secreción espontánea no lechosa, hemorrágica o con citología patológica por uno o
varios orificios, generalmente unilateral (Slawson SH y cols., 2001). Otra técnica es la
Resonancia Magnética (RMN) de mama que consiste en una técnica de imagen de gran
sensibilidad para la detección del cáncer de mama aunque presenta unas limitaciones
en cuanto a la especificidad que obligan a restringir sus indicaciones y asociarla por tanto
a las otras modalidades de imagen como son la mamografía o la ecografía mamaria
(Sentís M y cols., 2005). Y también encontramos la Tomografía de emisión de Positrones
(PET o PET-TAC) para la cual actualmente no hay establecida ninguna indicación para el
diagnóstico del cáncer de mama aunque se recomienda en determinadas ocasiones
(Rodríguez-Garrido M y cols., 2004).
En el caso del diagnóstico anatomopatológico se encuentran procedimientos
intervencionistas de mama como son la PAAF (Punción Aspiración con Aguja Fina) que
puede ser utilizada como técnica de elección o como apoyo para el diagnóstico tanto en
lesiones mamarias como en adenopatías axilares hasta para posibles recidivas o
metástasis cutáneas (Anastasiadis PG y cols., 2001). La BAG (Biopsia con Aguja Gruesa),
es un procedimiento diagnóstico para la obtención transcutánea de tejido mamario con
agujas de grosor variable y se obtienen a modo de cilindros que serán procesados
mediante la técnica histológica convencional. Gracias a la obtención de varios cilindros
se evita la cirugía abierta para el diagnóstico de patología benigna permitiendo el
diagnóstico de malignidad y una adecuada programación del tratamiento (Jacobs TW y
27
cols., 2002). La ABBI (Advanced Breast Biopsy Instrumentation), consiste en una
señalización de lesiones mediante la colocación de un marcador metálico, sirve para
llevar a cabo un diagnóstico histológico (Lifrange E y cols., 2001). Neumoquistografía,
indicada en el tratamiento de quistes somáticos, sirve para la detección de masas y
nódulos en la pared o interior de una lesión quística o cuando los hallazgos ecográficos
no reúnen todos los criterios de benignidad (Thurfjell E, 2001).
1.2.2. Pronóstico.
Los factores pronósticos nos informan sobre la historia natural y la evolución de la
enfermedad, sin tratamiento. Reflejan la mayor o menor agresividad de la enfermedad.
Los factores predictivos nos informan sobre la probabilidad de respuesta o resistencia
tumoral a un tratamiento determinado. De esta manera el concepto de “factores
predictivos” se va imponiendo al de “factores pronósticos” en un intento de poder
predecir cuales son los tumores que responderán a un medicamento en particular y no
a otro. Aun así, existen factores pronósticos de larga tradición que aún son necesarios a
la hora de tomar decisiones en el manejo de las pacientes. Primero se van a detallar
aquellos factores pronósticos morfológicos que constituyen indicadores pronósticos
clásicos y que pueden determinarse de forma rutinaria; después aquellos otros
indicadores “nuevos” de más reciente introducción y basados en marcadores
moleculares del tumor.
Factores pronósticos clásicos-morfológicos:
- Tamaño tumoral: Es uno de los principales factores pronósticos y está directamente
relacionado con el riesgo de recidiva, metástasis axilares y a distancia, y supervivencia
(Goyal A y cols., 2004). La relación entre el tamaño y el pronóstico es prácticamente
lineal, a mayor tamaño peor pronóstico y viceversa. La incidencia de metástasis
ganglionares en tumores de menos de 1 cm es del 5-25% y en los mayores de 5 cm del
75-80%. Otro aspecto muy importante es la probabilidad de recidivas en tumores
menores de 1 cm que ronda el 12%, mientras que la observada en los casos entre 1 y
2cm es del 28% (Waljee JF y cols., 2008).
28
- Afectación ganglionar axilar: La afectación ganglionar axilar sigue siendo el factor
pronóstico independiente más importante en el cáncer de mama. Cerca del 70% de las
enfermas con ganglios positivos recidivan a los 10 años, mientras que solo recidivan el
30% de las enfermas con ganglios negativos. Es necesario tener en cuenta tres factores:
el tipo de afectación ganglionar, el número de ganglios afectados y su localización según
define la clasificación TNM. En cuanto al valor del número de ganglios afectos, podría
separar dos grupos con diferente riesgo, cifrándose la supervivencia libre de
enfermedad en un 20-30% superior cuando el número de ganglios afectados es inferior
a 4 (Escobar PF y cols., 2006). Así como el tratamiento quirúrgico conservador ha ido
desplazando a la clásica mastectomía en la mayoría de pacientes, la linfadenectomía
axilar está siendo desplazada por la detección y exéresis del ganglio centinela. La técnica
de la biopsia selectiva del ganglio centinela mediante la cual se detecta y extirpa el
primer ganglio en el que drena la linfa, ha hecho que el estudio anatomopatológico de
este ganglio sea cada vez más preciso. A causa de estas limitaciones de muestreo se han
desarrollado nuevas técnicas moleculares. La más importante es el OSNA (One-step-
nucleic acid amplification) que mediante la detección de la Citokeratina 19 (CK19),
específica de células epiteliales, va a permitir un estudio intra-operatorio del ganglio
entero con alta sensibilidad, sin necesidad de un estudio postoperatorio, con una cirugía
de un solo tiempo y la posibilidad de guardar tejido para estudio histológico o
posteriores estudios. Todo esto con un alto grado de automatización y sobre todo de
estandarización (Tsujimoto M y cols., 2007; Schem C y cols., 2009).
- Tipo histológico: En cuanto al tipo histológico, clasificaremos los tipos histológicos en
aquellos que son los más habituales: ductal infiltrante (80%), lobulillar infiltrante (5-
15%) y mixtos, frente a otros tipos que tienen mejor o peor pronóstico.
- Mejor pronóstico: rara afectación axilar. CIS de bajo grado, papilar, tubular,
mucinoso (coloide), medular y adenoide quístico
-Peor pronóstico: mayor afectación axilar. CIS de alto grado, inflamatorio, con
células “en anillo de sello”, micropapilar y carcinosarcoma.
El carcinoma ductal infiltrante y el carcinoma lobulillar tienen pronósticos similares con
una tendencia favorable para el lobulillar infiltrante.
29
- Grado histológico: Aunque no se utiliza en el estadiaje, el grado histológico también es
importante como indicador pronóstico y junto con el tipo histológico y tamaño. Además,
está en relación con el tamaño tumoral, afectación ganglionar, recidiva y supervivencia.
El sistema de gradación establecido por Scarff-Bloom-Richardson y posteriormente
modificado por Elston es uno de los más utilizados (Bloom HJG y cols., 1957; Fisher ER y
cols., 1980; Elston CW, 1993). En este índice se tienen en cuenta tres factores: la
formación de túbulos, el pleomorfismo nuclear y el número de mitosis. Con estos tres
parámetros y mediante un sistema de puntuaciones se puede clasificar el grado
histológico o de diferenciación celular en tres grados: grado I (bien diferenciado), grado
II (moderadamente diferenciado) y grado III (pobremente diferenciado), (Elston CW,
2005).
- Invasión vascular linfática: La invasión de espacios linfovasculares tumorales o
peritumorales está en relación con la afectación de ganglios linfáticos y metástasis a
distancia. Además, está asociada a un riesgo relativo de recurrencia del 4.7 en pacientes
con ganglios negativos y parece un factor de mal pronóstico independiente del estado
hormonal de la paciente y del tamaño tumoral en algunos estudios (Mascarell I y cols.,
1998). En un estudio prospectivo de 2606 casos vieron que, en pacientes con ganglios
negativos, la presencia de invasión vascular linfática aumentaba estadísticamente el
riesgo de metástasis a distancia, disminuyendo la supervivencia libre de enfermedad y
la supervivencia total (Colleoni M y cols., 2007).
- Componente in situ (Componente intraductal extenso): No se ha demostrado que la
presencia de carcinoma in situ tenga valor pronóstico independiente. La importancia de
éste en el carcinoma invasivo, radica en la posibilidad de recidiva local si el margen de
resección no es suficientemente amplio y en la indicación de tratamiento mediante
radioterapia. Se define el componente intraductal extenso, como la presencia de más
del 25% del área de la lesión infiltrante y además en la periferia del mismo; o también
cuando la lesión es mayoritariamente intraductal con pequeños focos de tumor
infiltrante en la periferia del mismo. Éstas pacientes tienen mayor frecuencia de
márgenes afectos y más recidivas locales. Por tanto, en estos casos es importante
extirpar la lesión con un margen de seguridad suficientemente amplio (al menos 1cm).
30
Para la clasificación TNM, se mide sólo el componente infiltrante del tumor (Tresserra F
y cols., 2008).
- Necrosis tumoral: La necrosis tumoral es un fenómeno que se observa en tumores de
alto grado, poco diferenciados y por tanto de mal pronóstico. Es importante señalar su
presencia y su extensión en relación con el área tumoral en el informe
anatomopatológico (Tresserra F y cols., 2008).
Factores pronósticos moleculares:
- Receptores hormonales: Los receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP) han
sido de los primeros factores moleculares en utilizarse en la práctica clínica ya que
contribuyen en la regulación de la proliferación y diferenciación celular mamaria y, sobre
todo, son imprescindibles para la selección de pacientes que se beneficiarán de un
tratamiento hormonal mejorando el pronóstico y supervivencia de estas enfermas. Se
recomienda su detección en el tumor primario, recurrencias y en las lesiones
metastásicas (Hammond ME y cols., 2010).
- HER2/neu: HER2/neu (c-erb-B2) es un protooncogen localizado en el cromosoma
17q21 que codifica un receptor de la tirosinaquinasa transmembrana (ERB2 o p185) que
comparte una extensa similitud con el receptor del factor de crecimiento epidérmico
(EGFR). Está sobreexpresado aproximadamente en el 20% de los tumores de mama,
asociándose a un peor pronóstico. Las alteraciones de HER2/neu han sido registradas en
un 40-60% de los casos de CDIs, y están más extendidas en los subtipos comedo que en
los cribiformes, lo cual indica que existe un papel en la progresión de las lesiones
premalignas (Walker RA y cols., 1997). Se considera positivo si se detecta una alta
expresión IHQ (+++/+++ en más del 30%). Si la expresión es moderada debe
comprobarse si está amplificado mediante técnicas de inmunofluorescencia (FISH
superior a 2 es +) (Wolf A y cols., 2007). Actualmente, la técnica de hibridación in situ,
ya sea fluorescente (FISH) o con otros métodos de revelado (CISH, SISH) se considera el
gold standard en la valoración de la amplificación del gen ERBB2 (HER2/neu) en el cáncer
de mama (Sáez A y cols., 2006). La sobreexpresión HER2/neu se correlaciona con peor
31
pronóstico tumoral, menor intervalo libre de enfermedad y supervivencia global,
presencia de metástasis en ganglios axilares, hormonoindependencia, mayor capacidad
proliferativa y resistencia al tamoxifeno. Numerosos estudios randomizados han
demostrado que el uso de Trastuzumab debe considerarse como una parte integral de
la terapia adyuvante de pacientes con cáncer HER-2 positivos de mama (Romond EH y
cols., 2005; Dahabreh IJ y cols., 2008). También es un indicador fiable a la sensibilidad
celular ante la quimioterapia, esencialmente de las antraciclinas y los taxanos. Por otro
lado, los tumores de mama que no expresen RE ni RP ni HER2, los llamados “triple
negativos” tienen peor pronóstico (Kammori M y cols., 2008).
- Ki 67: Ki-67 es un antígeno nuclear de naturaleza proteica y es indicador de
proliferación celular demostrando ser un marcador pronóstico y predictivo de respuesta
al tratamiento en cáncer de mama. La actividad de este antígeno también se detecta por
el anticuerpo monoclonal MIB-1. En la práctica clínica debemos considerar que la
presencia de <10% o >20% de células con positividad nuclear, nos va a separar los
tumores con baja y alta actividad proliferativa. Viale G y cols. (2008) concluyen que Ki-
67 se comporta como un factor pronóstico en cáncer de mama ya que niveles elevados
de expresión se asocian a un peor pronóstico y a una supervivencia libre de progresión
más pobre, y como factor predictivo de respuesta a tratamiento hormonal adyuvante.
- p53: El gen supresor tumoral o antioncogen p53 que interviene en el control del ciclo
celular, como mediadora de la diferenciación, de la reparación del DNA y de la apoptosis.
Este gen se activa cuando la célula sufre daños en su DNA o cuando es sometida a estrés
celular, por eso se le ha llamado “guardián del genoma”. Alrededor de un tercio de los
cánceres de mama presentan mutaciones del gen p53. La hiperexpresión de la proteína
p53 mutada podría ser un factor independiente de predicción de supervivencia libre de
enfermedad y de supervivencia global, en pacientes con ganglios negativos, lo que
implicaría un peor pronóstico. Con respecto a la correlación entre la sobreexpresión de
p53 y otros factores clínicos y pronósticos hay gran variabilidad entre los distintos
estudios, aunque sí parece haber acuerdo en que p53 es un factor pronóstico
independiente que se relaciona con la agresividad tumoral, asociándose a positividad
para c-erb-B2, Ki67 y RE (Dookeran KA y cols., 2010)
32
- Angiogénesis: La neoangiogénesis está regulada por el factor del endotelio vascular
(VEGF), cuya presencia se asocia a un peor pronóstico (Bertolini F y cols., 2009). VEGF
está estrechamente relacionado con el receptor de estrógeno, sobreexpresándose
cuando éste se activa y favoreciendo la formación de nuevas yemas vasculares. Además,
también se correlaciona con el indicador de proliferación Ki67 y la aneuploidía de los
tumores mamarios (Applanat MP y cols., 2008).
- Perfil genético: El primer trabajo que examinó los patrones de expresión genética en
cáncer de mama fue publicado por Perou en la revista Nature el año 2000 (Perou C y
cols., 2000). Demostró que la heterogeneidad morfológica de los tumores mamarios
puede reclasificarse en 4 grupos principales: luminal A, luminal B, HER2 amplificado y
similar a basal (basal-like) en base a los estudios de reordenamiento genético. Poco
después (Sorlie T y cols., 2001) se demostró que los dos primeros son de mejor
pronóstico y que los tumores con fenotipo de células basales y los Her-2 positivos tienen
peor pronóstico. Los basal-like están relacionados con un comportamiento más
agresivo, con tendencia a desarrollar metástasis y con un fenotipo “triple negativo”
(para los receptores de estrógenos, de progesterona y para el HER2), que los excluye de
las terapias diana hormonal y anti HER2, aunque pueden responder bien a la
quimioterapia neoadyuvante y adyuvante.
En este contexto, los tests genéticos pronóstico están cobrando actualmente mayor
importancia en la práctica clínica. Los progresos en las técnicas genéticas han permitido
que el diagnóstico del cáncer de mama también pueda beneficiarse de la nueva era
genómica. De estos nuevos avances caben destacar los ADN microarray. Estos
microarrays nos permiten definir un perfil de expresión genética, que puede medir
desde unos cuantos genes hasta miles de ellos de forma simultánea (Checa T y cols.,
2008). Actualmente los cuatro tests genéticos predictivos más empleados son:
- Oncotype DX (Genomic Health Inc, Redwood, CA)
- MammaPrint (Agendia, Slotervaart Hospital, Amsterdam, Holanda)
- Rotterdam Signature Test (Erasmus MC/Daniel den Hoed Cancer Center, Roterdam)
- H/I Test, Breast Cancer Gene Expression Ratio (Avaria Dx Inc, Carlsbad, CA).
33
1.2.3. Tratamiento.
El tratamiento de una paciente con cáncer de mama se aborda desde distintos frentes
como la cirugía, la quimioterapia, la radioterapia y la hormonoterapia. Para poder llevar
a cabo una correcta elección del tratamiento, se debe tener en cuenta tanto las
características tumorales, principalmente el estadio, así como el estado y actitud del
paciente de cara al tratamiento y a la enfermedad (Oncoguia CV, 2012).
En el caso de carcinomas in situ, como son tumores localizados que no presentan
metástasis, no se consideran una lesión propiamente neoplásica sino que se podría
considerar como un factor de riesgo de padecer carcinoma de mama en el futuro. El
tratamiento más adecuado va a ser la cirugía, consistente en una mastectomía uni o
bilateral sin biopsia selectiva del ganglio centinela ni linfadenectomia axilar (NCI, 2004;
Burnstein HJ y cols., 2004). Además puede ir acompañado de radioterapia (Singletary E
y cols., 2002), o tratamientos sistémicos como quimioterapia o hormonoterapia
adyuvante según proceda pero solamente en el caso de que sea ductal in situ, ya que el
lobulillar no va a requerir de estos tratamientos adicionales para reducir el número de
recidivas ya sean locorregionales o a distancia (Cohen M, 2004).
En el otro extremo se encuentran los pacientes con un tumor en estadio IV, que se
considera una enfermedad diseminada, por lo tanto incurable, y cuya supervivencia
global está entre 24 y 36 meses. El objetivo en este caso será un tratamiento únicamente
paliativo y con el fin de mejorar la calidad de vida de la paciente, y como última instancia
si es posible aumentar la supervivencia. El tratamiento se va a basar en hormonoterapia
y quimioterapia mediante distintos mecanismos y dosis (Mouridsen H y cols. 2003). Las
combinaciones más activas son las de Taxanos y Antraciclinas que producen un modesto
aumento en la supervivencia (Alba E y cols., 2003). Se puede realizar un tratamiento con
anticuerpos monoclonales, pero este tratamiento sólo va a ser útil para pacientes que
presenten cáncer de mama con sobreexpresión de HER2 (Burnstein HJ y cols., 2004). La
radioterapia en esta etapa del cáncer va a tener un papel importante en la disminución
de síntomas, pero no se va a buscar curar la enfermedad, sino que lo que se busca es
maximizar el bienestar de la paciente (Oncoguia CV, 2012).
34
1.3. CÁNCER DE MAMA HEREDITARIO
1.3.1. Teoría de la doble mutación de Knudson.
A lo largo del siglo XX se realizaron numerosas descripciones clínicas de agrupaciones
familiares de cáncer, sin embargo fueron la teoría de Knudson a principios de los años
setenta (Knudson AG, 1971), junto con el descubrimiento en el año 1986 del primer gen
de susceptibilidad al cáncer, Rb, implicado en el retinoblastoma familiar (Friend SH y
cols., 1986), los dos hitos que marcaron una nueva era en el campo del cáncer
hereditario. La teoría de Knudson se basó en la observación de 48 casos de
retinoblastoma, un tumor maligno de retina. En el año 1971, Knudson desarrolló su
teoría de two-hits, o “doble mutación”, basándose en la observación de que los casos
de retinoblastoma hereditario presentaban una edad de aparición mucho más temprana
que los casos esporádicos (casos únicos sin antecedentes familiares). Según la hipótesis
de Knudson, la enfermedad está causada por dos eventos mutacionales, que afectarían
a las dos copias del gen causante de la enfermedad. En la forma hereditaria, una
mutación (alteración en la información genética) se encontraría en la línea germinal,
transmitiéndose de generación en generación y confiriendo a los portadores una
susceptibilidad muy alta a padecer el cáncer. Esta susceptibilidad se heredaría de forma
autosómica dominante, es decir, un gen anormal de uno de los padres sería suficiente
para causar la susceptibilidad a sufrir la enfermedad, aunque la segunda copia del gen
del otro progenitor fuera normal. La segunda copia se alteraría a nivel somático, en este
caso la retina, y es entonces cuando se produciría el tumor. En las formas no
hereditarias, ambas mutaciones ocurrirían a nivel somático.
35
Figura 1. Modelo de transmisión hereditaria de mutaciones germinales en genes
supresores de tumores propuesto por AG Knudson en 1971. La alteración de la segunda
copia del gen en la célula somática suele producirse por pérdida alélica (pérdida de un
fragmento del cromosoma que contiene el gen).
1.3.2. Predisposición genética al cáncer de mama.
El cáncer de mama mayoritariamente tiene un carácter esporádico, lo que implica la
ausencia de una susceptibilidad heredada de desarrollar el cáncer. Sin embargo, los
avances en genética han permitido demostrar la base hereditaria para un subgrupo de
este tipo de cáncer, en los que las mutaciones de genes críticos se encuentran presentes
en las células somáticas y son heredadas de los progenitores (Rebbeck TR y cols., 2015). El
patrón de herencia de la enfermedad se ajusta a la Teoría de la doble mutación
propuesta por AG. Knudson en 1971.
Existe entre un 5-10% donde aparece esta predisposición hereditaria de desarrollar la
enfermedad (Claus EB y cols., 1996; Hall MJ y cols., 2009), de modo que la mutación
aparece en un gen que se hereda de forma mendeliana e incrementa el riesgo de la
persona portadora de desarrollar cáncer de mama a lo largo de su vida. Como esta
mutación se hereda a partir de la célula germinal de uno de los parentales, el individuo
va a presentar dicha mutación heredada en todas las células de su organismo. Además,
existe un 15% adicional de mujeres con cáncer de mama, que aunque no presenten un
36
patrón de herencia claro, sí que presentan algún antecedente familiar que lleva a
sospechar que consiste en un cáncer de mama hereditario (Rebbeck TR y cols., 2015).
Se han identificado 2 genes de susceptibilidad principales: el gen BRCA1 localizado en el
brazo largo del cromosoma 17 (17q21) que fue aislado en 1994 (Miki Y y cols. ,1994), y
el gen BRCA2 localizado en el brazo largo del cromosoma 13 (13q12) que fue aislado a
finales de 1995 (Wooster R y cols., 1995). Ambos genes son genes supresores de
tumores.
