Post on 02-Feb-2016
Estrategias de Secuenciación Estrategias de Secuenciación de Genomasde Genomas
José Guillermo Dávila RamosJosé Guillermo Dávila Ramos
Centro de Ciencias Genómicas, UNAMCentro de Ciencias Genómicas, UNAM
Secuenciación del DNASecuenciación del DNA
Principios y Métodos más Principios y Métodos más empleados empleados
Genomas SecuenciadosGenomas Secuenciados
En años recientes, se ha logrado la secuenciación a gran En años recientes, se ha logrado la secuenciación a gran escala del genoma de organismos eucariotesescala del genoma de organismos eucariotesLos 5 primeros genomas secuenciados de organismos Los 5 primeros genomas secuenciados de organismos pluricelulares son:pluricelulares son:1998 1998 Caenorhabditis elegansCaenorhabditis elegans - 8 x 10 - 8 x 1077 pb - un nemátodo pb - un nemátodo2000 2000 Homo sapiensHomo sapiens - 3 x 10 - 3 x 1099 pb - el Humano pb - el Humano2000 2000 Arabidopsis thalianaArabidopsis thaliana - 1.15 x 10 - 1.15 x 1088 pb- una planta pb- una planta2000 2000 Drosophila melanogasterDrosophila melanogaster - 1.65 x 10 - 1.65 x 1088 pb - la mosca pb - la mosca de la frutade la fruta2002 2002 Anopheles gambiaeAnopheles gambiae - 2.78 x 10 - 2.78 x 1088 pb - el mosquito pb - el mosquito vector de la malariavector de la malaria
Secuenciación Tipo SangerSecuenciación Tipo Sanger
El método de secuenciación de Sanger aprovecha la El método de secuenciación de Sanger aprovecha la forma normal de la replicación del DNAforma normal de la replicación del DNAPara extender la cadena de DNA, usando la DNA Para extender la cadena de DNA, usando la DNA polimerasa, deberá estar presente un grupo hidroxilo polimerasa, deberá estar presente un grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la deoxiribosaen el carbono 3’ de la deoxiribosaLos fragmentos se generan al agregar pequeñas Los fragmentos se generan al agregar pequeñas cantidades de 2’ 3’ dideoxinucleótidos a la reacción cantidades de 2’ 3’ dideoxinucleótidos a la reacción lo que interrumpe la polimerización cada vez que son lo que interrumpe la polimerización cada vez que son incorporados en la cadena de DNAincorporados en la cadena de DNALa polimerasa usada deberá de carecer de la actividad La polimerasa usada deberá de carecer de la actividad de la exonucleasa de corrección 3’ > 5’ para que de la exonucleasa de corrección 3’ > 5’ para que funcione el métodofuncione el método
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azucar
Base
Fosfato
3’
5’
2’
1’4’
DideoxinucleótidosDideoxinucleótidosLa secuenciación de DNA usando La secuenciación de DNA usando el método de Sanger emplea 2’3’-el método de Sanger emplea 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfatados dideoxinucleótidos trifosfatados ademas de los normales 2’-ademas de los normales 2’-deoxinucleótido trifosfatadodeoxinucleótido trifosfatadoYa que los 2’3’-dideoxinucleótidos Ya que los 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfato carecen del grupo 3’ trifosfato carecen del grupo 3’ hidroxilo, y la polimerización del hidroxilo, y la polimerización del DNA ocurre solo en la dirección 3’, DNA ocurre solo en la dirección 3’, cada vez que un 2’3’-cada vez que un 2’3’-dideoxinucleótido trifosfato es dideoxinucleótido trifosfato es incorporado la extención se detieneincorporado la extención se detiene
H
2’3’-dideoxinucleótido monofosfato
2’-deoxinucleótido monofosfato
E
SQ
UE
LE
TO
AZ
UC
AR
-FO
SF
AT
O
H
P
O
HO
O
O
CH2
HOH
P
O
O
HO
O
O
CH2
H
P
O
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N
N
N
O
O
NH2N
NH
N
N
N O
NH2
N
B A
S E
S
Los 2’3’Los 2’3’dideoxi-dideoxi-
nucleótidosnucleótidosterminanterminan
la síntesis la síntesis del DNAdel DNA
OH
P
O
HO
O
O
CH2
HO
O
H 2N
NHN N
N H
H OH
P
O
OH
O
O
CH2
CH 3
O
O
HNN
OH
H
P HO
O
O
CH2
HO
N
O
H 2N
N
H2O
2’3’did
eoxinucleótid
o
Secuenciación de DNASecuenciación de DNA
Plásmido con un fragmento clonado
de DNA
Sitios de Prímeros
fragmento Clonado
Prímero
La Reacción con ddATPLa Reacción con ddATP
5’TTATCG3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’
5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGA
5’TTATCGTACCA
5’TTATCGTACCATGACTA
5’TTATCGTA
5’TTATCGTACCATGA
5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA
5’TTATCGTACCATGACTAGA
Pol.5’TTATCGTA Ya no
puedes!
Pol.5’TTATCGTACCATGA
Otravez!
Pol.5’TTATCGTACCATGACTAGA
NoDe nuevo!
Pol.5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA
A que la!
