Post on 08-Nov-2021
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Estructura y Función de los ácidos nucleicosEstructura y Función de los ácidos nucleicos
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Estructura de los acidos nucleicos
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Diferencias estructurales del ADN y el ARN
Porque 2´-dideoxi en el ADN ?
Dos grupos OH en el ARN lo hacen mássuceptible a hidrólisis.
El ADN sin OH en 2´ es más estable a hidrólisis.
H20
NH3
Porque Timina en el ADN y uracilo en el ARN?
La Citosina se deamina espontaneamenteformando Uracilo
Las enzimas reparadoras reconocen estas"mutaciones" y reemplazan Us por Cs
Si no hubiera Timina (5-metil-U) como distinguir lasU normales de las resultantes de deaminación?
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Estructura secundaria del ADN: Características Principales
Dos cadenas polinucleotídicasenrrolladas en una doble hélice dextrógira
Las hebras son antiparalelas
Los esqueletos azucar-fosfato en el exterior de la doble hélice
Pares de base planares a través de puentes de hidrógeno, en el centro de la estructura
A T (2 H) GC (3H)
Pares de base separados 3.4 A. Una vuelta de hebra (3.4 nm) tiene aprox. 10 pares de base
La posición de los esqueletos azucar-fosfato definen surco mayor y menor.
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Flujo de información en Flujo de información en la célulala célula
Odio ser una molécula de
ADN!!Hay tanta
información que debo recordar!!
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Reglas de síntesis de moléculas informativas
AcidosAcidos nucleicos y proteínasnucleicos y proteínas
Formados por un número Formados por un número limitado de limitado de subunidadessubunidades
Las unidades son Las unidades son agregadas agregadas secuencialmentesecuencialmente formando formando cadenas linealescadenas lineales
Cada cadena tiene un Cada cadena tiene un punto de inicio, avanza en punto de inicio, avanza en una única dirección y tiene una única dirección y tiene un punto de finalizaciónun punto de finalización
Los productos de la síntesis Los productos de la síntesis primaria son modificados primaria son modificados previamente a cumplir su previamente a cumplir su funciónfunción
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Señales en el ADN
Señales Donde comienza y termina un gen?
Donde comienza y termina una proteína?
Como leer estas señales?
Legibilidad
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Reconocimiento de ADN por proteínas
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Legibilidad de secuencias de ADN
Accesibilidad a la secuencia (surcos mayor y menor)Variación con movimientos de pares de baseFormas alternativas del ADN
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La estructura de los ácidos nucleicos no es rígida
Enlaces móvilesEnlace N-glicosídicoEnlace Fosfo-di-éster
Movilidad de las basesdependiendo de la secuencia varía el ángulo entre los pares de base
Ladeado Abertura
Giro Propulsor
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forma Aforma Acondiciones de baja humedadhíbridos ADN-ARN
ARN-ARN11pb/vta
bases inclinadassurco mayor profundosurco menor angosto, mas expuesto
Formas alternativas del ADNforma Zforma Z
alternancia de purinas y pirimidinas (CGCGCG)lev ógira12 pb/vtasurco mayor muy profundo y cerradosurco menor muy expuesto
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Propiedades fisico-químicas de los ácidos nucleicos
Aumento de TemperaturaRegiones ricas en AT se disocian primero
Aumento de TemperaturaDisociación cooperativa de las hebras
Separación de hebras y formación de ovillos
1. Desnaturalización de los ácidos nucleicos
Desnaturalización Parcial del ADN necesaria para procesos de copiado
ExperimentalPor temperaturaSe analiza mediante espectroscopía
Tm : un reflejo de la composición promedio de un ADNDepende del contenido de GC
Tm Temperatura de disociación
T a la que la mitad del ADN está disociado
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Tm : un reflejo de la composición promedio de un ADNSe analiza mediante espectroscopía
Depende del contenido de GC
Tm Temperatura de disociación
T a la que la mitad del ADN está disociado
Denaturalización de los ácidos nucleicos: Tm
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2. Renaturalización del ADN
Reacción BimolecularEncuentro de hebra complementariaZipping de complementariasdepende del tiempo y de la concentración de reactantes
AplicacionesComplejidad del genomaBúsqueda de secuencias específicas
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Permite analizar complejidadde un genoma
Secuencias repetidasreasocian rapidamente
Secuencias únicasreasocian lentamente
Cot1/2
50
100
0
% D
NA
rea
soc
iad
o
log Cot
rápido(repetidos)
intermedio(repetido)
lento (copia única)
Fracciones obtenidas:reasociación rápidareasociación intermediareasociación lenta
Cot1/2
Cot1/2
Reasociación de ADN: complejidad del genoma
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Cot1/2 = 1 / k2 k2 = constante de segundo ordenCo = concentración de ADN t1/2 = tiempo medio de reacción
Cot1/2
50
100
0
% D
NA
reas
ocia
do
I I I I I I I I Ilog Cot
rápido(repetidos)
intermedio(repetido)
lento (copia única)
Fracciones obtenidas:reasociación rápidareasociación intermediareasociación lenta
Cot1/2
Cot1/2
Cinética de reasociación del ADN genómico humano
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3. Hibridación de ácidos nucleicos
En soluciónEn soportes sólidos
Southern Blot ADNNorthern Blot ARNDot blotMicro-arrays
Búsqueda de secuencias específicas en mezclas complejas de ácidos nucleicos
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En soportes sólidosSouthern Blot ADNNorthern Blot ARNDot blotMicro-arrays
3. Hibridación de ácidos nucleicos
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Estructura terciaria de los ácidos nucleicos: palíndromes, horquillas y cruciformes
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Acidos nucleicos monocatenarios:Estructura secundaria y terciaria
Los ARN suelen adoptar distintas conformaciones, muchas de ellas estables y mantenidas por regiones autocomplementarias
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Topología y función
• Superenrrollamiento necesario para la compactación del ADN y su función
• In vivo la mayoría del ADN está superenrrollado negativamente
• Esto favorece la disociación local de las hebras, importantes durante la duplicación y transcripción
• Enzimas topoisomerasas regulan los niveles de superenrrollamiento celular
• Es posible que se formen estructuras alternativas debido a desenrrollamientoslocales generados por superrollamiento
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Estructuras complejas de ARN
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Topología del ADN
Como hace el ADN para caber en los limitados volumenes intracelulares?SuperenrrolamientoAsociación con proteínas
El ADN relajado en forma B tiene 10 pb/vta.