Aunque en principio estos dos genes parecían explicar la mayor parte de los casos de
cáncer de mama hereditario (Easton DF y cols., 1995), estudios posteriores demuestran
que dichas probabilidades fueron sobreestimadas ya que los estudios se habían
realizado en familias cuya carga genética era muy elevada. Hoy día se sabe que la
contribución de dichos genes al cáncer de mama hereditario está presente pero es más
modesta de lo que se pensaba, ya que todavía existen muchos casos que no pueden ser
explicados por la presencia de mutaciones en éstos genes. Se postula la existencia de un
posible BRCA3, pero hasta el momento no se ha localizado. Además, se sabe que hay
otros genes relacionados con el cáncer de mama, como CHEK2, TP53, pero éstos confieren
un riesgo mucho menor, de un 5%, 1% respectivamente (Figueroa L y cols., 2009). En la
mayoría de los casos están implicados en otras enfermedades sindrómicas con alta tasa
de incidencia de cáncer de mama (Nik-Zainal S, 2016). Se han identificado otros genes
cuyas mutaciones son poco frecuentes, pero que también presentan una correlación con
el cáncer de mama y ovario hereditario, como son los genes ATM, CDH1, CHEK-2, PALB2,
PTEN, STK11, MLH1 y MLH2. Mutaciones germinales en otros genes se han visto que
tienen mayor implicación como son los genes NBN, RAD51C, PALB2, BRIP1, BARD1. El
estudio mediante secuenciación individual de cada uno de ellos es ineficiente y muy
caro, de modo que gracias a las nuevas tecnologías de NGS se pueden realizar paneles
de secuenciación para determinar simultáneamente la presencia de mutaciones en
todos estos genes (Tung N y cols., 2015).
37
1.3.3. Genes BRCA1/BRCA2.
BRCA1
El gen BRCA1 es un gen de gran tamaño. Su secuencia de 5.592 nucleótidos, se extiende
a lo largo de 100 Kb de DNA genómico. El ARNm transcrito es de 7,8 Kb y se traduce a
una proteína de 1.863 aminoácidos. Su asociación con el cáncer de mama se conoce
desde 1990, cuando se mapeó por ligamiento un gen de susceptibilidad a cáncer de
mama en el cromosoma 17, en el intervalo 17q12-21 (Hall MJ y cols., 1990). El gen BRCA1
(OMIM #113705) fue identificado posteriormente por clonación posicional en 1994
(Miki y cols.1994), encontrándose que contenía 24 exones, 22 de los cuales codifican
para una proteína de 1863 aminoácidos. La región codificante comienza en el exón 2; el
exón 11 es el de mayor tamaño abarcando aproximadamente el 60% de todo el gen. Las
mutaciones en este gen se han identificado entre el 15 y 20% de las mujeres con historia
familiar de cáncer de mama y entre un 60 y 80% de mujeres con historia familiar de
cáncer de mama y ovario. Así las mujeres en donde se han detectado mutaciones en
este gen tienen entre un 60 y 80% de mayor riesgo de presentar este tipo de cáncer que
aquéllas que no las tienen (Morgan D y cols., 2009).
Figura 2.- Estructura del gen BRCA1. Se indican las mutaciones y variantes del gen en
familias españolas con cáncer de mama y cáncer de ovario hereditario (Baiget M y cols.,
2001).
38
Estructuralmente, BRCA1 es una fosfoproteína nuclear de 220 KDa, en donde la región
amino terminal contiene dominios proteicos tipo RING, los cuales consisten en motivos
estructurales de dedos de zinc, que están relacionados con la capacidad para
interaccionar físicamente con otras proteínas. La región acídica carboxilo terminal se
caracteriza por contener dominios de coactivación transcripcional y en donde se ha
demostrado que BRCA1 es capaz de unirse a proteínas que forman parte de la
maquinaria basal de transcripción como la RNApol-II y la Helicasa A (Scully R y cols.,
2000; Nathanson K y cols. 2001).
Figura 3.- Estructura de la proteína BRCA1. Los motivos estructurales de “dedos de zinc”
presentes en la región amino terminal de la proteína están asociados a interacciones
proteína-proteína. BRCA1 tiene una localización esencialmente nuclear. Esta proteína es
capaz de relocalizarse hacia los sitios donde se lleva a cabo síntesis de DNA, como en
fase S y durante los procesos de reparación que ocurren después de daño genotóxico.
Una de las regiones más importantes en la proteína es el dominio BRCT, localizado en la
región carboxilo terminal, en el cual se encuentran los motivos estructurales para unión
a proteínas que forman parte de la maquinaria basal de transcripción. Esta zona es la
responsable de la actividad coactivadora transcripcional de esta proteína en genes como
p21 y BclX.
Tanto BRCA1 como BRCA2 son capaces de unirse a la proteína RAD51 que es la homóloga
estructural y funcional en mamíferos de Rec A en E.coli. Estas proteínas son
indispensables en los mecanismos de reparación asociados a daño por rotura de la doble
39
hebra de DNA (DSBR) a través del mecanismo de recombinación homóloga (Yuan S y
cols., 1999). Además se ha demostrado que BRCA1 forma parte del multicomplejo que
incluye a las proteínas básicas para reparación como MSH2, MSH6, MLH1, ATM y BLM.
Este complejo funciona como controlador del daño al ADN. BRCA1 además es capaz de
interaccionar con la proteína p53 en sitios múltiples estimulando así la actividad
transcripcional de esta proteína (Tung N y cols., 2015).
A nivel molecular las pacientes con alteraciones en el gen BRCA1 tienen una alta
frecuencia de mutaciones en p53 y menor sobre-expresión de Her2/neu. Todos estos
hallazgos incluyen tanto factores pronósticos favorables como adversos (Xu X y cols.,
2001).
Desde el aislamiento del gen BRCA1, se han descrito más de 1600 variantes en secuencia
(incluyendo mutaciones, polimorfismos y variantes de significado incierto) (Breast
Cancer Information Core. http://www.nhgri.nih.gov/
Intramural_research/Lab_transfer/BIC 1997. Accessed 25 Jan 2017). Inicialmente solo 8
mutaciones fueron asociadas a enfermedad (Fútrela PA y cols., 1994), posteriormente
esta lista se ha incrementado. La mayor parte de estas variaciones incluyen mutaciones
de tipo frameshift o corrimiento en el marco de lectura, sin embargo, existen un gran
número de mutaciones tipo missense que son responsables de un mal funcionamiento
de la proteína. Se han reportado también diversas deleciones intrónicas como fuente de
mutación en BRCA1. Se presupone que este tipo de mutaciones tienen una alta
frecuencia debido a la presencia de diversas regiones Alu existentes en estas regiones,
lo cual facilita una alta frecuencia de inter-recombinación. No presenta “hot spots”,
excepto en población de judíos Ashkenazi, donde se informan frecuentemente dos
mutaciones; la 185delAG y 5382insC (Narod SA y cols., 2011).
BRCA2
Un segundo gen de susceptibilidad a cáncer fue encontrado un año después que BRCA1
(Wooster R y cols., 1995), se denominó BRCA2 (OMIM #600185) y está localizado en el
brazo largo del cromosoma 13 en la región q12.3. Las mutaciones de BRCA2 son las
causantes de cáncer en aproximadamente 35% de los casos de cáncer de mama
40
familiares y está asociado a cáncer de mama en varones, cáncer de ovario, próstata y
páncreas (Morgan D y cols., 2009). BRCA2 es un gen con 27 exones distribuidos en 70Kb
de ADN genómico que codifica una proteína de 3.418 aminoácidos con un marco de
lectura de 10.3 Kb (Bignell G y cols., 1997). Tanto BRCA1 como BRCA2 tienen un exón 11
muy largo y el sitio de traducción inicia en el exón 2.
Figura 4.- Estructura del gen BRCA2. Se indican las mutaciones y variantes del gen en
familias españolas con cáncer de mama y cáncer de ovario hereditario (Baiget M y cols.,
2001).
BRCA2 se une a BRCA1 y a RAD 51 lo cual la involucra en mecanismos básicos de
reparación, es decir, esta proteína está involucrada en los procesos para el
mantenimiento de la integridad genómica (Chen PL y cols., 1998). BRCA2 se ha asociado
también a procesos relacionados con el remodelamiento de la cromatina durante la
formación del sinaptonema en la recombinación homóloga en situaciones de daño al
ADN, en donde éste es un mecanismo de reparación importante, como en la persistencia
de cadena sencilla por detenimiento de la horquilla de replicación por formación de
fotoaductos por radiación U.V. (Scully R y cols., 2000). Los niveles más altos de expresión
se observan en mama, timo y en menor grado en pulmón, ovario y bazo.
41
Figura 5.- Estructura de la proteína BRCA2. Los sitios para su interacción con BRCA1 no
han sido mapeados. La región central denominada OCC es donde se encuentran con
mayor frecuencia las mutaciones asociadas a riesgo de cáncer de ovario.
Toda la información acerca de las funciones celulares de BRCA1/2 está asociada a la
interacción de estas proteínas con la maquinaria básica de reparación y con procesos de
remodelamiento de la cromatina. (Chen J y cols., 1998)Como es sabido todos los
mecanismos de reparación están presentes de manera constitutiva en todas las células
y son activos de manera independiente a la fase del ciclo celular. La manera de explicar
el porqué es precisamente en cáncer de mama en donde se han asociado alteraciones
en la función de BRCA1/2, es debido a que durante el metabolismo estrogénico se
generan especies altamente reactivas capaces de formar estructuras aberrantes
(aductos) en el ADN. Estos productos se encuentran en mayor cantidad en aquellos
órganos que responden fuertemente a estrógenos como la mama y el ovario. En
pacientes con mutaciones germinales en BRCA1/2 los mecanismos básicos para
detección y reparación de daño están alterados lo cual permite el acúmulo de
mutaciones asociadas a la formación de estos aductos (Venkitaraman AR y cols., 2001).
El riesgo para cáncer de mama en personas con mutaciones en este gen se estima entre
un 60 y un 85%, y el riesgo para cáncer de ovario entre un 10 y 20% (Morgan D y cols.,
2009).
La prevalencia de mutaciones en BRCA2 en la población general es desconocida, se ha
estimado por estudios poblacionales en 1-2 personas por mil (Satagopan JM y cols., 2001;
Esteban-Cardeñosa E y cols., 2008). Se han descrito mutaciones muy particulares en dos
42
grupos étnicos específicos: población de Islandia donde la mutación 999del5 ocurre en
el 0.6% de los casos y en 7.7% de mujeres y 40% de hombres con cáncer de mama
(Thorlacius S y cols., 1996); judíos Ashkenazi donde la mutación 6174delT ocurre con
una frecuencia de cerca de 1% (Offit K, 2006).
1.3.4. Pérdida de función de los genes BRCA1/BRCA2.
Las proteínas BRCA1 y BRCA2 actúan en las vías de reparación del ADN y su inactivación
debido a la presencia de una mutación en uno de ambos genes, provoca inestabilidad
genética, de modo que confieren una mayor predisposición de desarrollar cáncer de
mama así como un riesgo de desarrollar otros tipos de cáncer (Cavanagh H y cols., 2015),
debido a que se origina indirectamente la aparición de un tumor por acumulación de
mutaciones en otros genes reguladores directos del ciclo celular, ya que no han podido
ser reparados (Kinzler KW y cols.,1997).
De acuerdo con la Teoría de la doble mutación de AG Knudson (1971) en los genes
BRCA1 y BRCA2, la alteración de la segunda copia del gen en la célula somática, se
produce mayoritariamente por perdida alélica por deleción de un fragmento del
cromosoma que contiene la copia normal del gen (pérdida de heterocigosidad). Es
necesario que se dé la pérdida del segundo alelo (alelo sano) para que se desencadene
el proceso neoplásico, ya que aún con una sola copia funcional del gen se sigue
produciendo el funcionamiento normal del ciclo celular (Narod S y cols., 2004).
También se han descrito centenares de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 que
suelen consistir en pequeñas inserciones o deleciones que provocan un cambio en la
pauta de lectura, provocando la aparición de un codón de parada prematuro, cuya
consecuencia es el truncamiento de la proteína y por lo tanto la pérdida de función; en
otras ocasiones se puede ver alterado el proceso de eliminación de intrones
generándose un transcrito anómalo, o mutaciones no sinónimas, que son aquellas en
las que se produce un cambio de un nucleótido que provoca un cambio aminoacídico en
la proteína (Narod SA y cols., 2011).
Otro mecanismo de pérdida de función detectado en los genes BRCA1 y BRCA2 es
mediante una hipermetilación que silencia el gen. La hipermetilación es un proceso
43
mediante el cual se produce la metilación de islas CpG que encontramos en las regiones
promotoras, tanto del BRCA1 (Smith TM y cols., 1996) como del BRCA2 (Davis PL y cols.,
1999). Al producirse dicha metilación, se impide la transcripción del gen, ya sea porque
la proteína necesaria para la transcripción ya no es capaz de unirse al promotor o porque
proteínas represoras que presentan afinidad por las zonas metiladas se unen al
promotor inhibiendo la transcripción (Chan KY y cols., 2002).
Aunque en general existe una gran heterogeneidad alélica, algunas mutaciones se
presentan repetidamente en familias no emparentadas. Ciertas poblaciones presentan
unas pocas mutaciones con una frecuencia inusualmente alta. Se trata de mutaciones
“fundadoras”. Aparecen en individuos de una población pequeña y tras generaciones
sucesivas con un cierto grado de endogamia, aumenta su presencia en la población,
pasando a ser una alteración altamente recurrente o, incluso, característica. La
mutación 185delAG es la más frecuente en el gen BRCA1. Aparece en pacientes de etnia
judía en general, aunque con mayor prevalencia en la Ashkenazi, y todos los portadores
comparten un haplotipo común (Satagopan JM y cols., 2001). En la actualidad, es una
de las mutaciones recurrentes en población española, debido a la presencia histórica de
judíos en la península Ibérica. Otras mutaciones frecuentes son: en BRCA1, la 243delA
(localizada en Cataluña) y la 330A>G (de origen gallego); y en BRCA2, las 3036del4
(común en Europa), 6857delAA (origen catalán) y 9254del5 (presente en Cataluña y
Levante), (Diez O y cols., 2003).
1.3.5. Penetrancia de las mutaciones en genes BRCA1/BRCA2.
La penetrancia de ambos genes no es completa. Junto con la mutación se hereda la
susceptibilidad y una alta probabilidad de riesgo, aunque no es del 100%. La penetrancia
varía según la población estudiada y es generalmente más alta en familias con múltiples
casos comparada con series de pacientes no seleccionados. Esta variación es debida a la
heterogeneidad alélica (distintas mutaciones pueden causar distintos riesgos de cáncer),
así como a factores modificadores, genéticos y ambientales (Chen S y Parmigiani G, 2007).
44
En los estudios iniciales, el riesgo de padecer cáncer de mama superaba el 80% para
ambos genes a los 70 años de edad. Sin embargo, estos estudios sobreestimaban los
valores al estar basados en familias de muy alto riesgo, con numerosos casos de cáncer.
En diversos estudios más recientes con pacientes no seleccionados según su historia
familiar, los riesgos acumulados estimados fueron menores. El riesgo de cáncer de
mama a los 70 años fue de un 65% para BRCA1 y de un 45-80% para BRCA2.
Adicionalmente, las mujeres con cáncer de mama y mutaciones en BRCA1 o BRCA2
tienen un riesgo del 40% de desarrollar un segundo cáncer de mama a lo largo de su vida
y hasta 10 veces más riesgo de desarrollar un cáncer de ovario, comparadas con mujeres
no portadoras de mutación(Chen S y Parmigiani G, 2007).
La presencia de mutaciones en el gen BRCA2 se asocia con un aumento del riesgo de
cáncer de mama masculino (5-10% para BRCA2 a lo largo de la vida). Además, aumentan
su riesgo de cáncer de próstata (16% a los 70 años) y los portadores menores de 65 años
tienen hasta 7 veces más riesgo de padecer cáncer de próstata que los no portadores.
El riesgo en portadores de mutación en BRCA1 es menor que para BRCA2, pero dobla el
de la población general. Por lo tanto, una proporción de hombres con cáncer de próstata
precoz presenta mutaciones y debe investigarse su historia familiar por la posible
repercusión en las mujeres de la familia. Por último, ambos genes incrementan
ligeramente el riesgo de cáncer de colon, páncreas y otras neoplasias en dichas familias
(Cavanagh H y cols., 2015).
Los riesgos citados se han estimado sólo en familias de alto riesgo o en poblaciones
concretas, como la judía Ashkenazi. El cálculo de los riesgos asociados es de extrema
importancia para basar las decisiones clínicas posteriores. Debería realizarse en cada
población específica, para considerar el bagaje genético y los factores ambientales
propios (Antoniou A y cols., 2003; Morgan D y cols., 2009).
Es importante tener en cuenta que la penetrancia varía según la población estudiada
debido a otros factores diversos que no están relacionados con la genética. Por ejemplo,
el uso de anticonceptivos orales, la ooferectomía y la paridad, tienen influencia en el
riesgo de desarrollar cáncer de ovario (Petrucelli N y cols., 2005; Morgan D y cols., 2009).
Además a medida que las mujeres portadoras conocen su estatus genético, la
45
prevalencia del cáncer hereditario irá disminuyendo si se toman medidas preventivas
como la mastectomía y la ooforectomia profiláctias (Metcalfe KA y cols., 2008; Calderón
Del Valle SA y Gallón-Villegas LJ 2012).
Existen diversos modelos que se utilizan para la estimación del riesgo genético de
desarrollar cáncer de mama atendiendo a distintos factores:
Modelo de Couch: para el cálculo del riesgo se basa en la edad media de cáncer de
mama en la familia de la portadora. Otros factores que introduce son la historia familiar
de cáncer de mama o de cáncer de mama/ovario. El problema de éste modelo es que se
realizó con un número relativamente pequeño de familias (Couch FJ y cols., 1997).
Modelo de Frank: este modelo permite estimar la probabilidad de que una mujer con
cáncer de mama diagnosticado antes de los 50 años sea portadora de una mutación en
BRCA1 o BRCA2, basándose exclusivamente en la historia familiar (Frank TS y cols.,
1998).
Modelo BRCAPRO: utiliza un método matemático probabilístico basada en la herencia
mendeliana y aplica las bases del teorema de Bayes. Estima la probabilidad de ser
portador de una mutación en BRCA1 o BRCA2 según la historia familiar. La limitación es
que la muestra seleccionada se compone de mujeres con una importante historia
familiar de cáncer de mama y ovario, por lo tanto predice correctamente el riesgo
cuando se trate de familias con alto riesgo de presentar mutaciones BRCA (Berry DA y
cols., 2002; Euhus DM y cols., 2002).
Modelo de la Hoya: estima la probabilidad de presentar mutación en BRCA1 o BRCA2
mediante el desarrollo de una regresión logística. Tiene en cuenta el número de casos
de cáncer de ovario, la existencia de cáncer de mama y ovario en una misma persona, el
cáncer de mama bilateral, cáncer de mama en varones y la edad media de diagnóstico
de cáncer de mama (De la Hoya M y cols., 2002).
Ningún modelo matemático ha sido convenientemente validado, de modo que muchos
especialistas en cáncer familiar, optan por definir criterios de riesgo para la
recomendación del análisis genético.
46
1.4. TÉCNICAS MOLECULARES DIAGNÓSTICAS
El enorme tamaño de los genes BRCA1 y BRCA2, y la variedad en la localización y
tipología de las mutaciones hace que su análisis sea laborioso y complejo mediante la
secuenciación enzimática de Sanger (Sanger F y cols., 1974), pero ahora con la nueva
tecnología de NGS ha aumentado la eficiencia, y disminuido el tiempo de respuesta y el
coste económico de la secuenciación. Debido a la gran heterogeneidad de alteraciones
posibles las técnicas empleadas deben ser diversas y de gran capacidad de detección, y
realizarse tras una precisa selección de los pacientes a los que se les va a realizar el
estudio genético (Strom CM y cols., 2015).
1.4.1. Estudios genéticos.
Secuenciación Masiva (Next Generation Sequencing, NGS)
El enfoque de secuenciación paralela masiva o de próxima generación (NGS) para el
análisis de ADN representa un número potencial de ventajas sobre los métodos
tradicionales, incluyendo la habilidad de secuenciación completa de grandes números
de genes (cientos a miles) en una sola prueba. Además, las NGS pueden detectar,
simultáneamente, supresiones, inserciones, copiar alteraciones numéricas,
translocaciones y sustituciones de bases. La secuenciación NGS está cambiando el
diagnóstico genético debido a su enorme capacidad y favorable relación coste-
efectividad (Storm CM y cols., 2015). Este ensayo se basa en el uso de dos tecnologías
claves:
- Amplificación por PCR múltiples
- MPS (Secuenciación Masiva en Paralelo)
La secuenciación masiva es una técnica que se basa en fragmentar el genoma en
millones de partes de pequeño tamaño, capturar los fragmentos pertenecientes a los
exones de los genes o los genes incluyendo exones e intrones, secuenciar esos miles de
fragmentos y, posteriormente, ensamblarlos de tal forma que se pueda leer de forma
ordenada el genoma o exoma. De esta manera, se puede examinar si existen o no
47
mutaciones, pequeñas delecciones, inserciones o grandes reestructuraciones que
expliquen la susceptibilidad familiar al cáncer. Los programas de análisis bioinformático
procesan la información generada y permite la detección y evaluación tanto de variantes
descritas, como el descubrimiento de nuevas variantes en los genes BRCA1/BRCA2, de
una forma rápida y eficaz (Feliubadaló L y cols., 2013; D’Argenio V y cols., 2015;).