Separación de los FragmentosSeparación de los Fragmentos
Todos los métodos actuales de Todos los métodos actuales de secuenciación requieren que la secuenciación requieren que la separación de los fragmentos de separación de los fragmentos de DNA detecten diferencias en longitud DNA detecten diferencias en longitud de una basede una baseEsto se logra por una electroforesis Esto se logra por una electroforesis ya sea en geles de poliacrilamida o ya sea en geles de poliacrilamida o en capilares con polímeros líquidosen capilares con polímeros líquidos
Separación de Fragmentos (Sanger)Separación de Fragmentos (Sanger)Los productos de las 4 Los productos de las 4 reacciones, cada una reacciones, cada una conteniendo una pequeña conteniendo una pequeña cantidad de uno de los cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, cuatro dideoxinucleótidos, son cargadas en el gel y son cargadas en el gel y sometidas a electroforesissometidas a electroforesisComo la polimerización es Como la polimerización es solo en dirección 5’ a 3’, los solo en dirección 5’ a 3’, los fragmentos más cortos fragmentos más cortos estarán en 5’ y los más estarán en 5’ y los más largos que se encontrarán largos que se encontrarán en la dirección 3’en la dirección 3’
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5’
a 3’
des
de la
bas
a al
tope
Applied BiosystemsApplied Biosystems
Applied Biosystems (ABI) ha desarrollado colorantes Applied Biosystems (ABI) ha desarrollado colorantes fluorescentes más sensibles, mejorado el método de fluorescentes más sensibles, mejorado el método de cargado de la muestra y la electroforesiscargado de la muestra y la electroforesisCuatro colorantes que fluoresen a una longitud de onda Cuatro colorantes que fluoresen a una longitud de onda distinta, pero con el mismo impacto en la movilidad distinta, pero con el mismo impacto en la movilidad electroforética, pueden ser usados para marcar ya sea electroforética, pueden ser usados para marcar ya sea los prímeros o los nucleótidos que terminan la reacciónlos prímeros o los nucleótidos que terminan la reacciónSi se usan los dideoxinucleótidos fluorados, la reacción Si se usan los dideoxinucleótidos fluorados, la reacción de secuenciación completa se realiza en un solo tubode secuenciación completa se realiza en un solo tuboEn lugar de los geles de poliacrilamida, se emplea un En lugar de los geles de poliacrilamida, se emplea un solo capilar con un polímero líquido que se remplaza al solo capilar con un polímero líquido que se remplaza al final de cada corridafinal de cada corrida
3’AATAGCATAACGTTAACGTTACGCTAT5’Pol.
Oh comeon!
5’TTATCGTACCACPol.
5’TTATCGTACCATAATTNot
Again!
Pol.
Agggg….
5’TTATCGTACCATAATTGCA
Secuencia con Terminadores FluoradosSecuencia con Terminadores Fluorados
5’TTATCG
5’TTATCGTATTGCAATTGCA
5’TTATCGTATTGCAATT
5’TTATCGTA
5’TTATCGTATTGCAAT
5’TTATCGTATTGCAATTG
5’TTATCGTATTGCAA
5’TTATCGTATTGCAATTGC
5’TTATCGTATTGCA
5’TTATCGTAT
5’TTATCGTATTG5’TTATCGTATT
5’TTATCGTATTGC
Pol.5’TTATCGTA Let me
Through!
Como la base al final de cada fragmento esta marcada con un fluoróforo único, la reacción total se puede hacer en un solo tubo
…..
Placa caliente
Pol. líquido
ATTGC A
Sistema Prisma 310 ABISistema Prisma 310 ABI
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reacción Secuencia
Capilar
El ABI Prisma 3700El ABI Prisma 3700
ABI Prism 3700
El Estado del ArteEl Estado del ArteEl ABI Prisma 3730XL, representa la última El ABI Prisma 3730XL, representa la última generación de equipos de secuenciación capilar generación de equipos de secuenciación capilar automáticaautomáticaEl 3730XL puede secuenciar hasta 1,500,000 de bases El 3730XL puede secuenciar hasta 1,500,000 de bases diariasdiariasCon esta capacidad el genoma de una bacteria de Con esta capacidad el genoma de una bacteria de 5,000,000 de pares de bases, puede ser totalmente 5,000,000 de pares de bases, puede ser totalmente secuenciado en un messecuenciado en un mesEl desarrollo más reciente es la piro-secuencia, que El desarrollo más reciente es la piro-secuencia, que incrementa en un orden de magnitud el número de incrementa en un orden de magnitud el número de bases obtenidas por díabases obtenidas por día
Estrategias para la Estrategias para la Secuenciación de GenomasSecuenciación de Genomas
Secuenciación al Azar ySecuenciación al Azar ySecuenciación Jerárquica al Secuenciación Jerárquica al
AzarAzar
Método de Secuenciación al AzarMétodo de Secuenciación al Azar
Fragmentación
clonación
Plásmido
Genoteca del genoma
Secuenciación y alineamientode los insertos
ATTCGCTGGCGGT TTGCTGCAAAATTG CGGTATTGCGCTTGCTGC
Refinamiento
ATTCGCTGGCGGTATTGCGCTTCTGCAAAATTG
Secuencia final
Genoma
Secuenciación Jerárquica al AzarSecuenciación Jerárquica al Azar
1. Fragmentación
2. Clonación
BAC
Genoteca de BACs
Genoma
3. Secuencia de los bordes de los insertos de los BACs y alineamiento para crear un mapa de CONTIGS
4. Secuenciación y alineamientode los insertos de cada BAC
ATTCGCTGGCGGT TTGCTGCAAAATTG CGGTATTGCGCTTGCTGC
Refinamiento
ATTCGCTGGCGGTATTGCGCTTCTGCAAAATTG
Secuencia final
RhizobiumRhizobium
NHNH44++
HH22OO
COCO22
HH22OO
NN22
nódulo
OO22
OO22
Rizósfera
NN22
suelo
fed
cab
Cromosomacircular
Cromosomacircular
PlásmidosPlásmidos
= plásmidosimbiótico
El Genoma de Rhizobium etli
El primer genoma completo hecho en México