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-Tesis Doctoral-
Estudio a nivel de moléculas individuales de la
actividad de replicación del ADN de la
polimerasa del bacteriófago Phi29
José Alberto Morin Lantero
Julio de 2013
Universidad Autónoma de Madrid
Facultad de Ciencias
Departamento de Física de la Materia Condensada
Memoria presentada para obtar al grado de Doctor en Biofísica
José Alberto Morin Lantero
Junio, 2013
Universidad Autónoma de Madrid
Facultad de Ciencias
Departamento de Física de la Materia Condensada
Directores de tesis:
Dr. Borja Ibarra
IMDEA Nanociencia
Dr. José L. Carrascosa
CNB - CSIC
3
Abstract
The accurate replication of DNA is essential to keep genetic integrity. Replicative DNA polymerases
are the enzymes responsible for DNA synthesis; they work as molecular motors that translocates
along DNA through a series of conformational changes fuelled by dNTP binding and hydrolysis. This
process requires overcoming the energetic barrier associated with the base pair melting of its double
helix and a �ne tuned coordination between the processes of DNA unwinding and replication. One
intriguing question that remains poorly understood is the exact mechanism of the coupling of these
two reactions. Moreover, little is known about the mechanochemistry of translocation: How thermal
and chemical energies are converted to movement? Or more speci�cally, which step of the dNTP
binding and incorporation cycle lead to translocation? In the bacteriophage Phi29 the processes of
replication and unwinding are tightly coupled within the same protein: the Phi29 DNA polymerase.
This polymerase also presents the basic architecture of the polymerase domain, common to all known
polymerases, and the basic features of Family B DNA polymerases.
In this thesis we use optical tweezers to characterize, at a single molecule level, the basis for the
tight coupling between replication and unwinding and the mechanochemistry of translocation in
the Phi29 DNA polymerase. We found, after including the pause kinetic in a model to quantify
the unwinding mechanism, that the wild type and an unwinding de�cient polymerase variant both
destabilize the fork with the same active mechanism: the polymerase destabilize at least two base
pairs in the junction with an energy per base pair of 4Gd = 2 kBT .
We also found that this polymerase presents a robust mechanism, capable of processing DNA at
high opposing forces. For all conditions tested (opposing and aiding forces (−50 to 20 pN)) the
velocity without pauses follows a Michaelis-Menten relation (for dNTP concentrations of 5, 10, 50,
100, 200, 500 µM). The force dependence of the Michaelis-Menten parameters (Vmax and Km)
indicates that the force dependent step in the polymerization cycle is related to the binding step,
suggesting a Brownian ratchet type of mechanism.
5
Índice general
Abstract 5
1. Introducción 5
1.1. La Replicación del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1.1. El ciclo de Polimerización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2. Mecanoquímica de la translocación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3. Estudios a nivel de moléculas indviduales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.3.1. Técnicas experimentales de molécula individual . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.3.2. Aplicaciones al estudio de la replicación del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.4. La polimerasa de ADN de Phi29 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2. Objetivos 29
3. Materiales y Métodos 31
3.1. El instrumento de pinzas ópticas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.1.1. Diseño de la celda de �uidos y sistema de �uidos. . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.2. Diseño de las moléculas de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.2.1. Estudio del acoplamiento de las actividades de extensión del primer y despla-
zamiento de banda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.2.2. Estudio del mecanismo de translocación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.2.3. Preparación de las asas con digoxigeninas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.3. Protocolo experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.3.1. Protocolo para unir las moléculas de ADN entre las microesferas. . . . . . . . 38
3.3.2. Tampones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.3.3. Obtención de las microesferas recubiertas con antidigoxigenina. . . . . . . . . 39
3.4. Polimerasa de ADN de Phi29 salvaje, mutante D12AD66A y biotinilada. . . . . . . . 39
i
3.5. Dependencia del tiempo de residencia con la secuencia de la horquilla. . . . . . . . . 40
4. Resultados 41
4.1. Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . 41
4.1.1. Diseño experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.1.2. Caracterización de la horquilla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.1.3. Detección de Actividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.1.4. Efecto de la estabilidad de la horquilla en la velocidad de replicación . . . . . 47
4.1.5. Cinética de Pausas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.1.6. Cuanti�cación del mecanismo de apertura de la doble hebra. . . . . . . . . . . 58
4.2. Mecanoquímica de la translocación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.2.1. Diseño experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.2.2. Detección de Actividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.2.3. Efecto de la fuerza y la concentración de nucleótidos en la actividad de repli-
cación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
5. Discusión 77
5.1. Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . 77
5.2. Mecanoquímica de la translocación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
6. Conclusiones 85
Agradecimientos 87
7. Anexos 89
7.1. Ensayo bioquímico de actividad de polimerización, exonucleólisis y desplazamiento de
banda de la polimerasa de Phi29 etiquetada con biotina en el extremo amino-termial. 90
7.1.1. Ensayo acoplado de polimerización/exonucleólisis (pol/exo). . . . . . . . . . . 90
7.1.2. Ensayo de desplazamiento de banda acoplado a la replicación del ADN M13. . 91
7.2. Determinación de las energías de enlace entre pares de bases AT y GC. . . . . . . . . 91
7.3. Modelo de Betterton y Julicher . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
7.4. Artículos publicados durante el periodo de tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
Bibliografía 99
Nomenclatura 109
ii
Índice de �guras
1.1. Proteínas que componen la horquilla de replicación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2. El ciclo de polimerización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3. Transición de la con�guración abierta a cerrada en el dominio dedos de la polimerasa Klentaq1. . . 10
1.4. Diagrama de energía libre de una reacción afectada por una fuerza inhibitoria. . . . . . . . . . . 12
1.5. Elasticidad del ADN de cadena doble y sencilla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.6. Ejemplo de aplicaciones de las técnicas de manipulación de moléculas individuales al estudio de
polimerasas de ADN, ARN y helicasas a nivel de moléculas individuales. . . . . . . . . . . . . . 21
1.7. Estructura del complejo binario de la polimerasa de Phi29 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.1. Construcción de la celda de �uidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.2. Representación esquemática (no a escala) de la horquilla construida para el estudio de la replicación
acoplada al desplazamiento de banda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.3. Representación esquemática del diseño y componentes de las moléculas de ADN utilizadas para
formar el complejo ADNp-ADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4.1. Diseño experimental. Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda . . . . . . . . 42
4.2. Detección de las actividades de desplazamiento de banda y extensión del primer. . . . . . . . . . 43
4.3. Determinación de la curva de fuerza-extensión del ssDNA para el estudio de la replicación acoplada
al desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.4. Dependencia con la tensión de las velocidades medias para la polimerasa salvaje y el mutante ddb. . 48
4.5. Dependencia del tiempo de residencia con la secuencia para la polimerasa salvaje y el mutante ddb. 49
4.6. Procedimiento de detección de pausas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.7. Procesividad de las polimerasas salvaje y mutante ddb. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.8. Dependencia de la duración de pausas con la concentración de polimerasa para las polimerasas salvaje
y mutante ddb. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
1
4.9. Comportamiento de la frecuencia de pausas para la polimerasa salvaje. Estudio del acoplamiento
entre las actividades de desplazamiento de banda y replicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
4.10. Comportamiento de la frecuencia de pausas para el mutante ddb. Estudio del acoplamiento entre las
actividades de desplazamiento de banda y replicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
4.11. Duración de pausas para las polimerasas salvaje y mutante ddb. . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4.12. Representación esquemática y notación del modelo utilizado para describir el avance de la polimerasa
en las condiciones de desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.13. Predicción de la velocidad media de desplazamiento de banda con valores alternativos de ∆Gd y M . 64
4.14. Diseño experimental. Estudio del mecanismo de translocación. Con�guración fuerza a favor. . . . . 68
4.15. Diseño experimental. Estudio del mecanismo de translocación. Con�guración fuerza en contra. . . . 69
4.16. Actividad de replicación de la polimerasa inmovilizada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.17. Determinación de la curva de fuerza-extensión del ssDNA. Mecanismo de translocación. . . . . . . 70
4.18. Procedimiento de detección de pausas. Mecanismo de translocación . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.19. Frecuencia y duración de pausas. Mecanismo de translocación . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.20. Dependencia de la velocidad de replicación con la fuerza a diferentes concentraciones de dNTP en
los modods de extensión del primer y desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.21. Dependencia de la velocidad sin pausas con la concentración de nucleótidos . . . . . . . . . . . . 75
4.22. Dependencia de de Km, Vmax y Kb con la fuerza. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
5.1. Mecanismo de apertura del ADN propuesto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
5.2. Efecto de la fuerza en la estabilidad del complejo binario/terciario . . . . . . . . . . . . . . . . 82
7.1. Ensayo acoplado de polimerización/exonucleólisis (pol/exo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
7.2. esplazamiento de banda acoplado a la replicación del ADN M13 . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
7.3. Determinación de las energías de enlace entre pares de bases AT y GC . . . . . . . . . . . . . . 93
7.4. Alineamiento de las curvas experimentales de apertura mecánica de la doble hebra. . . . . . . . . 95
2
Índice de tablas
4.1. Rates y cambios conformacionales durante las reacciones de extensión del primer (e. p.) y despla-
zamiento de banda (d. b.) determinados a partir de ajustes independientes a la dependencia de la
frecuencia y duración de pausas con la tensión. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.2. Rates de entrada y salida durante las reacciones de polimerización y desplazamiento de banda (poldb)
y solo polimerización (pol) determinados a partir de la distribución de frecuencia de duración de pausas. 61
4.3. Rates de entrada a pausa por unidad de tiempo sin pausa, (a f = 0), y cambios conformacionales
durante las reacciones de polimerización y desplazamiento de banda (poldb) y solo polimrización (pol)
determinados a partir de la dependencia de tensión de la longitud y la frecuencia de pausas. . . . . 63
3
1 Introducción
1.1. La Replicación del ADN
La molécula de ADN contiene toda la información genética necesaria para la vida. Antes de cada
evento de división celular, se deben hacer nuevas copias de cada una de las muchas moléculas que
forman la célula, incluyendo la duplicación de todas las moléculas de ADN. La replicación es el
proceso de duplicación de la información genética (los genes), que permite que esta información pase
de cada célula a las dos células hijas producto de la división celular y por tanto de un organismo a
su descendencia (Alberts (2003)).
La estructura del ADN, una doble hélice formada por cadenas complementarias antiparalelas (Wat-
son (1953)), tiene consecuencias notables en el proceso de replicación. El hecho de que cada nucleótido
en una de las cadenas esté apareado con un nucleótido complementario de la cadena opuesta, signi�ca
que cualquier parte de la secuencia podría actuar como una plantilla para la parte correspondiente
de la cadena complementaria. Esta estructura ofrece además, la estabilidad física necesaria, en las
condiciones del interior celular, a una molécula cuya función principal es la de contener la informa-
ción genética. Al mismo tiempo, cualquier mecanismo de lectura, ya sea durante la replicación o la
transcripción de genes, requiere el acceso dinámico a la secuencia de bases escondidas en el interior
de la doble hélice. Por esta razón, el proceso de apertura de las dos cadenas no puede ser espontá-
neo, sino que requiere de proteínas especializadas capaces de vencer el conjunto de interacciones que
mantienen unidas las dos cadenas.
La replicación en el interior celular es llevada a cabo por un complejo de proteínas llamado �repliso-
ma�, que se ensambla para formar una estructura en forma de �Y� llamada horquilla de replicación
(Cairns (1963)) y de la cual la polimerasa replicativa de ADN, la enzima responsable de copiar el
ADN, es su componente fundamental, Figura 1.1.
Esta proteína utiliza la energía proveniente de la unión e hidrólisis de los nucleótidos trifosfato (dATP,
dTTP, dGTP, dCTP) para desplazarse, en la dirección 3' a 5' de la cadena molde, incorporando
5
Capítulo 1 Introducción
AbrazaderaMdeslizante
Helicasa
PolimerasaMenMlaMcadenaMlíder
PrimasaPrimosoma
Topoisomerasa
ParentalMDNAMhelix
ProteínaMdeMuniónMaMcadenaMsencilla
FragmentoMdeMOkazakiM
MoldeMlíder
CargadorMdeMabrazadera
CebadorMdeMARN
MoldeMretrasado
Figura 1.1: Reproducido de Alberts (2003). Proteínas que componen la horquilla de replicación. La maquinaria
de replicación en organismos tan variados como virus, bacterias y eucariotas posee un conjunto de proteínas que
realizan funciones similares. Cada sistema consiste en una molécula de polimerasa de ADN en la hebra líder y
una en la retrasada, una primasa, proteínas de unión a cadena sencilla que revisten al ADN molde y lo mantienen
abierto y con las bases expuestas, una helicasa que junto a la topoisomerasa promueven la apertura la doble hélice y
proteínas accesorias adicionales que mantienen las polimerasas unidas entre si y al molde de ADN . Adicionalmente,
se necesitan un conjunto de proteínas (no se muestran) que promueven la formación de la horquilla en el origen de
replicación, una enzima ARNasaH para eliminar los primers de ARN de los fragmentos de Okazaki y una ligasa de
ADN para sellar los fragmentos de Okazaki adyacentes entre sí para formar una cadena de ADN continua.
secuencialmente el nucleótido seleccionado, de acuerdo a su emparejamiento con el complementario
(T, A, C o G, respectivamente), al extremo 3' de la cadena naciente. La direccionalidad química
de la cadena sencilla de ADN y el hecho de que las dos cadenas que forman la doble hebra sean
antiparalelas implica que sólo una de las cadenas hija pueda ser sintetizada de manera continua, por
una polimerasa que se mueve a lo largo de la cadena líder, mientras otra copia de la polimerasa es
necesaria para la síntesis de la cadena retrasada, a través de la síntesis una serie de fragmentos cortos
de ADN llamados fragmentos de Okazaki (Okazaki et al. (1968)). Además del molde, las polimerasas
de ADN necesitan un extremo de una cadena de ADN o ARN preexistente (un cebador, en inglés
primer) al cual unir el nucleótido incorporado. Por esta razón la polimerasa de la cadena retrasada
necesita la acción de una enzima llamada primasa que produce una molécula corta de ARN que
actúa como primer de cada fragmento de Okazaki.
La �delidad del proceso de replicación es crucial para mantener la estabilidad genética. En general,
este proceso se lleva a cabo cometiendo un error por cada 109 - 1010 bases replicadas. Esta alta
6
1.1 La Replicación del ADN
precisión se logra mediante la combinación de diferentes mecanismos que funcionan al unísono: i) La
selectividad del nucleótido correcto durante la síntesis procesiva, ii) la capacidad de corrección de
errores que tienen muchas polimerasas y iii) mecanismos de eliminación de errores una vez el error
ha sido incorporado.
Ante el evento de incorporación de un nucleótido incorrecto, muchas polimerasas poseen una activi-
dad de corrección exonucleasa asociada que hidroliza los nucleótidos de la cadena primer apareados
de forma incorrecta, mejorando la �delidad en más de 100 veces (Kunkel (2004)). En el caso en que
un error se sella y queda incorporado en el genoma, existen mecanismos de reparación que eliminan
la/s base/s erróneas. La mayor contribución a la �delidad en el proceso de replicación la aporta la
actividad de la polimerasa de ADN.
La helicasa replicativa de ADN es la enzima encargada de abrir la doble hebra. Esta proteína se
mueve a lo largo de una de las cadenas forzando a la doble hélice a abrirse por delante de la horquilla
de replicación de manera que la juntura (frontera entre la región de cadena doble y de cadena sencilla)
de la horquilla se desplaza en la dirección de replicación de la cadena líder al tiempo que las bases
del ADN queden expuestas para ser copiadas por la polimerasa. Estas proteínas poseen actividad
ATP-asa, lo que les permite convertir la energía química proveniente de la hidrólisis dATP en trabajo
mecánico capaz de generar movimiento unidireccional y aportar energía al proceso de separación de
las cadenas de la doble hebra(Lohman and Bjornson (1996)).
La maquinaria replicativa se alinea de manera especí�ca de modo que cada paso sucesivo está
�namente regulado por el anterior dando lugar a un proceso extremadamente complejo, pero a su
vez rápido e increíblemente preciso. La caracterización de un sistema biológico como la replicación del
ADN, requiere responder preguntas fundamentales sobre la mecánica, dinámica y mecanoquímica
del proceso: ¾Cómo modulan las propiedades físicas del ADN la organización y actividad de la
maquinaria replicativa?, ¾Cómo están acopladas las reacciones de apertura y replicación del ADN?
¾Cuál es el mecanismo físico que utilizan las polimerasas y helicasas replicativas para replicar y
desestabilizar la juntura al mismo tiempo?
Por otra parte, poco se sabe acerca de la dinámica y mecanoquímica de translocación de las polime-
rasas replicativas: ¾Cómo convierten estas proteínas las energías térmica y química en movimiento
a lo largo del ADN? ¾Qué paso del proceso de unión e incorporación de dNTP conlleva a la translo-
cación? O de manera más general, ¾Presenta la polimerasa un mecanismo de `Brownian ratchet' en
el cual la unión de dNTP solo es capaz de capturar y estabilizar el estado translocado o presenta un
mecanismo de `power stroke' en el cual la hidrólisis de dNTP, o la liberación del producto, induce
7
Capítulo 1 Introducción
un cambio conformacional en la proteína que �empuja� la enzima hacia delante (Steitz (2006))?
1.1.1. El ciclo de Polimerización
Todas las polimerasas de ADN de una sola unidad, de las cuales se conoce su estructura, a pesar de
provenir de organismos que cubren toda la gama de seres vivos (Archaea, Bacteria, Eukaria y virus)
y de presentar una gran disparidad en su secuencia, presentan un dominio de polimerización con
una arquitectura básica y una relación espacial similar, que asemeja la forma de una mano derecha
formada por subdominios identi�cados como palma, pulgar y dedos (Rothwell and Waksman (2005)).
Los subdominios pulgar y dedos forman una hendidura en forma de �U� debajo de la cual se encuentra
el subdominio catalítico palma. El subdominio pulgar estabiliza el dúplex primer-molde, producto de
la síntesis, mientras que el subdominio dedos contiene residuos básicos que unen la región trifosfáto
del nucleótido entrante y el pirofosfato, producto de la reacción de transferencia fosforil.
Un mecanismo cinético estándar, basado principalmente en estudios de pre-steady state kinetics of
nucleotide turnover, (Johnson (1993)), también se ha propuesto para todas las polimerasas conocidas
y se inicia una vez la enzima se ha unido al extremo terminal del primer (p/t) para formar el
complejo enzima-p/t (E:p/t) (paso 1), Figura 1.2. La unión de la proteína al sitio p/t redunda en
cambios conformacionales en la proteína fundamentalmente localizados en el dominio pulgar y cuyo
resultado global es el de formar un cilindro que rodea completamente al ADN. Las interacciones
que se establecen entre la proteína y la porción corriente arriba del ADN, además de mantener el
extremo 3' del primer alineado con el sitio activo de polimerización, permiten que la proteína se
mantenga unida al ADN durante el proceso de polimerización procesiva.
El siguiente paso del ciclo de incorporación es la unión del nucleótido (dNTP) al complejo E:p/t (paso
2). Estudios estructurales sugieren que las polimerasas de la familia A (polimerasas de reparación
en bacterias, la mayoría de las polimerasas replicativas en bacteriófagos, y la polimerasa de ARN de
T7) unen el nucleótido entrante a un sitio de pre-inserción localizado cerca del dominio dedos antes
de acompañarlo al sitio de inserción, estando la base de cada nucleótido apuntando hacia la zona de
unión a ADN. Por otra parte, debido a que las polimerasas de la familia B (replicación del genoma
en virus y eucariota) presentan una discriminación mucho mayor entre el nucleótido correcto y el
incorrecto, se ha propuesto que estas polimerasas unen el nucleótido directamente en el sitio activo.
En todo momento el subdominio dedos �uctúa entre una conformación abierta y cerrada, estando la
conformación abierta favorecida en ausencia del nucleótido entrante o del producto pirofosfato (Dahl
8
1.1 La Replicación del ADN
3'
5'
-10
+15'
sitio)de)inserciónMolde
Primer5'
3'-10
+15'
dNTP)entrante5'
3'-10
+15'
Pol)+)p/t)DNA))))(binario)))
3'
5'
-10+1
5'
3'
5'
Translocación)?
Pol+p/t+dNTPpre-inserción)
-10
+15'
Pol+p/t+dNTPpost-inserción
(ternario)
Liberación)depirofosfáto
Pol+p+1/t)pre-traslocación)))))))))))))
Moldecorriente)abajo
Pol+p+1/tpost-traslocación)
(binario)
Figura 1.2: El ciclo de polimerización. Reproducido de Berman et al. (2007). La polimerasa (círculo gris) se
une a un molde con un extremo 3' (azul y rojo) para formar el complejo binario E:p/t , seguido de lo cual el
nucleótido entrante (verde) se une al sitio de inserción (naranja) para formar el complejo ternario (E:p/t:dNTP).
La incorporación del dNTP al la hebra primer, catalizada por la polimerasa, resulta en la extensión del primer un
nucleótido más una molécula de pirofosfato unida cerca del sitio activo. La liberación de pirofosfato es necesaria
para que el nucleótido recién incorporado se mueva desde el sitio de inserción al sitio de priming.
et al. (2012); Rothwell et al. (2005)). Adicionalmente, en la con�guración abierta de los dedos, un
impedimento estérico se inserta en el sitio activo de polimerización y se posiciona encima del primer
par de bases del dúplex, Figura 1.3a, bloqueando el acceso directo del nucleótido entrante a la base
molde. En la conformación cerrada los dedos se mueven hacia adentro y se posicionan mucho más
cerca del sitio activo de polimerización, lo que facilita que los grupos fosfato del nucleótido entrante
actúen como un intermediario electrostático1 entre residuos básicos en la punta de los dedos y los
iones metálicos catalíticos quelados por los residuos conservados del subdominio palma, estabilizando
de esta forma la conformación cerrada (Rothwell and Waksman (2005)), Figura 1.3b. Durante esta
transición, el impedimento estérico es liberado del sitio activo, lo que permite a la primera base de la
cadena sencilla (la base molde) posicionarse en frente del nucleótido entrante en una con�guración
espacial similar a la que tendría si formara parte de la doble hebra. Una de las características más
llamativas de esta conformación es que contiene, universalmente, una interfase plana con la cual
veri�car la disposición de planos paralelos inherente al apareamiento de Watson y Crick (Steitz
1Corsslink
9
Capítulo 1 Introducción
(2006)).