Secuenciación mediante el método de Sanger
El método de secuenciación por dideoxinucleótidos (ddNTP), mejor conocido como el
método Sanger se basa en el proceso biológico de la replicación del ADN. El método de
secuenciación ideado por Sanger está basado en el empleo de dideoxinucleótidos que
carecen del grupo hidroxilo del carbono 3', de manera que cuando uno de estos
nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no puede
continuar elongándose. La ADN-polimerasa necesita de este grupo para añadir el
siguiente nucleótido por lo que el polímero naciente se termina. Además cada ddNTP
correspondiente a cada base, va marcado con un fluorocromo distinto, de modo que va
a permitir determinar la secuencia separando por tamaños los distintos fragmentos
amplificados y detectar un pico de fluorescencia correspondiente a cada base (Sanger F
y cols., 1975). Mediante esta técnica se aborda el estudio de mutaciones puntuales, y
pequeñas deleciones o inserciones en los genes BRCA1/BRCA2.
Técnica MLPA
La técnica de MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) se basa en una
detección simultanea del número de copias de una secuencia diana mediante la
hibridación genómica del ADN con una mezcla de sondas específicas (Schouten JP y cols.,
2002). Cada sonda está constituida por un oligonucleótido sintético y un fragmento
derivado del bacteriófago M13. Cada uno de estos segmentos presenta una secuencia
de hibridación que es complementaria a la secuencia diana y una secuencia de unión a
cebadores que son común para todas las sondas. El fragmento derivado del
bacteriófago, presenta además una secuencia de relleno que varía de tamaño para cada
sonda, de modo que nos permitirá diferenciar los productos amplificados por tamaño.
Cuando ambas partes de la sonda hibridan de forma específica sobre el ADN problema,
se produce la ligación de ambos fragmentos de la sonda y la posterior amplificación de
48
la secuencia. Las sondas que no hayan hibridado o no se hayan ligado, no serán
amplificadas. La cantidad relativa de producto amplificado se corresponde con el
número de copias de la secuencia diana. Los productos amplificados son identificados y
cuantificados mediante electroforesis capilar (Madrigal S, 2008).
La técnica de MLPA se aplica en el estudio genético de BRCA1 y BRCA2 para el estudio
de pérdida de dosis génica. Permite la detección de grandes deleciones que mediante la
secuenciación convencional de Sanger no se pueden detectar.
Figura 6.- Representación esquemática de la técnica de MLPA (Multiplex Ligation-
Dependent Probe Amplification).
Resultados de la prueba molecular
En este tipo de pruebas moleculares se pueden tener tres posibles resultados:
- Resultado negativo: Es cuando no hay mutación detectable en el gen; puede
ser erróneo ya que una mutación indetectable puede estar presente en el
individuo o la familia. Se debe tener información acerca de la sensibilidad de
las pruebas de laboratorio utilizadas para tener en cuenta un posible
resultado falso negativo.
- Resultado indeterminado: a) cuando el significado clínico de un resultado
molecular no puede ser interpretado: esto sucede cuando un miembro de la
familia no está disponible para la prueba molecular, en este caso el gen
mutante original de la familia no es identificado. Es importante que el familiar
que solicite la prueba entienda que aun cuando la prueba sea negativa, el
49
resultado debe ser considerado indeterminado y los miembros de la familia
tendrán que seguir tratándose como individuos de alto riesgo; b) cuando se
detecta una variante genética de significado incierto: el resultado deberá
considerarse indeterminado. El laboratorio es incapaz de interpretar si este
resultado se considera como variante normal o no.
- Resultado positivo: Indica la presencia de una mutación patogénica y, por lo
tanto, el individuo estará en riesgo incrementado de desarrollar cáncer. Este
riesgo puede variar de familia en familia debido a otros genes modificadores,
estilo de vida o la presencia de otros factores de riesgo epidemiológico
(Ochoa-Carrillo FJ y cols., 2006).
1.4.2. Importancia clínica del estudio genético.
El diagnóstico molecular identifica individuos, tanto sanos como ya afectados, que
pueden beneficiarse de opciones médicas específicas para su alto riesgo heredado y que
suelen consistir en supervisión y detección precoz, cirugía profiláctica o quimioprofilaxis
(Metcalfe KA y cols, 2008).
- Detección precoz. Incluye la autopalpación de las mamas a partir de los 18
años de edad y el inicio de mamografías anuales, así como ecografías
transvaginales y determinación del marcador tumoral CA-125 cada 6 o 12
meses, para la detección precoz del cáncer de mama y del cáncer de ovario,
respectivamente. Estas prácticas deberían iniciarse a los 25 años de edad o
al menos 10 años antes del diagnóstico del primer caso de cáncer de mama
en la familia (ACOG, 2009; Pinto AE y cols., 2013). Estas recomendaciones se
basan en opiniones de expertos, aunque los datos preliminares obtenidos en
portadoras de BRCA1 apoyan estas medidas. Existen trabajos que indican la
necesidad de incorporar la resonancia magnética para aumentar la
sensibilidad respecto a la mamografía en portadoras de una mutación
(Metcalfe KA y cols, 2008).
- Cirugía profiláctica. La mastectomía profiláctica bilateral reduce el riesgo de
aparición de cáncer de mama en un 90%, aunque no desaparece totalmente
50
la posibilidad de malignización de tejido residual (Calderon del Valle SA y
cols., 2012). Debe considerarse en mujeres cuyas mamografías son de difícil
interpretación (mamas fibroquísticas o mamas muy densas en mujeres
jóvenes), con lesiones premalignas de alto riesgo o en aquellas cuyas
parientes de primer grado han sufrido cáncer de mama o cáncer de ovario
con rápidos desarrollos, no detectados a pesar de un seguimiento regular.
Obviamente, tiene efectos considerables de tipo físico y psicológico (Rojas-
May G, 2006; Metcalfe KA y cols, 2008).
La salpingo-ooforectomía bilateral reduce el riesgo de cáncer de ovario, para
el que no existe una forma eficaz de detección precoz, en más del 90%,
aunque se han documentado casos de carcinomatosis peritoneal después de
la ooforectomía. Si se realiza antes de la menopausia (especialmente antes
de los 40 años de edad), reduce también el riesgo de cáncer de mama a la
mitad (Metcalfe KA y cols., 2014). Es una de las opciones más recomendadas
para mujeres con riesgo, especialmente cuando han cumplido sus
expectativas de maternidad. El uso posterior de terapia hormonal sustitutiva
no parece alterar la reducción del riesgo (Calderon del Valle SA y cols., 2012;
Morales-Chamorro R y cols., 2015).
- Quimioprevención. Es un área controvertida en general y, especialmente, en
el cáncer de mama hereditario. El uso del tamoxifeno administrado durante
5 años parece ser efectivo en la reducción del riesgo (cerca del 40%) en
mujeres con antecedentes familiares o personales, como una biopsia con
cambios premalignos (Poveda M y cols., 2003). Sin embargo, existen dudas
acerca de cuál es el grado de riesgo que requiere el uso de este fármaco y a
qué edad debe comenzarse su administración. Teniendo en cuenta que los
tumores de portadoras de mutación en BRCA1 son RE- (receptores de
estrógenos negativos) en la mayoría de los casos, mientras que los de BRCA2
suelen ser tumores RE+ (receptores de estrógenos positivos), existen dudas
acerca de la utilidad del tamoxifeno en portadoras de BRCA1.
Adicionalmente, el tratamiento con tamoxifeno reduce hasta la mitad el
riesgo de cáncer de mama contralateral en portadoras de mutación
(Calderon del Valle SA y cols., 2012).
51
En la actualidad se están llevando a cabo diversos estudios de prevención con
éste y otros fármacos (otros moduladores de los receptores de estrógenos,
inhibidores de aromatasas, etc.), en mujeres a riesgo portadoras o no de
mutaciones para obtener datos más concluyentes (Morales-Chamorro R y
cols., 2015).
- Terapia hormonal. Se ha evidenciado un ligero incremento del riesgo de
cáncer de mama por el uso de contraceptivos orales en general,
independientemente del riesgo familiar. Otros estudios muestran este
aumento en mujeres con mutaciones en BRCA1, especialmente en las
tratadas hace décadas, con dosis de estrógenos orales superiores a las
actuales (Eisen A y cols., 2008). No parece haber un riesgo mayor relacionado
con BRCA2, pero el número estudiado de mujeres hasta ahora es menor. Por
el momento, aunque parece haber un ligero aumento de riesgo y las mujeres
deben ser informadas al respecto, no se contraindica su uso (Rodríguez S y
cols., 2006).
El uso de contraceptivos orales durante 6 o más años se ha asociado con una
reducción de cerca del 60 % en el riesgo de cáncer de ovario en mujeres
portadoras de mutaciones en BRCA1 o BRCA2 (Metcalfe KA y cols, 2008).
Actualmente también se recomienda la realización de RM en el esquema de
seguimiento debido a que en estudios prospectivos se ha demostrado
consistentemente que la sensibilidad de esta técnica es mayor que la de
cualquier otra modalidad. De modo que se ha demostrado que la RM
combinada con la mamografía y el examen clínico tienen una mayor
sensibilidad para detectar cáncer de mama en pacientes de alto riesgo
(Warner E y cols., 2004).
- Nuevas Terapias (Olaparib). Se están utilizando el fármaco Olaparib para
pacientes portadores de mutación en BRCA y con cáncer de mama y/o ovario,
así como otros tipos de cáncer cuya asociación con mutaciones germinales
en BRCA se ha visto relacionada (Kaufman B y cols., 2015). El olaparib es un
inhibidor oral de la poli ADP ribosa polimerasa (PARP). La función de PARP es
la reparación del daño celular. Uno de los mecanismos alternativos a las PARP
consiste en la intervención de dos proteínas, BRCA1 y BRCA2. Cuando uno de
52
estos genes tiene una mutación, el daño al ADN no puede repararse
adecuadamente y, como resultado, las células tienen más probabilidad de
presentar alteraciones genéticas adicionales que pueden conducir al cáncer.
El olaparib actúa selectivamente sobre líneas celulares con BRCA mutante o
con baja expresión BRCA, especialmente con respecto al BRCA2, ya que al
tener dicho gen mutado y sin posibilidad de reparar el daño en el ADN, la vía
alternativa que utiliza la célula para la reparación sería la PARP y como el
fármaco inhibirá dicha vía, la célula entrará en apoptosis. Por ello, se espera
que el fármaco tenga efectos mínimos sobre las células normales (sin
mutaciones o heterocigóticas para BRCA1 o BRCA2), (Lowery MA y cols., 2011;
Kaufman B y cols., 2015).
1.4.3. Asesoramiento genético y aspectos psicológicos y éticos.
Debido a la complejidad clínica del síndrome, al requerimiento de considerable
información de antecedentes familiares y personales, y a la laboriosidad y complejidad
del análisis molecular, estos estudios se realizan en centros que dispongan de un equipo
profesional multidisciplinar.
El proceso de asesoramiento comprende una sesión informativa sobre los riesgos de
cáncer propios y de transmisión a los hijos, la posibilidad del análisis genético y la
variedad de resultados posibles, las opciones y limitaciones clínicas y terapéuticas
posteriores al análisis, etc. Debe ofrecerse también información acerca de las
limitaciones y contratiempos que acompañan al proceso y respetarse el derecho a
rechazarlo. Solamente con el previo consentimiento se procede al análisis genético. En
ausencia de un beneficio anticipado para niños o adolescentes, se recomienda posponer
el análisis hasta que el individuo pueda tomar sus propias decisiones en la edad adulta.
Una vez conocido el resultado, se discuten las pautas clínicas de actuación y las
repercusiones familiares (ASCO, 2003). En caso de existir una mutación, es el propio
probando quien debe comunicarlo a sus parientes. Toda la información debe tratarse
de forma confidencial y privada. Deben discutirse las dudas acerca del riesgo de
discriminación social o laboral, así como de alteraciones psicológicas. Aunque,
generalmente, se observa una disminución de la ansiedad una vez conocido el resultado
53
del análisis, cualquiera que sea éste, debe existir la capacidad de proporcionar ayuda
psicológica (Ochoa-Carrillo FJ y cols.; 2006; Rojas-May G, 2006).
2. JUSTIFICACIÓN
Alrededor de un 5-10% de los casos de cáncer de mama se atribuyen a genes de
predisposición de alto riesgo y herencia autosómica dominante, y poco menos de la
mitad de ellos son debidos a mutaciones en los genes BRCA1/BRCA2 (Belman J y cols.,
2011). Sólo una minoría de casos se deben a mutaciones presentes en genes de riesgo
intermedio o moderado como TP53 (síndrome de Li-Fraumeni), PTEN (síndrome de
Cowden), ATM (ataxia telangectasia), etc… (Tung N y cols., 2015; Nik-Zainal S y cols., 2016).
Generalmente estos cánceres de mama se reconocen por aparecer a edades muy
tempranas y/o estar asociados a fuerte agregación familiar.
Aunque las mutaciones en los genes BRCA1/BRCA2 son raras en la población general
(0,2%), responden de casi la mitad de los casos de cáncer de mama y ovario hereditarios.
Su importancia radica en su elevada penetrancia: las mutaciones de BRCA1 predicen un
riesgo acumulado a los 75 años de un 65% (51-75%), y un riesgo de un cáncer de ovario
de un 39% (22-51%); el riesgo asociado a BRCA2 es de un 45% (33-54%) para el cáncer
de mama y de un 11% (4-18%) para el cáncer de ovario (Calderón del Valle SA y cols.,
2012). No obstante en familias con múltiples casos de cáncer de mama y ovario estos
riesgos son aún mayores.
La justificación de la detección de pacientes portadores de mutaciones en los genes
BRCA1/BRCA2 es la realización de un seguimiento para detectar precozmente la
aparición de tumores. Las recomendaciones de este seguimiento incluyen:
- Autoexploración mamaria mensual postmenstrual (18 a 25 años).
- Exploración clínica mamaria realizada por un médico experto desde los 25-35
años con periodicidad de 6-12 meses.
- Mamografía/ecografía anual a partir de los 25-35 años.
- Exploración ginecológica con ecografía transvaginal y determinación sérica de
CA125, con una periodicidad semestral o anual a partir de los 25-35 años.
54
- En varones con mutaciones en BRCA2 (riesgo de cáncer de mama 6%); sólo se
recomienda advertir al paciente y a su médico un alto índice de sospecha ante
cualquier síntoma. Se aconseja una exploración prostática anual (mediante tacto
rectal) y determinación serológica del PSA a partir de los 40-50 años.
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
3.1. HIPÓTESIS DE TRABAJO
Las mutaciones encontradas en los genes BRCA1 y BRCA2 están implicadas en la
aparición del cáncer de mama hereditario. Además la prevalencia alélica de dichos genes
está condicionada por el sustrato étnico de la población local.
3.2. OBJETIVOS PRIMARIOS Y SECUNDARIOS:
OBJETIVO PRIMARIO
Identificar mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 en pacientes con cáncer de mama
que cumplan criterios de riesgo hereditario y conocer la prevalencia de dichas
mutaciones en el Departamento de Salud de la Ribera de la Comunidad Valenciana.
OBJETIVOS SECUNDARIOS
- Caracterizar el tipo de paciente que acude a la Unidad de Riesgo Familiar del
Departamento de Salud de la Ribera.
- Determinar qué mutaciones de los genes BRCA1 y BRCA2 están presentes en nuestra
población de riesgo de cáncer de mama y de ovario.
- Conocer la distribución alélica en los genes BRCA1 y BRCA2 en la población de riesgo
del Departamento de salud de la Ribera de la Comunidad Valenciana.
- Detectar familias portadoras de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 del
Departamento de Salud de la Ribera.
55
4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1. ÁMBITO DE ESTUDIO
El estudio se ha realizado en el Área de Diagnóstico Biológico del Hospital Universitario
La Ribera (Alcira). Este hospital pertenece al Departamento de Salud La Ribera de la
Comunidad Valenciana y atiende a una población de 220.676 habitantes, según censo
de 2016 del banco de datos municipales ARGOS de la Generalitat Valenciana
(http://www.argos.gva.es/bdmun/pls/argos_mun/DMEDB_COMADATOSINDICADORES
.DibujaPagina?aNComaId=20&aNIndicador=2&aVLengua=c) repartidos en 36
municipios.
4.2. DISEÑO DEL ESTUDIO
Estudio observacional descriptivo.
4.3. PERIODO DE ESTUDIO
Desde el 1 Enero de 2011 hasta el 14 de Junio de 2016.
4.4. SELECCIÓN DE PACIENTES
Los criterios de selección para indicar el estudio de los genes BRCA1 y BRCA2 pueden
diferir en función de la guía clínica aunque suelen ser bastante similares, y la mayoría de
ellas comparten unas tasas de detección de mutaciones, que suelen ser de al menos el
10%. Estos criterios se revisan y modifican periódicamente en función de la evidencia y
conocimientos científicos que se vayan adquiriendo (Morales-Chamorro R y cols., 2015). En
la Comunidad Valenciana los criterios de selección han sido recogidos en la Oncoguía
(2012) y se recomienda el estudio genético en aquellas mujeres en las que se sospeche
un Cáncer de Mama y Ovario Hereditario. Los criterios clínicos de sospecha que se han
empleado consisten en:
56
Familias con un único caso de cáncer de mama
o Cáncer de mama diagnosticado antes de los 30 años, o
o Cáncer de mama primario bilateral antes de los 40 años, o
o Un cáncer de mama y un cáncer de ovario en la misma paciente.
Familias con dos casos en familiares de primer grado
o Dos cánceres de mama diagnosticados, al menos uno antes de los 50
años, bilateral, o
o Dos o más casos de cáncer de ovario (independientemente de la edad),o
o Un cáncer de mama y un cáncer de ovario en dos familiares
(independientemente de la edad), o
o Un cáncer de mama/ovario en una mujer y un cáncer de mama en un
varón (independientemente de la edad)
Familias con tres o más casos afectados por cáncer de mama:
o al menos dos en familiares de primer grado (madres, hijas o hermanas).
4.5. TAMAÑO MUESTRAL
Se ha realizado un estudio de las mutaciones de los genes BRCA1 y BRCA2 a un total de
300 pacientes, de los cuales se observa que un 7.33% (22/300) corresponde a varones y
el otro 92.67% (278/300) corresponde a mujeres. Mayoritariamente son de origen
caucásico y han sido remitidas desde el servicio de Ginecología y Oncología.
La media de edad de las mujeres estudiadas es de 41.63 ± 21.21 años con un rango de 20 a
77 años y en el caso de los varones de 52 ± 16.06 años con un rango desde 28 a 75 años.
4.6. ANÁLISIS GENÉTICO
4.6.1. Método de extracción de ADN a partir de sangre periférica.
El ADN genómico de cada paciente incluido en nuestro estudio se obtiene a partir de
muestras de sangre periférica anticoagulada con EDTA utilizando procedimientos
automatizados de extracción de ácidos nucleicos. Se utiliza un equipo Maxwell™
57
(Promega Corporations, USA) con protocolos específicos para los distintos tipos de
muestra y de ácidos nucleicos. El empleado en este estudio ha sido el protocolo para
extracción de ADN a partir de muestras de sangre periférica (Maxwell 16 LEV Blood DNA®
kit), en tandas de 16 muestras.
1.- Se prepara 1 eppendorf de 1.5ml por cada una de las muestras a extraer donde se
mezcla: 30μl de “proteinasa K” + 300 μl de “Lysis Buffer” + 300 μl de sangre bien
homogenizada por inversión del tubo de hemograma. Se homogeniza la mezcla
mediante vórtex y se da un spin para que todo el contenido del tubo quede abajo. Se
incuba la muestra durante 20 minutos a 56˚C.
2.- Se prepara el equipo para realizar la extracción de ADN a partir de sangre periférica
según indicaciones del fabricante. Se saca la bandeja donde se colocan los reactivos
necesarios que proporciona el kit para la extracción de ADN. Se coloca el rack con los
reactivos necesarios y un eppendorf de 1ml en la posición correspondiente donde se
añaden 120 μl de “Elution buffer”. También se inserta una punta en la posición proximal
del rack.
3.- Una vez finalizada la incubación a 56˚C, todo el volumen de muestra hemolizada se
introduce en la última posición del rack y se homogeniza bien con la pipeta.
4.- Se introduce la bandeja en el equipo donde inicia la extracción que dura 40 minutos.
5.- Se prepara un tubo de rosca y un eppendorf bien rotulados con número de petición,
fecha y prueba. En el tubo de rosca se guarda sangre periférica del paciente sin extraer
mientras que en el eppendorf se va a guardar la extracción de ADN a partir de la sangre
que se ha realizado.
6.- Cuando el equipo ha finalizado la extracción, avisa mediante una señal acústica, de
modo que se saca la bandeja, se desechan los racks y se recoge el eppendorf con la
extracción. Se da un spin para que las partículas de suciedad que puedan quedar en la
muestra precipiten al fondo y se recupera el sobrenadante donde se encuentra el ADN.
58
4.6.2. Medición de concentración de material genético.
Una vez extraído el ADN, se debe medir la concentración obtenida y su grado de pureza.
Se emplea un espectrofotómetro NANODROPTM (Thermo Scientific, EEUU), que necesita
muy poca cantidad de muestra para conocer la concentración de la misma. Éste trabaja
con un software específico, Nanodrop®.
Los pasos a realizar son los siguientes:
1- Quitar esponja que protege al espectrofotómetro.
2- Encender programa.
3- Calibrar máquina con buffer AE (1μl)
4- Realizar un blanco con el buffer y debe repetirse hasta que de un valor 0.
5- Limpiar cada vez que cambiemos muestra.
6- Poner 1μl muestra.
7- Anotar nº de muestra en ID.
8- Medir con F1, Realizando dos mediciones.