Un ADN superenrrollado tiene mas o menos pb/vta. (superenrrollamiento positivo o negativo)
•Torsión (Twist)
•Superenrrollamientoo Retorcimiento
(Writhe)
Topoisómeros
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Lk = Tw + Wr
Ligazón (Linking number)Torsión (Twist)Superenrrollamiento o Retorcimiento (Writhe)
Al superenrrollar el ADN se genera tensión, que se expresa en un desenrrollamientolocal del ADN (variando la torsion).
Al separar las hebras, se genera tensión que se resuelve enrrollando sobre si misma la molécula de ADN (variando el superenrrollamiento).
Torsión y superenrrollamiento
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Organización del material hereditario
• Necesidad de compactación
Volumen limitadoNeutralización de cargas del ADN
• Organización funcional del ADNmecanismos de segregación en duplicaciónaccesibilidad de proteínas reguladoras de la expresión génica
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El genoma bacteriano incluye un cromosoma circular y moléculas pequeñas circulares (plásmidos)
No existe núcleo definido
ADN en “región nucleoide”
Varios dominios de 40-80 Kb superenrrolladosasociado a ARN y proteínas
El nucleoide bacteriano
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El genoma nuclear humano comprende 46 moléculas de ADN lineales
El largo sumado de este ADN es mas de 1.5 metros
El diámetro del núcleo es aprox. 10 nm
10,000 nm
El núcleo eucariota
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Cromatinacomplejo compuesto por ADN y proteínas
Eucromatina zonas menos condensadas
Heterocromatina zonas más condensadas
Toda la cromatina se condensa previamente a la división celular
El nucleo interfásico
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Durante la división se visualizan cromosomas individuales
Los cromosomas metafásicos son la forma más condensada de la cromatina
Los cromosomas son herramientas de segregación del material hereditario
Cuáles son los pasos de compactación?
El ciclo celular
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A partir de núcleos aislados se puede aislarse cromatina
Al microscopio electrónico se observan fibras de 30 nm y collar de cuentas de 10 nm
La cromatina: microscopía
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Análisis bioquímico
Cantidades similares de ADN y proteínas
Digestión de ADN con nucleasas
repetidos de 160-200pb
Proteínas básicas – HISTONAS
La cromatina: bioquímica
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• Proteínas básicas pequeñas• Altamente conservadas• Centro globular y colas ricas en Lys y Arg• Sitios de acetilación de Lys en colas N terminales (+)• Sitios de fosforilación en Ser en colas de H1
Las histonas
Histone Fold H2A/H2B Dimer “handshake”
H1
H2B
H2A
H3
H4
hélice
variable
conservado
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Las histonas H2A y H2B forman un dímero
Dos H3 y dos H4 forman un tetrámero
Dos dímeros H2A-H2B y un tetrámero H3-H4 forman un octámero con forma de disco aplanado
El octámero de histonas
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•Sobre el octámero se enrrolla el ADN•Cada octámero organiza 145 pb en 1 ¾ vuelta•48 nm ADN en un disco de 6x11nm•Sitios distantes en el ADN se aproximan (accesibilidad)•Otros sitios quedan cubiertos (en la cara interna)
El nucleosoma
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•Cargadas positivamente
•Pasan entre las vueltas de ADN
•Contactan con el ADN adayente y del octámero próximo
Las colas de las histonas del core
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• No forma parte del octámero
•Organiza el ADN a la entrada y salida del octámero
La histona H1
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Hélice nucleosomal
6 nucleosomas por vuelta
El solenoide
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•La modificación de histonas es VITAL en la expresión génica•La acetilación y desacetilación de histonas es cíclica
Cuentas 10 nm
• Colas cargadas + Se unen al ADN de nucleosomes adyacentes
• Alto nivel de histona H1
NO es posible la transcripción
Fibra de 30 nm
• Colas acetiladasNO se unen al ADN
• Bajo nivelde histona H1
Existe transcripción génica
Correlación estructura función
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+ 2M NaCl
histonas
Eliminación de histonas(Tratamiento con detergentes leves o altas concentraciones salinas)
Matriz nuclear proteica y bucles de ADNunidos a la matriz
Matriz nuclear
DNA loops
Proteínas no histonas en la cromatina
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Igual tratamiento en cromosomas metafásicos revela un esqueleto proteico del cromosoma (scaffold) del que salen bucles de ADN de 30 a 100 Kb
La matriz nuclear proteica es el scaffold durante la interfase
El andamiaje (scaffold)
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Existen regiones de ADN que se unen al scaffold
SARs (scaffold attachment regions)MARs (matrix attachment regions)SARs=MARs
Bucles de cromatina
Loops of 30 – 90 kb
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Bucles como dominios de cromatina
Cada bucle fijado al scaffold puede presentar una estructura diferente, mas o menos condensada.