(a)
Tyr 671
Base MoldeMoldeMolde
(b)
Figura 1.3: Transición de la con�guración abierta a cerrada en el dominio dedos de la polimerasa Klentaq1. En la
con�guración abierta de los dedos 1.3a, la Tirosina 671 se inserta en el sitio activo de polimerización bloqueando
el acceso directo del nucleótido entrante a la base molde (violeta). En la conformación cerrada 1.3b los dedos se
mueven hacia adentro y se posicionan mucho más cerca del sitio activo de polimerización, lo que facilita que los
grupos fosfato del nucleótido entrante (gris) actúen como un intermediario electrostático entre residuos básicos en
la punta de los dedos y los iones metálicos catalíticos quelados por los residuos conservados del subdominio palma
(naranja). Durante esta transición, el impedimento estérico es liberado del sitio activo.
Como se ha mencionado, la �delidad en la replicación de la información genética es un requerimiento
esencial del ciclo de polimerización. La idea inicial, propuesta por Watson y Crick y basada en
la estructura del ADN, fue que la selección estaba determinada por el apareamiento basado en
los enlaces de hidrógeno de las bases A-T y G-C. Sin embargo, la diferencia de energía, debida
exclusivamente a los enlaces de hidrógeno, entre la formación de un par de bases A-T y uno G-C
podría explicar a lo sumo una frecuencia de error de 10−2, (Loeb and Kunkel (1982)), en clara
contradicción con la frecuencia observada (∼ 10−3 - 10−6). La estructura del sitio de unión en la
conformación cerrada de los dedos provee una lectura estérica mucho más estricta y se piensa que
juega el papel fundamental en la discriminación entre el nucleótido correcto y el incorrecto.
Una vez en la con�guración cerrada de los dedos, ocurre una transición estructural, presumiblemente
el paso limitante de la reacción, en la cual todos los componentes del sitio activo son ensamblados y
organizados en una con�guración topológica y geométrica que le permite a la enzima llevar a cabo el
paso de la reacción química: una reacción de transferencia fosforil que implica el ataque nucleofílico
del grupo 3'-OH del extremo terminal del primer al fosfato alpha del dNTP entrante (paso 4).
10
1.2 Mecanoquímica de la translocación.
El sitio activo de polimerización se de�ne por un conjunto de grupos carboxilato y otros residuos
polares conservados en la hendidura de la base de la polimerasa. En particular, los grupos carboxilato
sirven para anclar dos iones metálicos divalentes (generalmente Magnesio) uno de los cuales promueve
la deprotonación del grupo 3' OH del extremo del primer, mientras que el otro estabiliza la carga
negativa que surge debido a la salida del oxigeno y se une a los fosfatos β y γ, facilitando la salida
del grupo PPi, promovida por un segundo cambio conformacional en el dominio dedos (paso 5). La
necesidad de tener un grupo 3'- OH para catalizar la inserción de un nuevo nucleótido explica el por
qué las polimerasas de ADN necesitan un primer, o lo que es lo mismo, no pueden iniciar la síntesis
de novo. Una vez que ocurre la reacción, el nucleótido recién incorporado se mueve desde el sitio
de inserción al sitio priming, liberando el sitio de inserción para que un nuevo nucleótido pueda ser
incorporado (síntesis procesiva).
Como resultado global del ciclo, la polimerasa ha incorporado un nuevo nucleótido y se ha desplaza-
do (translocado) sobre la cadena molde una base corriente abajo. En otras palabras, las polimerasas
de ADN transforman la energía química, proveniente de la unión y/o hidrólisis del nucleótido incor-
porado o la liberación del producto PPi en el trabajo mecánico asociado al desplazamiento sobre la
cadena sencilla molde. En cierto sentido la fuerza desarrollada por la polimerasa puede ser consi-
derada como un producto de la reacción química de polimerización. Por tanto, una fuerza externa
que se opone al movimiento puede actuar como un inhibidor de la reacción y una que asista puede
promover la reacción y actuar como un activador. Como resultado, la velocidad del motor frecuen-
temente depende de la fuerza externa y de la concentración de substrato de una manera dictada
por el mecanismo de operación. Por esta razón, la fuerza desarrollada por, o aplicada sobre el motor
resulta una variable natural para la descripción de estas proteínas en cuanto a su carácter mecánico,
así como las concentraciones de substrato y producto lo son en cuanto a sus propiedades catalíticas.
1.2. Mecanoquímica de la translocación.
Papel de la fuerza en la termodinámica y cinética de la reacción. De manera general la aplicación
de una fuerza externa sobre un sistema molecular tiene dos efectos inmediatos: i) Primeramente
introduce una dirección privilegiada que se convierte en la coordenada de reacción natural a lo largo
de la cual la reacción va a proceder, por lo que el diagrama de energía de la reacción puede ser descrito
como función de la posición a lo largo de esta coordenada, Figura 1.4. y ii) si el trabajo asociado se
realiza de manera reversible, a temperatura y presión constante, todo el trabajo entregado al sistema
11
Capítulo 1 Introducción
va a ser empleado en alterar la energía libre de la reacción, ∆G0 (Tinoco and Bustamante (2002);
Bustamante et al. (2004)).
Gx
A
B
∆G‡
∆x‡A
∆xAB
f ∆x AB
f ∆x‡A
∆G0
Figura 1.4: Diagrama de energía libre hipotético de una
reacción afectada por una fuerza inhibitoria. La �gura
muestra un diagrama de energía hipotético (línea sólida
roja) que conecta los estados A (inicial) y B (�nal) con
la coordenada mecánica, x , correspondiente al desplaza-
miento a lo largo de la dirección de translocación. En
este ejemplo, una fuerza inhibitoria f , inclina el per�l de
energía una cantidad igual al trabajo realizado en con-
tra de la fuerza aplicada, produciendo un cambio (línea
discontinua azul) en el per�l original. El estado de tran-
sición de la reacción se incrementa la cantidad f ·∆x‡A,donde ∆x‡A es la distancia al estado de transición locali-
zado entre A y B. La fuerza también afecta la termodiná-
mica del equilibrio entre los estados, elevando la energía
relativa del estado B la cantidad f ·∆xAB , donde ∆xAB
es la distancia de equilibrio entre A y B .
La Figura 1.4 muestra un diagrama de energía
libre, a lo largo de la coordenada establecida por
la aplicación de una fuerza externa, de una reac-
ción en la cual la especie A se convierte en la
especie B. Los estados A y B son observables
del sistema con mínimos en las posiciones xA y
xB, que en el caso de los motores moleculares
que translocan sobre el ADN de cadena sencilla
se corresponden a posiciones de bases contiguas.
En este ejemplo, la aplicación de una fuerza (f)
inhibidora cambia el per�l de energía libre ori-
ginal de la reacción (línea sólida roja) de modo
que la constante de equilibrio se ve afectada de
la forma:
K (f) = K (0) · exp
[−f ·∆xAB
kBT
](1.1)
donde K (0) es la constante de equilibrio de la
reacción en ausencia de fuerza externa y está to-
talmente de�nida por el cociente entre las pro-
babilidades de ocupación de los estados B y A,
que a su vez viene determinado por la diferencia de energía estándar entre estos estados (∆G0).
∆xAB = xB − xA es el cambio conformacional asociado a la transición A → B; kB es la constante
de Boltzmann y T es la temperatura absoluta.
Además de afectar la diferencia de energía estándar ∆G0 entre los estados A y B, si una fuerza
externa se opone a la reacción en un determinado sentido, por ejemplo en el sentido A → B,
entonces la energía libre del estado de transición ∆G‡ relativa a ese estado aumenta la cantidad
f · ∆x‡A, siendo ∆x‡A = x‡ − xA la distancia al estado de transición desde el estado A. Por el
contrario, la diferencia de energía entre el estado B y el estado de transición disminuye una cantidad
f ·∆x‡B con ∆x‡B = xB − x‡. En consecuencia, los rates de transición a través de la barrera también
12
1.2 Mecanoquímica de la translocación.
se ven afectados por la fuerza, según (para la transición A→ B):
kA→B (f) = kA→B (0) · exp
[−f ·∆x‡AkBT
](1.2)
donde kA→B (0) es el rate de transición del estado A al B en ausencia de fuerza. Una expresión
similar se aplica a la transición B → A.
Por lo tanto, la aplicación de una fuerza externa hace posible modular el equilibrio de una reacción
en la cual ocurre un cambio conformacional, así como afectar los rates independientes en uno u
otro sentido de la reacción. Adicionalmente, permite conocer las distancias características entre los
estados así como la distancia al estado de transición.
Efecto combinado de la fuerza y la concentración de substrato. Como se ha mencionado, la
característica fundamental que de�ne a una proteína como un motor molecular es que utiliza alguna
fuente de energía química para realizar trabajo mecánico. La manera en que se insertan los cambios
conformacionales en el ciclo catalítico de la enzima, o más directamente, la identidad de los pasos
de este ciclo asociados a la generación de fuerza, de�nen la mecanoquímica del motor. Para la
descripción apropiada del ciclo mecanoquímico característico de estos sistemas se deben tener en
cuenta pasos catalíticos que conecten los distintos estados químicos y pasos mecánicos que conecten
los diferentes estados conformacionales. Un camino de reacción debe incluir al menos un paso de
unión del sustrato, un paso de reacción química (hidrólisis), un paso de liberación de productos y
un paso mecánico, asociado a un cambio conformacional (que puede coincidir o no con alguno de los
pasos químicos) (Keller and Bustamante (2000); Bustamante et al. (2004)).
Asumiendo un ciclo mecanoquímico irreversible (como es el caso en el límite cuando la concentración
de productos de la reacción tiende a cero), la velocidad a la que la enzima completa un ciclo, kt, (en
inglés turnover rate) viene dada por la ecuación de Michaelis-Menten:
kt =kcat · [S]
KM + [S](1.3)
donde [S] es la concentración de sustrato, kcat es la velocidad catalítica máxima en unidades de
moles · sec−1 y KM la constante de Michaelis-Menten. En los experimentos en los que se aplica una
fuerza externa, ya sea opuesta o a favor de la dirección de movimiento del motor, la determinación
de la velocidad del motor, dada por v = δ ·kt2, donde δ es el tamaño del paso, en función de la fuerza2En esta de�nición se ha asumido, por simplicidad, que cada evento de catálisis produce un evento de movimiento
13
Capítulo 1 Introducción
informa sobre el paso del ciclo mecanoquímico implicado en la generación de fuerza (sólo el paso
que conlleva a un cambio conformacional genera una señal observable). Sin embargo, dado que sólo
se puede ver el efecto una vez completado el ciclo, esta curva no nos informa sobre la localización
de este paso (acoplamiento entre la reacción química y el paso mecánico), por lo que es necesario
conocer el comportamiento de esta magnitud a diferentes concentraciones de substrato y producto.
A concentraciones saturantes de substrato ([S] � KM ), la velocidad máxima, v ∼ Vmax = δ · kcat,
es independiente de substrato por lo que va a depender, en general, de todos los rates de transición
excepto aquellos asociados al paso de unión a substrato. A bajas concentraciones ([S] < KM ), la
velocidad está limitada por la unión de substrato, v ∼ δ · kcatKM·[S], donde kcat/KM es una constante de
unión (binding) efectiva, por lo que va a depender de todos los rates que conectan reversiblemente los
estados de la enzima conectados con el estado de unión a substrato y del rate de entrada al primer
estado irreversible posterior a la unión. En consecuencia, la localización del paso dependiente en
fuerza dentro del ciclo mecanoquímico, o lo que es lo mismo, la identidad de los rates de transición
que dependen de fuerza, dicta como va a ser la dependencia en fuerza de las magnitudes Vmax y kcatKM
.
La presencia de un paso ireversible introduce una separación muy clara entre los estados anteriores,
relacionados con la unión a substrato y los posteriores, completamente separados de estos. Tres
casos se pueden dar, en dependencia de donde se localiza el paso dependiente de fuerza (paso de
movimiento) con respecto al paso irreversible del ciclo.
El paso dependiente de fuerza coincide con el paso de unión a substrato. En este caso, una
fuerza que se opone al movimiento del motor actúa como un inhibidor competitivo para el substrato,
desplazando el equilibrio hacia el estado de la enzima libre y reduciendo por tanto la constante
de unión efectiva (kcat/KM ). Sin embargo, la adición de mas substrato contrarresta este efecto,
desplazando el equilibrio de vuelta al estado enzima-substrato. Como resultado, la velocidad a una
concentración in�nita de substrato (Vmax) no se ve afectada por la fuerza mientras que KM aumenta
con la fuerza, ya que cada vez hace falta más substrato para compensar el efecto de la fuerza.
El paso dependiente de fuerza está después del primer paso irreversible y precede al próximo
evento de unión. En este caso, una fuerza opuesta al movimiento del motor afecta el equilibrio
entre estados que no están conectados a la unión de substrato, como un inhibidor no competitivo.
Como resultado, cuando la unión de sustrato es limitante ([S] < KM ), la velocidad (v ∼ δ · kcatKM· [S])
(acoplamiento uno a uno)
14
1.3 Estudios a nivel de moléculas indviduales.
no depende de la fuerza3. En el otro extremo ([S] � KM ), la velocidad (v = Vmax) disminuye con
la fuerza, dado que el paso dependiente de fuerza (translocación) no está asociado a la unión de
substrato, por lo que el efecto de la fuerza permanece aun en condiciones de saturación. En este
caso, KM y Vmax deben tener la misma dependencia en fuerza, para garantizar la independencia de
fuerza de kcat/KM .
El paso dependiente de fuerza coincide con el primer paso irreversible. Este es un caso in-
termedio entre los dos anteriores, en el que una fuerza opuesta actúa como un inhibidor mixto (no
competitivo). Debido a que el paso irreversible está conectado de manera indirecta tanto a los pasos
relacionados con la unión a substrato, como a los posteriores a ésta (corriente abajo del paso irrever-
sible), tanto la constante de unión efectiva kcat/KM como la velocidad a concentraciones saturantes,
Vmax, van a estar afectadas por la fuerza. En este casoKM puede aumentar o disminuir como función
de la fuerza dependiendo de cómo la fuerza afecte relativamente a Vmax y a kcat/KM .
A pesar de la gran cantidad de estudios estructurales y cinéticos disponibles sobre polimerasas
replicativas, existe debate acerca de cuál de los pasos del ciclo de polimerización conduce a la
translocación []. Dos modelos, el power stroke y el browninan ratchet, han sido propuestos para
explicar el acoplamiento de la energía química y térmica a la translocación. En el contexto del ciclo
de polimerización, un mecanismo de power stroke implicaría que la energía para la translocación
se obtiene de la disociación del producto pirofosfato y es empleada para generar el movimiento
de translocación o lo que es lo mismo, que el paso dependiente de fuerza se corresponde con un
paso posterior a la hidrólisis del nucleótido (paso irreversible). Por otra parte en un mecanismo de
brownian ratchet la unión del nucleótido entrante serviría para �jar la posición translocada en un
sistema que está oscilando, potenciado por las �uctuaciones térmicas, entre las posiciones post- y
pre-translocadas (Guajardo and Sousa (1997); Dahl et al. (2012)), por lo que el paso dependiente
de fuerza sería anterior a la hidrólisis.
1.3. Estudios a nivel de moléculas indviduales.
El estudio de los motores moleculares vinculados al metabolismo de los ácidos nucléicos se ha abor-
dado desde diversas perspectivas experimentales. Por un lado, existe un gran número de estudios
estructurales que proporcionan información detallada sobre las distintas conformaciones del motor
3y por tanto kcat/KM
15
Capítulo 1 Introducción
en cada paso del ciclo mecanoquímico (Steitz (2006); Keller and Brozik (2005)). Sin embargo, aun-
que imprescindibles, estas imágenes son estáticas y no informan sobre los cambios dinámicos que
ocurren entre estados conformacionales del motor. Más aún, en estos estudios sólo es posible observar
uno de los múltiples estados accesibles al sistema, aquel que es más estable en la vencindad de las
condiciones de cristalización, por lo que se escapa la posibilidad de observar intermediarios de vida
corta difíciles de cristalizar.
Por ejemplo, hasta muy recientemente se pensó que los cambios conformacionales observados en el
dominio dedos de las polimerasas de ADN eran responsables de generar el movimiento necesario
para la translocación y que el paso limitante observado en experimentos cinéticos se debía a esta
transición. Posteriormente se ha observado que las conformaciones abierta y cerradas del dominio
dedos se encuentran en un equilibrio rápido (en comparación con el paso limitante) en todo momento,
por lo que este paso no debe ser el limitante.
Por otra parte, ensayos bioquímicos de motilidad y cinética proporcionan una imagen más dinámica
de estos sistemas []. Sin embargo, esta aproximación implica el promediado de señales provenientes
de todas las moléculas presentes en la muestra. Esta aproximación tiene limitaciones debido a tres
aspectos fundamentales: i) Dado que la reacción ocurre de manera estocástica (activada térmica-
mente) una vez comenzada, el alcance de la reacción en el momento de realizar la medición va a
ser diferente, en general, para cada molécula, por lo que la medición va a ser un promediado tem-
poral del estado de avance de la reacción; ii) una vez alcanzado el equilibrio químico, el proceso
de conversión de productos a reaccionantes y viceversa no cesa, sólo se mantiene constante en el
tiempo la proporción de moléculas que están en uno u otro estado. Visualizando el sistema como
un conjunto de reacciones químicas que ocurren en paralelo, en un momento determinado, cierta
proporción de estas reacciones habrán ocurrido en sentido directo (de reaccionantes a productos) y
cierta en sentido inverso. El equilibrio químico es el estado en el cual la proporción de reacciones
que se encuentran en un estado y en otro no cambia y iii) la presencia de molécuals inactivas o
�defectuosas� o de estados inactivos intrínsecos (como por ejemplo las pausas transcripcionales [])
puede llevar a una subdeterminación de las velocidades de catálisis. El resultado de lo anterior es
que al realizar una medición coexisten en la muestra moléculas en diversos estados (en el caso mas
simple, reaccionantes y productos), por lo que la señal pudiera corresponder a estados intermedios
que no se corresponden con ninguno de los estados accesibles al sistema. El efecto inmediato de este
tipo de medición es la observación de trayectorias de reacción suaves, en las cuales no se aprecia el
carácter estocástico intrínseco de las reacciones moleculares.
16
1.3 Estudios a nivel de moléculas indviduales.
Adicionalmente, como ha sido explicado, la fuerza es una variable muy relevante en el estudio de las
propiedades de sistemas macromoleculares, ya sea porque es un producto de la reacción, como en el
caso de los motores moleculares, o porque la aplicación de una fuerza externa permite la exploración
de estados conformacionales no accesibles de otra manera, como es el caso del estudio del plegamiento
de proteínas o las propiedades mecánicas de ácidos nucléicos. Las técnicas estructurales y bioquímicas
no permiten el acceso a esta variable. Sólo investigando una molécula a la vez es posible ejercer fuerza
y/o medir las fuerzas desarrolladas por estos sistemas. Más aún, el acceso a la dinámica de una sola
molécula permite, en principio, la observación directa de las �uctuaciones inherentes a las reacciones
moleculares, así como a todos los intermediarios cinéticos presentes en la reacción a lo largo de la
coordenada mecánica establecida (sólo limitado por la resolución experimental). Como consecuencia
de lo anterior, también es posible observar estados no representativos de la media, pero que ocurren
de manera sistemática así como seleccionar del conjunto sólo las moléculas activas.
Finalmente, debido al carácter estocástico de las reacciones moleculares, las propiedades del siste-
ma determinadas a nivel de molécula única presentarán grandes �uctuaciones. Por esta razón, es
necesario realizar un gran número de mediciones (sobre diferentes moléculas) para obtener una idea
acerca del comprtamiento medio de la magnitud en cuestión. La diferencia entre el promedio que se
realiza en este caso, y el promedio temporal y poblacional que se realiza en los estudios de muchas
moléculas (bulk) radica en que en el primero se promedia sobre propiedades reales del sistema.
1.3.1. Técnicas experimentales de molécula individual
Existe una gran variedad de técnicas experimentales que permiten el estudio de moléculas a nivel
individual (Greenleaf et al. (2007)). De manera general, todas estas técnicas requieren un método
de seguimiento o identi�cación de la molécula en cuestión. Los métodos en los que solamente se
sigue la posición de la molécula, o en general, se monitorea alguna propiedad del sistema sin in�uir
activamente sobre este, se conocen como métodos de seguimiento pasivo. Por otra parte, las técnicas
que permiten la manipulación de moléculas individuales requieren, además de un modo de localizar
espacialmente las moléculas, una sonda, normalmente de tamaño microscópico, capaz de generar o
detectar fuerzas y desplazamientos en la escala molecular(Neuman and Nagy (2008)).
Las pinzas ópticas Las pinzas ópticas es una de las técnicas de manipulación de moléculas in-
dividuales más versátiles. Esta técnica se puede utilizar como una herramienta cuantitativa capaz
17
Capítulo 1 Introducción
de ejercer fuerzas calibradas sobre sistemas moleculares de interés, así como para medir con gran
precisión y sensibilidad las fuerzas y desplazamientos generados por estos sistemas.
Debido a que la luz porta momento lineal y angular, es capaz de ejercer fuerzas y torques en su
interacción con la materia. Las pinzas ópticas explotan esta propiedad fundamental para atrapar
objetos en un pozo de potencial tridimensional (Ashkin (1970); Ashkin et al. (1986)). Las trampas
ópticas involucran el balance de dos fuerzas: las fuerzas de dispersión, las cuales empujan los objetos
a lo largo de la dirección de propagación de la luz y las fuerzas de gradiente, las cuales atraen a
los objetos dieléctricos a lo largo de un gradiente espacial de intensidad de la luz [Ricardo]. En
las implementaciones prácticas de trampas ópticas, un haz láser de longitud de onda en el infrarojo
cercano es fuertemente enfocado por un objetivo de microscopio de alta apertura numérica para crear
el gradiente espacial de intensidad necesario para formar una trampa estable (Neuman and Block
(2004)). En la vecindad de este foco, la trampa óptica se comporta como un resorte lineal, generando
fuerzas sobre el objeto atrapado, en el rango de 0,1 a 100 pN4, proporcionales al desplazamiento de
este con respecto al centro de la trampa. Esta escala de fuerzas, en comparación con otras técnicas de
manipulación basadas en fuerza, (Neuman and Nagy (2008)), es de especial relevancia en el estudio
de los motores asociados al metabolismo del ADN (Mo�tt et al. (2008)).