9- Anotar ng/μl en el tubo eppendorf.
Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los ácidos nucleicos
absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorción característico presenta un
máximo a λ ≈ 260 nm. Si bien el coeficiente de extinción en particular depende de la
secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten estimar la concentración a
partir del valor de A260. Así, una unidad de absorbancia a 260nm corresponde
aproximadamente a una concentración de 50 μg/ml de ADN doble hebra, 33 μg/ml de
fragmentos cortos de ADN monohebra (oligodesoxinucleótidos). En las preparaciones
de ácidos nucleicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteica. Dado que los
aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de proteínas lleva
a sobrestimaciones de la concentración. Dado que el máximo de absorbancia de las
proteínas se encuentra en λ ≈ 280 nm, es posible estimar el grado de impurezas de
origen proteico a partir del cociente A260/A280. La presencia de proteínas en la muestra
hará que el cociente A260/A280 sea menor que el esperado para ácidos nucleicos puros.
Para el ADN doble hebra en soluciones de alta pureza se espera A260/A280 ≥ 1.8. La
59
estimación de la pureza de la muestra de ADN y de su contaminación por impurezas es
necesaria para conocer si es apta para el estudio genético por PCR.
4.6.3. Estudio de los genes BRCA1 y BRCA2 por NGS (Next Generation
Secuencing).
Estudios recientes ponen de manifiesto la mayor eficacia de la técnica NGS (Next
Generation Secuencing) para el manejo clínico de las mujeres afectadas por cáncer de
mama, para la prevención y, sobre todo, para la identificación de familiares sanos de
alto riesgo. La técnica de NGS es más sensible, más rápida, más fácil de usar y menos
costosa que el método convencional de Sanger y en consecuencia es un método seguro
para la detección molecular rutinaria de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2
(D’Argenio V y cols., 2015; Strom CM y cols., 2015)
Mediante la técnica NGS se puede realizar el estudio completo de los genes BRCA1 y
BRCA2, ya que se trata una técnica de secuenciación masiva. Se ha utilizado el ensayo
BRCA MASTR Dx® de Multiplicom™, que está diseñado para amplificar por PCR todas las
regiones codificantes de los genes BRCA1 y BRCA2, mediante la utilización de cinco
mezclas de cebadores multiplexados. Se requiere una cantidad de ácidos nucleicos para
llevar a cabo la realización de dicha técnica de 20-50 ng de ADN genómico extraído a
partir de una muestra de sangre periférica de los pacientes. A los amplicones resultantes
de las PCRs iniciales se les agrega el adaptador para su identificación, utilizando el kit
Illumina MiSeq™, y secuenciando mediante el uso del instrumento MiSeq™ de acuerdo
con el fabricante.
El primer paso consiste en amplificar todas las regiones codificantes de los genes BRCA1
y BRCA2 como se ha dicho anteriormente y son amplificadas mediantes cinco PCR
multiplex separadas. Se utiliza una polimerasa de inicio en caliente y se preparan cinco
reacciones, cada una con un Plex Mix distinto, que presenta distintas parejas de
cebadores, y la polimerasa, obteniéndose así las cinco PCR multiplex para cada paciente.
60
Figura 7.- Representación esquemática de cómo se ubicarían los cebadores al hibridar
en la cadena de ADN para la realización de la PCR multiplex y la incorporación de los tags
en la copia de los fragmentos de interés para la posterior PCR universal.
Cada cebador viene marcado con unas tag que van a ser importantes para la realización
de las PCR universales para poder incorporar los identificadores a cada uno de los
pacientes.
Para 8 reacciones se mezclan 80 μl de mezcla PCR Plex + 0.6μl de Taq ADN Polimerasa
como indica el protocolo de la casa comercial. Se repartirán 10μl del mix
correspondiente a cada Plex para cada uno de los pacientes, al que se le añade 5μl de
ADN del paciente correspondiente para llevar a cabo la PCR, cuyo protocolo es:
Programa de PCR:
DESNATURALIZACIÓN 98° 10’
DESNATURALIZACIÓN 95° 45’’
ALINEAMIENTO 60° 45’’ 20ciclos
EXTENSIÓN 68° 2’
EXTENSIÓN FINAL 72° 10’
FINAL DE LA REACCIÓN 4° 1h Max.
61
Una vez realizada la primera PCR multiplex, se realiza un control de calidad con gel de
agarosa al 2%, para comprobar la presencia de amplicones. Si la amplificación ha sido
exitosa se detectará una banda claramente visible pero dispersa entre los 250-500pb.
Una vez comprobado que la PCR multiplex se ha realizado con éxito, las cinco Plex PCRs
para los amplicones derivados de BRCA MASTR Dx®, en primer lugar se van a diluir
1/1000 cada una de las reacciones de PCR multiplex y posteriormente se etiquetan
utilizando el kit MID Dx® para Illumina MiSeq™, mediante el cual se va a incorporar un
identificador molecular MID y los adaptadores p7 y p5, que son necesarios para la
secuenciación en el instrumento MiSeq™. Se va a incorporar en la reacción de PCR
universal una combinación adaptador p7 y p5 exclusivo para cada uno de los pacientes
para poder lograr la identificación y diferenciación entre cada uno de ellos, esencial para
la óptima realización y diferenciación de los pacientes al secuenciar toda la colección de
amplicones juntas.
Figura 8.- Representación esquemático de cómo se unirían los adaptadores para cada
uno de los pacientes en la amplificación de los productos de PCR de los plex de la
reacción inicial y como se incorporan junto con las copias de las cadenas de ADN para
una óptima secuenciación final e identificación de cada uno de los pacientes analizados.
El protocolo a seguir para realizar esta segunda PCR es el siguiente:
Universal PCR mix 10μl
Reactivo de Amplificación 10μl
MIP p7 primer 2μl
MID p5 primer 2μl
Taq ADN Polimerasa 0.125μl
62
Se repartirá del mix general 24μl para cada reacción y 1μl del resultado de la dilución
previamente realizada.
Para llevar a cabo la adición de los adaptadores, el programa que debe llevarse a cabo
en el termociclador es el siguiente:
Programa de PCR:
DESNATURALIZACIÓN 98° 10’
DESNATURALIZACIÓN 95° 45’’
ALINEAMIENTO 64° 45’’ 20ciclos
EXTENSIÓN 68° 2’
EXTENSIÓN FINAL 72° 10’
FINAL DE LA REACCIÓN 4° 12h Max.
Una vez realizada la PCR universal, se realiza un segundo control de calidad con gel de
agarosa al 2% cargando 5μl de PCR de cada pocillo. En este caso, si la PCR Universal se
ha realizado con éxito, se debe de observar una banda ancha y difusa entre 350-550pb.
Los amplicones etiquetados resultantes de cada PCR, se van a mezclar por cada
individuo aplicando un esquema de mezcla específico para cada ensayo, de modo que
se van a mezclar 8μl de la PCR plex 1; 11μl de la PCR plex 2; 13μl de la PCR plex 3; 8μl de
la PCR plex 4; y 10μl de la PCR plex 5, obteniéndose así una colección de amplicones (CA)
para cada uno de los pacientes y cada colección de amplicones va a contener 93
amplicones diferentes.
A continuación se realiza la purificación de cada una de las CA para eliminar los residuos
de la PCR que hayan podido quedar y no interfieran en la posterior secuenciación de los
fragmentos. La purificación se va a realizar mediante el uso de perlas magnéticas
Agencourt AMPure XP® (Beckman-Coulter™). Estas, mediante utilización del protocolo
63
especificado por el fabricante, van a permitir la eliminación de todos los residuos
presentes en las PCR y la obtención de las CA purificadas.
Finalmente se realiza la combinación de las diferentes CA de cada uno de los pacientes
para obtener un POOL equimolar de cada uno de ellos. Calculando el volumen de cada
CA mediante la fórmula:
Se diluye cada CA hasta obtener una concentración 4nM con tampón TAE 1X hasta un
Vfinal de 100μl. Luego se procede a combinar un volumen equimolar idéntico de cada
una de ellas obteniéndose de este modo el POOL equimolar de las CA de todos los
pacientes.
El POOL equimolar se analiza posteriormente en un equipo Illumina MiSeq™.
4.6.4 Análisis Bioinformático de los datos de NGS.
Los datos obtenidos mediante el equipo MiSeq™ se cargan al programa informático
DNAnexus™, que genera los archivos con la anotación de las posiciones cromosómicas
de las variantes detectadas.
Los archivos que se generan son de mapeado cromosómico, datos estadísticos y las
variantes encontradas en la secuenciación de los genes. Se emplea el archivo de
variantes.txt que se analiza con el programa Excel™ (Microsoft Office) donde están
recogidos todos los datos obtenidos de cada uno de los pacientes. Las variantes
detectadas posteriormente se comprueban si están registradas en las bases de datos
Breast Cancer Information Core (BIC) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de
Estados Unidos, ClinVar del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI)
y la base de datos HGMD® (Human Gene Mutation Database); de modo que se revisa y
comprueba la presencia y descripción de cada una. De todas ellas, se eliminan del
análisis las mutaciones intrónicas que se encuentran a una distancia mayor a 10
nucleótidos del exón tanto upstream como downstream, ya que es poco probable que
afecten el splicing del RNAm y por lo tanto no van a tener repercusión clínica. Del mismo
modo las mutaciones sinónimas tampoco se van a tener en cuenta, ya que no se va a
64
producir cambio aminoacídico en la proteína y por lo tanto ésta no se va a ver afectada
en su estructura y función. Tampoco se debe tener en cuenta aquellas mutaciones que
se repiten sistemáticamente dentro de una tanda de pacientes así como en la mayoría
de pacientes de estudio, ya que son artefactuales y no van a tener implicación
patológica. Se aplica por último un filtro de frecuencia alélica (MAF) considerando como
clínicamente relevantes aquellas que aparecen en la población general con una
frecuencia alélica inferior al 0,02%, considerando el resto polimorfismos. Para las
mutaciones no descritas anteriormente se realiza un análisis mediante software de
simulación como son Polyphen® o Mutation Taster®, que realizan un estudio
comparativo del cambio de aminoácido producido en función de las propiedades de
cada aminoácido, haciendo una estimación de la afección de la proteína frente a dicho
cambio y por tanto la modificación funcional que puede sufrir. Cuando se detecta una
mutación patológica en alguno de los pacientes por NGS se realiza una posterior
confirmación mediante el método directo de Sanger (Sanger F y cols., 1974). Las
variantes con relevancia clínica se nomenclaturan según la normativa de la Human
Genome Variation Society (HGVS). Como secuencias de referencia se emplean para el
gen BRCA1 la secuencia con código NM_007294.3 para la secuencia de nucleótidos y la
secuencia con código NP_009225.1 para la secuencia de aminoácidos. Para el gen BRCA2
las secuencias que se emplean son NM_00005959.3 y NP_000050.2 para la secuencia
de nucleótidos y aminoácidos respectivamente.
4.6.5. Estudio mutacional de los genes BRCA1 y BRCA2.
La metodología aplicada para la confirmación de mutaciones detectadas por NGS es la
secuenciación directa o de Sanger (Sanger F y cols., 1974), consiste en la amplificación
por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los genes BRCA1 y BRCA2 mediante la
utilización de oligonucleótidos cebadores específicos y la posterior secuenciación de los
fragmentos obtenidos. Los cebadores se diseñaron para incluir las regiones intrónicas
adyacentes a los exones, y así detectar posibles mutaciones que afectaran al splicing del
ácido ribonucleico mensajero (ARNm). El exón 11 del gen BRCA1 se amplifica
dividiéndolo en 12 fragmentos debido a su tamaño. En el caso del gen BRCA2, el exón
65
10 se divide en 4 fragmentos, y el exón 11 se divide en 16 fragmentos debido también a
su gran tamaño.
Los oligonucleótidos cebadores empleados en el estudio para la amplificación y
secuenciación de los exones de los genes BRCA1 y BRCA2 se diseñan de manera que las
regiones intrónicas adyacentes queden dentro del amplificado de modo que se puedan
detectar posibles mutaciones que afecten al splicing del ARNm, cuyas secuencias se
muestran en las tablas 1 y 2 del ANEXO I. La amplificación se realiza en un termociclador
GeneAmp® PCR System 2700 (Applied BiosystemsTM). El programa del termociclador y
las proporciones utilizadas de los reactivos han sido:
Mezcla de PCR (Vfinal=20 μl):
H2O 13,4 μl
Tampón 10X 2,0μl
MgCl2 1,0 μl
dNTPs 0,4 μl
Forward 0,4 μl
Reverse 0,4 μl
Polimerasa 0,4 μl
DNA 2,0 μl
Programa de PCR:
DESNATURALIZACIÓN 94⁰C---------5’
CICLOS DE PCR:
DESNATURALIZACIÓN 94⁰C---------30’’
ALINEAMIENTO 43⁰C---------30’’ 45ciclos
EXTENSIÓN 72⁰C---------45’’
EXTENSIÓN FINAL 72⁰C---------30’
66
La presencia de amplicones del tamaño adecuado se comprobó en un equipo de
electroforesis Quiaexcel® (QIAGEN™).
Posteriormente, se utiliza una alícuota de los productos de PCR para la reacción de
secuenciación con el sistema Big Dye Terminator Cycle Sequencing® (Perkin Elmer-
Applied ByosystemsTM). Dicha reacción se realiza en ambas direcciones, directa y reversa
utilizando los mismos cebadores que en la etapa de amplificación (tabla 1 y 2) a una
concentración de 5 μM con el siguiente protocolo:
Mezcla de PCR de secuencia: Vfinal=10 μl
H2O 6,45μl
Tampón 1,75μl
Big Dye 0,5 μl
Primer (F o R) 0,3 μl
Muestra de PCR 1,0 μl
Programa de PCR:
DESNATURALIZACIÓN 96° 1’
DESNATURALIZACIÓN 96° 10’’
ALINEAMIENTO 50° 5’’ 25ciclos
EXTENSIÓN 60° 4’
FINAL DE LA REACCIÓN 4° 10’
Los productos de PCR obtenidos en la etapa de secuenciación se purifican en placas
DyEx® (QIAGENTM) siguiendo las instrucciones del fabricante.
El secuenciador ABI-PRISM 3130 XL Genetic AnalyzerTM (PE-Applied BioSystems) se
programa siguiendo las instrucciones del fabricante. Su funcionamiento se basa en la
separación de los fragmentos mediante electroforesis capilar, excitación con luz láser de
los fluorocromos y análisis de los datos con un programa informático que muestra los
67
resultados en un electroferograma cuyos picos representan la posición de cada uno de
los nucleótidos de la secuencia de ADN procesada.
Las secuencias obtenidas se comparan con las secuencias revisadas del gen BRCA1 y
BRCA2 mediante el programa ChromasPRO™, que utiliza la herramienta Basic Local
Alignment Search Tool (BLAST). El programa compara las secuencias de nucleótidos o
proteínas de bases de datos de secuencia y calcula la significación estadística de las
coincidencias.
La presencia de dos nucleótidos en la misma posición (heterocigosis para una mutación
puntual) se pone de manifiesto por la superposición de dos picos en el
“electroferograma”, hecho que se comprueba en ambas direcciones de secuenciación.
La presencia de microinserciones o microdeleciones en un solo alelo provoca la
aparición en el “electroferograma” de picos desfasados de un alelo respecto a otro,
produciéndose un solapamiento de los mismos, dando a modo de una doble secuencia,
lo que se comprueba también en ambas direcciones.
4.6.6. Estudio de dosis génica de los genes BRCA1 y BRCA2.
Mediante la técnica de MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) se
puede determinar la dosis génica de cada gen y detectar grandes reordenamientos y
deleciones. La técnica consiste en una primera fase de hibridación con sondas específicas
para cada uno de los exones de los genes BRCA1 y BRCA2, una segunda fase de ligación
y por último una fase de amplificación por PCR con cebadores comunes. Posteriormente
se realiza un análisis de fragmentos con el equipo de secuenciación automática ABI-
PRISM 3130 XL Genetic AnalyzerTM (PE-Applied BioSystems). El análisis mediante MLPA
se realiza con un kit comercial SALSA MLPA P002BRCA1 Probemix (MRC HollandTM) para
el gen BRCA1, y SALSA MLPA P045BRCA2/CHEK Probemix (MRC HollandTM) para el gen
BRCA2, siguiendo las instrucciones del proveedor:
FASE 1: Desnaturalización del ADN e Hibridación con la sonda MLPA
Se separan 5 μL (20-500ng) del ADN genómico del paciente en tubos eppendorf de
0,2mL previamente rotulados, se centrifugan brevemente y se calientan, para su
desnaturalización, 5 minutos a 98ºC; bajando la temperatura a 25ºC antes de abrir el
68
termociclador. Mientras tanto, se añade, en un tubo eppenforf de 1mL, por cada
reacción: 1,5 μL de SALSA Probemix y 1,5 μL de MLPA buffer y se mezcla por repetido
pipeteo. De esta mezcla, se añaden con mucho cuidado 3 μL, a cada uno de los tubos
que contienen los 5 μL de ADN y se incuban 1 minuto a 95ºC, seguido de 16-18 horas a
60ºC.
FASE 2: Reacción de Ligación
En un tubo eppendorf de 1mL, se prepara la mezcla maestra de Ligasa 65. Por cada
reacción, se mezclan: 25 μL de agua de laboratorio, 3 μL de Ligase-65 buffer A, 3 μL de
Ligase-65 buffer B y después se añade 1 μL de Ligase-65. A continuación, se reduce la
temperatura del termociclador a 54ºC y se agregan 32 μL de la mezcla maestra de Ligasa
65 a cada tubo de 0,2mL que contiene 8 μL de ADN hibridado con las sondas. Una vez
añadida esta mezcla a todos los tubos, se deja 15 minutos más a 54ºC, seguido de 5
minutos a 98ºC, para inactivar la ligasa, y se baja la temperatura a 4ºC, para conservar
las muestras. Los productos de ligación se almacenaron en nevera a 4ºC, evitando la
exposición a la luz, un máximo de una semana.
FASE 3: Reacción de PCR
En un tubo eppendorf de 1mL se prepara, en hielo, la mezcla maestra de Polimerasa.
Por cada reacción, se mezclan: 5,5 μL de agua destilada, 2 μL de SALSA Enzime Dilution
Buffer, 2 μL de SALSA PCR-primer mix y antes de utilizar la mezcla, se añade 0,5 μL de
SALSA Polymerase. A continuación, en otro tubo eppendorf de 1mL se prepara la mezcla
maestra del tampón de PCR. Por cada reacción, se mezclan: 26 μL de agua destilada y 4
μL de 10xSALSA PCR buffer. Se añaden 30 μL de esta mezcla maestra a nuevos tubos
eppendorf de 0,2 mL previamente rotulados. Seguidamente, se les adicionan 10 μL de
su correspondiente reacción de ligación, que permanece a 4ºC. A continuación se hace
una breve centrifugación, para que los productos de la ligación bajen al fondo del tubo,
y se introducen en el termociclador a 60ºC. Posteriormente se añaden 10 μL de la mezcla
maestra de Polimerasa a cada uno e inmediatamente después, se empieza la reacción
de PCR.
69
Programa de PCR:
DESNATURALIZACIÓN 95° 30’’
ALINEAMIENTO 60° 30’’ 40ciclos
EXTENSIÓN 72° 1’
FINAL DE LA REACCIÓN 4° Conservar en nevera
Posteriormente los productos de la reacción de PCR se analizan en el secuenciador
automático ABI-Prism 3100XL Genetic Analyzer (Applied BiosystemsTM), para ello se
prepara en un tubo eppendorf de 1,5 mL una mezcla con 9 μL de HiDi formamida y 0,3μL
de marcador estándar GeneScan ROX 500TM (Applied BiosystemsTM), por reacción. Se
añaden 9,3 μL de esta mezcla y 0,7 μL de reacción de PCR en los pocillos de una placa
óptica de 96 pocillos MicroAmp® (Applied BiosystemsTM). A continuación, se incuba
durante 2 minutos a 94ºC, seguido de un choque térmico a 4ºC durante otros 5 minutos
antes de llevar la placa al secuenciador.
Tras la electroforesis capilar, se usa el programa GeneMapper (Applied BiosystemsTM),
con la opción Microsatélite default como método de análisis y GS500 como marcador
estándar. A continuación, se visualizan los electroferogramas y las tablas de cada uno
de los pacientes utilizando la herramienta: Display Plots, se exporta la tabla de datos y
se guarda para su posterior uso en el programa Coffalyser (MCR HollandTM).
Coffalyser es una macro creada para Excel (Coffalyser Home, 2007), que permite la
realización de un análisis estadístico de la mayoría de las MLPA probemix de MRC-
HollandTM, a partir de los datos importados de programas como GeneMapper o
GeneScan entre otros. Por cada proyecto realizado, se guarda un informe en formato
Excel, la gráfica Heatmap y el informe estadístico. Para el estudio se utiliza el histograma
para determinar las anomalías cromosómicas. Considerando como rango de normalidad
las ratios comprendidas entre 1,4-0,6. Así pues se valida como ganancia de dosis a
aquellas ratios superiores a 1,4, y pérdida de dosis a aquellas ratios inferiores a 0,6.
70
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. CARACTERÍSTICAS CLINICAS DE LOS PACIENTES
ESTUDIADOS
Al analizar la distribución de sexos entre el grupo de pacientes estudiados (n= 300), se
observa que hay un porcentaje mucho mayor de mujeres(n=278), un 92.67%, que de
hombres (n=22), que solo representan un 7.33% del total de pacientes estudiados. El
riesgo de desarrollar cáncer de mama a lo largo de la vida es aproximadamente una de
cada ocho mujeres. Entre las mujeres menores de 40 años es 1 cada 228; entre los 40 y
los 59 años 1 cada 24; y entre las mujeres de 60 a 79 años 1 cada 14 (Jemal A y cols.
