Dr. Jaime RodríguezLaboratorio de cultivo celular

Facultad de Ciencias de la SaludUniversidad de Talca

Julio 2005

Activación del endotelio por citoquinas proinflamatorias:

TNF (factor necrosis tumoral)

IL-1 (interleuquina 1)

Expresión de moléculas de adhesión ICAM-1, VCAM-1, E-selectina

Expresión de moléculas de atracción química MCP-1

(proteína-1 de quimioatracción de monocitos)

NF-κB

AMs

AMs

Marcadores biohumorales de activación endotelial:

Moléculas de adhesión (Ams):

• ICAM-1 (molécula 1 de adhesión intercelular)

• VCAM-1 (molécula 1 de adhesión celular vascular)

• E-selectina

La acción de TNF e IL-1 es mediada por las MAPKs (proteina-quinasas activadas por

mitógenos):

1. JNK (quinasa aminoterminal Jun)

2. p38

La deformación del endotelio provocada por el flujo sanguíneo es una importante fuerza ateroprotectora.

Activación de la MAPKs:

ERK 1/2 (quinasas relacionadas con señales extracelulares

BMK 1 (MAPK 1 grande)

Síntesis de NO

NO inhibe la expresión de moléculas de adhesión (Ams) por inhibición de NF-κB (factor nuclear kappa B).

NF- κB cuando transloca al núcleo activa genes: citoquinas, Ams, ciclooxigenasa, Nos.

ERK 1/2 inhibe la actividad de JNK, promueve la expresión de NOs (sintetasa del oxido nítrico).

BMK 1 antagoniza efectos de JNK y p38 (mecanismo en estudio).

AISLAMIENTO DE CELULAS ENDOTELIALES DE VENA UMBILICAL HUMANA

Retirar un segmento de vena umbilical y mantenerlo a 4 °C, hasta 1 hora en buffer

Canular y perfundir con buffer (lavado)

Llenar el trozo de vena con solución 0,2 % colagenasa y ligar en ambos extremos

Incubar en buffer a 37 °C, durante 15 min

Lavar con buffer y recibir el contenido en tubo de centrífuga

Sedimentar las células a 250 g por 10 min.

Lavar y resuspender

Condiciones de cultivo:

Medio 199, 20 % FCS, penicilina estreptomicina, 37 °C, 5 % CO2

Rendimiento: 0,5-1,5 millones de células

OTRAS CELULAS ENDOTELIALES:

HDMEC: Human dermal microvascular endothelial cells (Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA).

PMVEC: Human pulmonary microvascular endothelial cells (Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA).

Estudiar los efectos de pirrolidina ditiocarbamato (PDCT) y

espermina NONOato (Sper-NO) sobre la expresión de

moléculas de adhesión y la activación del factor nuclear kappa

B (NF-κB) inducidas por TNF- en HDMEC.

OBJETIVO

PDCT: antioxidante, Sper-NO: donante de NO

EXPRESION DE MOLECULAS DE ADHESION

TRATAMIENTO TNF 4 h

NAC (N-acetilcisteina): antioxidante.

SNAP S-nitroso-N-acetilpenicilamina: donante de NO.

EXPRESION DE MOLECULAS DE ADHESION

TRATAMIENTO TNF 4 h

EXPRESION DE MOLECULAS DE ADHESION

TRATAMIENTO TNF 8 h

EXPRESION DE mRNA de MOLECULAS DE ADHESION

TRATAMIENTO TNF 2 h

NAC (N-acetilcisteina): antioxidante.

SNAP S-nitroso-N-acetilpenicilamina: donante de NO.

EXPRESION DE mRNA de MOLECULAS DE ADHESION

TRATAMIENTO TNF 2 h

TRANSLOCACION NUCLEAR DE NF-Κb p65

Control TNF

PDCT+TNF Sper-NO+TNF

RAZON NUCLEO/CITOPLASMA DE NF-Κb p65

Estudiar el efecto de concentraciones de glucosa estable

“normal” (5 mM), estable alta (20 mM) e intermitente

(20/5 mM), sobre la producción de ICAM-1, VCAM-1 y

E-selectina, así como la actividad de PKC y la expresión de las

isoformas de PKC βI, βII y en HUVEC.

OBJETIVO

ACTIVIDAD PKC A LOS 14 DIAS DE TRATAMIENTO

LY379196: inhibitor of PKC β, BIMI-I: PKC inhibitor, TTFA: inhibitor of mitochondrial complex II, MnTBAP: SOD mimetic, Mannitol: osmotic control.

EXPRESION DE PKC β1

EXPRESION DE PKC β2

EXPRESION DE PKC

CONTENIDO DE ICAM-1 EN EL SOBRENADANTE

CONTENIDO DE VCAM-1 EN EL SOBRENADANTE

CONTENIDO DE E-SELECTINA EN EL SOBRENADANTE

EXPRESION DE mRNA ICAM-1

EXPRESION DE mRNA VCAM-1

EXPRESION DE mRNA E-SELECTINA

8-Hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG): a sensitive indicator of oxidative damage to DNA.

DAÑO OXIDATIVO DEL DNA

LY379196: inhibitor of PKC β, BIMI-I: PKC inhibitor, TTFA: inhibitor of mitochondrial complex II, MnTBAP: SOD mimetic, Mannitol: osmotic control.