La magnitud de las fuerzas ópticas es generalmente insu�ciente para atrapar establemente macro-
moléculas biológicas directamente, pero son más que su�ciente para atrapar objetos dieléctricos
microscópicos, tales como microesferas de polyestireno, las cuales pueden ser unidas bioquímica-
mente a las macromoléculas de interés. En la mayoría de los experimentos de molécula individual
utilizando pinzas ópticas, estas microesferas sirven como agarraderas del sistema biológico, permi-
tiendo su manipulación en el interior de una celda de reacción. Ejercer fuerzas calibradas sobre la
molécula de interés, generalmente requiere que esta se una a otro punto de manipulación por el
otro extremo. Típicamente, este segundo punto consiste en la super�cie de la celda de reacción, una
segunda microesfera mantenida mediante succión en la punta de una micropipeta o una miroesfera
mantenida en una segunda trampa óptica ( Bustamante et al. (2000a, 2003); Greenleaf et al. (2007)).
De esta manera, es posible estirar el sistema mediante el movimiento relativo de la trampa óptica
con respecto al segundo punto de unión. Una vez establecida una coordenada mecánica de reacción,
y gracias a los muy sensibles métodos de detección de la posición y la fuerza, es posible seguir en
�tiempo real� la evolución del sistema molecular en determinadas condiciones de reacción.
41 pN = 10−12 Newtons
18
1.3 Estudios a nivel de moléculas indviduales.
1.3.2. Aplicaciones al estudio de la replicación del ADN
A nivel de moléculas individuales, la actividad de los motores implicados en la replicación se puede
investigar a través de los cambios conformacionales que estos imponen sobre el ADN durante su
actividad, por lo que el conocimiento de las propiedades físicas, y en particular elásticas de este
biopolímero resulta esencial. Las propiedades físicas de la doble hélice de ADN son diferentes a
los de cualquier otro polímero natural o sintético. El apilamiento de las bases y la arquitectura
trenzada le con�eren una rigidez inusual. Más aún, el esqueleto de fosfatos lo convierten en uno de
los polímeros conocidos con mayor densidad de carga lineal.
Propiedades mecánicas del ADN. Aunque las propiedades mecánicas varían con la secuencia local
y la estructura de la hélice, las propiedades físicas más relevantes en el contexto biológico se pueden
describir utilizando un modelo de grano-grueso conocido como worm-like chain (WLC ) Kratky and
Porod (1949), el cual caracteriza al polímero como una línea continua que se dobla suavemente
bajo la in�uencia de las �uctuaciones térmicas aleatorias. En su variante más simple, este modelo
caracteriza la elasticidad del ADN a través de un único parámetro, la longitud de persistencia P , que
de�ne la distancia promedio a la que se pierde la linealidad local del polímero. De acuerdo con este
modelo, es energéticamente más favorable doblar la molécula suavemente, distribuyendo el estrés a
lo largo de distancias grandes que doblarlo localmente en regiones más pequeñas que la longitud de
persistencia (P ∼ 50 nm para el dsDNA y P ∼ 1,5 nm para el ssDNA, en condiciones �siológicas)
(Schellman (1974)). El modelo WLC conecta explícitamente la elasticidad local con la conformación
global de la molécula: un polímero con menor oposición a la �exión (menor longitud de persistencia)
tiende a adoptar una estructura de ovillo más compacta.
Un polímero �exible se enrolla aleatoriamente en solución, dando como resultado una distancia entre
extremos mucho más corta que su longitud de contorno. Estirar la molécula hacia un estado más
extendido es entrópicamente desfavorable, ya que el número de conformaciones disponibles disminuye
a extensiones más largas, siendo el límite una sola conformación posible (una línea recta perfecta)
para la extensión máxima (Bustamante et al. (1994)). La distancia entre extremos de la molécula,
y la fuerza necesaria para estirarla, son las variables con las que comúnmente se describe, a nivel de
moléculas individuales la elasticidad del ADN (Smith et al. (1992, 1996); Wang et al. (1997b)).
Para el ADN de doble cadena, la curva de fuerza extensión muestra un comportamiento no lineal:
por debajo de 6 pN, la fuerza se emplea para vencer el enrollamiento entrópico causado por las
19
Capítulo 1 Introducción
Fue
rza
(pN
) 60
40
20
0
80
0 0.5 1 1.5 2Extensión Normlizada
dsDNA
ssDNA
WLCinextensible
Sobreestiramiento
pol
dsDNA = ssDNA
Figura 1.5: Adaptado de Bustamante et al. (2003). Curva de fuerza extensión experimental, por par de bases, del
ADN de cadena doble (línea discontínua azul) y sencilla (línea discontínua verde) con los respectivos ajustes del
modelo WLC (línea sólida roja). La �echa horizontal muestra el cambio en distancia observado, por par de bases,
al mantener la tensión en el ADN constante durante la reacción de polimerización (pol).
�uctuaciones térmicas. Por encima de 6 pN, la molécula se extiende como un resorte lineal hasta
llegar a aprox 65pN, fuerza a la que ocurre una transición de sobre estiramiento. Por el contrario,
el ADN de cadena sencilla es un polímero mucho más �exible, por lo que adopta una con�guración
más compacta a bajas fuerzas, como resultado de lo cual se establecen numerosas interacciones
intramoleculares débiles que conducen a una extensión de extremo a extremo más corta. En el límite
opuesto, donde la fuerza de estiramiento es su�ciente para romper las interacciones intramoleculares,
el ssDNA se extiende considerablemente más que su homólogo de doble cadena, debido a que no
está restringido a adoptar una estructura helicoidal Smith et al. (1996), Figura 1.5.
Efecto de la tensión en el molde sobre la actividad de polimerización Como se ha mencionado
las polimerasa de ADN son motores moleculares que translocan sobre el ADN de cadena sencilla al
tiempo que incorporan el nucleótido complementario al extremo 3' de la cadena naciente. Dicho de
otra manera, estas proteínas convierten secuencialmente una molécula de ADN de cadena sencilla en
ADN de cadena doble, Figura 1.5. Esta propiedad ha sido explotada para observar la actividad de
replicación de polimerasas de ADN individuales, Figura 1.6 (a). En estos experimentos, una molécula
de ADN de cadena sencilla es estirada entre dos super�cies al tiempo que una polimerasa replica
la molécula, mantenida a una tensión constante. La actividad de replicación se puede monitorear
en tiempo real mediante el seguimiento de la extensión (por debajo de 6 pN) o contracción (por
encima de 6 pN) de la molécula anclada entre los dos puntos. Estos estudios mostraron que el
20
1.3 Estudios a nivel de moléculas indviduales.
paso limitante de la velocidad de replicación, es sensible a la tensión en el ADN y es capaz de
generar fuerzas tan altas como 35 pN . Un resultado sorprendente fue la inducción de actividad de
exonucleólisis procesiva a tensiones por encima de 40 pN Wuite et al. (2000); Maier et al. (2000).
En un estudio relacionado, utilizando la polimerasa de ADN de Phi29 salvaje y dos mutantes,
fue posible proponer dos intermediarios de la reacción de transferencia intramolecular del primer,
uno correspondiente a una conformación funcional sensible a la tensión y uno inactivo que pudiera
funcionar como punto de control para la reacción de corrección de errores Ibarra et al. (2009).
Figura 1.6: Ejemplo de aplicaciones de las técnicas de manipulación de moléculas individuales al estudio de
polimerasas de ADN , ARN y helicasas a nivel de moléculas individuales. (a) Adaptado de Wuite et al. (2000) y
Ibarra et al. (2009). Una molécula de ssDNA con un inicio de replicación es mantenida a tensión constante entre una
microesfera en la trampa óptica y una microesfera en la punta de una micropipeta. La actividad de polimerización
se observa como un cambio en distancia, a tensión constante, en la molécula de ADN . (b) Adaptado de Manosas
et al. (2012b). Mediante la utilización de imanes, es posible ejercer fuerzas sobre una molécula de ADN anclada
entre una super�cie funcionalizada y una micoresfera magnética para observar en tiempo real el acoplamiento entre
las actavidades de desplazamiento de banda (en este estudio con la helicasa de T4) y la actividad de replicación
de la polimerasa de ADN (en este estudio de T4 , T7 y Phi29 ). (c) Adaptado de Thomen et al. (2008). Al unir la
polimerasa de ARN de T7 directamente a una supre�cie funcionalizada y el extremo corriente abajo de la molécula
de ADN a una micoresfera atrapada ópticamente los autores pudieron ejercer tensión mecánica directamente sobre
la enzima a diferentes concentraciones de substrato e iones Magnesio.
Efecto de la tensión en la juntura de la horquilla en la actividad helicasa. Además de estirar
la molécula linealmente, es posible aplicar tensión en cada una de las cadenas que forman una
21
Capítulo 1 Introducción
horquilla de ADN, promoviendo la apertura mecánica de la doble hebra Essevaz-Roulet et al. (1997);
Bockelmann et al. (2002). El patrón de apertura mecánica del ADN tiene una forma de diente de
sierra cuyos picos guardan una relación muy estrecha con la secuencia de la horquilla. Este tipo de
experimentos ofrecen información de primera mano sobre el papel que juegan las interacciones entre
pares de bases y entre pares de bases vecinos (apilamiento de las bases) en la estabilidad global de
la molécula Huguet et al. (2010).
La desnaturalización mecánica del ADN tiene especial relevancia en el estudio de la actividad he-
licasa. Las helicasas son motores moleculares que se mueven a lo largo de una de las cadenas del
ADN, promoviendo la separación de la cadena complementaria. En este proceso, la interacción entre
la helicasa y la horquilla tiene carácter local: ocurre en la interface entre la porción de cadena doble
(corriente abajo) y sencilla. A diferencia de los procesos de desnaturalización térmica o por pH,
en los cuales toda la molécula está expuesta al agente desnaturalizante, la aplicación de tensión en
cada una de las cadenas, en la dirección de apertura, interroga especí�camente la estabilidad de la
juntura, por lo que simula de manera simpli�cada la forma en que las helicasas abren el ADN.
Este hecho ha sido explotado para interrogar si las helicasas interactúan con la horquilla de mane-
ra activa: los cambios conformacionales provocados por la hidrólisis del ATP son su�cientes para
translocar y a la vez desestabilizar la horquilla completamente; o pasiva: sólo tienen la capacidad
de translocación y necesitan que los primeros pares de bases de la horquilla se abran espontánea-
mente para avanzar y de esta manera evitar que se cierren Betterton and Julicher (2005). En la
con�guración experimental típica, la horquilla se mantiene a una tensión inferior a la necesaria para
abrirla (aprox 14 pN). Dado que la tensión en esta con�guración asiste la reacción de apertura de
la doble hebra, un mecanismo pasivo se vería favorecido por la aplicación de tensiones crecientes,
mientras uno activo no (cualquiera sea la tensión, una enzima activa sería capaz de abrir la doble
hebra e�cientemente). Los resultados más relevantes muestran que las helicasas utilizan mecanismos
de apertura que van desde prácticamente activo, como es el caso de la helicasa NS3 del virus de la
hepatitis C Cheng et al. (2007), parcialmente activo, como en el caso de la helicasa gp4 del fago T7
Johnson et al. (2007) hasta un mecanismo prácticamente pasivo, como es el caso de la helicasa gp41
del fago T4 Lionnet et al. (2007).
Acoplamiento entre apertura de la doble hebra y replicación. Este diseño experimental (en
este caso con pinzas magnéticas De Vlaminck and Dekker (2012)) ha sido utilizado para elucidar
el acoplamiento entre la actividad de polimerización de las polimerasas de los fagos T4, T7 y del
22
1.3 Estudios a nivel de moléculas indviduales.
bacteriófago Phi29 y la actividad de desplazamiento de banda de la helicasa gp41 de T4 Manosas
et al. (2012a). Experimentos con las polimerasas aisladas mostraron la síntesis rápida y procesiva
de la cadena líder unido a una capacidad de apertura de la doble hebra de�ciente. Adicionalmente,
se observa una actividad exonucleasa procesiva a bajas fuerzas, que se debe, según los autores, a
que la horquilla corriente abajo de la polimerasa genera una presión de regresión (ver) que inhibe
el movimiento de la polimerasa hacia adelante (en sentido de polimerización). Por el contrario, en
presencia de la helicasa de T4 el sistema acoplado (polimerasa más helicasa) es capaz de sintetizar
el ADN a la velocidad máxima5, excepto en el caso de Phi 29 en el que la velocidad de replicación
se observó muy similar en presencia y en ausencia de la horquilla. Finalmente, los autores proponen
un modelo de colaboración en el cual la helicasa libera la presión de regresión de la horquilla sobre
la polimerasa, permitiéndole adoptar una conformación de polimerización procesiva y a su vez, la
polimerasa desestabiliza las primeras bases de la horquilla y por tanto incrementa la e�ciencia de
apertura de la doble hebra mediada por la helicasaManosas et al. (2012b). Este último aspecto ya
había sido observado para el sistema de T7 Stano et al. (2005).
Mecanoquímica de RNAp de T7 El estudio experimental de la mecanoquímica de motores mo-
leculares requiere acceder a la coordenada mecánica de translocación al tiempo que se varía la
concentración de los cofactores químicos. En los experimentos de molécula individual descritos hasta
ahora, la coordenada mecánica con la que se interroga al sistema polimerasa-ADN (o Helicasa-ADN
o Helicasa-Polimerasa-ADN) es la distancia entre extremos de la molécula de ADN, en una con�gura-
ción geométrica u otra. Por esta razón, los cambios conformacionales detectados experimentalmente
sólo informan del efecto que tiene la actividad de estos motores sobre el ADN y no sobre los grados
de libertad internos de los mismos. Por el contrario, la aplicación de una fuerza directamente sobre
el motor, hace posible acceder a la coordenada mecánica de translocación.
Para lograr esto, la estrategia más utilizada consiste en unir la proteína en complejo con el ADN
directamente, o a través de una molécula espaciadora, a la super�cie pasiva y unir el otro extremo
del ADN a la microesfera localizada en la trampa óptica. De esta manera, el movimiento relativo
entre la super�cie pasiva y la trampa óptica, genera una tensión mecánica que es trasmitida a la
proteína a través del ADN.
Estudios de la polimerasa de ARN de T7, estructuralmente similar a las polimerasas de ADN Sousa
et al. (1993), bajo el efecto de una fuerza opuesta al movimiento y variando la concentración de
5Velocidad de extensión del primer en ausencia de la horquilla
23
Capítulo 1 Introducción
nucleótidos y magnesio revelaron que la fuerza actúa como un inhibidor competitivo para la unión
de nucleótidos y que los iones de de magnesio están involucrados en un paso que no depende de la
fuerza externa Thomen et al. (2005, 2008). Utilizando la información obtenida en los experimentos
de molécula individual, junto a la información bioquímica, de mutagénesis y estructural disponible
para este sistema Yin et al. (2004), los autores proponen un mecanismo de translocación del tipo
Brownian ratchet, en el cual la polimerasa �uctúa entre los estados pre- y post-translocados y la
hidrólisis de los NTP y la posterior liberación del producto, �ja a la polimerasa irreversiblemente
en el estado post-translocado. Un mecanismo de Power stroke, en el cual la translocación está
promovida directamente por la liberación de producto resulta incompatible con las observaciones
experimentales.
1.4. La polimerasa de ADN de Phi29
En esta tesis hemos escogido a la polimerasa de ADN de Phi29 (Phi29DNAp) como sistema modelo
para el estudio, a nivel de moléculas individuales, de la mecanoquímica de las polimerasas de ADN de
la familia B y del acoplamiento entre las actividades de polimerización y desplazamiento de banda.
Esta elección se basa en cuatro aspectos fundamentales: i) Este sistema está muy bien caracterizado
a nivel bioquímico Blanco and Salas (1996) y ii) estructural Kamtekar et al. (2004); Berman et al.
(2007); iii) es una polimerasa replicativa altamente procesiva, lo cual facilita la observación de
trazas de replicación largas (con muchos pasos del ciclo de polimerización) y iv) posee actividad de
desplazamiento de banda acoplada a replicación en la misma proteína, lo cual resulta ideal para el
estudio del acoplamiento entre estas actividades. Adicionalmente, existen estudios previos, a nivel de
moléculas individuales, del efecto que tiene la tensión en el ADN sobre la actividad de esta proteína
Ibarra et al. (2009).
Phi29 es un bacteriófago de B. subtilis con un genoma lineal de 19.2 kb de dsDNA. En este sistema la
replicación se inicia de manera no sincronizada desde cada extremo del genoma, cuando la polimerasa
de Phi29 se une a una proteína primer unida a cada extremo 5' del genoma (TP del inglés Terminal
Portein) Salas et al. (1978). Después de la adición de 10 nucleótidos, la polimerasa se disocia de la
TP y replica procesivamente el resto del genoma del fago Blanco and Salas (1985); Blanco et al.
(1989); Mendez et al. (1997). Según avanza desde cada origen de replicación, la polimerasa va
generando grandes cantidades de ADN de cadena sencilla (la cadena desplazada) que es protegido
de la degradación por la proteína de unión a cadena sencilla de Phi29 (Phi29 SSB, del inglés Single
24
1.4 La polimerasa de ADN de Phi29
stranded binding protein) hasta que la cadena desplazada se convierte en molde y es replicada por
la polimerasa que avanza desde el origen de replicación opuesto, por lo que en este sistema no existe
el equivalente a síntesis de la cadena retrasada.
La polimerasa de ADN de Phi29 consiste en un dominio de exonucleólisis (exo) N-terminal y un
dominio de polimerización (pol) C-terminal. A pesar de que no contiene el dominio regulatorio N-
terminal observado en otras polimerasas de la famila B cuyas estructuras se conocen Wang et al.
(1997a); Zhao et al. (1999); Hopfner et al. (1999); Rodriguez et al. (2000); Hashimoto et al. (2001),
la estructura y orientación relativa de los dominios exo y pol encajan bien en la arquitectura global
de las polimerasas de ADN de esta familia. El dominio de exo está estructuralmente conservado a
lo largo de las familias A, B y C y comparte un mecanismo común de catálisis mediada por dos
iones metálicos que se unen a la enzima a través de cuatro grupos carboxilatos. Estos grupos han
sido indenti�cados en el dominio exo de la Phi29 ADNp Bernad et al. (1990); Soengas et al. (1992);
Esteban et al. (1994).
Molde
Molde
Nucleótido entrante
Túnel corriente
abajoNucleótido +1(a) (b)
Figura 1.7: Estructura de la polimerasa de Phi29. (a) Representación tipo cinta de la organización de dominios
de la polimerasa de Phi29: dominio de exonucleólisis (rojo), palma (rosa), TPR1 (dorado), dedos (azul), TPR2
(cian) y pulgar (verde). El ADN que se muestra proviene del complejo ternario de RB69 (Franklin et al. (2001)) y
ha sido modelado sobre la estructura de la polimerasa de Phi29 usando como único elemento de alineamiento los
dominios palma de las estructuras de RB69 y Phi29 (Kamtekar et al. (2004)). Las posiciones del primer modelado
(gris claro), el molde (gris oscuro) y el nucleótido entrante (amarillo, representación de esferas sólidas) se indican.
(b): Representación tipo espacio-relleno de la polimerasa cortada a través de un plano que muestra el substrato
primer-molde y el ADN de cadena sencilla 5' en el túnel corriente abajo. El nucleótido +1 se muestra en amarillo,
el nucleótido entrante en magenta, la cadena primer en verde y la cadena molde en azul.
Adicionalmente a los subdominios encontrados en la arquitectura general del dominio de polime-
25
Capítulo 1 Introducción
rización de las polimerasas replicativas Joyce and Steitz (1994), la polimerasa de Phi29 posee dos
inserciones de secuencia asociadas con la interacción con la TP llamadas regiones de proteína ter-
minal 1 y 2 (TPR1 y TPR2, del inglés terminal protein region). Estos dominios, que son especí�cos
de polimerasas que inician la replicación mediada por proteínas, Salas et al. (1978), interactúan con
los dominios intermedio y primer de la TP respectivamente Dufour et al. (2000).
Residuos del subdominio palma, pulgar, TPR1 y TPR2 y del dominio exo encierran una apertura
hacia el sitio activo que envuelve el dsDNA corriente arriba. Un giro beta en la punta del dominio
pulgar, que es pequeño en comparación con el de otras polimerasas de la misma familia, contacta la
punta del dominio TPR2 para formar un arco capaz de envolver el ADN y mejorar la procesividad,
de manera análoga a como lo hacen los sliding clamps (Abrazadera, pinza, mordaza) presentes como
proteínas independientes en otros replisomas Kamtekar et al. (2004).
Un segundo túnel formado por residuos del dominio TPR2, exo, palma y dedos rodea la cadena
molde corriente abajo del sitio activo pol. Las pequeñas dimensiones de este túnel, menos de 10Å de
largo y aproximadamente 10Å de diámetro, obliga a las cadenas molde y complementaria a separarse
para que la cadena molde pueda entrar al sitio activo, proporcionado una base estructural para la
actividad de desplazamiento de banda observada en Phi29 Kamtekar et al. (2004). Por otra parte,
una conformación abierta del túnel sería necesaria para ensartar el molde durante la replicación
ssDNA circular []. Adicionalmente, in vivo la última base de la cadena molde se encuentra unida
covalentemente a la proteína terminal y el túnel, en su con�guración cerrada no permite el paso de
la TP al interior de la polimerasa por lo que la disociación de la polimerasa del ADN requiere una
conformación abierta también.