2004). Los hombres, en una proporción muy inferior a las mujeres, también pueden
desarrollar cáncer de mama (Volgestein B y cols., 2002; Antoniou A y cols., 2003). Esta
diferente susceptibilidad entres sexos en esta patología es la que explica por tanto esta
desproporción en los pacientes objeto de este estudio.
Figura 9.- Representación gráfica de la distribución de sexos de los pacientes en el
estudio, correspondiendo un 7.33% (22/300) a varones y un 92.67% (278/300) a
mujeres.
Otro factor de riesgo para el desarrollo de cáncer de mama y de ovario son los
antecedentes familiares. Tanto en varones como en mujeres, se observa que la mayoría
de los pacientes a los que se les realiza el estudio presentan dichos antecedentes, con
familiares afectados por algún tipo de cáncer de mama u ovario. La presencia de
DISTRIBUCIÓN DE SEXOS
VARONES
MUJERES
71
antecedentes familiares aumenta también la probabilidad de que el paciente sea
portador de alguna mutación en los genes estudiados. Se observa que el porcentaje de
mujeres que presentan antecedentes familiares es mayor que en el caso de los varones.
Figura 10.- Representación gráfica de los antecedentes familiares de cáncer de mama
de los pacientes femeninos y masculinos del estudio, siendo de un 59.09% (13/22) para
los hombres y un 70.14% (195/278) para las mujeres.
Se ha observado que hay otros tipos de cánceres relacionados con mutaciones en
algunos de éstos dos genes BRCA, como son el cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer
de próstata, cáncer de colon, cáncer de páncreas…, aunque podemos observar que lo
que prevalece son los antecedentes familiares de Cáncer de Mama y Ovario (Friedenson
B, 2005; Cavanagh H y cols., 2015 ).
Figura 11.- Representación gráfica de los antecedentes familiares de otros tipos de
cáncer también relacionados con los genes BRCA respecto al total de pacientes con
antecedentes familiares de cáncer, siendo de un 12.62% (11/206) para las mujeres y
20% (3/15) para los hombres.
Antecedentes Familiares-mujeres
CON AF
SIN AF
Antecedentes Familiares-varones
CON AF
SIN AF
Antecedentes Familiares-mujeres
AF OTROC Ca
AF CaM
Antecedentes Familiares-varones
AF OTROS Ca
AF CaM
72
En cuanto a los antecedentes personales en los pacientes varones se observan tres
grupos. En primer lugar están los pacientes que acuden a consulta por presentar un
cáncer de mama, bien sea intraductal (4.5%; n=1) o ductal infiltrante (22.73%; n=5); el
segundo grupo de pacientes son los que acuden por presentar una neoplasia de próstata
(22.73%; n=5); y un tercer grupo que acude por presentar antecedentes familiares (50%;
n=11). La presencia de cáncer de mama en varones se considera un dato indicativo de
una alta probabilidad de que presente mutaciones en el gen BRCA2 (Gayther SA y cols.,
1997, Antoniou A y cols., 2003; Morgan D y cols., 2009). En el caso de la neoplasia de
próstata se solicita estudio genético de BRCA1/BRCA2 porque se ha descrito una
correlación entre la presencia de mutaciones en éstos, principalmente en BRCA2 y el
desarrollo de este tipo de cáncer (Gayther SA y cols., 1997; Cavanagh H y cols., 2015).
Figura 12.- Representación gráfica de los antecedentes personales por los que se realiza
el estudio a los pacientes varones: CDI de mama 22.73% (n=5); Ca. Intraductal 4.54%
(n=1); Neoplasia de Próstata 22.73% (n=5); Estudio Familiar 50% (n=11).
Al analizar los antecedentes personales en el caso de las mujeres, se observa que hay
gran variedad en cuanto a tipos de cáncer que presentan, pero si se considera
conjuntamente todos los tipos de cáncer de mama y ovario o la combinación de ambos
de ellos como un solo grupo, el porcentaje es del 79.85% (n= 222). Sólo un 16.19% (n=45)
de las pacientes acudieron por presentar antecedentes familiares. Dentro del grupo de
las pacientes con cáncer, los tipos de neoplasias mayoritarias son el CDI con un 35.61%
(n= 99) y el CDIS que corresponde a un 7.19% (n= 20); un segundo sería la neoplasias de
Antecedentes personales-varones
CDI mama
Ca Intraductal
Neo. Próstata
Estudio Familiar
73
ovario que representa el 12.95% (n=36); y por último sería el compuesto por pacientes
que presentan cáncer de mama y ovario simultáneamente con un 2.88% (n=8).
Figura 13.- Representación gráfica de los antecedentes personales por los cuales se les
ha realizado el estudio a las pacientes mujeres: Cáncer de mama 62.94% (n= 175);
Cáncer de Ovario 12.95% (n=36); Mama y Ovario 2.88% (n= 8); FAD 2.88% (n=8); Otros
1.08% (n= 3); Estudio Familiar16.19% (n= 45).
Si se compara con los varones se puede observar que hay un mayor porcentaje de
varones a los que se les pide el estudio molecular por antecedentes familiares (50%; n=
11/22) que en el caso de las mujeres (16.19%; n= 45/278), ya que el cáncer de mama en
estas es mucho más frecuente. Por otro lado también se puede observar que hay mucha
más variedad de tipo de cáncer con posible implicación de los genes BRCA1 y BRCA2 en
mujeres que en el caso de los varones.
En el caso de la menopausia, es otro factor de riesgo para identificar pacientes con
posible cáncer de mama hereditario, en el estudio es mucho mayor el porcentaje de
mujeres estudiadas en pre-menopausia (83.37%; n= 232) que en post-menopausia
(17.63%; n= 49) para un total de 278 mujeres. En pacientes pre-menopáusicas se
encuentra una mayor prevalencia de cánceres hereditarios provocados por alguna
mutación en alguno de los genes BRCA1/BRCA2. Por el contrario en pacientes
postmenopáusicas, la probabilidad de desarrollar un cáncer de tipo no hereditario es
mucho mayor.
Antecedentes personales-mujeres
CDI unilateralCDISCLICPICDI+CDISCDI+CLICDI+CDIS+CLICDI+CDIS+CLISCa. BilateralMama+OvarioMama+OtrosFADNeo. OvarioOtrosEstudio Familiar
74
Figura 14.- Representación gráfica de las edades a las que se diagnosticó el cáncer a las
pacientes estudiadas, correspondiendo un 82.37% (n= 232) a edad pre-menopáusica y
un 17.63% (n= 49) a edad post-menopáusica.
En el estudio IHQ (inmunohistoquímico) de los cánceres de las pacientes estudiadas se
observa que tanto para los receptores de estrógenos (RE) como para los receptores de
progesterona (RP) hay un mayor porcentaje de positivos (RE: 76,88% (n= 133) positivos;
RP: 71.09% positivos (n= 123). La detección de receptores de estrógenos y progesterona
tiene una gran importancia a la hora de seleccionar el tratamiento más adecuado, siendo
su presencia en el tumor un factor predictivo de la respuesta a la terapia endocrina. La
presencia de estos receptores hormonales relaciona con el intervalo libre de
enfermedad independientemente de la edad, menopausia, tamaño tumoral o
afectación de ganglios axilares, habiéndose demostrado que las pacientes RE positivo
tienen intervalos libres de enfermedad más prolongados (De Hollander P y cols., 2013;
Deluche E y cols., 2015).
Menopausia en pacientes con cáncer de mama para estudio genético.
PREMENOPAUSIA
POSTMENOPAUSIA
75
Figura 15.- Representación gráfica del estudio IHQ de los receptores hormonales en el
tejido mamario con afectación cancerígena. En los Receptores de Estrógenos
encontramos un 76.88% (n= 133) de positivos frente a un 23.12% (n= 40) negativos; en
el caso de los Receptores de Progesterona encontramos un 71.09% (n= 123) de los
resultados positivos frente a un 28.91% de negativos (n= 50).
En el caso del receptor Her2/neu, la mayoría de los cánceres de mama de los pacientes
del estudio eran negativos. Los casos de cáncer de mama con amplificación del gen HER2
o sobreexpresión de la proteína HER2 se denominan HER2 positivos en el informe
anatomopatológico. Los casos de cáncer de mama de receptores HER2 positivos tienden
a crecer más rápido, y es más probable que se extiendan y se vuelvan a formar, en
comparación con los casos de cáncer de mama HER2 negativos. Existen tratamientos
farmacológicos específicos para los casos de cáncer de mama de receptores HER2
positivos. El medicamento que se utiliza con más frecuencia es HerceptinTM (nombre
genérico: Trastuzumab), que se une a los receptores HER2 de las células cancerosas e
impide que estos reciban señales de crecimiento. Al bloquear estas señales, Herceptin
puede ayudar a desacelerar o incluso interrumpir el crecimiento del cáncer de mama.
Otra opción para algunas mujeres que padecen cáncer de mama de receptores HER2
positivos en estadio avanzado es TykerbTM (nombre genérico: Lapatinib), (De Hollander
P y cols., 2013; Gampenrieder SP y cols., 2013; Deluche E y cols., 2015).
R.Estrógenos
POSITIVOS
NEGATIVOS
R.Progesterona
POSITIVOS
NEGATIVOS
76
Figura 16.- Representación gráfica de los resultados obtenidos mediante el análisis
inmunohistoquímico de la sobreexpresión de receptores HER2 en tejido mamario con
afectación cancerígena. Se observa que existe un 32.10% (n= 52) de resultados positivos
y un 67.90% (n= 110) de resultados negativos en los pacientes incluidos en el estudio.
En nuestro grupo de pacientes un 15.43% (n= 25) fueron triple negativos, en su mayoría
se trata de pacientes con CDI. Con la denominación triple negativo nos referimos a
pacientes que en el estudio inmunohistoquímico son negativos para los receptores de
estrógenos, progesterona y HER2. Está descrito que alrededor del 10 al 20% de los casos
de cáncer de mama son triple negativo (Kammori M y cols., 2008). Como las hormonas
no colaboran con el crecimiento, es poco probable que el cáncer responda a las
hormonoterapias, incluyendo Tamoxifeno®, Arimidex® (nombre genérico: anastrozol),
Aromasin® (nombre genérico: exemestano), Femara® (nombre genérico: letrozol) y
Faslodex® (nombre genérico: fulvestrant). Tampoco es probable que un cáncer de mama
triple negativo responda a los medicamentos que tienen como diana al HER2, como
Herceptin® (nombre genérico: trastuzumab) o Tykerb® (nombre genérico: lapatinib),
(Pinto AE y cols., 2013).
Además, el cáncer de mama triple negativo presenta las siguientes características:
Suele ser más agresivo que otros tipos de cáncer de mama.
Las tasas de supervivencia a cinco años también suelen ser más bajas
HER2
POSITIVOS
NEGATIVOS
77
Suele ser de grado más alto que otros tipos de cáncer de mama.
Usualmente se trata de un tipo de célula denominado “basaloide”.
Figura 17.- Representación gráfica de los resultados obtenidos de las pacientes que
presentan triple negativo, que son aquellas que tanto RE, RP como HER2 presentan
resultado negativo en el análisis inmunohistoquímico correspondiente, frente a las
pacientes que presentan al menos uno de ellos positivo. Se observa que un 15.43% (n=
25) son pacientes triple negativo frente un 84.57% (n= 162) que presentan algún
resultado positivo.
Se estima que el 11% de los cánceres de mama asociados con mutaciones en BRCA1 son
triple-negativos, se diagnostican a temprana edad y son del tipo basal (Young RS y cols.,
2009). La proporción de cánceres asociados a mutaciones BRCA1, que son negativos
para los receptores de estrógenos, es inversamente proporcional a la edad de la
paciente, esto quiere decir que a medida que el cáncer se diagnostica de forma más
temprana, es más probable que los receptores estrogénicos resulten negativos. El 81%
de los cánceres BRCA1 diagnosticados en pacientes menores de 45 años son negativos
para los receptores de estrógenos, mientras que el porcentaje disminuye a 65% en
aquellos cánceres diagnosticados después de los 65 años (Foulkes WD y cols., 2004). En
contraste con la alta proporción de cánceres asociados con mutaciones en BRCA1 que
RECEPTORES
3NEGATIVO
POSITIVO
78
son negativos para los receptores de estrógenos, sólo 15% de los que son triple
negativos están asociados con mutaciones BRCA1 (Dent R y cols., 2007).
En este estudio, las pacientes a las que se le ha detectado una mutación patológica en
el gen BRCA1 (n= 10), siete presentaban cáncer de mama, todos CDI y un 70% son triples
negativas. En el caso de las pacientes a las que se les ha detectado la presencia de una
mutación patológica en el gen BRCA2 (n= 10), seis presentan cáncer de mama, y ninguna
es triple negativa, aunque hay un tres casos donde el resultado del HER2 es negativo. En
general, los cánceres asociados con mutaciones en BRCA1 son ductales infiltrantes, de
tipo basal, con un alto grado histológico, con características medulares, infiltración
linfocitaria, patrón de crecimiento sincitial y resultan ser triple negativos. Además se
asocian con un comportamiento más agresivo y tienen un peor pronóstico. Esta es la
razón por la cual los cánceres de mama que se diagnostican a temprana edad tienen la
indicación de realizárseles una prueba genética, mientras que los relacionados al BRCA2
parecen no diferir de los cánceres de origen no hereditario (Petrucelli N y cols., 2005).
En resumen, el fenotipo de los cánceres asociados con las mutaciones del BRCA1 se
caracterizan por lo siguiente (Foulkes WD y cols., 2004):
Receptores de estrógenos negativos 75%, que coincide con este estudio, ya que
un 75% de las pacientes con mutación patológica en BRCA1 con cáncer de
mama presentan los RE negativos.
Expresión del Her2/Neu negativa 95%, en este estudio el resultado de HER2
negativos también es del 75%.
La presencia de carcinoma in situ es rara, en este estudio solamente en uno de
los casos con Mutación Patológica en BRCA1 y cáncer de mama presenta
conjuntamente un diagnóstico de CDI junto con CDIS.
Y el fenotipo de los cánceres asociados con las mutaciones del BRCA2 por lo siguiente
(Foulkes WD y cols., 2004):
79
Receptores de estrógeno positivo 75%, en este estudio, las pacientes con
mutación patológica en BRCA2 y cáncer de mama son en un 100% de los casos
RE positivos.
Expresión del Her2/Neu negativa 95%, en este estudio el resultado de HER2
negativos es del 67% de las pacientes.
La presencia conjunta de carcinoma in situ es común, en este estudio se
encuentra en una de las pacientes.
5.2. ANÁLISIS DE GRANDES DELECIONES Y REORDENAMIENTOS
DE LOS GENES BRCA1/BRCA2 MEDIANTE TÉCNICA DE MLPA
Se ha realizado un estudio piloto por MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe
Amplification) de 164 pacientes incluidos con el objetivo de determinar si presentan
deleciones o duplicaciones que provoquen un cambio en la dosis génica alterando la
función de los genes BRCA. El estudio por MLPA solamente se realiza a estos pacientes
porque se trata de un estudio piloto mediante el cual no se ha encontrado ningún
paciente positivo para ella y la baja incidencia de este tipo de alteraciones mostrada en
otras publicaciones nos conduce a finalizar el análisis, aunque podría realizarse para
complementar el estudio mutacional.
Para llevar a cabo el análisis de los pacientes mediante esta técnica, se han utilizado los
kits comerciales SALSA MLPA P002BRCA1 Probemix (MRC HollandTM) para el gen BRCA1,
y SALSA MLPA P045BRCA2/CHEK Probemix (MRC HollandTM) para el gen BRCA2. Las
sondas que lleva el kit para el gen BRCA1 son para los exones 1a, 1b, 2, 3, y del 5 al 24
con dos pares de sondas para el exón 11 y el 13 junto con sondas control. Para el BRCA2,
las sondas incluidas en el kit son para los exones del 1 al 27 con dos sondas para el exón
1, 3, 11 y 13, junto con sondas control.
En este estudio mediante esta técnica realizada a los 164 pacientes, no se ha encontrado
ningún paciente con duplicaciones, deleciones o reordenamientos que modifiquen la
dosis génica de BRCA1 o BRCA2. En un trabajo publicado en Asturias, se detectaban
mediante la misma técnica que un 1,17% de las pacientes analizadas (n=256)
80
presentaban alteraciones en la dosis génica del BRCA1 (Blay P y cols., 2013). En otro
estudio realizado en población alemana se detectaron reordenamientos mediante MLPA
en un 2.1% de las pacientes analizadas también en el gen BRCA1 (n=1506), (Engert S y
cols., 2008). Dada la baja incidencia publicada, la no detección en nuestro caso se podría
explicar por no haber alcanzado aún un tamaño muestral suficiente, aunque la incidencia
de estas es muy baja en la población en general como se demuestra en otros estudios
(Engert S y cols., 2008; Blay P y cols., 2013).
Tabla 3.- Representación numérica de los ratios obtenidos para el estudio mediante
MLPA del gen BRCA1 de 7 pacientes para las distintas sondas del kit SALSA MLPA
P002BRCA1 Probemix (MRC HollandTM).
81
Figura 18.- Diagrama de barras en el que se representa el ratio de dosis génica de un
paciente para cada sonda del kit SALSA MLPA P045BRCA2/CHEK Probemix (MRC
HollandTM). Se observa que el valor de la dosis génica está alrededor de 1 por lo tanto se
considera un paciente normal.
5.3. ANÁLISIS DE SECUENCIAS
El análisis mediante la técnica de Next Generation Secuencing (NGS) de los pacientes de
estudio de los genes BRCA1 y BRCA2 y posterior confirmación por el método de Sanger
ha permitido la determinación de mutaciones en ambos genes.
En cuanto a los cambios en la secuencia de nucleótidos de los genes BRCA1 y BRCA2 se
han encontrado todos los tipos de mutaciones (ver Figura 19): polimorfismos en los
que el cambio de un nucleótido no afectaba a su traducción en la proteína (mutaciones
sinónimas); mutaciones de un nucleótido que cambiaban la codificación de un
aminoácido en la cadena proteica (mutaciones missense); mutaciones que introducían
un codón de parada originando una proteína truncada (mutaciones nonsense);
pequeñas deleciones o inserciones; o mutaciones localizados en las zonas intrónicas
que pueden afectar al proceso de maduración o splicing del ARNm. Todas estas
mutaciones tendrán un carácter patológico o no dependiendo de cómo afectan a la
funcionalidad de la proteína BRCA1 y BRCA2. En el caso de las mutaciones missense y
nonsense, en el análisis de las secuencia en el eletroferograma, se observa del mismo
modo, un doble pico correspondiente a un cambio de nucleótido en una posición en
concreto que provoca un cambio de aminoácido, como sucede en la missense o la
00,20,40,60,8
11,2
13-0
31.6
FRY
13-0
31.8
…13
-031
.8…
13-0
31.8
…13
-031
.8…
13-0
31.8
…13
-031
.8…
13-0
31.8
…13
-031
.8…
13-0
31.8
…13
-031
.8…
13-0
31.8
…13
-031
.8…
13-0
31.8
…13
-031
.8…
13-0
31.8
…13
-031
.9…
22-0
27.5
HCS
20 c c c c
Series2
82
aparición en esa posición debido al cambio nucleotídica de un stop codón prematuro,
lo que sucede en la nonsense, que produce una interrupción en la síntesis de la
proteína y por lo tanto una proteína truncada sin sentido. Lo mismo sucede entre las
deleciones e inserciones, que en análisis de imagen en el eletroferograma, se observa a
partir del punto donde se produce el cambio una doble secuencia, pero el concepto es
distinto, en la deleción en una de las cadenas de ADN se escinden un número concreto
de nucleótidos, mientras que en la inserción se insertan.
(a) Mutación sinónima: p.e. en el paciente 58 de los 300 pacientes se encuentra la
mutación p.Ser1436Ser con cambio de nucleótido Timina por una Citosina.
(b) Mutación missense: p.e. en el paciente 14 de los 300 pacientes se encuentra la
mutación p.Gln356Arg con cambio de nucleótido Adenina por Guanina. La imagen del
electroferograma es la misma cuando es una nonsense.
(c) Deleción: p.e. en el paciente 18 de los 300 paciente donde se observa la escisión de
5 nucleótidos en el exón 23 del gen BRCA2 (p.Tyr3009_His3010fsTer6), recogida como
83
patológica en BIC, se observa a modo de doble secuencia a partir del punto de la
deleción. La imagen del electroferograma es la misma cuando es una inserción.
Figura 19.- Ejemplos de distintas mutaciones encontradas en el estudio. (a) Mutación
sinónima; (b) mutación missense o nonsense; (c) deleción o inserción.
Las mutaciones encontradas se han clasificado en cuatro grupos atendiendo a su valor
clínico: Variantes sin significado clínico o Variantes de significado clínico desconocido
(VSCD); Mutaciones patológicas (MP); y Mutaciones nuevas o no descritas (MND). Para
poder llevar a cabo esta clasificación se ha utilizado como referencia la base de datos
BIC (Breast Cancer Information Core), ClinVar y la base de datos HGMD. En el caso de
las mutaciones nuevas o no descritas, se han utilizado programas de simulación
mediante los cuales se realiza una estimación de la afectación del cambio a la
funcionalidad proteica y por tanto hace una estimación de la implicación patológica de
dicha mutación en base a las características aminoacídicas de la sustitución y dichos
programas son Polyphen v2.0 y Mutation Taster.
