Post on 21-Oct-2015
Técnicas de diagnóstico para detección de bacterias que afectan papa destinada a semilla
Rosaima García
Betty Paz
Franci Urbina
Misrael Monsrha
“Estandarización de Protocolos de los Laboratorios de Servicio Fitopatológicos:
Caso producción de semilla de Papa” . Mérida, Noviembre, 2013
Son microorgansismos unicelulares de
tamaño muy pequeño (0,5 y 5 µm).
Son procariotas, no tienen el núcleo definido
ni presentan en general, orgánulos
membranosos internos. Generalmente
poseen una pared celular compuesta
de peptidoglicano.
Se estima que se pueden encontrar en torno
a 40 millones de células bacterianas en un
gramo de tierra y un millón de células
bacterianas en un mililitro de agua dulce. En
total, se calcula que hay aproximadamente
5 1030 bacterias en el mundo.
Más de 2000 especies identificadas, 10%
aproximadamente son fitopatógenos.
¿Por qué se dificulta la detección de Las bacterias?
A-Monotrico; B-Lofotrico; C-Anfitrico; D-Peritrico.
FAMILIA GENERO TINCIÓN DE GRAM
PSEUDOMONACEAE Pseudomonas/Ralstonia, Bukholderia.
(-)
ENTEROBACTERIACEAE Erwinia/Pectobacterium/ Dickeya
(-)
MICROBACTERIACEAE Corynebacterium/ Clavibacter, (+)
STREPTOMYCETACEAE Streptomyces (+)
Principales familias y géneros de bacterias señaladas como causantes de Enfermedades en Papa
Técnicas de diagnósticos de Bacterias
Expresión de Síntomas: Preparaciones
Microscópicas y Pruebas de flujos.
Diagnóstico por Medios diferenciales
Histopatología- Uso de Microscopía
Técnicas Bioenzimáticas
PCR (Biología Molecular): Aún no se ha
estandarizado, está en proceso.
Método: Observación Visual, Diagnóstico por Síntomas
Daños Vasculares: Daño en
médula, taponamiento del
haz vascular, pudrición de
tubérculos.
Ralstonia, Clavibacter,
Pectobacterium .
Dentro del Tallo verdadero
o tubérculos: Pudrición del
tallo o pata negra,
marchitez, colapso,
pudrición blanda
Pectobacterium
Ahuecamiento del Tallo o
tubérculos
Diskeya
Daños superficiales en
superficies de tubérculos,
sarna, acorchamiento.
Streptomyces
Prueba Rápida del flujo bacteriano desde una rama de papa
Marchitez bacteriana de la planta y pudrición parda de tubérculos de papa por Ralstonia solanacearum
Prueba Rápida del flujo bacteriano desde una rama de papa
Marchitez por efecto de pata negra de la planta y pudrición blanda de tubérculos de papa por Pectobacterium carotovora
Sarna Común en papa (Streptomyces scabies). Síntomas
muy severos
Actualmente, se sólo se usa este método
como rutina y se combina con preparaciones
microscocópicas
Dickeya ( Erwinia chrysanthemi )
[Samson et al., 2005]
Tallo y Pudrición hueca de la papa
Dickeya chrysanthemi (Burkholder et al.
1953) Samson et al. 2005
Ultraestructura de un tallo de Papa, afectado por R. solanacearum. Obsérvese el haz vascular taponado por la pus bacteriana. Este Método se combina con el uso de medios diferenciales como rutina de servicio.
Técnica de Histopatología
Algunas Características
Características de las colonias Género TINCIÓN DE
GRAM
Metabolismo Respiratorio Oxidativo
Colonias blancas de bordes irregulares, muy fluídas en el medio Kelman (-) No fluorescentes en KB. Colonias color crema centro rosado semejante a helado en Kelman +TZC
Psudomonas (Ralstonia)
(-)
Metabolismo Respiratorio Fermentativo
Color amarillo en el Medio D3 y Kelman (-) Kelman Negativo y AN: Color crema a gris, algo traslucida bordes lisos a irregulares semejantes a huevo fritos y una estrellita en Kelman (-). Desarrollo de hoyos en el medio CVP
Dickeya Erwinia/Pectobacterium
(-)
Bacterias Corineformes
Colonias Amarilla en el medio YPDA o YPGA.
Corynebacterium/ Clavibacter,
(+)
(+)
Colonias blancas en AN o Agar -Tirosina Streptomyces scabies
Método: Uso de Medios Diferenciales: Clave
Orientadora para Clasificación Genérica
Características de las colonias: Pectobacterium carotovora
Gram (-), Prueba de KOH al 3%
Célula en forma de bastón, flagelos
periticas
Oxidasa negativa, anaeróbica
facultativa
Catalasa positiva
Pudrición de rodajas de papa (+).
Capacidad Pectolítica: produce hoyos
profundos en CVP
Colonias pequeñas, Color blanco a grisáceas, mucoides brillantes algo traslucidas, forma redonda bordes de lisos a levemente ondulada, lobulados, centro levantadas pronunciadas de color amarillo claro, convexas al inicio espumosas que después de 72 horas toman formas de huevos fritos en los medios de cultivos PDA, YCDA, YCA y Kelman(-). Kelman +TZC= Color crema, centro rosado oscuro a rojo, bordes irregulares semejantes a estrellitas. AN= Colonias pequeñas,planas, ligeramente circulares, color blancuzco y bordes irregulares BK: Crecimiento abundante, sin pigmentación, se tornan blanco grisáceos después de varios días.