El dominio TPR2 presenta una con�guración espacial que se enfrenta directamente a la juntura de
la horquilla corriente abajo. Esta conformación está estabilizada por los contactos que se establecen
entre el dominio pulgar y TPR2. Por otra parte el sitio activo exo, de�nido por la presencia de
los aminoácidos que unen iones metálicos (Asp12 y Glu14 del motivo Exo I, Asp66 del Exo II,
Asp169 del Exo III y Lys143 del Kx2hxA), está formado por residuos de los dominios exo y por
residuos pertenecientes a la punta del subdominio pulgar. Mutaciones introducidas en los residuos
catalíticos responsables de la actividad de exonucleólisis, además de inactivar esta actividad, afectan
severamente la actividad de desplazamiento de banda Soengas et al. (1992); de Vega et al. (1997).
Sorprendentemente, estas mutaciones no afectan la capacidad de síntesis procesiva en ausencia de
cadena doble. El hecho de que ninguna de las mutaciones introducidas en los residuos vinculados
con la unión de la proteína a ssDNA en el sitio activo exo afecten la capacidad de desplazamiento
26
1.4 La polimerasa de ADN de Phi29
de banda y que los datos cristalográ�cos descarten contactos entre la cadena desplazada y el sitio
activo exo hace suponer que la estabilidad de la interacción exo-pulgar esté fuertemente in�uida por la
unión de iones metálicos en esa región Esteban et al. (1994).Una distorsión sutil en el dominio pulgar
pudiera causar una orientación inapropiada del dominio TPR2 y explicar por tanto la pérdida de la
capacidad de desplazamiento de banda. En esta tesis, hemos escogido el doble mutante D12AD66A
(Soengas et al. (1992)) para estudiar el proceso de acoplamiento entre las actividades de replicación y
desplazamiento de banda en una polimerasa de�ciente en desplazamiento de banda pero que conserva
las propiedades de extensión del primer y compararla con la polimerasa salvaje.
27
2 Objetivos
Los objetivos de esta tesis se centran en dos proyectos diferentes, pero estrechamente relacionados.
1. Estudio del mecanismo de acoplamiento entre las actividades de repli-
cación y apertura del ADN. Utilizando la técnica de pinzas ópticas y la polimerasa
de ADN de Phi29 como modelo, pretendemos estudiar a nivel de moléculas individuales el
mecanismo de acoplamiento entre las actividades de replicación y desplazamiento de banda
de esta proteína y elucidar el mecanismo físico que utiliza esta enzima para desestabilizar la
doble hebra de ADN que encuentra a su paso. Para ello planteamos los siguientes objetivos
especí�cos:
a) Desarrollar un sistema experimental, utilizando pinzas ópticas, que permita detectar, a
nivel de moléculas individuales, las actividades de replicación y desplazamiento de banda
de manera diferenciada.
b) Determinar la dependencia de la velocidad de replicación y sus �uctuaciones (pausas) con
factores que afectan la estabilidad de la juntura de la doble hélice tales como la secuencia
y la fuerza externa aplicada sobre la juntura en la dirección de apertura.
c) Implementar un modelo teórico que explique la dependencia de la velocidad de replica-
ción con los factores que modulan la estabilidad de la juntura y que permita cuanti�car
la capacidad de la polimerasa de desestabilizar la doble hélice durante el proceso de
replicación.
2. Estudio del mecanismo de translocación de las polimerasas replicativas
de ADN. Para abordar el estudio de la dinámica y mecanoquímica del proceso de translo-
cación de la polimerasa de Phi29 sobre la cadena sencilla del ADN planteamos los siguientes
objetivos especí�cos:
a) Desarrollar un sistema experimental que permita inmovilizar la polimerasa de Phi29 en
una super�cie de modo que sea posible aplicar fuerzas externas directamente sobre la
29
Capítulo 2 Objetivos
proteína. Detectar a nivel de moléculas individuales la actividad de polimerización de la
polimerasa de Phi29 unida a la super�cie pasiva del instrumento de pinzas ópticas.
b) Determinar la dependencia de la cinética de replicación con la aplicación de fuerzas ex-
ternas en las direcciones a favor y en contra del movimiento a diferentes concentraciones
de dNTP.
30
3 Materiales y Métodos
3.1. El instrumento de pinzas ópticas.
Los experimentos mostrados en esta tesis se realizaron utilizando un instrumento de pinzas ópticas
de doble haz, diseñado por Smith et al. (2003) y construido en nuestro laboratorio por Hormeño... El
uso de haces contrapropagantes permite generar una trampa óptica estable combinando la utilización
de haces de baja apertura numérica y objetivos de alta apertura numérica a la vez que hace posible
colectar y analizar toda la luz que sale de la trampa en ambas direcciones. Esta última condición
permite aplicar el principio de conservación del momento lineal para determinar la fuerza externa
que actúa sobre una partícula atrapada: la variación del cambio de momento de todos los fotones
que entran y salen de la trampa es igual a la fuerza que actúa sobre la partícula atrapada.
Determinación de la Fuerza Cuando una fuerza externa actúa sobre la partícula, la distribución
angular de intensidad, colectada en detectores fotodiodo sensibles a posición de tipo continuo (DL-10,
United Detector Technology) colocados en los planos principales imagen de los objetivos (nikon..)
varía. A partir de las señales reportadas por los detectores y de constantes conocidas, es posible
calcular las componentes transversales de la fuerza como (Smith et al. (2003)):
Fx =DxRDcΨRL
Fy =DyRDcΨRL
(3.1)
donde Dx y Dy son las señales del detector en las direcciones x e y, proporcionales a la sensibilidad
Ψ del detector y a la suma de las irradiancias locales multiplicadas por sus distancias relativas al
centro del detector xRD
o yRD
siendo RD la mitad de la anchura del detector. RL es un radio efectivo
para la lente igual a su distancia focal y c la velocidad de la luz en el vacío.
La calibración de este sistema es independiente de la potencia del láser, del índice de refracción del
tampón, del tamaño, forma o índice de refracción de la partícula atrapada. Más aun, las pérdidas de
31
Capítulo 3 Materiales y Métodos
luz en las lentes de los objetivos y la óptica asociada se pueden incluir, siempre que sean constantes,
en una sensibilidad efectiva de los detectores.
Medición de distancias La distancia entre una microesfera en la trampa óptica y otra localizada
en la punta de una micropipeta móvil se determinó utilizando dos métodos complementarios para
determinar la posición de cada microesfera por separado.
Por un lado, se utilizó la imagen de video microscopía del plano imagen, coincidente con la posición
en la dirección z de la trampa óptica y con la posición de la microesfera localizada en la pipeta
(enfocada con este propósito), captada en una cámara ccd. Sobre las imágenes capturadas se aplica
un algoritmo que localiza el centro de las esferas y devuelve la posición promedio en píxeles en x e
y. Este método requiere la calibración previa de la cámara ccd para conocer la relación pı́xel/µm.
Por otra parte, para determinar la posición de la microesfera ubicada en la pipeta con mayor re-
solución se utilizó un sistema basado en la refracción de luz (en inglés light-lever). Este dispositivo
está compuesto por una �bra óptica unida a un láser de diodo (LPF-3224-635-FC, Thorlabs), un
detector sensible a la posición (DL-10, United Detector Technology) y una lente (C140TM-B, Nikon,
f = 1,45 mm) insertada en el marco de la cámara de �uidos. Esta lente colima la luz desde la �bra y
dirige el haz de salida sobre el fotodetector. Puesto que la distancia focal de la lente es muy pequeña
en comparación con su distancia al detector (640 mm), un desplazamiento pequeño de la lente (y,
por lo tanto, de la micropipeta �jada en la cámara de �uidos) se traduce en un movimiento ∼ 420
veces mayor de la luz sobre el detector. Finalmente se construye una curva de calibración con las
medidas en µm provenientes de la imagen de video-microscopia y las medidas a mayor resolución
provenientes del foto-detector sensible a la posición del dispositivo ligth-lever.
Para determinar con mayor resolución la posición de la microesfera atrapada ópticamente, se cons-
truyó una curva de calibración con las posiciones obtenidas a partir de la imagen de videomicroscopía
y la lectura del detector destinado al cálculo de la fuerza en la dirección y, Dy. Este método permi-
tió además comprobar, en cada experimento, la validez de la asunción de linealidad entre fuerza y
distancia en la trampa óptica Jahnel et al. (2011).
La mayoría de los experimentos se realizaron en un régimen de retroalimentación de fuerza, con-
sistente en corregir la distancia entre las micreosferas con el �n de mantener la tensión en el ADN
constante. La frecuencia de adquisición de datos está determinada por el límite que impone el ré-
gimen de retroalimentación, 60 Hz. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente
(23± 2 ºC)
32
3.1 El instrumento de pinzas ópticas.
3.1.1. Diseño de la celda de �uidos y sistema de �uidos.
Las celdas de micro�uidos utilizadas se construyeron manualmente en nuestro laboratorio y fueron
diseñadas especí�camente para nuestros experimentos.
El montaje se realiza siguiendo los siguientes pasos secuencialmente: Sobre un cubreobjetos (24 mm×
60 mm, Menzel Gläser) con seis agujeros (como muestra la �gura) se coloca una lámina de Nesco�lm
(Karlan) con tres canales grabados, haciendo coincidir el extremo de los canales con los agujeros
del cubreobjetos. Sobre los separadores de los canales se colocan tubos de cristal (dext : 100 µm;
dint : 25 µm, Garner Glass Company) para conectar los canales superior e inferior con el canal central;
una micropipeta y un tubo dispensador externo se colocan siguiendo la disposición geométrica que
muestra la Figura 3.1. Posteriormente se coloca otra lámina de Nesco�lm, idéntica a la anterior y se
sellan los tres canales formados colocando un cubreobjetos sin agujeros. Después de ensamblada, la
celda se coloca sobre una placa térmica a una temperatura de 120 ºC mientras se aplica presión sobre
la misma. Cuando el Nesco�lm se ha fundido de manera homogénea, formando un sello hermético
con el cristal, la celda está lista. La distancia entre las caras internas de la celda es de ∼ 200 µm.
Cubreobjetos
Parafilm
Soporte
Tornillos huecos
Tubos conectores
Succión
Tampón de Reacción
Figura 3.1: Diseño de la celda de �uidos y montaje so-
bre el marco de sujeción. Tanto los agujeros practicados
sobre el cubreobjetos, como los canales en las láminas de
Nesco�lm se realizaron con una grabadora y cortadora
láser (C-200 , Universal Laser Systems).
Las micropipetas se construyeron utilizando un
aparato de tracción de pipetas fabricado a me-
dida (U. Berkeley). Un capilar hueco de cristal
(dext : 80 µm; dint : 40 µm, Garner Glass Com-
pany) se calienta localmente utilizando un �la-
mento de platino incandescente con forma cir-
cular. Al fundirse el cristal, los dos extremos del
capilar se separan debido a un peso sujeto a uno
de los extremos del mismo. Esto da lugar a una
micropipeta cuya abertura disminuye gradual-
mente hasta alcanzar 0, 5 − 1 µm de diámetro
en la punta.
Tanto el extremo posterior de la micropipeta co-
mo el tubo dispensador externo, sobresalen de la
celda de micro�uidos. Se utilizaron tubos de polietileno para conectar la micropipeta a una jeringa
mediante la cual se le hizo succión y el extremo del tubo dispensador externo a una jeringa mediante
la cual se introdujo a la celda el tampón de reacción. Se utilizó un pegamento (características. . . )
33
Capítulo 3 Materiales y Métodos
para sellar la unión entre los tubos de cristal y de polietileno.
La celda se coloca en un marco de sujeción que la �ja y evita su ruptura. A través de agujeros en
el marco y de tornillos agujereados se colocan tubos de polietileno que conectan las tres entradas
de la celda y sus salidas correspondientes a jeringas y botes con los tampones necesarios en cada
experimento. El �ujo se puede controlar manualmente, utilizando el émbolo de las jeringas, o desde
un sistema de �uidos controlado por ordenador.
Todo el conjunto se sitúa sobre una plataforma piezoeléctrica que permite el movimiento tridimen-
sional de la celda, de manera manual a través de tornillos micrométricos, o controlado por ordenador,
a través de elementos piezoeléctricos. Mediante el movimiento en el plano x− y, o plano transversal
a la dirección de propagación de la luz, es posible generar desplazamiento relativo entre la posición
de la trampa óptica (�ja en todo momento) y la micropipeta. El movimiento en el eje z, permite
hacer coincidir el plano de la micropipeta con el de la trampa óptica.
3.2. Diseño de las moléculas de ADN
3.2.1. Estudio del acoplamiento de las actividades de extensión del primer y
desplazamiento de banda
Para estos experimentos, se diseñó una molécula de ADN en forma de horquilla con los siguientes re-
querimientos: i) poseer dos puntos de anclaje diferenciados químicamente; ii) tener un único extremo
3' para ofrecer un punto de inicio de replicación único; iii) contar con una región de doble cadena, en
una con�guración geométrica en la que sea posible ejercer tensión mecánica externa sobre la juntura
en la dirección de apertura; iv) poseer una secuencia con regiones ricas en pares de bases AT y GC
bien diferenciadas; v) ofrecer la posibilidad de seguir la actividad de polimerización acoplada a la de
desplazamiento de banda y en ausencia de esta sobre la misma secuencia.
Como segmento de replicación (azul, Figura 3.2) se utilizó un fragmento de ADN de 515 pb con
cuatro agrupaciones de la secuencia GCC (señalados en rojo, cuadro azul, Figura 3.2) de longitud
creciente (3, 6, 9 y 12) separados por segmentos de 97 pb con bajo contenido en pares GC (∼ 80 %
AT ) hecha a medida (Genscript Corp.). Esta fue digerida con las endonucleasas de restriccion EcoRI
y SalI. El extremo digerido con SalI fue ligado con un oligonucleótido que se auto hibrida formando
un penta-lazo (gris, Figura 3.2). El extremo digerido con EcoRI fue ligado con el extremo digerido
con EcoRI de un segmento enlazador pequeño de dsDNA (naranja, Figura 3.2). El otro extremo
34
3.2 Diseño de las moléculas de ADN
Segmento8de8replicación:85158pb5'atgttcattctaatctattctattgattgaagattttactaattacaaacatctaattttaaacaaatgtttatttgattatgaatgtatcataattcggatgttcattctaatctattctattgattgaagattttactaattacaaacatctaattttaaacaaatgtttatttgattatgaatgtatcataattcggcggatgttcattctaatctattctattgattgaagattttactaattacaaacatctaattttaaacaaatgtttatttgattatgaatgtatcataattcggcggcggatgttcattctaatctattctattgattgaagattttactaattacaaacatctaattttaaacaaatgtttatttgattatgaatgtatcataattcggcggcggcggatgttcattctaatctattctattgattgaagattttactaattacaaacatctaattttaaacaaatgtttatttgattatgaatgtatcataatt3'
Enlace
5'Biotina-ttttcaatcacttcaggtagcatc3' 3’acgtagtcggttagtgaagtccatcgtagttaa5’
5’tcgagcagatgcacgaataacgtgcatctgc3’
Lazo
Sitio8de8unión83'
Dig
2686dsDNA
Figura 3.2: Representación esquemática (no a escala) de la horquilla construida para el estudio de la replicación
acoplada al desplazamiento de banda. En la �gura se muestra el segmento de replicación principal (azul), el lazo
(gris) y la molécula de enlace de dsDNA (naranja) con la biotina en el extremo 5' (rojo) y 5 bases no hibridadas
corriente abajo del extremo 3' (rectángulos naranja) con sus respectivas secuencias. A esta construcción se le une
una molécula espaciadora de dsDNA (negro), marcada con antidigoxigenina (verde) en su extremo 5'.
del fragmento enlazador contiene una región pequeña de hebras no complementarias, estando el
extremo 5' marcado con biotina (círculo rojo, Figura 3.2) mientras que el 3' contiene la secuencia
de reconocimiento generada por la endonucleasa de restricción PstI. La longitud �nal de la horquilla
es de 556 pb. Los productos de la ligación fueron puri�cados siguiendo un procedimiento estándar
(Qiagen PCR Puri�cation Kit) y posteriormente un asa de ADN de cadena doble, de 2686 pb, cortado
con PstI y etiquetado con digoxigenina en el extremo 5' fue ligado al extremo 3', cortado con PstI,
de la región no hibridada del segmento enlazador. El etiquetado con digoxigenina se describe más
abajo (Ibarra et al. (2009)).
El asa de ADN de cadena doble proporciona una separación entre los dos puntos de anclaje de la
molécula (a cada una de las microesferas) y una zona de unión a extremo 3' único para la polimerasa.
Para facilitar la unión funcional de la polimerasa al extremo 3', el sitio de unión presenta 5 nucleótidos
de la cadena sencilla molde no hibridados, en la dirección corriente abajo del primer 3'.
35
Capítulo 3 Materiales y Métodos
3.2.2. Estudio del mecanismo de translocación.
Para el estudio del mecanismo de translocación, se diseñaron dos moléculas de ADN, una para la
con�guración de fuerza a favor y una para la con�guración de fuerza en contra.
Fuerza en contra Al vector de ADN pBacgus11 (Novagen) (8041 pb) se le hizo una escisión (en in-
glés nick) en la posición 564 con NBbvIA (New England Biolabs) y fue digerido en la posición 315 por
la endonucleasa de restricción BstXI (New England Biolabs), dejando un extremo 3' protuberante
de 4 nucleótidos. Esta molécula fue tratada con la Exonucleasa III (New England Biolabs), la cual
tienen muy baja a�nidad por el extremo 3' protuberante de 4 nucleótidos de longitud pero degrada
la cadena que contiene la en la dirección 3' − 5', desde la posición 564 a la 315. La reacción de la
Exonucleasa III se detiene añadiendo EDTA (10 mM) y Proteinasa K (0,1 µg/µl). Posteriormente,
el ADN es digerido con BamHI para obtener �nalmente una molécula de dsDNA de 3400 pb con
un extremo 3' protuberante de 249 nucleótidos. Una agarradera de ADN marcada con digoxigenina
(Ibarra et al. (2009)) fue ligada al extremo cortado con BamHI y un oligonucleótido de 20 bases,
complementario al extremo 3' protuberante (5'−GTGTGTGGGTGAAGTCATGC−3') fue ligado
para actuar como primer para la replicación del ADN .
DirecciónNdeNreplicación
EtiquetaNdeNDigoxigenina
229Nnt
3'3400Npb
DesplazamientoNdeNbanda
2686NpbagarraderaNdsDNA
229Nnt
EtiquetaNdeNDigoxigenina 3'
3400NpbDesplazamientoNdeNbanda
(a)
(b)
Figura 3.3: Representación esquemática del diseño y componentes de las moléculas de ADN utilizadas para
formar el complejo ADNp-ADN y ejercer fuerzas en contra Figura 3.3a y a favor Figura 3.3b de la dirección de
polimerización.
Fuerza a favor A la molécula de 3400 pb, con un extreme protuberante 3' de 249 nt, descrita ante-
riormente, se le unió un oligonucleótido de 24 bases (5'−CTAGGTGTGTGGGTGAAGTCATGC−
36
3.3 Protocolo experimental
3') en el extremo protuberante 3' dejando un saliente 5' de 4 nucleótidos (5' − CTAG) el cual fue
usado para ligar el vector de dsDNA pUC19 (Novagen) digerido previamente con Xbal y etiquetado
con digoxigenina en un extremo (Ibarra et al. (2009)). Esta molécula larga de dsDNA, añadida al
extremo corriente arriba del primer provee separación entre las microesferas (∼ 1 µm) y puede ser
usada como agarradera para aplicar fuerzas sobre el complejo ADN-ADNp a favor del movimiento.
3.2.3. Preparación de las asas con digoxigeninas.
Para construir estas asas se partió del vector pUC19 (2686 pb) y se introdujeron nucleótidos modi-
�cados con digoxigeninas (digoxigenina-11-dUTP, Roche) por PCR. Se usaron como cebadores dos
oligos (5'-CCT CTG ACA CAT GCA GCT CC-3' y 5'-CGC GGC CTT TTT ACG GTT CC-3') y se
preparó una mezcla de dTTP, dATP, dCTP y dGTP (10 mM) y MgCl2 en el tampón de reacción.
Se utilizó la enzyma TaqPol Platinum® (Invitrogen) en las condiciones de PCR apropiadas y un
volumen �nal de reacción de 100 µl. Las asas de ADN con digoxigeninas se puri�caron utilizando el
kit de puri�cación de fragmentos de PCR QIAquick de QIAGEN, siguiendo el protocolo estándar
descrito en el kit. Posteriormente, las asas se digirieron con BamHI y se volvieron a puri�car con
el mencionado kit. La puri�cación �nal de las asas se realizó por extracción de la banda de un gel
de agarosa con bajo punto de fusión, utilizando el kit QIAquick Gel Extraction. Según sus instruc-
ciones, se procedió inicialmente a fundir el bloque de agarosa que contenía la banda de interés por
incubación a 50 ºC. Una vez completada la fusión, se añadió rápidamente 1 volumen de isopropanol
(considerando el volumen del fragmento del gel según 100mg ≈ 100µl). Posteriormente, la muestra
se añadió a una columna y se procesó según las instrucciones hasta la elución �nal de las asas con
digoxigeninas puri�cadas.
3.3. Protocolo experimental
Para manipular moléculas individuales de ADN, se utilizaron dos tipos micreosferas con un recubri-
miento químico diferente: unas recubiertas con estreptavidina (Spherotech) y otras de antidigoxige-
nina (ver abajo). En todos los casos, las construcciones de ADN (Sección 3.2) poseen un extremo
marcado con digoxigenina y otro marcado con biotina (en el caso del estudio de la translocación este
papel lo desempeña la propia polimerasa). El extremo etiquetado con biotina se une expecí�camente
a su molécula complementaria (estreptavidina) en la super�cie de la microesfera correspondiente,
a través de un enlace fuerte no covalente. Por otra parte, la digoxigenina en el otro extremo de
37
Capítulo 3 Materiales y Métodos
la molécula reconoce especí�camente su anticuerpo, anti-dig, en la super�cie de la otra microes-
fera. El marcaje diferenciado de los extremos de la construcción de ADN y del recubrimiento de
las microesferas permite evitar enlaces dobles entre los dos extremos de una molécula y la misma
microesfera.