En las tablas del ANEXO II se recogen las distintas mutaciones encontradas en el estudio
y la agrupación se distribuye en dichas tablas en función de su clasificación como
Variantes Benignas o variantes sin significado clínico (VB), variantes de significado clínico
desconocido (VSCD), mutaciones patológicas (MP) o mutaciones no descritas o nuevas
(MND) para cada uno de los genes BRCA1 y BRCA2 por separado.
Para todas las mutaciones encontradas en esta población se ha calculado tanto la
prevalencia poblacional como la prevalencia alélica. El valor de la prevalencia alélica
debería ser la mitad que el de la poblacional, ya que en la primera, para realizar el cálculo
se cuentan todos los individuos de la población y en la segunda se tiene en cuenta que
cada individuo es poseedor de dos alelos para cada gen. Lo que sucede es que en
ocasiones se va a poder observar que la prevalencia alélica es mayor que la poblacional
y esto es debido a que se encuentran individuos homocigotos para un cambio, de modo
que el cambio lo encontramos en ambos alélos. Este hecho se observa principalmente
en las mutaciones sin significado clínico, ya que el cambio no es deletéreo para el
paciente y puede poseerlo en homocigosis.
84
En el caso del BRCA1, se observa que en las variantes sin significado clínico presentan
una prevalencia poblacional de 372.64% y la alélica es de 221.54%, estos resultados
mayores que cien son debidos a que cada paciente puede poseer más de un cambio de
este tipo. De éstas mutaciones se puede observar que las más prevalentes son la S1613G,
la S1436S, la P871L y la E1038G, la primera con una prevalencia poblacional de 56.58%
y las otras tres con una prevalencia poblacional sobre 52%, pero al observar la
prevalencia alélica se observa que es de 34.54% para la primera y entre un 30-32% para
las otras tres, de modo que se puede determinar que se encuentran más homocigotos
para la primera mutación. En el caso de variantes de significado clínico incierto se
observa que en general la prevalencia poblacional es de 31.17% mientras que la alélica
es de 12.96%. De este grupo de mutaciones la más prevalente es la Q356R con una
prevalencia poblacional del 12.76% y una prevalencia alélica 6.38%. Si se analizan las
mutaciones patológicas encontradas en la población las prevalencias, en general es de
2.93% para la poblacional y 1.5% para la alélica. En este gen han sido 7 las mutaciones
encontradas de este tipo, en el exón 2 la c.66_67delAG, en el exón 11 la
c.2866_2870delTCTCA, la c.4035_4035delA y la c.4065_4068delTCAA, en el exón 13 la
c.4307_4308delCT y finalmente en el exón 18 la p.Arg1699Trp y la p.Ala1708Glu. En
otros estudios se ha encontrado que la mutación más prevalente también es la
c.66_67delAG (Cardeñosa E. y cols., 2008). La siguiente mutación con mayor prevalencia
es la c.4307_4308delCT, la cual en este estudio presenta una prevalencia de 0.41%
mientras que en otros estudios es de un 1.28% (De Juan I y cols., 2013), la diferencia que
encontramos puede ser debida al tamaño poblacional del estudio. En el caso de las
mutaciones nuevas se observa que la prevalencia de estas mutaciones en la población
es 9.19% para la poblacional y 4.61% para la alélica, pero de todas las mutaciones, la más
prevalente es la p.Met751Lys con una prevalencia poblacional de 3.14% y una
prevalencia alélica de 1.57%.
En el caso del gen BRCA2, se observa que las variantes sin significado clínico presentan
una prevalencia poblacional de 498.39% y una prevalencia alélica de 367.51%, de modo
que también se observa que la prevalencia alélica no es la mitad que la poblacional,
debido a los pacientes que son homocigotos para algunas de las mutaciones. La
mutación de este tipo encontrada en la población con mayor prevalencia es la A2466V
85
con una prevalencia poblacional i alélica de 97.37%, de modo que en este caso todos los
pacientes a los que se les ha encontrado la mutación la presentan en homocigosis, y la
p.Lys1521= con una prevalencia poblacional de 75.17% y una prevalencia alélica de
72.24%. En el caso de las variantes de significado clínico incierto se observa que la
prevalencia poblacional general para este gen es de 18.08% y la alélica es de 9.03%. La
mutación con mayor prevalencia en la población de este tipo es la p.Arg2034Cys con una
prevalencia poblacional de 4.17% y alélica de 2.08%. Para las mutaciones patológicas se
observa en general una prevalencia poblacional de 3.91% y la prevalencia alélica es de
1.93%, siendo las más prevalentes la deleción c.9026_9030del5 ATCAT (o 9254del5) con
una prevalencia poblacional de 1.39% y una prevalencia alélica de 0.69%, y la mutación
p.Arg3128Ter con una prevalencia poblacional de 0.77% y una alélica de 0.39%. Estas
son las mutaciones patológicas más prevalentes en nuestra población, resultado que
concuerda con el obtenido en otros estudios realizados en población española (Diez O y
cols., 2010). En el caso de mutaciones nuevas encontramos que la prevalencia
poblacional es de 12.62% mientras que la alélica es de 6.31% en general, siendo la más
prevalente la p.Ala483= con una prevalencia poblacional de 3.64 y 1.82% de prevalencia
alélica.
De estos resultados se puede determinar que en el caso de las variantes sin significado
clínico se observa una elevada presencia de mutaciones en ambos genes en la población
estudiada. En el caso de las variantes de significado clínico incierto se observa que hay
un mayor prevalencia en el gen BRCA1 que en el gen BRCA2. En el caso de las mutaciones
patológicas se observa una clara diferencia entre ambos genes siendo el BRCA2 más
prevalente, dato que se observa en diferentes estudios en población española (Diez O y
cols., 2010; De Juan I y cols., 2013). Las mutaciones patológicas que se ha detectado con
mayor frecuencia han sido la deleción c.9026_9030del5ATCAT del gen BRCA2 que se ha
encontrado en 5 pacientes y la p.Arg3128Ter que se ha detectado en 2 pacientes. En el
caso de las mutaciones nuevas se observa que en ambos genes se detectan gran
variedad de cambios que no están descritos, pero que sería de interés estudiar para
determinar su implicación en el desarrollo del cáncer de mama/ovario hereditario en
nuestra población.
86
5.4. PACIENTES DETECTADOS CON MUTACIONES PATOLÓGICAS.
Se ha encontrado un total de 18 pacientes a los que se les ha detectado una mutación
patológica, de los cuales solamente uno es un varón de 66 años que fue remitido para
la realización del estudio por ser poseedor de antecedentes familiares y presentar un
hermano con la misma mutación. Las otros 17 son mujeres con una media de edad de
43.12 ± 6.36 años y con un rango de 28 a 76 años.
Del total de las 17 pacientes con mutación patológica, dos de ellas presentaron un CDI
y otra un CDIS + un CDI en la mama derecha, las tres con resultados triple negativos;
otras tres presentaron CDI cuyos resultados IHQ fueron positivo para receptores
hormonales y negativo para el Her2; otras pacientes presentaron CDI, CDIS o cáncer de
mama bilateral con resultados positivos tanto para receptores hormonales como para
Her2; cinco de las pacientes presentaron neoplasia de ovario, siendo en uno de los casos
bilateral; y finalmente se encontraron mutaciones patológicas en dos pacientes que
fueron remitidas por FAD y estudio familiar. Del total de pacientes con mutaciones
patológicas, un 61.11% presentaron mutaciones en el gen BRCA2 mientras que un
38.89% las presentaron en el gen BRCA1.
Paciente 1: Mujer de 42 años de edad remitida por el Servicio de Oncología a la Unidad
de Riesgo Familiar de Cáncer de mama del Hospital Universitario de la Ribera. Acude a
urgencias por dolor en el hipogastrio donde se le detectó por radiografía una tumoración
abdominal y fue remitida para valoración ginecológica. Se le solicitó una Ecografía
abdominal y posterior TAC de pelvis sin contraste y TAC abdomino-pélvico con contraste
mediante las cuales se observó la presencia de masas ováricas bilaterales concordantes
con neoplasia bilateral, sin evidencia metabólica de carcinomatosis peritoneal ni
afectación adenopática retroperitoneal. Además se observó en la analítica un resultado
positivo para el marcador Ca125 (>35U/ml). El diagnóstico final fue cáncer de ovario
bilateral. La paciente se sometió a una Salpingooferectamía bilateral. En cuanto a los
antecedentes personales tuvo la menarquía a los 11 años, 1º hijo a los 23 años, después
de 3 hijos se realizó ligadura de trompas por laparoscopia. La historia familiar de cáncer
que presentó era: padre con cáncer de pulmón, madre con cáncer de ovario pre-
87
menopausia, una hermana con cáncer de ovario pre-menopausia a los 47 años, otra
hermana con CDI de mama izquierda pre-menopausia a los 41 años y tía materna con
bultoma de mama. El árbol genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia
de ésta paciente se puede observar en la figura 20 del ANEXO III.
La mutación que se detectó a esta paciente fue una deleción de dos nucleótidos
correspondientes a Alanina y Guanina en la posición 66 (c.66_67delAG) en el exón 2 del
gen BRCA1. Esta mutación provoca la síntesis de una proteína truncada con pérdida de
función y por lo tanto tiene un carácter patológico con un incremento en el riesgo de
desarrollar cáncer de mama y ovario hereditario. Se solicita una ampliación del estudio
a sus familiares.
Paciente 2: Mujer de 28 años de edad que fue remitida por el Servicio de Oncología a la
Unidad de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera.
Las pruebas realizadas para el estudio de la paciente fueron ecografía de mama, biopsia
por escisión y posterior intervención para la resección del CSE de la mama derecha (MD).
A esta paciente se le diagnosticó un CDI de MD con extensión a márgenes de resección.
El estudio inmunohistoquímico (IHQ) demostró que era un caso de triple negativo para
receptores hormonales (RE y RP) y Her2. En cuanto a los antecedentes personales tuvo
la menarquía a los 11 años de edad y era nuligesta. Los antecedentes familiares que
presentó la paciente por cáncer era hermana con cáncer de estómago a los 37 años.
La mutación que se le detectó a esta paciente fue una deleción de AG en el exón 2 del
gen BRCA1 en la posición 66 (c.66_67delAG), produciendo una pauta de lectura
incorrecta y por lo tanto una proteína BRCA1 truncada, de modo que se describe en BIC
como patológica.
Paciente 3: Mujer de 49 años de edad fue remitida por el Servicio de Oncología a la
Unidad de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera.
Se practicó una ecografía abdominal junto con una citología del líquido peritoneal cuyo
resultado dio negativo para células malignas pero el Ca125 fue elevado (1203 U/ml).
Presentaba un adenocarcinoma seroso pobremente diferenciado ovárico bilateral con
una extensión al epiplón, mesenterio, capa serosa uterina y apendicular. Se sometió a
la paciente a una laparotomía, histerectomía, una doble anexectomía, se realizó una
88
resección peritoneo-parietal y visceral, linfadenectomía pélvica bilateral y para-aórtica.
También se llevó a cabo una resección de la cúpula, una resección del peritoneo parietal.
En cuanto a los antecedentes personales de la paciente tuvo la menarquia a los 14 años
y 1º hijo a los 27 años y menopausia a los 38 años. Los antecedentes familiares que
presentó la paciente fueron su madre con cáncer de mama pre-menopáusico a los 45
años de edad, tía materna cáncer de mama pre-menopausia a los 45 años y una familiar
de primer grado con cáncer de ovario a los 37 años. Otros antecedentes de cáncer en la
familia fueron un hermano con cáncer gástrico y el abuelo materno también con cáncer
gástrico. El árbol genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta
paciente se puede observar en la figura 21 del ANEXO III.
La mutación que se le encontró a esta paciente fue una deleción de 5 nucleótidos en la
posición 2866 (c.2866_2870delTCTCAdel5) en el exón 11.8 del gen BRCA1 y esta
deleción provoca una proteína BRCA1 truncada no funcional debido a la incorporación
de un stop codón prematuro. Mutación descrita en BIC como patológica.
Figura 22.- Electroferograma de la secuencia de nucleótidos de una deleción de 5
nucleótidos en la posición 2806 (c.2806__2870delTCTCAdel5), descrita en la base de
datos BIC como patológica.
Paciente 4: Mujer de 44 años fue remitida por el médico de atención primaria a la
Unidad de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera
por notarse un bulto en el CSI de la MD. Las pruebas realizadas a la paciente fueron
mamografía, ecografía, biopsia de mama ecoguiada (BAG) y una inyección de marcador
de hidrogel, además de una resección del cuadrante afecto de la mama. En la resonancia
magnética se ven imágenes sugestivas de neoplasia de mama sin infiltración
metastásica. A esta paciente se le diagnosticó un CDI de la MD. En el estudio IHQ de los
receptores hormonales así como del Her2, la determinación fue positiva, obteniéndose
89
un resultado de RE 80%, RP 80% y Her2:+++. En cuanto a los antecedentes personales,
la paciente tuvo la menarquía a los 13 años y dio a luz a su primer hijo a los 34 años. Los
antecedentes familiares que presentaba era una hermana pre-menopáusica con CDI +
CDIS de mama izquierda a los 38 años, madre con cáncer de mama y padre con neoplasia
de próstata. El árbol genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta
paciente se puede observar en la figura 23 del ANEXO III.
La mutación que se le detectó a esta paciente fue una deleción de 4 nucleótidos TCAA
en la posición 4065 (c.4065_4068delTCAA) en el exón 11 del gen BRCA1. Está deleción
produce un cambio en la pauta de lectura introduciendo un stop codón prematuro a los
10 nucleótidos provocando una interrupción en la síntesis de la proteína y dando lugar
a una proteína truncada con una alteración en su funcionalidad. En la base de datos BIC
se describe como una mutación patológica.
Paciente 5: Mujer de 38 años remitida por el Servicio de Oncología a la Unidad de Riesgo
Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera. Las pruebas
realizadas a la paciente para su diagnóstico fueron ecografía mamaria, mamografía y
resonancia magnética. El diagnóstico de la paciente fue CDI en la MD bien diferenciado
con extensión axilar. A esta paciente se le realizó una mastectomía radical bilateral y
tratamiento con quimioterapia y Taxotere. Posteriormente se le realizó una
ooferectomía profiláctica y una reconstrucción mamaria bilateral. En cuanto a los
antecedentes personales, la paciente tuvo la menarquía a los 13 años y dio a luz a su
primer hijo a los 27. Los antecedentes familiares de cáncer que presentó fueron la de
una tía materna con cáncer de mama pre-menopausia a los 35 años, abuela materna
con posible cáncer de ovario, otra tía materna con posible cáncer de ovario y madre con
CDIS. El árbol genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta
paciente se puede observar en la figura 24 del ANEXO III.
La mutación que se le detectó a esta paciente fue una deleción de 2 nucleótidos CT en
la posición 4307 (c.4307_4308delCT), en el exón 13 del gen BRCA1 produciendo una
pauta de lectura incorrecta y por lo tanto una proteína disfuncional. Ésta también tiene
un carácter patológico según la base de datos BIC.
90
Figura 25.- Cromatrograma de la secuencia de nucleótidos donde se observa la deleción
de los nucleótidos CT en la posición 4307 (c.4307_4308delCT), descrita en la base de
datos BIC como mutación patológica y por lo tanto con implicación en el desarrollo de
cáncer de mama/ovario hereditario.
Paciente 6: Mujer de 50 años de edad remitida por el Servicio de Oncología a la Unidad
de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera. Se le
realizó una ecografía vaginal mediante la cual se pudo observar un gran mioma
intramural. Mediante resonancia magnética se determinó que la paciente presentaba
masas complejas con lóculos quísticos de contenido líquido con pequeño nivel hemático
y se determinó que radiológicamente se trataba de un tumor probablemente de origen
ovárico sólido-quística, uni o bilateral (cistoadenoma-carcinoma). Fue diagnosticada de
una neoplasia de ovario. En cuanto a los antecedentes familiares que presentó la
paciente fueron su madre fallecida probablemente por una neoplasia de ovario hace 30
años y su hermana que falleció por neoplasia de mama hace 25 años. El árbol
genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta paciente se puede
observar en la figura 26 del ANEXO III.
La mutación detectada fue un cambio de aminoácido de Arginina (R) por Triptófano (W)
en el codón 1699 (p.Arg1699Trp) en el exón 18 del gen BRCA1 descrita previamente
como patológica en BIC.
91
Figura 27.- Electroferograma de la secuencia de nucleótidos de una mutación puntual
donde se produce un cambio del aminoácido R por una W (p.Arg1699Trp) localizada en
el exón 18 del gen BRCA1.
Paciente 7: Mujer de 37 años de edad remitida de la Unidad de Planificación Familiar a
la Unidad de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera
para realizar valoración de Historia familiar y seguimiento. Se le realizaron exploraciones
ecográficas anuales donde no se observaron nódulos dominantes ni áreas de mala
transmisión acústica en el seno del parénquima glandular. En 2011 y 2012 se realizó una
RM bilateral con contraste con secuencias dinámicas sin alteraciones significativas y con
una captación glandular difusa. En el 2013 se realizó una mamografía bilateral y
tomosíntesis donde no se observaron nódulos dominantes, microcalcificaciones
sospechosas y distorsiones en la arquitectura glandular. En 2015, cuando la paciente
tenia 41 años, se realizó una nueva RM bilateral con contraste mediante la cual se
identificó una área de captación no masa en CIE MD BIRADS 5 sugestiva de CDIS con un
pequeño foco de CDI y por tanto se remite a la paciente para completar el estudio
mediante la realización de ecografía de mama, biopsia ecodirigida e inyección de clip.
Finalemente se le diagnosticó un CDI con predominio de componente intraductal y CIS
de alto grado, multifocal alcanzando el borde inferior de reseccion de la mama derecha.
En el estudio IHQ que se realizó a partir del tejido biopsida se observaron que los
receptores hormonales (RE y RP) y el Her2 eran negativos. Por lo tanto se trataba de una
paciente triple negativa. En cuanto a los antecedentes personales, esta paciente tuvo la
menarquía a los 11 años y el primer hijo a los 30 años. Los Antecedentes Familiares que
presentó eran su madre con CaM pre-menopausia a los 32 años fallecida, tia materna
cáncer de mama post-menopausia a los 78 años, dos tias abuelas con cáncer de mama
una pre-menopausia a los 45 años y otra post-menopausica a los 57 años. El árbol
92
genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta paciente se puede
observar en la figura 28 del ANEXO III.
En esta paciente la mutación encontrada fue un cambio de un nucleótido citosina a una
adenina en la posición 5123 (c.5123C>A) que provoca un cambio de aminoácido Alanina
a Glutamina en el codón 1708 (p.Ala1708Glu) en el exón 18 del gen BRCA1. Dicho cambio
de aminoácido induce un cambio en la estructura de la proteina provocando un mal
funcionamiento de ésta. Esta mutación está descrita en BIC como patológica.
Paciente 8: Mujer de 34 años remitida desde el Servicio de Cirujía Plástica a la Unidad
de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera. La
paciente llevaba prótesis mamaria PIP y sufrió una rotura de la prótesis izquierda y
sustitución. Se detectó por palpación un bulto y se solicitó una ecografia mediante la
cuál se detectó un nódulo correspondiente con FAD situado en CSE MI y se solicitaron
controles ecográficos. A los 6 meses se realizó la siguiente ecografía de mama bilateral
junto con mamografía y tomosintesis. Se observó que el nódulo había aumentado de
tamaño, y se asociaron microcalcificaciones en su interior y contornos mal definidos, por
lo tanto se estableció que se trataba de un BIRADS 5. En la misma mama se observó otro
nódulo, hipoecoico mejor definido, no descrito en la ecografía previa. Mediante la
mamografía se confirma la presencia de microcalcificaciones pleomórficas y siliconomas
en la axila sin evidenciar adenopatías de aspecto neoplásico. Se citó para realizar una
biopsia ecodirigida de ambas lesiones y se obtuvo un fragmento. Finalmente el
diagnóstico que se realizó fue CDI de mama izquierda. En el estudio IHQ se determinaron
los receptores hormonales y el Her2 cuyos resultados obtenidos fueron: RE 40%; RP
100%; y Her2 -. Se realizó una RM bilateral con contraste. Se realizó una mastectomia
radical modificada y eliminación de las protesis. Se le proporcionó un trataminto con
Tamoxifeno durante 5 años. En cuanto a los antecedentes personales, esta paciente
tuvo la menarquia a los 14 años y era nuligesta. No presentaba antecedenetes familiares
de cáncer, pero tras la detección de la mutación se le realiza el estudio a sus 5 hermanos
y se observó que 3 de ellos también eran portadores de la mutación. El árbol genealógico
correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta paciente se puede observar en
la figura 29 del ANEXO III.
93
La mutación encontrada en esta paciente fue una inserción del nucleótido Timina en la
posición 3263 (c.3263_3264insT) en el exón 11 del gen BRCA2, que provoca un cambio
en la pauta de lectura introduciendo un stop codon prematuro a los 10 nucleótidos, de
modo que al traducirse a proteina va a provocar la aparición de una proteina BRCA2
truncada y con perdida de función. Mutación descrita en BIC como patológica.
Paciente 9: Mujer de 32 años remitida por su médico de Atención Primaria a la Unidad
de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera por
palpación de bulto en mama derecha y por su historia familiar de cáncer de mama para
estudio y valoración. Se realizó estudio ecográfico mediante el cual se observó que se
trataba de un FAD. En cuanto a los antecedentes personales, la paciente tuvo la
menarquía a los 11 años y era nuligesta. Los antecedentes familiares que presentaba de
Cáncer era madre afecta de neoplásia de mama pre-menopausia a los 28 años, abuela
materna cáncer de mama/cerebral pre-menopausia antes de los 50 años, tia abuela
cáncer de tiroides.