Pueden ser dominios funcionalmente independientes
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Visualización in vivo de niveles superiores de compactación: cromosomas plumulados
A. Lampbrush chromosomes. Cromosomas meióticos apareados parcialmente condensados y pausados durante la profase meiótica para sintetizar ARNs y proteinas a ser almacenadas para el desarrollo temprano del huevo.
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cromátide
radial loopchrosomosome model
1µm
10 µ
m
cromátide
Crom
osom
am
itótic
o
Los bucles de ADN fijados al scaffold se pliegan formando una superhélice
Dominios condensados
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Forma de máxima compactación de la cromatina
Unidad estructural segregacional de la información hereditaria
El cromosoma metafásico
Constricción secundaria Región organizadora nucleolarCon genes ribosomales
CentromeroConstricción primariaSitio de unión de proteínas que forman cinetocoro
Brazos Porciones del cromosoma entre el centrómero y el telómero
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Unidad funcional de la información hereditaria
Centrómero Constricción primaria
Rico en secuencias repetidasSitio de unión de proteínas que forman
cinetocoroFunción = segregación
TelómerosRegiones terminales de los cromosomas
Secuencias repetidas particularesMecanismo de duplicación particular
Función = Integridad cromosómica
Orígenes de replicaciónARS (secuencias de replicación autónomas)
Varios por cromosomaFunción = replicación
El cromosoma
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Citogenética: técnicas de estudio de los cromosomas
La CITOGENETICA analiza la cantidad y morfología de los cromosomasLos cromosomas se pueden describir en base a la posición del centromero
Bandeo cromosómicoTratamiento desnaturalizante o enzimático del cromosoma y posterior tinciónCada cromosoma revela un patrónespecífico de bandas claras y oscuras,
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Revelan diferencias estructurales en la cromatina que constituye cada banda
Tratamiento desnaturalizante o enzimático y tinciónBandas oscuras y claras (1-10 Mb)
•Bandeo G•tratamiento con tripsina
Bandas claras zonas activasreplicación temprana
Bandas oscuras zonas inactivasreplicación tardía
•Bandeo R •patrón opuesto a Bandeo G
•Bandeo C•heterocromatina constitutiva •pericentromérica
Técnicas de bandeo cromosómico
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FISHHibridación in situ sobre cromosomas con sondas fluorescentes
Técnicas de localización cromosómicas
Cariotipo EspectralMultiple FISH con sondas específicas de cada cromosoma marcadas con un fluorocromo diferente
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Tamaño compacto DNA longitud compactado
Núcleo (humano) 2 x 23 = 46 cromosomas 92 moléculas ADN 10 µm esfera 12,000 Mbp 4 m DNA 400,000 x
Cromosma mitótico 2 cromátides, 1 µm espesor 2 moléculas ADN 10 µm forma X 2x 130 Mbp 2x 43 mm DNA 10,000 x
Dominio de ADN Bucle de AND anclado 1 replicón ? 60 nm x 0.5 µm 60 kbp 20 µm DNA 35 x
Fibra de cromatina approx. 6 nucleosomas por vuelta of 11 nm 30 nm diámetro 1200 bp 400 nm DNA 35 x
nucleosoma disco 1 ¾ vueltas de ADN (146 bp) + ADN linker 6 x 11 nm 200 bp 66 nm DNA 6 - 11 x
Par de bases 0.33 x 1.1 nm 1 bp 0.33 nm DNA 1 x
Compactación debida a histonas
Compactación debida al scaffold / matriz nuclear
Niveles de compactación
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Compactación
neutralización de cargas del ADN
mecanismos de segregaciónen duplicación
Represor transcripcional
Dominios topológicos independientes
( Regulación independiente)
Problemas
Que sucede durante la duplicación y la transcripción?
Correlación estructura función