3.3.1. Protocolo para unir las moléculas de ADN entre las microesferas.
Las microesferas recubiertas de estreptavidina se �uyeron al interior de la celda de �uidos del instru-
mento de pinzas ópticas sin ninguna modi�cación, disueltas en el tampón principal. Una de estas,
es capturada en la trampa óptica y colocada (mediante el dezplasamiento relativo de la celda de
�uidos con la trampa óptica) en la punta de la micropipeta, donde se mantiene gracias a la succión
de aire. Posteriormente, se �uyen las microesferas recubiertas de moléculas de ADN a través de un
conducto distinto y una de estas es capturada. Moviendo la cámara con respecto a la trampa, las
dos microesferas se aproximan hasta que se logra una conexión entre la biotina en un extremo de la
construcción y la microesfera en la micropipeta. El protocolo para unir las moléculas de ADN a las
microesferas recubiertas de antidigoxigenina varía según el caso, pero en todos fue optimizado hasta
conseguir aproximadamente una molécula de ADN por microesfera:
Estudio de la replicación acoplada al desplazamiento de banda. En este caso, la relación óptima
se consiguió mezclando ∼ 3 µl de microesferas recubiertas con anti-digoxigenina, ∼ 3 µl de la
horquilla de replicación (∼ 3 ng/µl) y ∼ 3 µl del tampón principal. La mezcla fue incubada durante
∼ 5 minutos a temperatura ambiente (23± 2 ºC) y disuelta en∼ 300 µl del tampón principal.
Estudio del mecanismo de translocación En este caso se siguieron dos pasos de incubación secuen-
ciales. Primeramente se formaron los complejos ADN -polimerasa mezclando 3 µl de la construcción
de ADN (∼ 3µg/µl) con 1 µl de la polimerasa biotinilada (x ng/ul). Esta mezcla se incubó durante
∼ 5 minutos a temperatura ambiente y se le añadió 3 µl de las micreosferas recubiertas con anti-
digoxigenina. Esta última mezcla fue incubada durante ∼ 5 minutos y posteriormente disuelta en
300 µl del tampón principal.
3.3.2. Tampones
En ambos estudios se utilizó el mismo tampón principal:50 mM Tris-HCL (pH 7, 5 ), 20 nM
Sulfato de Amonio, 7 mM 2-mercaptoetanol, 4 % Glycerol (peso/volúmen), 0, 025 % Tween20 (pe-
38
3.4 Polimerasa de ADN de Phi29 salvaje, mutante D12AD66A y biotinilada.
so/volúmen), 0, 1 µg/ml BSA).
En el caso del estudio dela replicación acoplada al desplazamiento de banda, la polimerasa se in-
trodujo en la celda de reacción a través del dispensador externo, disuelta en el tampón de racción
(al tampón principal se le añade 50 µM dNTP, 10 mM MgCl2). Todos los experimentos se realiza-
ron con una concentración de polimerasa de 20 nM , exepto los mostrados en la Figura 4.8, que se
realizaron con una concentración de 2 , 20 y 200 nM .
En el caso del estudio del mecanismo de translocación, a través del dispensador externo solo se
introdujo el bu�er de reacción: al tampón principal se le añade 10 mM MgCl2 y 5, 10, 50, 100, 200
y 500 µM dNTP según el caso.
3.3.3. Obtención de las microesferas recubiertas con antidigoxigenina.
Las microesferas recubiertas con anti-digoxigenina se obtuvieron a partir de microesferas recubiertas
de proteína G (Spherotech) según el protocolo que se describe a continuación. En primer lugar, el
tampón inicial de las microesferas se sustituyó por una solución de 100 mM fosfato sódico y 100 mM
NaCl. Después, las microesferas se mezclaron con dimetil pimelimidato dihidrocloruro (DMP) y con
anticuerpos de anti-digoxigenina (1 µg/µl), previamente disueltos en tampón fosfato salino (PBS ) a
pH 7. El DMP une covalentemente la antidigoxigenina a la proteína G de las microesferas mediante
la incubación durante 1 h a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, las microesferas se
precipitaron por centrifugación a 3000 rpm durante 3 min y se resuspendieron en 2 M Tris para
parar la reacción de unión. Tras 2 h las microesferas se centrifugaron de nuevo, se resuspendieron
en PBS y se conservaron a 4 ºC.
3.4. Polimerasa de ADN de Phi29 salvaje, mutante D12AD66A y
biotinilada.
Todas las polimerasa utilizadas fueron suministradas por el grupo de M. Salas en el Centro de
Biología Molecular Severo Ochoa, C. S. I. C. Para los experimentos del estudio del mecanismo de
apertura se utilizaron la polimerasa de Phi29 salvaje y el mutante D12AD66A, cuyo protocolo de
generación y puri�cación ha sido descrito previamente (Lazaro et al. (1995); Soengas et al. (1992)).
39
Capítulo 3 Materiales y Métodos
Biotinilación in vivo de la polimerasa de ADN de Phi29 La biotinilación in vivo del dominio
amino terminal de la polimerasa de Phi29 con una sola biotina fue realizada por José M. Lázaro,
perteneciente al grupo de M. Salas en el Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, C. S. I. C.
utilizando un set comercial de biotinilación (Avidity). De manera resumida: El gen que contiene la
secuencia de la polimerasa de Phi29 se insertó en un vector pAN corriente abajo de la secuencia
GLNDIFEAQKIEWHE (secuencia Avitag). La proteína recombinate fue expresada en la sepa de E.
coli K12 (AVB100), que contiene la ligasa BirA, la cual une covalentemente una sola biotina a la
secuencia Avitag. La proteína etiquetada fue puri�cada siguiendo métodos estándar (Lazaro et al.
(1995)).
Para veri�car posibles efectos de la etiqueta de biotina en la actividad de la proteína, se llevaron a
cabo ensayos bioquímicos estándar para examinar las actividades de polimerización, exonucleólisis
y desplazamiento de banda de la polimerasa recombinante. La comparación con la actividad de la
polimerasa salvaje muestra que la biotina en el extremo amino-terminal no afecta signi�cativamente
las actividades principales de la polimerasa de Phi29 (Sección 7.1).
3.5. Dependencia del tiempo de residencia con la secuencia de la
horquilla.
Para determinar el tiempo de residencia promedio en cada posición de la secuencia, se seleccionaron
trazas en un rango de fuerzas de 2−4 pN y se calculó, mediante un ajuste lineal, el tiempo promedio
que pasa la polimerasa en segmentos de 10 bases de longitud a lo largo de la traza. Posteriormen-
te, las trazas de tiempo de residencia fueron alineadas siguiendo el procedimiento descrito en la
Subsección 4.1.2 y se determinó la curva promedio, Figura 4.5.
La velocidad en función de la secuencia se calculó como el inverso del tiempo de residencia multipli-
cado por la longitud del segmento (10 bases). El porcentage de pares de bases GC se determinó de
manera directa a partir de la secuencia de la horquilla en intervalos de igual longitud. La asociación
entre los valores de velocidad y tiempo de residencia con la posición de la secuencia se realizó a
través del alineamiento entre las trazas calculadas (velocidad y tiempo) y el porcentaje de secuencia,
considerando sólo las actividades totales y haciendo coincidir los puntos de inicio y �nal de las trazas
con los de la secuencia.
40
4 Resultados
4.1. Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de
banda.
4.1.1. Diseño experimental
Para abordar el estudio del acoplamiento entre las actividades de desplazamiento de banda (db)
y polimerización (pol) de la polimerasa de ADN de Phi29, se aislaron horquillas de replicación
individuales entre dos microesferas localizadas en el interior de la cámara de reacción del instrumento
de pinzas ópticas Figura 4.1a. Una de las microesferas fue atrapada ópticamente y la otra mantenida
mediante succión mecánica en la punta de una micropipeta móvil. Cada una de las cadenas de la
horquilla fue modi�cada de manera complementaria con el recubrimiento químico de cada una de las
micreoesferas, lográndose la unión especí�ca de cada hebra a una microesfera. De esta manera fue
posible, desplazando la micropipeta con respecto a la trampa óptica, ejercer tensión mecánica sobre
la juntura de la doble hebra en la dirección de apertura. Para determinar el efecto de la secuencia en
la actividad de polimerización, la horquilla fue diseñada con cuatro regiones de 100 pares de bases
rica en pares AT (∼ 80 % AT ) separadas por cuatro regiones con de una a cuatro repeticiones de la
secuencia GCC. La inclusión de una lazo de unión entre las dos hebras al �nal de la horquilla, hizo
posible estudiar el proceso de replicación en presencia y en ausencia del proceso de desplazamiento
de banda, sobre la misma secuencia y en el mismo contexto experimental. Este diseño experimental
nos permitió por tanto estudiar la medida del efecto particular que tiene la tensión mecánica en la
juntura y la secuencia de la horquilla en las reacciones de replicación y desplazamiento de banda de
la polimerasa salvaje de Phi29 y el mutante de�ciente en desplazamiento de banda (ddb) D12AD66A.
El efecto de la estabilidad mecánica de la horquilla en la velocidad de replicación, comparada con
la velocidad de extensión del primer en las polimerasas salvaje y mutante permitió entender y
cuanti�car el mecanismo de apertura del ADN utilizado por esta polimerasa y su acoplamiento con
41
Capítulo 4 Resultados
el proceso de replicación.
(a)T
ensi
ón (pN
)Distancia (μm)
0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6
10
15
20
25
30
5
0
dsDNAfinal
HorquillaAbierta
Δx1(f,t) Δx2(f,t)Espaciador dsADN
Linker
Lazo
(b)
Figura 4.1: Diseño experimental. 4.1a: Representación esquemática del montaje experimental (no a escala). Una
única horquilla de replicación fue unida a microesferas funcionalizadas en el interior de la cámara de reacción del
instrumento de pinzas ópticas. Una de las hebras (azul) se unió, a través de un espaciador de ADN de doble
cadena, a la microesfera localizada en la trampa óptica, mientras que la hebra complementaria (rojo) fue unida
a la microesfera inmovilizada en la punta de una micropipeta móvil. La distancia entre ambas microesferas y la
fuerza que actúa sobre la microesfera atrapada fueron monitoreadas a una frecuencia de 60 Hz. 4.1b: Experimento
representativo que muestra la curva de apertura mecánica (negro) y relajación (rojo) de la horquilla de ADN . Los
elementos que componen la horquilla son fácilmente identi�cables: el linker, el lazo y las agrupaciones de repeticiones
de la secuencia GCC (picos equiespaciados de altura creciente). Al abrir toda la horquilla, se observa el patrón
de fuerza extensión típico de una molécula lineal híbrida de ADN de cadena sencilla y doble. Las actividades de
desplazamiento de banda ∆x1 (f, t) y extensión del primer ∆x2 (f, t) se detectan como una variación de la distancia
entre las microesferas (�echas horizontales) manteniendo la fuerza constante a un valor inferior a 14 pN . El producto
�nal de ambas reacciones consiste en una molécula lineal de dsDNA de 3800 pb.
4.1.2. Caracterización de la horquilla
Al estirar la molécula diseñada es posible identi�car todos los elementos que la componen, Figura 4.1b.
Por debajo de ∼ 14 pN , se observa la curva de fuerza extensión característica de una molécula de
ADN de doble cadena con una longitud de contorno que corresponde a 2686 pares de bases. Una vez
se supera cierto umbral, la fuerza aplicada es su�ciente para vencer los enlaces de Hidrógeno y el
resto de las interacciones que mantienen unidas las dos hebras de la doble cadena. En esta región se
observa el patrón de apertura mecánica de la doble hebra, el cual guarda una relación muy estrecha
con la secuencia del segmento de enlace, la horquilla, y el lazo, mostrando zonas más estables en
las posiciones donde existe una mayor concentración de pares de bases GC. Una vez se ha abierto
42
4.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
toda la molécula, y gracias al lazo colocado al �nal de la horquilla, es posible incrementar la fuerza
aun más. En este caso, el patrón de fuerza extensión corresponde al estiramiento de una molécula
lineal híbrida, que contiene 2686 pares de bases de dsDNA y 1000(515*2 + linker + lazo) bases
de ssDNA. Si el proceso de estiramiento se ha realizado a una velocidad su�cientemente lenta, es
posible disminuir la fuerza gradualmente y obtener una curva de relajación idéntica a la curva de
apertura1.
4.1.3. Detección de Actividad
Una vez comprobado que tenemos la molécula deseada, se le instruye al aparato que mantenga
la fuerza constante a un valor determinado, inferior a la fuerza de apertura. En estas condiciones,
cualquier cambio registrado en la fuerza sobre la partícula situada en la trampa óptica, será corregido
por el aparato acercando o alejando la microesfera ubicada en la pipeta.
(a)
0 5 10 15 20 25 30
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
Dis
tanc
ia (μm
)
Tiempo (segundos)
Salvaje Mutante ddb
Δx1(f,t) Δx2(f,t)
d. b. e. p. d. b. e. p.
(b)
Figura 4.2: Detección de las actividades de desplazamiento de banda y extensión del primer. 4.2a: Representa-
ción esquemática del diseño experimental. A fuerza constante y en presencia de dNTPs, la polimerasa de Phi29
(triángulo rojo) se une al único extremo 3' libre en la horquilla y comienza la actividad de polimerización acoplada
al desplazamiento de banda (poldb), seguida de la actividad exclusiva de polimerización (pol). Las actividades se
detectan como el cambio en distancia entre las microesferas en el tiempo, ∆x1 (f, t) y ∆x2 (f, t) respectivamente.
4.2b: Trazas representativas de la actividad de replicación de las polimerasa salvaje (azul) y mutante (verde) que
muestran en detalle el cambio en distancia durante las actividades poldb (∆x1 (f, t)) y pol (∆x2 (f, t)) (f ∼ 11 pN).
Al mantener la fuerza constante durante un tiempo aproximado de 5 minutos se comprueba que el
1El hecho de que relaje por la misma curva de subida es prueba de lo �su�cientemente�
43
Capítulo 4 Resultados
sistema es estable en una escala temporal superior a la típica de un experimento (20 segundos a una
velocidad de 60 nt/s) y que no existen transiciones que puedan ser activadas térmicamente o por
algún otro factor no controlado, como las vibraciones mecánicas trasmitidas a través de la pipeta.
Posteriormente se �uye al interior de la celda, a través del dispensador externo, una solución que
contiene la polimerasa de ADN de Phi29 en el tampón de reacción (que contiene los dNTPs). Una
vez que la solución alcanza la región de la celda de reacción donde se encuentra anclado el ADN, la
polimerasa se une al único extremo 3' libre de la horquilla y comienza la actividad de replicación,
Figura 4.2a.
Podemos identi�car dos regímenes de actividad: En un primer momento, la polimerasa se mue-
ve a través de la horquilla utilizando una de las hebras como molde para incorporar el nucleótido
complementario al extremo 3' del primer, a la vez que desplaza la hebra complementaria hacia ade-
lante. La apertura del ADN que antes formaba parte de la horquilla provoca que la longitud de ADN
entre las dos microesferas aumente gradualmente a lo largo de la actividad. Debido al régimen de
retroalimentación en fuerzas impuesto, el sistema está obligado a corregir la posición de la microes-
fera en la pipeta, para garantizar la fuerza constante en la trampa. Esto provoca un incremento de
la distancia entre las dos microesferas, ∆x1 (f, t), evidencia de la actividad de polimerización aco-
plada al desplazamiento de banda (poldb) de la polimerasa en el tiempo, Figura 4.2. El número de
nucleótidos replicados en el tiempo Xnuclt (f, t) se determinó como el cambio en distancia observado
dividido por la contribución debida a la elasticidad de los polímeros de ADN de cadena sencilla y
doble a la fuerza a la que se realiza el experimento. En este régimen, el efecto que tiene el avance de
la enzima sobre el substrato se puede explicar como la generación de dos bases de ssDNA, debido
a la apertura de un par de bases de la juntura, y la incorporación de una de estas al primer, o lo
que es lo mismo, la conversión de una de las bases de ssDNA a dsDNA. El número de nucleótidos
replicados en este caso viene dado por:
Xnuclt (f, t) =∆x1 (f, t)
2 · xss (f)− (xss (f)− xds (f))=
∆x1 (f, t)
xss (f) + xds (f)(4.1)
donde xss (f) y xds (f) son las características fuerza-extensión promedio por nucleótido para el ADN
de cadena sencilla y doble respectivamente, Figura 4.3.
Una vez que la enzima ha terminado la replicación de la horquilla, procede con la replicación de
la cadena sencilla complementaria previamente desplazada. La actividad de polimerización ocurre
ahora sin necesidad de abrir la doble hebra (pol). La conversión de la porción de 521 bases de ssDNA
44
4.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
en pares de bases de dsDNA provoca un cambio en la estructura de la molécula lineal híbrida anclada
entre las microesferas, debido a las diferentes propiedades mecánicas entre ambos polímeros Smith
et al. (1996); Bustamante et al. (2000b).
A fuerzas bajas predomina el régimen de elasticidad entrópica, en el cual la distancia entre los extre-
mos de la molécula está determinada por la capacidad que tiene el polímero de curvarse localmente
como resultado de las �uctuaciones térmicas. El efecto que tiene la actividad de replicación (con-
versión de ADN de cadena sencilla a doble), en este régimen, es el de convertir un polímero con
cierta �exibilidad en uno más rígido (Lp_ssDNA vs Lp_dsDNA=50 nm Fiosológicas), por lo que,
manteniendo la fuerza constante, la actividad se detecta como un aumento de la distancia entre
extremos de la molécula híbrida, ∆x2 (f, t).
Fuerzas más altas aplicadas en los extremos de la molécula, son capaces de vencer las �uctuaciones
térmicas y linealizar el polímero. En este régimen predomina la elasticidad intrínseca por lo que la
distancia entre extremos de la molécula viene dada por la estructura química de la molécula, a saber,
la distancia entre monómeros y la elasticidad longitudinal intrínseca (referencia). La actividad de
replicación en este caso se detecta como una disminución de la distancia, ∆x2 (f, t), Figura 4.2b,
entre los extremos de la molécula híbrida debido a la relación entre la distancia promedio entre
monómeros para las moléculas de ADN de cadena sencilla y doble (xss/xds = >1 poner número,
F=10pN, en nuestras condiciones experimentales).
A cierta fuerza, ambos efectos se compensan, y las características fuerza extensión para los polímeros
de ssDNA y dsDNA se igualan. En este rango de fuerzas (en nuestras condiciones 7 ± 2 pN ¾) es
imposible detectar actividad de replicación utilizando este método. En este régimen, para todo el
rango de fuerzas (excepto 7 ± 2 pN ¾), el número de nucleótidos replicados viene dado por Ibarra
et al. (2009):
Xnuclt (f, t) =∆x2 (f, t)
xss (f)− xds (f)(4.2)
Las magnitudes Xnuclt (f, t) calculadas de esta forma, están libres del efecto de la elasticidad del
substrato, por lo que responden intrínsecamente a características cinéticas del proceso de replicación
y desplazamiento de banda. Sin embargo, en el cálculo de las mismas no se ha asumido ningún modelo
cinético, número de estados o interconexión especí�ca entre estos: independientemente del esquema
cinético subyacente, el efecto total en el cambio en distancia que se detecta experimentalmente, se
propone viene dado por las expresiones Ecuación 4.1 y Ecuación 4.2. Una comprobación directa de
45
Capítulo 4 Resultados
la aplicabilidad de estas expresiones viene dada por el hecho de que la longitud total (en número de
nucleótidos replicados) de la mayoría de las actividades grabadas coincide con la longitud esperada
para el substrato diseñado bioquímicamente, Figura 4.7a.
Tensió
n (
pN
)
Distancia ( m)
0,6 0,8 1,0 1,2 1,40
2
4
6
8
10
12
(a)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,50
2
4
6
8
10
12
14
Ten
sión
(pN
)
Extensión (nm) / ssDNA (nt)(b)
Figura 4.3: Determinación de la curva de fuerza-extensión del ssDNA para el estudio de la replicación acoplada
al desplazamiento de banda. 4.3a: La inclusión de un sitio abásico (naranja) en el vértice del lazo colocado al �nal
de la horquilla de replicación, impide que la polimerasa replique la cadena desplazada en la primera parte de la
actividad, generando una molécula lineal híbrida compuesta por 3242 pb de dsDNA y 556 nt de ssDNA. Las curvas
de fuerza extensión representativas muestran la extension de la molécula espaciadora inicial (antes de la apertura
mecánica) (negro), ajustada con el modelo wlc (rojo) y la extensión de la molécula híbrida �nal (azul). 4.3b:
Extensión promedio (a partir de 21 moléculas independientes) entre nucleótidos de ssDNA en nuestras condiciones
experimentales. Las barras corresponden al error estándar.
Determinación de xds (f) y xss (f). La característica fuerza-extensión por nucleótido del ADN
de cadena doble, xds(F ), se calculó utilizando el modelo de física de polímeros llamado WLC (del
inglés, worm-like chain) Bustamante et al. (1994). En particular se utilizó la aproximación re�nada
ofrecida por (Bouchiat et al. (1999)(silvia)�> en matlab: Brochard & Croquette, Biophys J. 1998,
no aparece la referencia), con valores de longitud de persistencia de 53 nm y módulo de estiramiento
de 1200 pN/nm y valores de las constantes α de −56,70872, 157,99776, −155,50428, 64,29988,
−10,949672, −2,0656912, 4 y −1.
Para determinar la característica fuerza-extensión por nucleótido del ADN de cadena sencilla, en
nuestras condiciones experimentales, se utilizó un método basado en la reacción de replicación media-
da por la polimerasa, Figura 4.3. Se construyó una horquilla de replicación muy similar a la utilizada
en los ensayos de replicación, en la que se sustituyó la timina localizada en el vértice del lazo de
46
4.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
unión al �nal de la horquilla por un nucleótido abásico. Sobre este substrato, una vez la enzima ha
terminado la actividad de replicación y desplazamiento de banda, le es imposible continuar con la
actividad de extensión del primer. El resultado �nal de la reacción consiste en una molécula híbrida
que contiene Nds = 3242 pares de bases de dsDNA y Nss = 556 bases de ssDNA. Gracias a que
la hebra complementaria al segmento libre ha sido replicada, es posible relajar esta molécula por
debajo de ∼ 14 pN sin que ocurra la rehibridación y determinar así los valores de fuerza-extensión
xhı́b (f) de la molécula híbrida en el rango de fuerzas de interés. Los valores de xss(f) se obtienen
substrayendo a esta curva, la contribución debida a la porción de cadena doble y normalizando el
resultado al número total de nucleótidos de ssDNA, según la expresión:
xss (f) =xhı́b (f)− xds (f) ·Nds
Nss(4.3)
Nuestro diseño experimental permite la identi�cación inequívoca de los puntos de inicio y �nal de
cada reacción. La actividad poldb comienza en el único extremo 3' libre que posee la horquilla, el cual
coincide con la extensión de la molécula espaciadora de doble cadena. El punto �nal, se determina a
partir del cambio en la pendiente durante la actividad, Figura 4.2b, el cual también marca el inicio
de la actividad pol. Adicionalmente, este punto se puede identi�car a través de la distancia esperada
para una molécula hibrida con característica fuerza extensión xhı́b (f). El �nal de la actividad
de extensión del primer es fácilmente identi�cable a través de la extensión de la molécula de ADN
de cadena doble que resulta de procesar todo el substrato (dsDNA de 3798 pb, Figura 4.1b).