La mutación que se encontró en esta paciente era una deleción del nucleótido Citosina
en la posicón 5120 (c.5120_5121delC) en el exón 11 del gen BRCA2. Dicha deleción
introduce un cambio en la pauta de lectura introduciendo un stop codon prematuro a
los 5 nucleótidos, de modo que al traducirse la proteina, va a obtenerse una proteina
BRCA2 truncada y con perdida de fucnionalidad. Esta mutación se decribe en BIC como
patológica.
Paciente 10: Varón de 66 años de edad remitido desde el Servicio de Oncología a la
Unidad de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera.
Este paciente fue remitido para consejo genético por antecedentes familiares de
neoplasias de colon, páncreas, mama y próstata. Los antecedentes familiares que
presentó este paciente fueron su madre con cáncer de vesícula a los 74 años, un
hermano con un tumor pélvico a los 66 años, un hermano con cáncer de próstata a los
60 años, un sobrino con cáncer de páncreas a los 44 años y una sobrina fallecida por
cáncer de mama pre-menopausia a los 21 años de edad. El árbol genealógico
correspondiente al estudio familiar de la familia de ésta paciente se puede observar en
la figura 30 del ANEXO III.
94
En este paciente se detectó la mutación c.5722_5723delCTCT en el exón 11 del gen
BRCA2 que se trata de una deleción de 4 nucleótidos que provocan un cambio en la
pauta de lectura y por tanto la obtención de una proteína BRCA2 truncada. Descrita
también como patológica en BIC.
Paciente 11: Mujer de 34 años de edad remitida por el Servicio de Ginecología a la
Unidad de Riesgo Familiar de Cáncer de mama del Hospital Universitario de la Ribera. Se
le diagnosticó mediante ecografía un adenocarcinoma endometrioide moderadamente
diferenciado ovárico y al análisis bioquímico resultó positivo para el marcador tumoral
Ca125 (>35U/ml). La paciente se sometió a una ooferectomia. En cuanto a los
antecedentes personales, tuvo la menarquía a los 11 años y era una paciente nuligesta.
La historia familiar de cáncer que presentó era la de su padre fallecido por cáncer de
pulmón.
La mutación que se detectó en esta paciente fue una inserción de un nucleótido
correspondiente a una Guanina en la posición 6024 (c.6024_6025insG) en el exón 11 del
gen BRCA2. Esta mutación provoca la síntesis de una proteína truncada con pérdida de
función y por lo tanto tiene un carácter patológico con un incremento en el riesgo de
desarrollar cáncer de mama hereditario. Al detectarse la mutación, la paciente se
sometió a una mastectomía profiláctica bilateral con reconstrucción inmediata.
Figura 9.- Electroferograma de la secuencia de nucleótidos donde se observa la inserción
de una G en la posición 6024(c.6024_6025insG), descrita en la base de datos BIC como
patológica y por lo tanto con implicación en el desarrollo de cáncer de mama hereditario.
95
Paciente 12: Mujer de 59 años remitida desde atención primaria a la Unidad de Riesgo
Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera por palpación del
nódulo en mama izquierda de 3 meses de evolución sin secreción por el pezón. Se le
realizó una mamografía con tomosíntesis y ecografía de mama mediante las cuales se
observó un nódulo en la mama izquierda correspondiente a BIRADS 5 y dos adenopatías
en la axila izquierda con morfología redondeada sugestivas de metástasis. Se le
recomendó realizar una biopsia guiada ecográficamente y una RM de mama bilateral con
contraste. Se le diagnosticó un CDI de mama izquierda. En el estudio IHQ del tejido
biopsiado se determinó que lo receptores hormonales y el Her2 eran positivos: RE100%,
RP10%, Her2+++. Se le proporcionó quimioterapia neoadyuvante a lo que respondió
bien. Se le realizó una mastectomía radical modificada de la mama izquierda y posterior
radioterapia. En cuanto a los antecedentes personales, esta paciente tuvo la menarquia
a los 14 años y el primer hijo a los 25 años sin lactancia materna. Los antecedentes
familiares de cáncer que presentó la paciente fueron padre con cáncer de colon, madre
con cáncer oral, hermano con cáncer de mama, dos tías maternas cáncer de mama y dos
sobrinas maternas con cáncer de mama pre-menopausia a los 35 años y post-
menopausia a los 58 años.
La mutación encontrada en esta paciente fue una deleción de 14 nucleótidos en la
posición 8976 (c.8976_8989delATCATCAGATTTAT) en el exón 23 del gen BRCA2
produciendo un cambio en la pauta de lectura y por tanto la introducción de un stop
codón prematuro que en la traducción de la proteína cesará la incorporación de los
aminoácidos correspondientes produciéndose una proteína BRCA2 truncada
disfuncional. La mutación se describe en BIC como patológica.
Paciente 13: Mujer de 42 años de edad remitida por el Servicio de Oncología a la Unidad
de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera. Las
pruebas realizadas para el estudio de la paciente fueron ecografía y biopsia con arpón
sobre las microcalcificaciones y se determinó que la paciente presentaba un carcinoma
intraductal in situ (CIIS). El seguimiento médico que siguió esta paciente fue la
realización de tratamiento con radioterapia y Tamoxifeno previamente a la operación.
Se observó que posteriormente al tratamiento tanto la mama derecha, la mama
96
izquierda como las axilas se encontraban libres de adenopatías. También se le realizó un
seguimiento a la paciente mediante mamografía bilateral. En cuanto a los antecedentes
personales, la paciente tuvo la menarquía a los 13 años de edad y el primer hijo a los 24
años. Los antecedentes familiares de cáncer de mama que presentó esta paciente fue el
de su madre con cáncer de mama pre-menopausia y su hermana con cáncer de mama
pre-menopausia. El árbol genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia
de ésta paciente se puede observar en la figura 31 del ANEXO III.
La mutación que se detectó en esta apaciente fue una deleción de 5 nucleótidos
(c.9026_9030delATCAT) en el exón 23 del gen BRCA2, descrita como patológica en BIC
como se ha comentado anteriormente.
Paciente 14: Mujer de 77 años de edad remitida por el Servicio de Oncología a la Unidad
de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera. La
paciente acudió a la consulta por un sangrado postmenopáusico y se le practicó un TAC
abdomino-pélvico con contraste y una analítica para marcadores tumorales. En el TAC
se apreciaba una gran masa pélvica sólida y lobulada con una porción quística posterior,
también un lóbulo líquido que desplazaba hacia la derecha el recto. También se
observaron dos nódulos en la reflexión peritoneal de 1 ,2 y 3 cm sugestivos de implantes
tumorales. No se identificaron lesiones en el marco óseo que sugirieran enfermedad
metastásica. En el caso de los marcadores solicitados presentó el Ca125 un poco por
encima del rango normal (56 U/ml). Por lo tanto se le diagnosticó a la paciente un
carcinoma indiferenciado de ovario izquierdo con extensión a la capa serosa uterina. Se
realizó una laparotomía y una resección del muñón rectal junto con una posterior
quimioterapia. En cuanto a los antecedentes familiares que presentaba la paciente
fueron: madre con neoplasia de mama a los 63 años, una hermana con neoplasia de
mama + endometrio post-menopausia a los 52 años y otra sobrina con neoplasia de
mama pre-menopausia a los 50 años. Era una paciente con 5 hijos y menopáusica desde
los 50 años de edad.
La mutación que se detectó fue una deleción de 5 nucleótidos en el exón 23 del gen
BRCA2 (c.9026_9030delATCAT) ya descrita anteriormente. Descrita como patológica en
BIC.
97
Paciente 15: Mujer de 45 años de edad remitida por el Servicio de Ginecología a la
Unidad de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera.
En primer lugar en la exploración física de la paciente se palparon mamas nodulares
destacando un nódulo para-areolar en la mama derecha doloroso por lo cual se le
solicitó a la paciente una mamografía y una ecografía mamaria en la que se le detectaron
microcalcificaciones periareolares en la mama derecha correspondientes a un nódulo
sólido, palpable y de bordes parcialmente mal definidos con microcalcificaciones en su
interior. También se detectó otro nódulo de bordes parcialmente definidos no palpable
correspondiente a un nódulo hipoecoico lobulado compatible con una adenopatía
intramamaria patológica. También se pudo identificar en la axila derecha varias
adenopatías patológicas. Posteriormente le practicaron la biopsia (BAG) del nódulo
retroareolar derecho, una PAAF y una resonancia magnética nuclear. Los resultados
obtenidos permitieron realizar el diagnótico de la paciente determinando un CDI de MD
con receptores hormonales positivos: RE 80%, los RP 60% y el HER2 negativo. Se le
practicó una mastectomía radical unilateral y se le administró posteriormente
quimioterapia neoadyuvante. Se le recomendó una mastectomía profiláctica
contralateral desde la Unidad de Mama que se realizó junto con una histerectomía y una
ooforectomia bilateral. En cuanto a los antecedentes personales, la paciente tuvo la
menarquía a los 14 años siendo ésta regular hasta el momento. También tuvo el primer
hijo a los 21 años. En cuanto a los antecedentes familiares indicaban que tenía madre
con cáncer de mama post-menopausia a los 70 años, una tía paterna con neoplasia de
mama pre-menopausia a los 35 años, una segunda tía materna con cáncer de mama
post-menopausia y una prima segunda con neoplasia de mama pre-menopausia a los 40
años de edad.
La mutación que se le detectó a esta paciente fue una deleción de 5 nucleótidos en el
exón 23 del gen BRCA2 (c.9026_9030delATCAT), la misma que la detectada en pacientes
anteriores y está descrita como patológica en la base de datos BIC.
98
Paciente 16: Mujer de 37 años de edad remitida por el Servicio de Oncología a la Unidad
de Riesgo Familiar de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera. En primer
lugar se le realizó una mamografía de dos proyecciones de la mama izquierda,
resonancia magnética bilateral con contraste con secuencia dinámicas, ecografía de
mama para realizar la reevaluación, biopsia de mama ecodirigida y BAG. Con el estudio
ganglionar se determinó ausencia de malignidad. Se realizó el estudio IHQ de los
receptorers hormonales a partir de los cilindros biopsiados de las mamas y la
determinación que se hizo fue para la mama derecha: RE 90%; RP 50%; HER2 +. Para la
mama izquierda: RE 95%; RP 10%; HER2 +. Finalmente se le diagnosticó un cáncer de
mama bilateral: en la mama izquierda presentaba un CDI mientras que en la mama
derecha se detectó un CLI. La paciente se sometió a una mastectomía radical modificada
bilateral con reconstrucción total de mama. Se realizó un vaciamiento axilar y una
biopsia del ganglio centinela obteniéndose un resultado negativo para malignidad. Se
sometió a quimioterapia con Tamoxifeno. Finalmente se llevó a cabo la reconstrucción
mamaria. En cuanto a los antecedentes personales, la menarquia la tuvo a los 11 años y
era una paciente nuligesta. Los antecedentes familiares de cáncer de mama que
presentó esta paciente fue el de una tía paterna con cáncer de mama pre-menopausia
a los 36 años. El árbol genealógico correspondiente al estudio familiar de la familia de
ésta paciente se puede observar en la figura 32 del ANEXO III.
La mutación que se encontró en esta paciente fue una deleción de 5 nucleotidos en el
exón 23 del gen BRCA2 (c.9026_9030delATCAT). Esta deleción tiene una implicación
patológica en el desarrollo de cáncer de mama hereditario y confiere riesgo familiar
como se observa en BIC.
Paciente 17: Mujer de 38 años remitida desde atención primaria a la Unidad de Riesgo
de Cáncer de Mama del hospital Universitario de la Ribera para valoración de historia
familiar y seguimiento. A los 51 años, mediante mamografía con tomosíntesis de
seguimiento (por Hª Familiar), resonancia magnética de mama y biopsia ecodirigida, se
le diagnosticó un CDI de mama derecha con afectación axilar. En el estudio IHQ se realizó
la determinación de los receptores hormonales así como del HER2 dando un resultado
de RE 90%; RP 40% y Her2-. Se le proporcionó quimioterapia neoadyuvante y posterior
mastectomía radical modificada de la mama derecha. Se le realizó radioterapia por
99
afectación de adenopatías retropectorales. En cuanto a la historia personal, la paciente
tuvo la menarquia a los 11 años y el primer hijo a los 19 años. Los antecedentes
familiares que presentó esta paciente fueron madre con cáncer de mama post-
menopausia a los 53 años, hermana cáncer de mama pre-menopausia a los 42 años y tío
materno cáncer de mama a los 72 años.
La mutación encontrada en esta paciente fue un cambio del nucleótido Citosina por
Timina en la posición 9382 que se traduce en un cambio de aminoácido Arginina (R) por
un stop codón (X) en el codón 3218 (p.Arg3128Ter) en el exón 25 del gen BRCA2. De
modo que la síntesis de la proteína termina de forma prematura obteniéndose una
proteína truncada disfuncional. Dicha mutación está descrita en BIC como patológica.
Paciente 18: Mujer de 32 años remitida desde atención primaria a la Unidad de Riesgo
de Cáncer de Mama del Hospital Universitario de la Ribera por presentar molestias en
mama derecha y una historia familiar relevante para valoración. Se le realizó una
resonancia magnética con contraste y se diagnosticó un FAD. En cuanto a los
antecedentes personales, la paciente tuvo la menarquía a los 13 años y era nuligesta.
Los antecedentes familiares que presentó fueron madre con cáncer de mama pre-
menopausia los 50 años, tía materna cáncer de mama bilateral pre-menopausia a los 50
años, primas hermanas con cáncer de mama pre-menopausia y tío abuelo materna con
cáncer de mama.
La mutación encontrada en esta paciente fue un cambio de nucleótido Citosina por
Timina en la posición 9382 que se traduce en un cambio de aminoácido Arginina (R) por
un stop codón (X) en el codón 3218 (p.Arg3128Ter) en el exón 25 del gen BRCA2. De
modo que la síntesis de la proteína termina de forma prematura obteniéndose una
proteína truncada disfuncional. Dicha mutación está descrita en BIC como patológica.
100
6. CONCLUSIONES
En nuestro estudio los pacientes que se realizaron el estudio genético de BRCA1 y
BRCA2 fueron mayoritariamente mujeres (92.67%) con antecedentes familiares de
cáncer de mama y de ovario principalmente (70.14%) y pre-menopáusicas (82.37%).
Las pacientes femeninas que acudieron a la Unidad de Riesgo familiar en un 83.81%,
de los casos presentaban algún tipo de cáncer y sólo un 16.19% acudió por consejo
genético por presentar antecedentes familiares.
Las neoplasias más frecuentes en el grupo de pacientes femeninas fueron
mayoritariamente de mama (62.94%) siendo el más frecuente el CDI (35.61%). Los
cánceres de ovario representaron el 12.95% y las pacientes que presentaron cáncer
de mama y de ovario simultáneamente fueron un 2.88%.
Los pacientes varones que acudieron a la Unidad de Riesgo de Cáncer de Mama
Familiar, un 27,26% por presentar algún tipo de cáncer de mama, un 22,74% cáncer
de próstata y un 50% por consulta de consejo genético por antecedentes familiares.
En nuestro estudio la prevalencia poblacional de mutaciones patológicas de los
genes BRCA1/BRCA2 causantes de cáncer de mama y ovario hereditario ha sido de
un 7.37%.
La técnica de MLPA dirigida a la detección de alteraciones en la dosis génica de
BRCA1/BRCA2 no ha detectado ningún caso de grandes duplicaciones, deleciones o
reordenamientos en los 164 pacientes analizados.
En el caso de las variantes sin significado clínico se observa una elevada presencia de
mutaciones en ambos genes en la población estudiada, siendo más frecuentes en el
gen BRCA1 que en el gen BRCA2.
En el caso de las variantes de significado clínico incierto, se observa que hay un
mayor prevalencia en el gen BRCA1 que en el gen BRCA2.
101
En el caso de las mutaciones nuevas se observa que en ambos genes se pueden
detectar gran variedad de cambios que todavía no se han descrito, pero que sería de
interés estudiar para determinar su implicación en el desarrollo del cáncer de
mama/ovario hereditario en nuestra población.
Se ha encontrado un total de 18 pacientes a los que se les ha detectado una
mutación patológica, de los cuales solamente uno es un varón. Las otras 17 son
mujeres con una media de edad de 43.12 años (SD= 6.36) con un rango de 28 a 76
años; diez de ellas con cáncer de mama y cinco con cáncer de ovario. Es importante
ampliar el estudio a la familia de éstas pacientes para determinar los pacientes de
riesgo y poder realizar un seguimiento y profilaxis adecuados.
La mutación patológica que se ha detectado con mayor frecuencia ha sido la deleción
c.9026_9030del5ATCAT en el exón 23 del gen BRCA2 que se ha encontrado en un
total de 5 pacientes.
Del total de pacientes con mutaciones patológicas un 61.11% presentaron
mutaciones en el gen BRCA2 y un 38.89% en el gen BRCA1.
102
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118
8. ANEXOS
ANEXO I
Tabla 1.- Lista de cebadores empleados en el estudio para la amplificación de los exones
del gen BRCA1. El diseño de los cebadores se hace de manera que las regiones intrónicas
adyacentes queden dentro del amplificado de modo que se puedan detectar posibles
mutaciones que afecten al splicing del ARNm.
GEN EXÓN CEBADORES
BRCA1 2 F: GAA GTT GTC ATT TTA TAA ACC TTT R: TGT CTT TTC TTC CCT AGT ATG T BRCA1 3 F: TCC TGA CAG AGC AGA CAT TTA R: TTG GAT TTT CGT TCT CAC TTA BRCA1 5 F: CTC TTA AGG GCA GTT GTC AG R: TTC CTA CTG TGG TTG CTT CC BRCA1 8 F: GCATTGTACCTGCCACAGTA R:ACCAGCTTCATAGACAAAGGTTCT BRCA1 9 F: TTGGTCATTTGACAGTTCTGCAT R:TTGTGGGTTGTAAAGGTCCCA BRCA1 11.1 F: CCA AGG TGT ATG AAG TAT GT R: GAT CAG CAT TCA GAT CTA CC BRCA1 11.2 F: CTC ACT AAA GAC AGA ATG R: CTT TCT GAA TGC TGC TAT BRCA1 11.3 F: CAG AAA CTG CCA TGC TTC AGA R: AGG CTT GCC TTC TTC CGA TA BRCA1 11.4 F: GTT CAC TCC AAA TCA GTA GAG AG R: CAG CTT TGC TTT TGA AGG CAG BRCA1 11.5 F: CCT AAC CCA ATA GAA TCA CTC G R: GAA CCA GGT GCA TTT GTT AAC TTC BRCA1 11.6 F: CAG CGA TAC TTT CCC AGA GC R: GTC CCT TGG GGT TTT CAA A BRCA1 11.7 F: CTG GAA GTT AGC ACT CTA GG R: GTT GCA CAT TCC TCT TCT GC BRCA1 11.8 F: CCG TTT TCA AAT CCA GGA AA R: TGA TGG GAA AAA GTG GTG GT BRCA1 11.9 F: GAG GCA ACG AAA CTG GAC TCA R: CTC AGG TTG CAA AAC CCC TA BRCA1 11.10 F: AAC AGA GGG CCA AAA TTG AA R: GGG TGA AAG GGC TAG GAC TC BRCA1 11.11 F: AAA GCG TCC AGA AAG GAG AGC R: GCC TTT GCC AAT ATT ACC TGG BRCA1 11.12 F: CAT TGA AGA ATA GCT TAA ATG R: CCT GGT TCC AAT ACC TAA GTT BRCA1 13 F: GGAAAGCTTCTCAAAGTATTTCR: GCTTAAGATATCAGTGTTTGG BRCA1 18 F: GGCTCTTTAGCTTCTTAGGAC R: TCTGAGGTGTTAAAGGGAGG BRCA1 19 F: CCTCTCTATCTCCGTGAAAAGAGR: CTATATGACTGAATGAATATCTCTGG BRCA1 20 F: CTGCTCCACTTCCATTGAAG R: GAGATTTTTGTCAACTTGAGGG
119
GEN EXÓN CEBADORES BRCA2 2 F: CCAGCGCTTCTGAGTTTTAC R: GTGACGTACTGGGTTTTTAGC BRCA2 3 F: GGGTCACAAATTTGTCTGTCAC R: GTAGTTCTCCCCAGTCTACC BRCA2 10.1 F: GTG CTT CTG TTT TAT ACT TT R: CCA TTA GAT TCA AAT GTA G BRCA2 10.2 F: CTC ATT TGT ATC TGA AGT GG R: GAG AGA TGA AGA GCA GCA TC BRCA2 10.3 F: GCC ATT AAA TGA GGA AAC AG R: GAT AAT GGA AGC TGG CCA GC BRCA2 10.4 F: CTG TTT GCT CAC AGA AGG AG R: GAT TCA GGT ACC TCT GTC BRCA2 11.1 F: AGT GAA TGT GAT TGA TGG TAC R: CAT GCT GCA GCC AAG ACC TCT BRCA2 11.2 F: GAA GGA CAG TGT GAA AAT G R: CCT TTC TTG AAG GTG ATG C BRCA2 11.3 F: AAG ATG TAT GTG CTT TAA ATG R: CTC CTC TGC AAG AAC ATA AAC BRCA2 11.4 F: AGA CAC AGG TGA TAA ACA AG R: CAA GGT ATT TAC AAT TTC AA BRCA2 11.5 F: GCT CTC TGA ACA TAA CAT TAA G R: CAT TAT GAC ATG AAG ATC AG BRCA2 11.6 F: TAT CTT AAA GAC CAC TTC TG R: TGA AAC AAC AGA ATC ATG AC BRCA2 11.7 F: CTT CTG CAG AGG TAC ATC R: CAG TAA ATA GCA AGT CCg BRCA2 11.8 F: TTT GAT GGC AGT GAT TCA AG R: CTT ATG TCA GAA TGT AAT TC BRCA2 11.9 F: ATC AGA AAC CAG AAG AAT TG R: ATC TCA ATG GTC TCA CAT GC BRCA2 11.10 F: CAG AGA GGC CTG TAA AGA C R: GAA GTC TGA CTC ACA GAA G BRCA2 11.11 F: TGA AAA TTC AGC CTT AGC R: GCA TCT TTT ACA TTG GAT BRCA2 11.12 F: GTA TTG AGC CAG TAT TGA AG R: TGC CTC GTA ACA ACC TGC CAT BRCA2 11.13 F: GTT TCA GTA AAG TAA TTA AG R: AGA TTT TCC ACT TGC TGT GC BRCA2 11.14 F: AAG TCA GTC TCA TCT GCA A R: GAA ACT TGC TTT CCA CTT G BRCA2 11.15 F: CAT CTG CTT TCT CTG GAT TTA R: ATG TTC TCA ACA AGT GAC ACT BRCA2 11.16 F: ATG TTG AAG GTG GTT CTT CAG R: GTG ATT GGC AAC ACG AAA GG BRCA2 23 F: GAGGATCTGTATTTATTTTGAAAC R: GCTAACTGTATGTTAGCTCTTTC BRCA2 25 F: GGAAAACCTGAGCTTTCGCCA R: AGCTATTTCCTTGATACTGGACTGT BRCA2 27 F: GGGGAGGGAGACTGTGTGTAAT R:ACCAATACGGAATCGGGCAA
Tabla 2.- Lista de cebadores empleados en el estudio para la amplificación de los exones
del gen BRCA2. El diseño de los cebadores se hace de manera que las regiones intrónicas
adyacentes queden dentro del amplificado de modo que se puedan detectar posibles
mutaciones que afecten al splicing del ARNm.