Actualmente sólo se usa el medio
Kelma (-) y Keman (+) como rutina de
servicio.
Kelman (-)
De Kado D3
Dickeya ( Erwinia chrysanthemi )
Colonias pequeñas, Color crema a amarillo claro, mucoides brillantes algo traslucidas, forma redonda bordes levemente onduladas,, centro levantados de color amarillo claro, convexas después de 72 horas toman formas de huevos fritos en los medios de cultivos PDA, YCDA, YCA y Kelman(-).
Kelman +TZC= Color crema, centro rosado oscuro a rojo, bordes irregulares semejantes a estrellitas.
AN= Colonias pequeñas, planas, ligeramente circulares, color blancuzco y bordes irregulares
BK: Crecimiento abundante, sin pigmentación, se tornan blanco grisáceos después de varios días. Crecen a 35 ºC en YDCA
Aún no se ofrece como servicio, sólo se
determinan como Erwinias
Características de las colonias de R. solanacearum (E.F. Smith).
Células en forma de varillas rectas o ligeramente curvada, Gram negativa y
móviles mediante uno o varios flagelos polares, aérobios, oxidasa positiva, catalasa
positiva, licuan lentamente la gelatina o no lo hacen (Palleron,1984).
TZC: Colonias medianas a grandes, color blanco cremoso con una puntuación rosado en
el centro, de forma irregular, semejantes a un helado, visibles a las 48 horas y desarrollo
completo a las 72 con choque térmicos de 30 a 22ºC. Son muy fluidas se deslizan por todo
el medio.
YDC y Kelman (-): Colonias blancas cremosas, superficie lisas, convexas de bordes
irregulares .
BK: No producen pigmentos fluorescentes.
Para Servicio se usa como rutina medio Kelman (+) y Kelman (-)
Características de las colonias de R. solanacearum, mediante el uso del medio
específico TZC (Hayward, 1967, Kelman, 1953 -1954)
Es un microorganismo filamentoso,
heterótrofo.
Produce un micelio fragmentado que puede
Sub-dividirse asexualmente originando
esporas, presenta gran similitud con hongos
pero tiene un micelio de menor diámetro
(Hooker, 1981).
Tiene una estructura celular Procariota, es
aeróbico en el medio de cultivo produce
filamentos y melanina que es un pigmento
café oscuro (Contreras, 2001).
Es Gram (+).
Streptomyces scabies
Actualmente, no se usa como rutina
Proceso estandarizado para detección de dos de las bacterias que afectan la papa
Muestra de
semilla de papa
Desinfección con alcohol isopropílico
80% y flameados. Se Cortan trozos
delgados del haz vascular del
tubérculo o tallitos
Se coloca en bolsas plásticas
gruesas con 20 mL de agua y se
macera
Muestra de
planta de papa
Siembra del Macerado en
los medios K(-),K (+) o AN Incubar 48 a 72 horas 28+2 Se observan y seleccionan
las colonias en el
Estereoscopio
Muestra de
semilla de papa
Desinfección: 1% Hipoclorito de Na
5min, se secan se coloca alcohol
isopropílico 85% y flamean. Se Cortan
trozos delgados del anillo vascular del
tubérculo o tallitos 2X1 mm (Inferiro a
0,50g/tubérculo)
Se coloca en bolsas plásticas
gruesas con 20 mL de agua y se
macera
Muestra de
planta de papa
0,5 mL SMSA 1X +0,5 mL del
extracto en eppendorf de 1,5L.
Incubar en caldo de
enriquecimiento 48 horas 28+2 se
agitan 2 veces/día
Detección de infección latente de R. solanacearum a través de la Técnica de NCM-ELISA (Gutarra y Gamboa, 1995)
Preparación de muestras de plantas y semilla de papa
Actualmente no se cuenta con reactivos para ofrecer el servicio
Detección de infección latente de R. solanacearum a través de la Técnica de NCM-ELISA (Gutarra y Gamboa, 1995)
La Reacción enzimática se observa a través de una
coloración purpura en las muestras positivas con
diferentes intensidades de claro a oscuro (Morado).
Actualmente no se cuenta con reactivos para ofrecer el
servicio
Detección de bacterias de Muestras de suelo
La técnica de extracción de la muestra, dilución seriada y siembra en plato
agar (Medios Generales Y/o Selectivos)
Muestra de suelo Se Tamiza
Tomar 5 g 50 mL de
agua
+
Agitar 2
horas a 100
RPM
Proceso de extracción de suelo y
enriquecimiento para la detección
de R. solanacearum en suelo
mediante ELISA-DAS Pasos de la Prueba de ELISA-DAS
Reacción Final de la
Prueba de ELISA-DAS
Detección de R. solanacerum en suelos por ELISA-DAS
Actualmente no se
cuenta con reactivos
para ofrecer el
servicio