4.1.4. Efecto de la estabilidad de la horquilla en la velocidad de replicación
Tensión en la juntura La velocidad media de polimerización y desplazamiento de banda de la
polimerasa salvaje aumenta moderadamente con la fuerza, de Vpoldb = 80 nt/s (3,5 pN) a Vpoldb =
120 nt/s (13 pN), una velocidad similar a la velocidad de polimerización a lo largo de la hebra
complementaria (Vpol = 128 nt/s), Figura 4.4a. Por el contrario, la velocidad media de poldb de la
polimerasa mutante ddb presenta una dependencia en fuerza mucho más marcada, incrementándose
en un factor 9, de Vpoldb = 10 nt/s (4,2 pN) a Vpoldb = 90 nt/s (12 pN), también aproximándose
a su velocidad de pol Vpol = 128 nt/s, Figura 4.4b. Ambas polimerasas presentan una velocidad
de polimerización idéntica e independiente de la tensión por debajo de 14 pN , lo que indica que la
tensión en la hebra molde no afecta el paso limitante de la reacción de replicación, de acuerdo con lo
que ha sido reportado anteriormente para estas polimerasas Ibarra et al. (2009). Por lo tanto, estos
47
Capítulo 4 Resultados
datos indican que durante el proceso de desplazamiento de banda, la apertura de la doble hebra es
el paso dependiente de fuerza de la reacción, el cual limita moderadamente el avance a través de
la horquilla de la polimerasa salvaje y fuertemente el avance del mutante ddb (Vpoldb/Vpol= 0,67 vs
0,08 respectivamente).
Vep
Vdb
Vel
ocid
ad M
edia
(nt/s
)
12108642 14
140
120
100
80
60
40
20
0
Tensión (pN)(a)
Vep
Vdbsin pausas
Vdbcon pausas
140
120
100
80
60
40
20
012108642 14
Vel
ocid
ad M
edia
(nt/s
)
Tensión (pN)(b)
Figura 4.4: Dependencia con la tensión de las velocidades medias para la polimerasa salvaje y el mutante ddb. Sólo
se consideraron actividades totales. 4.4a: La dependencia con la tensión de la velocidad media de desplazamiento
de banda (Vpoldb) de la polimerasa salvaje con y sin pausas (círculos azules rellenos y vacíos respectivamente) se
explica correctamente con nuestro modelo activo (linea sólida azul). 4.4b: Las diferencias en la dependencia con la
tensión entre las velocidades medias de desplazamiento de banda Vpoldb del mutante ddb con y sin pausas (círculos
verdes rellenos y vacíos respectivamente) pueden ser explicadas con el mismo modelo activo cuando se tiene en
cuenta la cinética de pausas (línea sólida verde) (crossreference ecuación) o cuando ésta se excluye del modelo
(linea discontinua verde) (crossreference ecuación). 4.4a y 4.4b: Para ambas polimerasas los círculos rojos rellenos
y vacíos representan las velocidades medias de extensión del primer (Vpol) con y sin pausas respectivamente. La
línea roja discontinua representa la velocidad de extensión del primer independiente de tensión y secuencia utilizada
en el modelo (128 nt/s). Las barras de error representan el error estándar.
Efecto de la secuencia A continuación, determinamos el efecto de la secuencia en las velocidades
de desplazamiento de banda y extensión del primer de ambas polimerasas. Para la polimerasa salvaje,
durante la reacción poldb, una comparación directa entre el tiempo de residencia promedio que
pasa la proteína en cada posición de la horquilla y el patrón de apertura mecánica de la horquilla
muestra que esta pasa más tiempo en las posiciones con mayor concentración de pares de base
GC, Figura 4.5a. La cuanti�cación de este efecto reveló que la velocidad de apertura de los pares
GC es aproximadamente tres veces menor que la de los pares AT (VpoldbGC/VpoldbAT = 0,36), la
cual a su vez es similar a la velocidad de extensión del primer (VpoldbAT /Vpol = 0,86). Durante la
reacción pol, el tiempo de residencia promedio de ambas polimerasas, no presenta un incremento
48
4.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
preferencial en la regiones más estables de la horquilla (o en ninguna otra), Figura 4.5b, sugiriendo
que la secuencia de la hebra molde no tiene un efecto signi�cativo en la velocidad de extensión del
primer de las polimerasas salvaje y mutante. Curiosamente, la polimerasa mutante ddb presenta,
durante el desplazamiento de banda, pausas largas localizadas en la regiones de la horquilla con
mayor concentración de pares GC, Figura 4.6b.
Posición en el Molde (nucleótidos)
14
18
16
Te
ns
ión
(p
N)
segu
ndo
s / 1
0 nt
0 100 200 300 400 5000,0
0,1
0,2
0,3
(a)
9 GC 12 GC6 GC3 GC
0 100 200 300 400 5000,0
0,1
0,2
0,3
segu
ndos
/ 10
nt
Posición en el Molde (nucleótidos)(b)
Figura 4.5: Dependencia del tiempo de residencia con la secuencia para la polimerasa salvaje y el mutante ddb.
4.5a: Durante la actividad de desplazamiento de banda, la polimerasa salvaje pasa más tiempo (azul, f ∼ 4 pN ,
N = 15, ventana w = 10 nt) en las regiones más estables de la horquilla. El modelo propuesto (naranja) describe
correctamente este comportamiento. Para comparar, el patrón de fuerza-extensión experimental del proceso de
apertura mecánica de la horquilla se muestra en negro. 4.5b: Dependencia del tiempo de residencia durante la
reacción de extensión del primer con la secuencia para las polimerasas salvaje (azul, N = 17) y mutante (verde,
N = 12, w = 10 nt).
Estos datos indican que la apertura de las regiones más estables de la horquilla tiene diferentes
efectos en cada polimerasa: (i) Ralentiza la translocación de la polimerasa salvaje y (ii) promueve
la entrada del mutante ddb en un estado de pausa de larga duración. El efecto diferenciado de la
estabilidad de la horquilla en la reacción de polimerización acoplada al desplazamiento de banda de
cada polimerasa sugiere diferencias en sus mecanismos de apertura de la doble hebra Betterton and
Julicher (2005).
4.1.5. Cinética de Pausas
Nuestros datos indican que los estados inactivos de pausa pueden ser relevantes durante la reacción
de apertura de la doble hebra. Por lo tanto, para profundizar aun más en el mecanismo de despla-
49
Capítulo 4 Resultados
zamiento de banda de cada polimerasa, analizamos en detalle la dinámica de pausas y su relación
con las velocidades de desplazamiento de banda y extensión del primer.
Pos
ició
n en
el M
olde
Tiempo (segundos)
Velocidad (nt/s)
500
400
0
300
200
100
0 6 108
1000
0.06
0.03Pro
bab
ilid
ad
42 12
(a)
Pos
ició
n en
el M
olde
Tiempo (segundos)
Velocidad (nt/s)
500
400
0
300
200
100
0 40 12080
1000
0.08
0.04Pro
bab
ilid
ad
(b)
Figura 4.6: Procedimiento de detección de pausas. 4.6a: Trazas representativas (negro) y distribución de proba-
bilidad de velocidades (interior, azul, f ∼ 7,5 pN , N = 8) de la actividad de desplazamiento de banda para la
polimerasa salvaje. El ajuste a la función doble gaussiana revela un peso del pico centrado en 0 nt/s de A1 = 0,09,
una media x1 = 4,18 nt/s y una desviación estándar s1 = 4,58 nt/s. Para el estado de movimiento A2 = 0,92,
x2 = 93,98 nt/s y s2 = 1,12 nt/s 4.6b: Trazas representativas (negro) y distribución de probabilidad de velocidades
(interior, verde, f ∼ 5 pN , N = 8) de la actividad de desplazamiento de banda para la polimerasa mutante. En
este caso se detectan pausas largas localizadas en las regiones ricas en bases GC de la horquilla. El ajuste a la
distribución de probabilidad de velocidades revela para el pico del estado de pausa: A1 = 0,50, x1 = 0,00 nt/s y
s1 = 0,24 nt/s y para el del estado de movimiento: A2 = 0,50, x2 = 76,05 nt/s y s2 = 2,70 nt/s. �> Ver bondad
de los �ts. El umbral para determinar los eventos de pausa (interior, linea discontinua gris). Los eventos de pausas
detectados se muestran en rojo sobre las trazas, así como las posiciones de las cuatro regiones de la horquilla ricas
en pares GC (líneas discontínuas horizontales).
Detección de pausas El procedimiento de detección de pausas, Ibarra et al. (2009), se inicia
con la unión de las trazas grabadas a fuerzas similares (en un rango de ±1, 6 pN), con el �n de
aumentar el tamaño de la muestra. A partir de las trazas catenadas, se determinó la velocidad de
replicación instantánea mediante un ajuste lineal al número de nucleótidos replicados en un intervalo
de tiempo pequeño (ver, depende del caso t = 0, 7 s, equivalente a Nwin puntos), que se desplaza
secuencialmente sobre cada punto de la traza. Este procedimiento, conocido como media móvil
(�moving average� en inglés) devuelve un valor de velocidad correspondiente a cada punto (excepto
los últimos Nwin) que contiene información de los anteriores t segundos tomados en consideración,
por lo que además de permitir el cálculo de magnitudes medias a lo largo de la serie temporal,
constituye en si mismo un procedimiento de �ltrado, equivalente a un �ltro pasa bajo que elimina,
50
4.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
mediante el promediado, las �uctuaciones que ocurren en una escala temporal menor que t (o sea, a
una frecuencia mayor que 1/t).
A partir del histograma de velocidades se calculó la distribución de probabilidad de velocidades como
el número de conteos para un valor determinado de velocidad dividido por la suma total de conteos,
Figura( 4.6a y 4.6b, interior). En todos los casos estudiados (para ambas polimerasas y para todas
las tensiones) la distribución de probabilidad de velocidades presentó una distribución bimodal, en
la que fue posible asignar un pico (centrado en la vecindad de 0 nt/s) al estado de pausa y otro
(centrado en algún valor de velocidad positivo) al estado de movimiento. Un ajuste a una función
doble gaussiana permitió parametrizar este comportamiento:
y = A1 exp
(− (x− x1)2
2s21
)+A2 exp
(− (x− x2)2
2s22
)(4.4)
Donde A1 y A2 son las amplitudes, x1 y x2 los valores medios y s1, s2 las desviaciones estándar de
cada una de las funciones de Gauss, Figuras( 4.6a y 4.6b, interior linea sólida roja).
A partir del ajuste, se puede de�nir la velocidad del estado de movimiento, o velocidad sin pausas,
como el valor medio de la distribución correspondiente a la segunda gausiana: Vsin−pausas = x2 y la
velocidad media, Vmedia, como el promedio de todas las velocidades.
A partir de la posición x1, se de�nió un umbral, localizado 2 veces la desviación estándar (s1)
a la derecha, por debajo del cual se considera que la polimerasa atraviesa un estado de pausa,
Figuras( 4.6a y 4.6b, interior, línea discontinua gris). Posteriormente se determinó en la curva de
velocidad instantánea las porciones de la actividad con velocidad inferior al umbral y se procedió a
recuperar las regiones de la traza de nucleótidos replicados en el tiempo a las cuales corresponden
estos intervalos, Figuras( 4.6a y 4.6b, segmentos rojos sobre la traza).
Con este procedimiento fue posible identi�car y estudiar la cinética de pausas de ambas polimerasas,
con una resolución de 0, 4-0, 8 s segundos, en los dos regímenes de actividad (poldb y pol) y en todo
el rango de tensión.
Procesividad Previo a un análisis detallado de la cinética de pausas, veri�camos que para ambas
polimerasas, el comportamiento de pausas observado no se debe al reemplazo de moléculas de po-
limerasa en el extremo 3' del primer. En nuestros experimentos, la polimerasa salvaje de ADN de
Phi29 (altamente procesiva, REFERENCIA) replica la totalidad de la horquilla en todo el rango
51
Capítulo 4 Resultados
de tensión estudiado. Por el contrario, a tensiones bajas (menores que 4 pN) solo se detectaron
actividades parciales para la polimerasa mutante ddb. Sin embargo, la aplicación creciente de ten-
sión desestabilizadora en la juntura de la horquilla permitió rescatar mecánicamente la actividad
de la polimerasa mutante: a 6 pN el 90 % de las moléculas fue capaz de replicar toda la horquilla,
Figura 4.7a.
Como actividad parcial consideramos un evento de replicación en el cual la polimerización no se
recupera en un tiempo de 5 min después de un evento de pausa. Esta ventana de tiempo es apro-
ximadamente 10 veces mayor que la duración media de pausas para la polimerasa mutante durante
el desplazamiento de banda (a baja tensión) y aproximadamente 300 veces mayor que la duración
media de las pausas cortas encontradas para ambas polimerasas durante la actividad pol.
12108642
600
550
500
450
400
350
300
250
Tensión (pN)
Nuc
leót
idos
rep
licad
os
(a)
3 GC 6 GC 9 GC 12 GC
5004003002001000
Posición en el molde (nucleótidos)
30
25
20
15
10
5
0
% A
ctiv
idad
es p
arc
iale
s
(b)
Figura 4.7: Procesividad de las polimerasas salvaje y mutante ddb. 4.7a: Polimerasa salvaje, desplazamiento
de banda (círculos rellenos azules, N = 76 actividades), extensión del primer (círculos rellenos rojos, N = 50).
Cerca del 98 % de las actividades completan la replicación de la horquilla. Para el mutante ddb, desplazamiento de
banda (círculos rellenos verdes, N = 81), extensión del primer (círculos vacíos rojos, N = 45). La concentración de
proteína para ambas polimerasas es de 20 nM . Las barras de error muestran el error estándar. La línea negra señala
la longitud total de la horquilla (556 pb). 4.7b: El 93 % de las actividades parciales del mutante ddb se detienen en
las posiciones de la horquilla con mayor densidad de pares GC (N = 20).
Curiosamente, el número de actividades parciales no depende de la concentración de polimerasa. Esto
se puede deber a al menos dos situaciones: i) El complejo inactivo polimerasa - ADN es muy estable
(más de 5 min). ii) Después de la replicación parcial, la polimerasa eventualmente se desprende de
la horquilla. La rápida rehibridación de la horquilla obstruye el sitio de unión de la polimerasa (el
cual requiere entre 3 y 4 nucleótidos de la hebra molde libres), previniendo la unión de moléculas
adicionales de polimerasa y por tanto evitando que se reanude la actividad de polimerización.
52
4.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
Estas observaciones sugieren que, dado que la polimerización generalmente se reanuda después de una
pausa de duración igual o menor que 30 s, la cinética de pausas observada no se debe al reemplazo
de moléculas de proteína en el extremo 3' del primer. La independencia de la duración de pausas
con la concentración de proteína (en un rango entre 2 y 200 nM), determinada experimentalmente,
refuerza aún más esta hipótesis, Figura 4.8.
Concentración de Polimerasa (nM)
Dur
ació
n de
pau
sas
(s)
1,2
0,8
0,4
0,01000100101
(a)
Concentración de Polimerasa (nM)
1000100101
12
8
4
0
Dur
ació
n de
pau
sas
(s)
(b)
Figura 4.8: Dependencia de la duración de pausas con la concentración de polimerasa para las polimerasas salvaje
y mutante ddb. 4.8a: Duración media del estado de pausas cortas (segundos): Polimerasa salvaje: desplazamiento
de banda, circulos rellenos azules y extensión del primer, circulos rellenos rojos. La polimerasa mutante: extensión
del primer, circulos rellenos verdes. La línea roja corresponde a un ajuste lineal a los datos (pendiente = −0, 45×10−4± 8, 33× 10−4 s
nM). 4.8b: Duración media del estado de pausas largas de la polimerasa mutante. Cada punto
representa el promedio de muchas actividades tomadas a 8 ± 1 pN , la línea roja corresponde a un ajuste lineal a
los datos (pendiente = −0, 004± 0, 006 snM
).En ambos paneles las barras de error representan el error estándard.
Cuanti�cación de la cinética de pausas. Tres magnitudes caracterizan la cinética de pausas ob-
servada. i) La frecuencia de pausas, FP =np
tnp,[
1s
], donde np es el número promedio de pausas de
cada tipo (cortas y largas) por actividad, en actividades dentro de un rango de tensión similar y
tnp el tiempo medio sin pausas en cada actividad, de�ne la frecuencia de ocurrencia de cada tipo de
evento de pausa. ii) En el cálculo de la frecuencia se seleccionan y agrupan las pausas de cada tipo.
Debido a que la frecuencia de ocurrencia de los eventos de corta duración es mucho mayor que los de
larga duración, decidimos calcular la distribución de frecuencias de duración de pausas, FDP[
1s2
],
de�nida como la frecuencia de ocurrencia de una determinada duración de pausas dividida por el
tiempo sin pausas. iii) La duración de pausas, que se obtiene de manera directa a partir del proceso
de detcción de pausas.
53
Capítulo 4 Resultados
Para la polimerasa salvaje, solo se detectaron pausas cortas durante las condiciones de poldb y pol.
En ambos casos las pausas presentaron características similares: La distribución de frecuencia de
duración de pausas, FDP (f, t), es consistente con una estadística de Poisson correspondiente a un
solo tipo de evento. La frecuencia de pausas, FP decrece exponencialmente con la tensión y crece
linealmente con la densidad de pares GC en la horquilla, Figura( 4.9b y 4.9c), mientras que la
longitud media de pausas (aproximadamente 0,6 s) es independiente de la tensión y de la secuencia,
Figura( 4.11a y 4.11c).
Estas similitudes indican que la presencia de la juntura no altera signi�cativamente la cinética de
pausas características de la replicación del ADN y no promueve la entrada en ningún estado de
pausas alternativo, sugiriendo que estos estados de pausas cortas están relacionados con el ciclo
bioquímico de replicación y no con la reacción de apertura de la doble hebra.
Durante la reacción de extensión del primer (pol) el mutante ddb también presenta pausas cortas
con iguales proporciones (rates) y dependencia de tensión y secuencia que la polimerasa salvaje,
Figura( 4.10a - 4.10c) y Figura( 4.11b y 4.11c), sugiriendo que la naturaleza del estado inactivo de
corta duración, durante el ciclo de replicación, es la misma para ambas polimerasas. Este resultado es
consistente con los observados en ensayos bioquímicos, en los que este mutante presenta las mismas
propiedades de extensión del primer que la polimerasa salvaje Esteban et al. (1994).
Sin embargo, durante la reacción de desplazamiento de banda, las propiedades del comportamiento
de pausas del mutante ddb son diferentes. En este caso, la distribución de frecuencia de duración
de pausas se ajusta mejor a una doble exponencial, indicando que al menos dos tipos de eventos
de pausas, cortas (típicamente menores de 4 s) y largas (típicamente mayores de 4 s), coexisten,
Figura 4.10a. El análisis de los eventos de pausas de corta duración revela que estas presentan casi
las mismas características que las pausas observadas durante la extensión del primer y las descritas
para la polimerasa salvaje, sugiriendo que estas pausas corresponden al estado de corta duración
característico de la replicación del molde, y que no están relacionadas con la apertura de la doble
hebra. Las pausas largas, por el contrario, presentan propiedades muy diferentes a las de las cortas:
Sólo ocurren durante la apertura de la doble hebra y no durante la extensión del primer. Su duración
es aproximadamente 50 veces mayor que la de las cortas (a bajas fuerzas), Figura 4.11d y lo más
importante, presentan una marcada dependencia con la tensión, decreciendo, exponencialmente al
incrementarse la tensión externa que desestabiliza la horquilla, Figura 4.11b. Adicionalmente, su
frecuencia decrece exponencialmente con la tensión, Figura 4.10b y aumenta linealmente con el
aumento de la densidad de pares GC en la horquilla, Figura 4.10c. En su conjunto, estos datos
54
4.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
0.010
1.000
0.0010 321
Tiempo (s)
0.100
exp[FLP(f,t)
(s-2 )
]
(a)
0.10
1.00
0.01
2 1210864 14exp[FP(f,t)
(s-1 )
]Tensión (pN)(b)
FP(f,t)
(s-1 )
-1
%GC
0 60402010 30 50 70
1
1,5
0
0,5
2
(c)
Estado Activo
Pausa
Corta P1
k1a
ka1(f)
(d)
Figura 4.9: Comportamiento de la frecuencia de pausas para la polimerasa salvaje. 4.9a - 4.9c: Los puntos
rojos representan la reacción de extensión del primer y los azules la reacción de desplazamiento de banda. 4.9a:
La distribución de frecuencia duración de pausas (FDP (f, t)[s−2
]) puede ser ajustada con una exponencial simple
(f ∼ 5 pN). Extensión del primer, línea roja (R2 = 0,89, N = 22) y desplazamiento de banda, línea azul (R2 = 0,87,
N = 38). 4.9b: La frecuencia de pausas[s−1
]decrece exponencialmente con la tensión (las líneas sólidas representan
un ajuste a los datos con la Ecuación 4.5) y 4.9c: aumenta linealmente con el aumento del contenido de pares de
bases GC en el ADN (f ∼ 5 pN). Extensión del primer, línea roja (R2 = 0,81, N = 38) y desplazamiento de banda,
línea azul (R2 = 0,78, N = 22). 4.9d: Modelo cinético propuesto para explicar el comportamiento de las pausas
cortas (Pausa Corta P1). Véase la Tabla 4.1 con los valores de los rates transición y la dependencia en tensión
asociada, da1.