120
ANEXO II
GEN EXON MUTACIÓN NM_007294.3
MUTACIÓN NP_009225.1
TIPO MUTACIÓN
PREV. ALELICA
PREV. POBLAC.
BIC ClinVar HGMD
BRCA1 9 c.591C>T p.Cys197= SINONIMA 0.33% 0.66% NP BENIGNA Cáncer de mama y/o ovario? BRCA1 11.1 c.839C>T p.Ala280= SINONIMA 0.18% 0.36% NP BENIGNA No incluida BRCA1 11.5 c.2082C>T p.Ser694= SINONIMA 28.47% 48.08% NP BENIGNA No incluida BRCA1 11.5 c.2077G>A p.Asp693Asn MISSENSE 5.92% 12.19% NP BENIGNA Mutación relacionada con
exposición a radiación BRCA1 11.6 c.2311T>C p.Leu771= SINONIMA 26.48% 44.25% NP BENIGNA No incluida BRCA1 11.7 c.2612C>T p.Pro871Leu MISSENSE 31.55% 52.41% NP CL1 BENIGNA Mutación asociada con bajo
riesgo de Cáncer cervical BRCA1 11.9 c.3113A>G p.Glu1038Gly MISSENSE 31.27% 52.11% NP BENIGNA Mutación asociada a
Endometriosis BRCA1 11.10 c.3548A>G p.Lys1183Arg MISSENSE 30.03% 52.08% NP BENIGNA Mutación asociada a baja
protección frente CaM BRCA1 11.11 c.3600G>C p.Gln1200His MISSENSE 0.18% 0.36% NP BENIGNA Cáncer de mama? BRCA1 13 c.4308T>C p.Ser1436= SINONIMA 31.76% 52.46% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA1 15 c.4535G>T p.Ser1512Ile MISSENSE 0.33% 0.41% NP BENIGNA Cáncer de mama? BRCA1 16 c.4837A>G p.Ser1613Gly MISSENSE 34.54% 56.58% NP BENIGNA No incluida
Tabla 4.- GRUPO 1 BRCA1: VARIANTES BENIGNAS O PROBABLEMENTE BENIGNAS
GEN EXON MUTACIÓN NM_007294.3
MUTACIÓN NP_009225.1
TIPO MUTACIÓN
PREV. ALELICA
PREV. POBL.
BIC ClinVar HGMD
BRCA1 5 c.199G>T p.Asp67Tyr MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD BENIGNA Cáncer de mama y/o ovario? BRCA1 11.1 c.981A>G p.Thr327= MISSENSE 0.18% 0.35% VSCD VSCD CL2 No incluida BRCA1 11.2 c.1067A>G p.Gln356Arg MISSENSE 6.38% 12.76% VSCD BENIGNA Mutación asociada con CaM y/o Ov BRCA1 11.5 c.1945G>C p.Glu649Gln MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL4 No incluida BRCA1 11.6 c.2183G>A p.Arg728Lys MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA1 11.7 c.2521C>T p.Arg841Trp MISSENSE 1.55% 3.10% VSCD BENIGNA Cáncer de ovario? BRCA1 11.7 c.2632 G>A p.Ala878Thr MISSENSE 0.35% 0.69% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA1 11.7 c.2635G>A p.Glu879Lys MISSENSE 0.35% 0.69% VSCD VSCD CL4 No incluida BRCA1 11.8 c.2662C>T p.His888Tyr MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA1 11.8 c.2733A>G p.Gly911= MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL2 No incluida BRCA1 11.9 c.3024G>A p.Met1008Ile MISSENSE 0.18% 0.35% VSCD BENIGNA Cáncer de mama? BRCA1 11.9 c.3119G>A p.Ser1040Asn MISSENSE 0.17% 5.99% VSCD BENIGNA Cáncer de mama? BRCA1 11.11 c.3601 G>A p.Gly1201Cys MISSENSE 6.75% 10.95% NoDes VSCD No incluida BRCA1 11.11 c.3708T>G p.Asn1236Lys MISSENSE 0.18% 0.37% VSCD VSCD CL3 Cáncer de mama y/o ovario? BRCA1 11.11 c.3739G>A p.Val1247Ile MISSENSE 0.55% 1.09% VSCD BENIGNA No incluida BRCA1 11.12 c.3785C>T p.Ser1262Leu MISSENSE 0.35% 0.35% VSCD VSCD CL4 No incluida BRCA1 11.12 c.4039A>G p.Arg1347Gly MISSENSE 0.33% 0.66% VSCD BENIGNA Cáncer de mama? BRCA1 16 c.4956G>A p.Met1652Ile MISSENSE 0.99% 1.97% VSCD BENIGNA Cáncer de mama y/o ovario? BRCA1 18 c.5152+5G>A IVS18+5 MISSENSE 0.35% 0.70% VSCD VSCD CL4 Mutación asociada con CaM y/o Ov BRCA1 19 c.5176A>G p.Arg1726Gly MISSENSE 0.18% 0.35% VSCD VSCD CL2 No incluida
Tabla 5.- GRUPO 2 BRCA1: VARIANTES DE SIGNIFICADO CLÍNICO INCIERTO
121
GEN EXON MUTACIÓN NM_007294.3
MUTACIÓN NP_009225.1
TIPO MUTACIÓN
PREV. ALELICA
PREV. POBL.
BIC ClinVar HGMD
BRCA1 2 c.66_67delAG p.Leu22_Glu23LeuValfsTer17
FRAMESHIFT 0.39% 0.77% Patológica CL5
Patológica Mutación relacionada con CaM
BRCA1 11.8 c.2866_2870 delTCTCA
p.Ser956_Gln957fsTer11
NONSENSE 0.18% 0.35% Patológica CL5
Patológica Murtación relacionada con cáncer de mama
BRCA1 11.12 c.4035_4035 delA
p.Glu1345=fsTer20
FRAMESHIFT 0.18% 0.35% Patológica CL5
Patológica NO INCLUIDA
BRCA1 11.12 c.4065_4068 delTCAA
p.Asn1355_Gln1356?fsTer10
FRAMESHIFT 0.18% 0.35% Patológica CL5
Patológica Mutación Relacionada con CaM
BRCA1 13 c.4307_4308delCT
p.Ser1436PhefsTer2
NONSENSE 0.21% 0.41% Patológica CL5
Patológica NO INCLUIDA
BRCA1 18 c.5095C>T p.Arg1699Trp MISSENSE 0.18% 0.35% Patológica CL5
Patológica Mutación relacionada con CaM y Ca Colorrectal
BRCA1 18 c.5123C>A p.Ala1708Glu MISSENSE 0.18% 0.35% Patológica CL5
Patológica Mutación relacionada con CaM
Tabla 6.- GRUPO 3 BRCA1: MUTACIONES PATOLÓGICAS
GEN EXON MUTACIÓN NM_007294.3
MUTACIÓN NP_009225.1
TIPO MUTACIÓN
PREV. ALELICA
PREV. POBL.
POLYPHEN MUTATION-TASTER
BRCA1 11.1 c.859 A>G p.Asn287Asp MISSENSE 0.18% 0.35% 0.947 PP PLMF BRCA1 11.4 c.1521 A>T p.Arg507Ser MISSENSE 0.91% 1.83% 0.995 PP PLMF BRCA1 11.5 c.1954 A>G p.Lys652Glu MISSENSE 0.18% 0.35% 0.132 BENIGNA PLMF BRCA1 11.6 c.2252 T>A p.Met751Lys MISSENSE 1.57% 3.14% 0.051 BENIGNA PLMF BRCA1 11.9 c.3072 C>A p.Ser1024Arg MISSENSE 0.35% 0.70% 0.894 PP PLMF BRCA1 11.9 c.3184 G>A p.Gly1062Ser MISSENSE 0.18% 0.35% 0.882 PP PLMF BRCA1 11.12 c.3839 C>G p.Ser1280Cys MISSENSE 0.35% 0.70% 0.030 BENIGNA PLMF BRCA1 11.12 c.3943 C>G p.Pro1315Ala MISSENSE 0.35% 0.70% 0.664 BENIGNA PLMF BRCA1 12 c.4226 A>T p.Gln1409Leu MISSENSE 0.33% 0.66% 0.033 BENIGNA Causal de enfermedad BRCA1 13 c.4337 A>T p.Glu1446Val MISSENSE 0.21% 0.41% 0.146 BENIGNA PLMF
Tabla 7.- GRUPO 4 BRCA1: MUTACIONES NUEVAS NO DESCRITAS
GEN EXON MUTACION NM_00005959.3
MUTACION NP_000050.2
TIPO MUTACIÓN
PREV. ALELICA
PREV. POBL.
BIC ClinVar HGMD
BRCA2 2 c.-26G>A IVS1-26 g>a 5’ UTR 17.53% 39.82% NP CL1 BENIGNA Protección frente a cáncer de mama esporádico
BRCA2 10.1 c.865A>C p.Asn289His MISSENSE 2.78% 5.56% NP BENIGNA Riesgo reducido de cáncer de mama
BRCA2 10.2 c.1114C>A p.Asn372His MISSENSE 18.30% 30.91% NP CL1 VSCD Asociada a cáncer de mama
BRCA2 10.2 c.1365A>G p.Ser455= SINONIMA 3.46% 6.91% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 10.4 c.1786G>C p.Asp596His MISSENSE 0.37% 0.75% NP BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 10.4 c.1792A>G p.Thr598Ala MISSENSE 0.19% 0.37% NP BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 11.2 c.2229T>C p.His743= SINONIMA 3.38% 6.76% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 11.3 c.2803G>A p.Asp935Asn MISSENSE 0.34% 0.68% NP BENIGNA Cáncer de mama y/o
ovario?
122
BRCA2 11.4 c.2971 A>G p.Asn991Asp MISSENSE 3.43% 6.85% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 11.5 c.3396A>G p.Lys1132= SINONIMA 24.74% 45.29% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 11.7 c.3807T>C p.Val1269= SINONIMA 15.29% 26.80% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 11.8 c.4068G>A p.Leu1356= SINONIMA 1.62% 3.24% NP BENIGNA No incluida BRCA2 11.8 c.4258G>T p.Asp1420Tyr MISSENSE 0.18% 0.36% NP BENIGNA Cáncer de mama y/o
ovario? BRCA2 11.9 c.4563A>G p.Leu1521= SINONIMA 72.24% 75.17% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 11.11 c.5199C>T p.Ser1733= SINONIMA 0.17% 0.35% NP BENIGNA No incluida BRCA2 11.11 c.5312G>A p.Gly1771Asp MISSENSE 0.52% 1.04% NP BENIGNA Cáncer de mama y/o
ovario? BRCA2 11.13 c.5744C>T p.Thr1915Met MISSENSE 1.89% 3.78% NP CL1 BENIGNA Asociada con riesgo de
cáncer de mama BRCA2 11.13 c.5976A>G p.Ser1992= SINONIMA 0.17% 0.34% NP CL2 BENIGNA No incluida BRCA2 11.15 c.6347A>G p.His2116Arg MISSENSE 0.17% 0.34% NP BENIGNA Cáncer de mama y/o
ovario? BRCA2 11.16 c.6513G>C p.Val2171= SINONIMA 62.37% 68.29% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 14 c.7242A>G p.Ser2414= SINONIMA 22.04% 39.47% NP CL1 BENIGNA No incluida BRCA2 14 c.7397C>T p.Ala2466Val MISSENSE 97.37% 97.37% NP CL1 BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 15 c.7469T>C p.Ile2490Thr MISSENSE 0.66% 1.32% NP CL1 BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 18 c.8182G>A p.Val2728Ile MISSENSE 0.33% 0.66% NP BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 22 c.8851G>A p.Ala2951Thr MISSENSE 0.33% 0.66% NP CL1 BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 27 c.9976A>T p.Lys3326Ter NONSENSE 2.30% 4.61% NP BENIGNA Asociada con riesgo de
cáncer de mama BRCA2 27 c.10234A>G p.Ile3412Val MISSENSE 0.33% 0.66% NP CL1 BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 3’UTR c.*105A>C 3’UTR_105A>
C 3’ UTR 16.45% 32.89% NP CL1 BENIGNA No incluida
Tabla 8.- GRUPO 1 BRCA2: VARIANTES SIN SIGNIFICADO CLÍNICO
GEN EXON MUTACION NM_00005959.3
MUTACION NP_000050.2
TIPO MUTACIÓN
PREV. ALELICA
PREV. POBL.
BIC ClinVar HGMD
BRCA2 3 c.125A>G p.Tyr42Cys MISSENSE 0.22% 0.44% VSCD BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 3 c.223G>C p.Ala75Pro MISSENSE 0.22% 0.44% VSCD BENIGNA Cáncer de mama? BRCA2 3 c.280C>T p.Pro94Ser MISSENSE 0.22% 0.44% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA2 11.13 c.5836T>C p.Ser1946Pro MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA2 11.13 c.5925T>G p.Cys1975Trp MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL4 No incluida BRCA2 11.14 c.6100C>T p.Arg2034Cys MISSENSE 2.08% 4.17% VSCD BENIGNA Asociada con riesgo de Leucemia BRCA2 11.15 c.6215C>G p.Ser2072Cys MISSENSE 0.34% 0.68% VSCD VSCD CL3 Cáncer de mama BRCA2 11.15 c.6323G>A p.Arg2108His MISSENSE 0.85% 1.69% VSCD BENIGNA No incluida BRCA2 11.15 c.6443C>A P.Ser2148Tyr MISSENSE 0.17% 0.34% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA2 11.16 c.6613G>A p.Val2205Met MISSENSE 0.17% 0.35% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA2 11.16 c.6803G>A p.Arg2268Lys MISSENSE 0.33% 0.66% VSCD VSCD CL3 Cáncer de mama? BRCA2 19 c.8359C>T p.Arg2787Cys MISSENSE 0.33% 0.66% VSCD VSCD CL3 No incluida BRCA2 27 c.10110G>A p.Arg3370= SINONIMA 0.33% 0.66% VSCD VSCD CL2 No incluida
Tabla 9.- GRUPO 2 BRCA2: VARIANTES DE SIGNIFICADO CLÍNICO INCIERTO
123
GEN EXON MUTACION NM_00005959.3
MUTACION NP_000050.2
TIPO MUTACIÓN
PREV. ALELICA
PREV. POBL.
BIC ClinVar HGMD
BRCA2 11.4 c.3264_3265insT p.Pro1088_Gln1089fsTer10
FRAMESHIFT 0.17% 0.35% Patológica CL5
Patológica Cáncer de mama
BRCA2 11.11 c.5120delC p.Thr1707MetfsTer5 FRAMESHIFT 0.17% 0.35% Patológica No descrita BRCA2 11.13 c.5722_5723delCT p.Leu1908ArgfsTer53 FRAMESHIFT 0.17% 0.35% Patológica
CL5 Patológica No descrita
BRCA2 11.14 c.6024_6025insG p.Lys2008_Gln2009fsTer8
NONSENSE 0.17% 0.35% Patológica CL5
Patológica No descrita
BRCA2 23 c.9026_9030delATCAT;c.9254del5
p.Tyr3009_His3010fsTer6
FRAMESHIFT 0.69% 1.39% Patológica CL5
Patológica Cáncer de mama
BRCA2 23 c.8975_9100del126 p.Pro2992_Gln3034? FRAMESHIFT 0.17% 0.35% Patológica CL5
Patológica Cáncer de mama y/o ovario
BRCA2 25 c.9382C>T p.Arg3128Ter NONSENSE 0.39% 0.77% Patológica CL5
Patológica Cáncer de mama
Tabla 10.- GRUPO 3 BRCA2: MUTACIONES PATOLÓGICAS
GEN EXON MUTACION NM_00005959.3
MUTACION NP_000050.2
TIPO MUTACIÓN
PREV. ALELICA
PREV. POBL.
POLYPHEN MUTATION-TASTER
BRCA2 4 c.401 T>C p.Ler134Pro MISSENSE 0.33% 0.66% 0.001 BENIGNA Causal de enfermedad
BRCA2 10.3 c.1449 A>G p.Ala483= SINÓNIMA 1.82% 3.64% PLMF BRCA2 11.1 c.1934 G>T p.Arg645Ile MISSENSE 0.35% 0.70% 0.899 PP PLMF BRCA2 11.1 c.2181 A>G p.Ser727= SINÓNIMA 0.35% 0.69% PLMF BRCA2 11.3 c.2451 G>T p.Lys817Asn MISSENSE 0.34% 0.68% 0.003 BENIGNA PLMF BRCA2 11.3 c.2793 A>G p.Gly931= SINÓNIMA 0.17% 0.34% PLMF BRCA2 11.4 c.3152 T>C p.Leu1051Ser MISSENSE 0.17% 0.34% 0.084 BENIGNA PLMF BRCA2 11.5 c.3159 A>G p.Leu1053= SINÓNIMA 0.35% 0.69% PLMF BRCA2 11.5 c.3248 A>G p.Asn1083Asp MISSENSE 0.35% 0.69% 0.047 BENIGNA PLMF BRCA2 11.8 c.4090 A>G p.Ile1346Val MISSENSE 0.18% 0.36% 0.008 BENIGNA PLMF BRCA2 11.8 c.4284 A>C p.Ala1395= SINÓNIMA 0.36% 0.72% Causal de enfermedad BRCA2 11.8 c.4303 A>C p.Asn1435His MISSENSE 0.18% 0.36% 0.999PP PLMF BRCA2 11.9 c.4584 C>T p.Ser1528= SINÓNIMA 0.17% 0.35% Causal de enfermedad BRCA2 11.12 c.5395 G>A p.Ala1799Thr MISSENSE 0.17% 0.34% 0.000 BENIGNA PLMF BRCA2 11.12 c.5430 T>A p.Val1810= SINÓNIMA 0.34% 0.68% PLMF BRCA2 11.14 c.6182 C>A p.Ala2061Glu MISSENSE 0.17% 0.35% 1.000 PP Causal de enfermedad BRCA2 11.15 c.6257 T>A p.Ile2086Asn MISSENSE 0.34% 0.68% 0.133BENIGNA PLMF BRCA2 11.16 c.6660 A>G p.Glu2220= SINÓNIMA 0.17% 0.35% Causal de enfermedad BRCA2 27 c.9676 T>C p.Tyr3226His MISSENSE 0.33% 0.66% 0.021 BENIGNA PLMF
Tabla 11.- GRUPO 4 BRCA2: MUTACIONES NUEVAS NO DESCRITAS
124
ANEXO III
Figura 20.- Árbol Genealógica 1. Árbol genealógico de la familia de la paciente 1 a la que se ha detectado la MP c.66_67delAG; p.Leu22_Glu23LeuValfsTer17 en el exón 2 del gen BRCA1.
Figura 21.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 3 a la que se ha detectado la MP c.2866_2870delTCTCA en el exón 11 del gen BRCA1.
125
Figura 23.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 4 a la que se ha detectado la MP c.4065_4068delTCAA en el exón 11 del gen BRCA1.
Figura 24.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 5 a la que se ha detectado la MP c.4307_4308delCT en el exón 13 del gen BRCA1.
126
Figura 26.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 6 a la que se ha detectado la MP p.Arg1699Trp en el exón 18 del gen BRCA1.
Figura 28.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 7 a la que se ha detectado la MP p.Ala1708Glu en el exón 18 del gen BRCA1.
127
Figura 29.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 8 a la que se ha detectado la MP c.3263_3264insT en el exón 11 del gen BRCA2.
Figura 30.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 8 a la que se ha detectado la MP c.5722_5723delCTCT en el exón 11 del gen BRCA2.
128
Figura 31.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 8 a la que se ha detectado la MP c.9254delATCATC en el exón 23 del gen BRCA2.
Figura 32.- Árbol genealógico de la familia de la paciente 16 a la que se ha detectado la MP c.9254delATCATC en el exón 23 del gen BRCA2.
129
Figura 33.- Leyenda para la interpretación de los árboles genealógicos