55
Capítulo 4 Resultados
0.010
1.000
1E-4
0 352010
Tiempo (s)
0.100
exp[
FL
P(f
,t) (
s-2)]
5 15 25 30
1E-3
Corta Larga
(a)
0.10
1.00
0.01
2 1210864 14
exp[FP(f,t)
(s-1 )
]Tensión (pN)(b)
FP(f,t)
(s-1 )
-1
1
1,5
0
0 604020
%GC
10 30 50 70
0,5
2
(c)
Estado Activo
Pausa
Corta P1
Pausa
Larga P2
k1a k2a(f)
ka2(f)ka1(f)
(d)
Figura 4.10: Comportamiento de la frecuencia de pausas para el mutante ddb. 4.10a: La distribución de frecuencia
longitudes de de pausas (FLP (f, t)[s−2
]) durante la reacción de extensión del primer (f ∼ 6,5 pN , círculos rojos)
es compatible con una exponencial sencilla (línea sólida roja, R2 = 0,97, N = 25) y es similar a la distribución de
frecuencias de pausas cortas durante el desplazamiento de banda y la extensión del primer de la polimerasa salvaje
(linea gris), Figura 4.9a. Durante la reacción de desplazamiento de banda (f ∼ 6,5, círculos verdes) se requiere una
doble exponencial para ajustar los datos (línea sólida verde, R2 = 0,93, N = 41). 4.10b - 4.10c: Los círculos verdes
representan las pausas cortas durante el desplazamiento de banda, los círculos rojos las pausas cortas durante la
extensión del primer y los círculos negros las pausas largas durante el desplazamiento de banda. 4.10b: Para ambos
tipos de pausas, la frecuencia (FP
[s−1
]) decrece exponencialmente con la tensión (las líneas sólidas representan un
ajuste de los datos a la Ecuación 4.5) y 4.10c: crece linealmente con el porcentaje de pares GC en la horquilla (las
líneas sólidas representan ajustes lineales, R2 = 0,98, 0,99, 0,92). 4.10d: Modelo cinético propuesto para explicar
el comportamiento pausas de la polimerasa mutante durante el desplazamiento de banda. Véase Tabla 4.1 con los
valores de los rates transición y las dependencias en tensión asociadas.
56
4.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
2 1210864 14
Tensión (pN)
1.5
Long
itud
de
Pau
sas
(s)
1.0
0.5
0.0
2.0
(a)
2 1210864 14
Tensión (pN)
1
10
0.1Long
itud
de
Pau
sas
(s)
(b)
1.5
Long
itud
de
Pau
sas
(s)
1.0
0.5
0.0
2.0
%GC
40 602010 30 50 70
(c)
%GC
40 602010 30 50 70
30
Long
itud
de
Pau
sas
(s)
20
10
0
80
40
50
60
70
(d)
Figura 4.11: Duración de pausas para las polimerasas salvaje y mutante. 4.11a: Para la polimerasa salvaje la
duración media de pausas [s] es independiente de la tensión, tanto durante la actividad poldb (círculos azules) como
durante la pol (círculos rojos). La línea roja muestra un ajuste lineal a los datos (pendiente: 0,001 ± 0,016 spN
).
4.11b: Para la polimerasa mutante ddb la duración media de las pausas cortas, tanto durante poldb (círculos verdes)
como durante pol (círculos rojos) es independiente de tensión mientras que la duración media de las pausas largas
durante poldb (círculos negros) decrece exponencialmente con la tensión (La línea negra representa un ajuste a la
Ecuación 4.5). 4.11c: Dependencia de la duración media de las pausas cortas con el porcentaje de pares GC en la
horquilla (ventana de 20 pb). Para la polimerasa salvaje: poldb, círculos azules rellenos, pol , círculos azules vacíos.
Para la polimerasa mutante ddb: poldb, cuadrados verdes rellenos y pol , cuadrados verdes vacíos. La línea roja
representa un ajuste lineal a los datos (pendiente: 0,00± 0,17 s%GC
). 4.11d: Dependencia de la duración media de
pausas con el contenido de pares GC, del estado inactivo de larga duración para la polimerasa mutante durante
poldb (ventana de 20 pb, f ∼ 6 pN). La línea roja muestra un ajuste lineal a los datos (pendiente: 0,19±0,27 s%GC
).
En todas las �guras las barras de error representan la desviación estándar.
57
Capítulo 4 Resultados
indican que las pausas largas corresponden a un estado inactivo del complejo ADN -polimerasa
inducido durante la apertura de las regiones más estables de la horquilla (agrupaciones de GC )
y que la desestabilización mecánica externa de la juntura promueve la salida de este estado. Estas
observaciones explican la incapacidad del mutante ddb de replicar in vitro el genoma de doble cadena
del fago Phi29 mas allá de la región inicial rica en bases GC Esteban et al. (1994).
El comportamiento de pausas de la polimerasa salvaje (durante las reacciones poldb y pol) y de la
polimerasa mutante durante la reacción pol puede ser explicado con un modelo cinético simple en el
cual las pausas cortas corresponden a un estado único o�-pathway que se bifurca del estado activo
principal de la proteína durante la replicación de las regiones del molde ricas en pares GC (Pausa
Corta P1, Figura 4.9d). En cambio, el modelo más simple que puede explicar el comportamiento de
pausas del mutante durante la apertura de la doble hebra requiere que los estados de pausas cortas
y largas bifurquen de manera independiente del estado activo principal de la polimerasa (Pausa
Corta P1 y Pausa Larga P2 respectivamente, Figura 4.10d). Modelos alternativos también fueron
considerados ANEXO?.
En estos modelos, los rates dependientes de tensión, de entrada y salida a los estados de pausa, k (f)
varían con la tensión según Bustamante et al. (2004):
k (f) = k (0) exp
(−f · dkBT
)(4.5)
donde f es la tensión aplicada, k(0) es el rate de transición entre los estados activos y de pausa
en ausencia de fuerza aplicada (f = 0) y d es la distancia al estado de transición a lo largo de la
coordenada mecánica de�nida por la dirección de aplicación de la tensión externa.
4.1.6. Cuanti�cación del mecanismo de apertura de la doble hebra.
Nuestros datos revelan que las pausas modulan fuertemente la velocidad media de desplazamiento de
banda del mutante. De manera similar, ha sido descrito que las pausas forman parte del mecanismo
de apertura de numerosos motores especializados de ácidos nucleicos Cheng et al. (2007); Sun et al.
(2008); Kim et al. (2010a); Ribeck et al. (2010). Por lo tanto, para la correcta interpretación de las
dependencias en secuencia y tensión, de las velocidades de apertura de la doble hebra, la cinética de
eventos de pausa debe ser considerada. Hemos extendido la descripción física Betterton and Julicher
(2005); Johnson et al. (2007), Sección 7.3, en la cual el grado de actividad de un motor de ácidos
nucleicos capaz de abrir la doble hebra depende de la energía de interacción ∆Gint entre la proteína
58
4.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
y la juntura de la doble hélice, para incluir el efecto de las pausas en la reacción de apertura de la
doble hebra de la polimerasa de ADN de Phi29. Esta parte del trabajo se hizo en colaboración con
F. J. Cao del departamento de Física Atómica, Molecular y Nuclear de la Universidad Complutense
de Madrid.
5'
3'
3'
5'
5'
l m
M
L
Replicación
Figura 4.12: Representación esquemática y notación
del modelo utilizado para describir el avance de la poli-
merasa (triángulo rojo) en las condiciones de desplaza-
miento de banda. M de�ne el rango de interacción entre
la polimerasa y la juntura; m es el número de nucleóti-
dos disponibles entre la la posición de la polimerasa (l,
número de nucleótidos replicados) y la juntura. L es la
longitud total de la horquilla.
Generalización del modelo La generalización
para incluir la cinética de pausas se hizo de ma-
nera directa, en términos del tiempo de residen-
cia de la polimerasa en cada posición del molde.
El tiempo de residencia teniendo en cuenta las
pausas T (f) está determinado por el tiempo de
residencia en ausencia de pausas Ta (f) mas la
contribución de cada tipo de evento de pausa
Ti (f) según T (f) = Ta (f) +∑
i Ti (f)
En ausencia de pausas, el tiempo de residencia
promedio en la posición l viene dado por:
ta (f) =1
ka (l, f)
y el tiempo de residencia promedio por nucleó-
tido para toda la secuencia viene dado por:
Ta (f) =1
L
L∑l=1
1
ka (l, f)
De acuerdo a nuestros modelos cinéticos, la contribución al tiempo de residencia debido a los eventos
de pausa viene dado por:∑
i Ti (f) = T1 + T2 donde los tiempos de residencia adicionales T1 y T2
vienen dados por los rates de entrada y salida (ka1 (f), ka2 (f) y k1a, k2a (f)) a los estados de pausas
de corta y larga duración según T1 (f) = Ta (f) · ka1(f)k1a
y T2 (f) = Ta (f) · ka2(f)k2a(f) .
Determinación de los rates De acuerdo con el modelo, encontramos que tanto la frecuencia como
la duración de pausas dependen de tensión según la Ecuación 4.5. Los rates dependientes de tensión,
de entrada y salida a los estados de pausa P1 (ka1 (f, t), k1a) y P2 (ka2 (f, t), k2a (f, t)), así como
sus respectivos cambios conformacionales asociados (da1, da2 y d2a), se determinaron a partir de un
59
Capítulo 4 Resultados
ajuste a la Ecuación 4.5 (ka1 (f) = ka1 (0) exp [−da1·f/kBT ] para el rate de entrada al estado de pausa
P1, de manera análoga para los otros rates) a los datos de dependencia de la frecuencia (entrada) y
duración (salida) de pausas con la tensión, (Figura 4.9b y 4.10b), Tabla 4.1. La frecuencia de salida
del estado de pausa corta, k1a puede ser calculada directamente como el inverso de la longitud de
pausas cortas, independiente de tensión y secuencia, (Tabla 4.1).
salvaje e. p salvaje d. b. ddb e. p. ddb d. b.
ka1 (0) 0,80± 0,12 0,35± 0,05 0,7± 0,3 0,7± 0,3
da1 0,50± 0,08 0,45± 0,08 0,6± 0,2 0,5± 0,2
k1a 1,5± 0,9 1,5± 1,4 1,4± 1,1 1,4± 1,2
ka2 (0) n.a. n.a. n.a. 0,4± 0,3
da2 n.a. n.a. n.a. 0,7± 0,3
k2a (0) n.a. n.a. n.a. 0,02± 0,02
d2a n.a. n.a. n.a. −0,7± 0,4
Tabla 4.1: Rates y cambios conformacionales durante las reacciones de extensión del primer (e. p.) y desplazamiento
de banda (d. b.) determinados a partir de ajustes independientes a la dependencia de la frecuencia y duración de
pausas con la tensión. Los rates (k) están en s−1, las dependencias de tensión de Arrenius (d) en nm y los errores
representan el error estándar. n. a., no se aplica.
Por otra parte, el efecto de las pausas en los tiempos de residencia y la velocidad global de replicación
también determina la distribución de frecuencia de duración de pausas FDP (f, t). En nuestro modelo
cinético, la probabilidad de ocurrencia de un evento de pausa tipo P1 y duración t viene dada
por: PP1 = k1a · exp [−k1a · t]. De manera similar, para un evento de pausa de tipo P2: PP2 =
k2a · exp [−k2a · t]. La frecuencia media de ocurrencia de los eventos de pausa P1 y P2 viene dada
por ka1 y ka2 respectivamente por lo que si efectivamente solo existe un estado de pausa (Pausa
corta P1) (Figura 4.9d), la distribución de frecuencias de duración de pausas tiene la forma:
FDP (f, t) = ka1 · PP1 = ka1 (f) · k1a · exp [−k1a · t] (4.6)
donde ka1 (f) es el rate de transición entre el estado de polimerización activo y el estado de pausa
P1, y k1a es el rate de salida del estado de pausa P1 hacia el estado activo. Este simple modelo
explica la distribución de frecuencias de longitudes de las pausas cortas para la polimerasa salvaje
(en ambas condiciones de replicación, Figura 4.9a) y para el mutante ddb en las condiciones de solo
polimerización, Figura 4.10a, círculos rojos. El ajuste a estos datos proporcionó los valores de los
rates de entrada y salida, ka1 y k1a, al estado de pausa cortas para ambas polimerasas (Tabla 4.2).
Si efectivamente existen dos estados de pausa, (Pausa Corta P1 y Pausa Larga P2), sin transiciones
entre ellos, Figura 4.10d, la distribución de frecuencias de duración de pausas tiene la forma de una
60
4.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
doble exponencial:
FDP (f, t) = ka1 (f) · k1a · exp [−k1a (f) · t] + ka2 (f) · k2a (f) · exp [−k2a (f) · t]
donde ka2 (f) y k2a (f) son los rates de transición entre el estado activo de polimerización y el estado
de pausa P2.
La distribución de frecuencias de duración de pausas para el mutante ddb durante el desplazamiento
de banda se ajustó directamente con esta función de cuatro parámetros (Figura 4.10a), devolviendo
los valores para los rates de entrada y salida al estado de pausa P2 (Tabla 4.2). Estos valores se en-
cuentran dentro del rango de error de aquellos hallados mediante el análisis de los rates dependientes
de tensión (Tabla 4.1).
salvaje pol salvaje poldb ddb pol ddb poldb
ka1 0,70± 0,33 0,35± 0,10 0,87± 0,37 0,60± 0,05
k1a 2,0± 0,3 2,2± 0,4 2,35± 0,46 2,25± 0,60
ka2 n.a. n.a. n.a. 0,30± 0,14
k2a n.a. n.a. n.a. 0,02± 0,02
Tabla 4.2: Rates de entrada y salida durante las reacciones de polimerización y desplazamiento de banda (poldb)
y solo polimerización (pol) determinados a partir de la distribución de frecuencia de duración de pausas. Los rates
(k) están en s−1, las dependencias de tensión de Arrenius (d) en nm y los errores representan el error estándar. n.
a., no se aplica.
Una doble exponencial también se obtiene en el caso en que se permitan transiciones entre los estados
de pausa:
Sin embargo, los 6 rates de transición que surgen de este modelo más general, no pueden ser deter-
minados a partir de los cuatro coe�cientes que de�nen la doble exponencial. Este ejemplo pone de
mani�esto que distintos modelos cinéticos pueden conllevar a la misma distribución de frecuencias
de longitudes pausas, aunque con el modelo más sencillo (sin transiciones entre los estados de pausa)
es su�ciente para explicar nuestros datos.
61
Capítulo 4 Resultados
Las frecuencias de entrada a los estados de pausa corta (ka1(f)) y larga (ka2(f)), además de ser
dependientes de tensión, lo son de la secuencia (Figura 4.9c y Figura 4.10c), por lo que calculamos
las frecuencias particulares de entrada de ambos estados de pausa en las posiciones ricas en GC,
ka1GC(f) y ka2GC(f) teniendo en cuenta que el tiempo de residencia también puede ser expresado
en función del tiempo de residencia promedio por nucleótido en un par de base GC o AT (TaAT y
TaGC respectivamente) como:
Ta (f) = (1−XGC) · TaAT (f) +XGC · TaGC
siendo XGC la fracción de pares de bases GC que han sido replicados,
TaGC (f) = 1XGC ·L ·
∑pb(l+1)=GC
1ka(l,f)
el tiempo de residencia promedio por nucleótido en una base G o C y
TaAT (f) = 1(1−XGC)·L ·
∑pb(l+1)=AT
1ka(l,f)
en una base A o T. Debido a que solo hemos observado pausas asociadas con los nucleótidos G o C (la
frecuencia de pausas es aproximadamente 0 pausas/s en las posiciones con 100 % de pares de bases
AT, Figura 4.9c y 4.10c) podemos rede�nir los rates de entrada en términos de una frecuencia por
tiempo sin pausa en GC, corrigiendo ka1 (0) y ka2 (0) con la proporción de tiempo que la polimerasa
pasa en las posiciones GC del molde. Este nuevo rate, ka1GC (f) (para el caso del estado de pausa
P1), está relacionado con el anterior según: ka1GC (f) = Ta(f)TaGC(f) · ka1 (f), lo que conduce a que
T1 (f) = TaGC (f) · ka1GC(f)k1a(f) . De manera análoga se determina el rate de entrada al estado de pausa
P2. Los valores de estos rates se obtuvieron a partir del ajuste a la frecuencia y duración de pausas
dependiente de tensión, Tabla 4.3.
Ajuste del modelo Hemos utilizado este modelo para cuanti�car la actividad de apertura de la
doble hebra de ambas polimerasas, teniendo en cuenta las pausas en la velocidad media de despla-
zamiento de banda y eliminando las mismas. En el caso particular de una polimerasa de ADN, la
62
4.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
salvaje pol salvaje poldb ddb pol ddb poldb
ka1GC (0) 3,20± 0,11 0,72± 0,11 3,0± 1,3 1,5± 0,6
da1GC 0,53± 0,18 0,28± 0,18 0,6± 0,2 0,4± 0,2
ka2GC (0) n.a. n.a. n.a. 0,8± 0,6
da2GC n.a. n.a. n.a. 0,5± 0,3
Tabla 4.3: Rates de entrada a pausa por unidad de tiempo sin pausa, (a f = 0), y cambios conformacionales durante
las reacciones de polimerización y desplazamiento de banda (poldb) y solo polimrización (pol) determinados a partir
de la dependencia de tensión de la longitud y la frecuencia de pausas. Los rates (k) están en s−1, las dependencias
de tensión de Arrenius (d) en nm y los errores representan el error estándar. n. a., no se aplica.
translocación ocurre en pasos discretos de 1 nt (tamaño del paso, δ = 1 nt)Berman et al. (2007) y
la tranaslocacion en dirección corriente arriba no se espera y no ha sido observada con la resolución
de nuestros experimentos. Además, la polimerasa solo se puede mover hacia adelante cuando hay
nucleótidos de cadena sencilla de la hebra molde disponible, m ≥ 1. En nuestras condiciones experi-
mentales, hemos determinado que el rate de translocación hacia adelante es k0 ∼ 128 nt/s mientras
que el de translocación hacia atrás puede ser considerado 0 nt/s y su efecto ser despreciado en el
cómputo de la velocidad de replicación.
Sólo dos variables determinan los ajustes: la energía de interacción por par de bases entre la polime-
rasa y la juntura, ∆Gd, y el alcance de esta interacción M . El mejor ajuste al modelo (ECUACION
V(F)), para la velocidad de polimerización y desplazamiento de banda dependiente de tensión de
la polimerasa salvaje (con y sin pausas) se obtiene para un valor del incremento del potencial de
interacción por par de bases de ∆Gd = 2 kBT y M = 2, Figura 4.4a. Además, estos valores predi-
cen correctamente el tiempo de residencia (y velocidad) dependiente de secuencia de la polimerasa
durante la actividad de desplazamiento de banda, lo cual refuerza la validez de nuestro modelo,
Figura 4.5a. Por lo tanto, la velocidad (con y sin pausas) dependiente de fuerza y secuencia de la
polimerasa de ADN de Phi29 salvaje respalda un mecanismo de apertura de la doble hélice activo,
en el cual la polimerasa desestabiliza al menos dos pares de bases en la juntura facilitando de esta
forma la apertura de la misma.
La fuerte dependencia de tensión y secuencia en la velocidad de apertura de la doble hebra del
mutante ddb sugiere que esta proteína utiliza un mecanismo de apertura diferente, o menos activo
que el de la polimerasa salvaje. Sin embargo, cuando la cinética de pausas es considerada, los valores
∆Gd = 2 kBT y M = 2 predicen muy bien la velocidad media de desplazamiento de banda del
mutante, Figura 4.4b. Por lo tanto, nuestros datos indican que ambas enzimas utilizan el mismo
mecanismo activo de apertura de la doble hebra, pero el mecanismo del mutante ddb falla en la
63
Capítulo 4 Resultados
Tensión (pN)
Vel
ocid
ad M
edia
(nt/s
)
12108642 14
140
120
100
80
60
40
20
0
(a)
140
70
130
120
110
100
90
80Vel
ocid
ad M
edia
(nt/s
)12108642 14
Tensión (pN)(b)
5
30
25
20
15
10
97 8642 3 510
mse
M(c)
Figura 4.13: Predicción de la velocidad media de desplazamiento de banda con valores alternativos de ∆Gd y
M . 4.13a: Un modelo pasivo no reproduce los datos. Hemos considerado la posibilidad de que la polimerasa no
interactúe con la juntura. En este caso la energía de desestabilización es ∆Gd ∼ 0 kBT y el rango de interacción
M ∼ 0. Este modelo (curva negra) no explica la dependencia en tensión de la velocidad de desplazamiento de
banda de la polimerasa salvaje (círculos azules) y el mutante ddb (círculos verdes) con y sin pausas (círculos
rellenos y vacíos respectivamente). 4.13b: Solo un modelo activo ajusta la dependencia de tensión de la velocidad
de desplazamiento de banda sin pausas de la polimerasa salvaje (círculos vacíos azules). El mejor ajuste se obtiene
con a = 0, 01, ∆Gd = 2 kBT y M = 2 (línea azul). Otros valores de M ajustan peor los datos, dando saturación
a diferentes alturas y con diferentes pendientes entre ellas, M = 1, (curva negra) y M = 4, (curva roja). 4.13c:
El mejor ajuste, con el menor error estándar medio (mse, del inglés mean standard error) se obtiene para M = 2
(a = 0, 01). Un incremento gradual del valor de M conlleva a un incremento gradual del mse del ajuste.
64
4.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
apertura de las regiones más estables de la horquilla, lo cual promueve la entrada al estado inactivo de
pausa de larga duración. Por otra parte, los valores de las dependencias de tensión de la velocidad de
desplazamiento de banda sin pausas, hallados para ambas polimerasas, son idénticos lo cual refuerza
aún mas esta hipótesis.
65
Capítulo 4 Resultados
4.2. Mecanoquímica de la translocación.
Como se ha mencionado, para el estudio experimental de la mecanoquímica de motores moleculares
se requiere acceder a la coordenada mecánica de translocación. A diferencia de los experimentos en
que se observan los cambios producidos por la enzima sobre una molécula de ADN, en este caso
se requiere aplicar fuerza directamente sobre la proteína. Adicionalmente, es necesario acceder a la
variable química, que en el límite de baja concentración de producto consiste en la concentración de
dNTP.
4.2.1. Diseño experimental
Para abordar el estudio del mecanismo de translocación de la polimerasa de ADN de Phi29, se
aislaron complejos binarios ADN-polimerasa (ADNp-ADN) entre las dos microesferas localizadas en
el interior de la cámara de reacción del instrumento de pinzas ópticas, Figura 4.14 y Figura 4.15. En
estos experimentos se utilizó una variante de la polimerasa salvaje de Phi29 que contiene una biotina
en su extremo N-terminal (Sección 3.4). Esto permitió unir el complejo, a través de la polimerasa,
directamente a la microesfera recubierta con estreptavidina localizada en la micropipeta. El otro
extremo de la molécula de ADN se unió, a través de enlaces digoxigenina-antidigoxigenina, a la
microesfera localizada en la trampa óptica.
Se utilizaron dos construcciones de ADN diferentes, pero con un segmento de replicación idéntico:
una región de cadena sencilla de 229 nucleótidos seguida de una región de cadena doble de 3400 pb
a partir de un único punto de inicio de la replicación (extremo 3'). La diferencia entre una molécula
y otra radica en la posición de la etiqueta de digoxigenina: i) con el �n de aplicar fuerzas sobre la
proteína a favor de la dirección de movimiento, se colocó la etiqueta de digoxigenina en el extremo
de la porción corriente arriba del primer y ii) con el �n de aplicar fuerzas opuestas al movimiento,
se colocó la etiqueta en el extremo de la porción corriente abajo (Sección 3.2).
Este diseño experimental permitió por tanto seguir en tiempo real la actividad de replicación en
presencia y en ausencia de la actividad de desplazamiento de banda de polimerasas individuales
sujetas a fuerzas opuestas o a favor del movimiento así como el efecto combinado de la fuerza con la
variación de la concentración de dNTP.
66
4.2 Mecanoquímica de la translocación.
4.2.2. Detección de Actividad
Para unir los complejos ADN-polimerasa a las microesferas primeramente se formaron los complejos
ADNp-ADN que fueron unidos, en solución, a las microesferas recubiertas con antidigoxigenina.
Esta solución se �uyó al interior de la cámara de reacción del instrumento. Al poner en contacto
las microesferas (una recubierta con las moléculas de ADN unidas a la polimerasa y otra recubierta
de estreptavidina), se logra la unión de la biotina en el extremo N-terminal de la polimerasa y la
estreptavidina que recubre la microesfera en la pipeta. Una ventaja inicial de este diseño, es que
impone que sólo cuando la polimerasa está unida al ADN se logren enlaces, aunque no se garantiza
que esta unión sea funcional.
Una vez logrado un enlace, se comprueban las características de la curva de fuerza extensión de la
construcción y que la longitud de contorno experimental (extensión de la molécula a aproximada-
mente 10 pN) se corresponde con la molécula diseñada. Posteriormente se �uye al interior de la
celda una solución que contiene los dNTP y el MgCL2 y comienza la actividad de replicación, que
se observa de manera diferente según se trate de la con�guración de fuerza a favor u opuesta.
Fuerza a favor En este caso, la molécula de ADN está unida a la microesfera localizada en la
trampa óptica a través del extremo corriente arriba de la polimerasa Figura 4.14a. El segmento de
replicación no contribuye a la curva de fuerza extensión inicial, correspondiéndose esta a la de una
molécula de ADN de cadena doble de 2686 pb (f1(x) en la Figura 4.14, Sección 3.2) utilizada como
agarradera.
Al �uir los nucleótidos, la polimerasa comienza la actividad de replicación en la dirección corriente
abajo de modo que, a medida que el producto de la síntesis se incorpora a la molécula inicial, f1(x),
Figura 4.14, la longitud de la molécula anclada entre las microesferas aumenta (segmento verde,
panel inferior Figura 4.14a). En un régimen de retroalimentación en fuerza, esta actividad se detecta
como un aumento de la distancia entre las microesferas, ∆x (f, t), Figura 4.14 y Figura 4.16a.
En esta con�guración, el número de nucleótidos replicados en el tiempo se determinó como el cambio
en distancia observado dividido por la distancia promedio entre pares de bases para el ADN de
cadena doble a la fuerza en que se grabó la actividad (xds (f)), correspondiéndose los primeros
229 nucleótidos a la actividad de extensión del primer (sobre cadena sencilla, segmento rojo, panel
superior Figura 4.14a) y el resto a la actividad de desplazamiento de banda.
67
Capítulo 4 Resultados
Figura 4.14: Detección de la actividad de replicación de la polimerasa de Phi29 en la con�guración de fuerza a
favor. a) Representación esquemática (no a escala) del diseño experimental. El complejo ADNp-ADN se une a la
microesfera en la punta de la micropiepta a través de la polimerasa de Phi29 (triángulo rojo) biotinilada (círculo
naranja). El extremo corriente arriba de la molécula de ADN se une, a través de una etiqueta de digoxigenina
(cuadrado verde) a la microesfera localizada en la trampa óptica. En presencia de los dNTPs la polimerasa comienza
la actividad de extensión del primer (segmento rojo) seguida de la de desplazamiento de banda. El aumento de la
longitud de la molécula inicial (f1(x)), en un régimen de retroalimentación en fuerzas, se observa como un incremento
en la separación entre las microesferas (∆x (f, t), segmento verde, transición horizontal verde, Figura 4.14 b) en el
tiempo. b) La curva de fuerza extensión de la molécula inicial (f1(x)) se corresponde con la curva esperada, según
el modelo WLC , para una molécula de dsDNA de 2686 pb (línea sólida azul). La curva de fuerza extensión f2(x),
muestra un paso intermedio de la actividad de replicación y se corresponde con la curva esperada, según el modelo
WLC , para una molécula de dsDNA de 4300 pb.
Fuerza en contra En este caso, la molécula está unida a través del extremo corriente abajo, por lo
que la curva de fuerza extensión inicial se corresponde con el segmento de replicación: una molécula
hibrida con 229 nt de ADN de cadena sencilla y 3400 pb de ADN de cadena doble.
La síntesis del segmento corriente abajo, provoca un acortamiento de la molécula anclada, por lo que
la actividad en esta con�guración se detecta como una disminución en la distancia, necesaria para
mantener la tensión en el ADN constante, Figura 4.16b. Como resultado de la replicación de toda
la molécula, la distancia entre las microesferas llega a cero y las microesferas entran en contacto,
observándose el comportamiento lineal esperado para la curva de fuerza extensión de una microesfera
en la trampa óptica (Figura 4.15b, línea discontinua roja).
En este caso, aunque en teoría sería posible observar un cambio en la elasticidad de la molécula
anclada al producirse el cambio en el modo de actividad (de extensión del primer a desplazamiento
68
4.2 Mecanoquímica de la translocación.
Figura 4.15: Detección de la actividad de replicación de la polimerasa de Phi29 en la con�guración de fuerza en
contra. a) Representación esquemática del diseño experimental. El complejo ADNp-ADN se une a la microesfera
en la punta de la micropipeta a través de la polimerasa de Phi29 (triángulo rojo) biotinilada (círculo naranja). El
extremo corriente abajo de la molécula de ADN se une, a través de una etiqueta de digoxigenina (cuadrado verde)
a la microesfera localizada en la trampa óptica. En presencia de los dNTPs la polimerasa comienza la actividad de
extensión del primer (segmento rojo) seguida de la de desplazamiento de banda. El acortamiento de la molécula
inicial (f1 (x)), en un régimen de retroalimentación en fuerzas, se observa como una disminución en la separación
entre las microesferas (4x (f, t), segmento verde) en el tiempo. b) La curva de fuerza extensión de la molécula
inicial (f1 (x)) se corresponde con la curva esperada, según el modelo WLC, para una molécula híbrida formada
por 3400 pb de dsDNA y 229 bases de ssDNA (línea sólida azul). Una vez la enzima ha replicado toda la molécula,
la curva de fuerza extensión observada se corresponde con la relación lineal entre la fuerza y el desplazamiento de
la micreosfera en la trampa óptica. La línea roja discontinua corresponde a un ajuste lineal a esta porción de la
curva (pendiente = 0,14± 0,51 · 10−3 pNnm
; R2 = 0,994).
de banda), la proporción entre las cantidades de ADN de cadena doble (3400 pb) y de cadena
sencilla (229 nt) es tan baja, que no permite la determinación inequívoca de este punto. Por esta
razón, el punto de cambio de modo de actividad se determinó a partir de la distancia esperada,
desde el inicio de la actividad, para una molécula de ssDNA con 229 nt. La conversión a número
de nucleótidos replicados en el tiempo se realizó dividiendo el cambio en distancia observado por la
distancia promedio entre bases para el ssDNA (xss (f)) en esta región y por la distancia promedio
entre pares de bases de dsDNA (xds(f)) para el resto de la actividad.
Determinación de xss (f) La distancia promedio entre bases para el ssDNA en estas condiciones
experimentales se determinó a partir de la curva de fuerza extensión de la construcción de ADN
utilizada en la con�guración de fuerza en contra, utilizando la Ecuación 4.3 con valores de Nds =
69
Capítulo 4 Resultados
Tiempo (segundos)6 12 180 24 30 36
1.1
1.2
1.3
1.4
Ext
ensi
ón (μm
)
F= 14 pN
F= 4 pN
F= 2 pN
A favor
(a)
1.0
1.2
0.6
0.8
0.4
0.2
0.050 100 1500 200 250 300
Tiempo (segundos)
Ext
ensi
ón (μm
)
F= 5 pN
F= 15 pN
F= 25 pN
F= 10 pN
En contra
(b)
Figura 4.16: Cambio en distancia observado durante la actividad de deplazamiento de banda a diferentes fuerzas
a favor ( 4.16a) y en contra ( 4.16b).
3400,Nss = 229 y tomando xhı́b (f) como los valores de la curva de fuerza extensión de la construcción
híbrida en este caso. Como curva de fuerza extensión promedio entre pares de bases para el dsDNA
se utilizó la descrita en la Sección 4.1.3.
(a)
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
0
5
10
15
20
Fue
rza
(pN
)
Extensión (nm)/ssDNA(nt)(b)
Figura 4.17: Determinación de la curva de fuerza-extensión del ssDNA en nuestras condiciones experimentales.
4.17a: A partir de la curva de fuerza extensón de la molécula híbrida (xhib (f), línea azul) , compuesta por
un segemento de 3400 pb de dsDNA (diagrama, segemento rojo) y 229 nt de ssDNA se determina la curva de
fuerza extensión por nucleótido para el ssDNA según la Ecuación 4.3. Como referencia se muestra la curva de
fuerza extensón predicha por el modelo WLC para una molécula de 3400 pb de dsDNA (línea roja, P = 53 nm,
S = 1200 pN/nm) 4.17b: Curva de fuerza extensión por nucleótido para el ssDNA. Los puntos representan la
media de calculada a partir de 20 moléculas independientes. Los errores representan el error estándar. La línea roja
muestra la curva de fuerza extensión predicha por el modelo WLC con valores de P = 0,75 nm y S = 800 pN/nm.
70
4.2 Mecanoquímica de la translocación.
4.2.3. Efecto de la fuerza y la concentración de nucleótidos en la actividad de
replicación.
A partir de las trazas de nucleótidos replicados en el tiempo se determinó la velocidad de replicación
(MM) en un amplio rango de fuerzas (20 a −50 pN) y para seis concentraciones de dNTP (5, 10,
50, 100, 200 y 500 µM) con una concentración de pirofosfato inorgánico de 1 µM (a no ser que se
especi�que lo contrario).
Efecto de la biotinilación e inmovilización sobre la actividad de polimerización. La velocidad
media de replicación a bajas fuerzas (Vave = 60 nt/s, 3,7 pN , 50 µM dNTP) es similar a la
observada en los experimentos descritos en la sección anterior, para la polimerasa salvaje a baja
tensión desestabilizadora Vpoldb = 80 nt/s (3,5 pN , 50 µM dNTP). Adicionalmente, esta velocidad
es compatible con la observada en los experimentos previos a este trabajo, en los que se estudió la
actividad de replicación de la polimerasa de Phi29 bajo el efecto de tensión en el ADN (Ibarra et al.
(2009)), en las mismas condiciones de concentración de dNTP y a bajas tensiones (∼ 60− 80 nt/s,
4 pN , 50 µM dNTP). Estos resultados, unido a experimentos bioquímicos que muestran que la
biotinilación en el extremo N-terminal de la proteína no cambia la procesividad, la velocidad media
de replicación ni el equilibrio pol-exo indican que la biotinilación y la inmovilizción de la Phi29 DNAp
en la super�cie de la microesfera no alteran signi�cativamente la actividad de replicación normal
(salvaje, en solución).
Cinética de Pausas La actividad de replicación en estas condiciones también presenta pausas
cortas ocasionales. Siguiendo un procedimiento similar al descrito en la Sección 4.1.5, analizamos la
dependencia del comportamiento de pausas con la fuerza y con la concentración de dNTP, así como
de manera independiente para las reacciones de extensión del primer y desplazamiento de banda.
A todas las fuerzas y para todas las concentraciones de dNTP, el histograma de velocidad instantánea
muestra una distribución bimodal, con un pico centrado en ∼ 0 nt/s, asociado con el estado de pausa
y uno centrado en valores positivos de velocidad asociados con el estado activo de la proteína.
Con nuestra resolución experimental (∼ 0,4 s), la duración de pausas se observa independiente
de fuerza (Figura 4.19b) y ocurren con una probabilidad por unidad de tiempo �ja, Figura 4.19a,
indicando que pudieran corresponder a un estado inactivo transitorio separado del camino principal
del ciclo (o�-pathway) de adición de nucleótidos y por tanto no afectar la dependencia en fuerza de
71
Capítulo 4 Resultados
Tiempo (segundos)
Nuc
leót
idos
rep
lica
dos
(nt)
0 10 20 30 40 50 60
0
200
400
600
(a)
-20 0 20 40 60 800,00
0,02
0,04
0,06
Pro
babi
lida
d
Velocidad (nt/s)(b)
Figura 4.18: Procedimiento de detección de pausas. 4.18a: Trazas de nucleótidos replicados en el tiempo en las
condiciones de desplazamiento de banda, a una fuerza opuesta al movimiento de 15 pN y 50 uM dNTP . Las zonas
rojas muestran los eventos de pausas identi�cados. 4.18b: Distribución de probabilidad de velocidades observada
para las condiciones de 4.18a ajustada con una función doble gaussiana (Ecuación 4.4, linea sólida roja). Los
eventos de pausa se de�nieron como aquellas porciones de la actividad con una velocidad inferior a la establecida
por el umbral (linea discontinua gris) localizado 2 veces la desviación estandar (s1) a la derecha del pico centrado en
la vecindad de 0 nt/s (línea sólida verde, A1 = 0,03u0,10, x1 = 2,10±0,21 nt/s, s1 = 8,32 ±0,64nt/s). La velocidad
sin pausas se de�nió como el pico de movimiento (línea sólida azul, A2 = 0,04 ± 0,05, x2 = 25.,73 ± 0,63 nt/s,
s2 = 27.,41± 1,28 nt/s)
éste. Adicionalmente, la frecuencia y duración de pausas no afecta signi�cativamente la velocidad
media de replicación, en comparación con la velocidad sin pausas.
En ningún caso se observa actividad de exonucleólisis procesiva, aunque es probable que existan
eventos exo cortos no detectados con nuestra resolución a fuerzas superiores a 20 pN (en Ibarra
et al. (2009) solo se detecta actividad exo procesiva a partir de 25 pN).
Efecto de la fuerza sobre la translocación. Nuestros resultados muestran que para todas las
concentraciones de dNTP, la velocidad de replicación sin pausas se ve favorecida ligeramente por
la fuerza a favor del movimiento, Figura 4.20a. Fuerzas mayores de 20 pN provocan la ruptura
del contacto entre las dos microesferas, presumiblemente por la pérdida de la interacción ADN-
polimerasa, en un estado en el que la polimerasa trabaja a alta velocidad (la máxima para cada
condición de dNTP).
En el régimen de fuerza opuesta, la velocidad decrece gradualmente con el incremento de la fuerza,
hasta la perdida de la interacción ADN-ADNp. En este caso, aunque la velocidad se ve reducida
drásticamente (hasta ∼ 5 ± 2 nt/s), la polimerasa no llega a frenarse por completo, Figura 4.20a.
72
4.2 Mecanoquímica de la translocación.
-30 -20 -10 0 10 20
0,0
0,2
0,4
0,6
Fre
cuen
cia
de p
ausa
s (p
ausa
s/se
gund
o)
Fuerza (pN)(a)
Fuerza (pN)
-30 -20 -10 0 10 200,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Dur
ació
n de
Pau
sa(s
egun
dos)
(b)
Fre
cuen
cia
de p
ausa
s (p
ausa
s/se
gund
o)
-25 -20 -15 -10 -5 00,0
0,2
0,4
0,6
Fuerza (pN)(c)
-25 -20 -15 -10 -5 0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Dur
ació
n de
Pau
sa(s
egun
dos)
Fuerza (pN)(d)
Figura 4.19: Dependencia de 4.19a: la frecuencia (pausas /segundo) y 4.19b: duración de pausas con la fuerza a
diferentes concentraciones de dNTP en las condiciones de desplazamiento de banda. 4.19a: la línea roja representa
un ajuste lineal a los datos (pendiente = −0,001±0,001 s−1 ·pN−1). 4.19b: la línea roja representa un ajuste lineal
a los datos (pendiente = −0,009 ± 0,003 s · pN−1). En ambas �guras la concentración de dNTP se corresponde
con: 500 µM (triángulos azules), 200 µM (círculos rojos), 100 µM (cuadrados negros), 50 µM (cuadrados negros
vacíos), 10 µM (círculos rojos vacios), 5 µM (triángulos azules vacios). 4.19c y 4.19d Durante las condiciones de
extensión del primer y de desplazamiento de banda se observa un comportamiento de pausas similar. Frecuencia
( 4.19c) y la duración de pausas ( 4.19d) en función de la fuerza durante las reacciones de desplazamiento de banda
(círculos llenos) y extensión del primer (círculos vacíos). Para ambas �guras las concentraciones de dNTP son:
100 µM (círculos verdes), 50 µM (círculos negros), 5 µM (círculos azules). En todas las �guras las barras de error
representan el error estándar.
73
Capítulo 4 Resultados
Adicionalmente, la fuerza máxima, fuerza a la cual la unión entre el complejo DNAp-DNA se rompe
con mayor probabilidad, decrece con la concentración de dNTP .
Fuerza (pN)
0
40
20
60
80
100
120
140
Vel
ocid
ad (
nt/s
)
-40 -30 -20-50 -10 10 20
(a)
-30 -20 -10 0 10 200
10
20
30
40
50
60
70
80
Vel
ocid
ad (
nt/s
)Fuerza (pN)(b)
Figura 4.20: Dependencia de la velocidad de replicación con la fuerza a diferentes concentraciones de dNTP en los
modods de extensión del primer y desplazamiento de banda. 4.20a: Velocidad de replicación con (símbolos vaciós) y
sin (símbolos sólidos) pausas en función de la fuerza para diferentes concentraciones de dNTP en las condiciones de
desplazamiento de banda. Las concentraciones de dNTP son: 500 µM (triángulos rojos), 200 µM (rombos azules),
100 µM (cuadrados grises), 50 µM (triángulos azules), 10 µM (hexágonos naranja), 5 µM (triángulos verdes).
4.20b: El modo de replicación no afecta la dependencia en fuerza de la velocidad media de replicación. La �gura
muestra la dependencia en fuerza de la velocidad media (sin pausas) en las condiciones de desplazamiento de banda
(círculos sólidos) y extensión del primer (círculos vacíos) a diferentes concentraciones de dNTP: 50 µM (círculos
negros), 10 µM (círculos verde olivo), 5 µM (círculos azules). En ambas �guras las barras de error representan el
error estándar.
Llamativamente, a concentraciones saturantes de dNTPs, la ADNp de Phi29 es capaz de replicar en
contra de fuerzas muy altas, en el orden de aprox 46 pN , lo cual re�eja la extraordinaria robustez del
complejo ADN -polimerasa. En este extremo no se observan, de manera consistente, pausas largas o
movimientos en sentido contrario al de polimerización (actividad exo inducida por fuerza), contrario
a lo reportado en Ibarra et al. (2009) para tensiones en el ADN molde superiores a 25 pN .
La comparación entre las actividades de extensión del primer y desplazamiento de banda no re�eja
diferencias signi�cativas en la velocidad media en todo el rango de fuerzas (opuestas y a favor)
y para todas las concentraciones de dNTP estudiadas, Figura 4.20b. Este hecho, unido a que el
comportamiento de pausas en ambos modos de replicación es similar, Figura 4.19c y 4.19d, sugiere
que bajo la acción de una fuerza mecánica (a favor o en contra) el proceso de translocación, y no el
proceso de desplazamiento de banda, es el paso limitante de la reacción.
74
4.2 Mecanoquímica de la translocación.
Efecto de la concentración de nucleótidos sobre la translocación. La disminución de la concen-
tración de dNTP reduce la velocidad de replicación a todas las fuerzas estudiadas. Para todas las
fuerzas, la velocidad media de replicación sin pausas, Vsp, sigue una relación de Michaelis-Menten,
Ecuación 1.3:
Vsp =Vmax · [dNTP ]
KM + [dNTP ](4.7)
donde Vmax es la velocidad máxima de reacción y Km la constante aparente de unión de nucleóti-
dos. La baja concentración de producto utilizada en este trabajo asegura que esta contribución sea
despreciable.
0 100 200 300 400 500[dNTP] (μM)
0
20
40
60
80
100
120
Vel
ocid
ad s
in p
ausa
s (n
t/s)
(a)
0 100 200 300 400 500[dNTP] (μM)
0
20
40
60
80
100V
eloc
idad
sin
pau
sas
(nt/
s)
(b)
Figura 4.21: Dependencia de la velocidad sin pausas con la concentración de nucleótidos a diferentes fuerzas a
favor ( 4.21a: 5 pN , círculos vacíos rojos, 10 pN , triángulos vacíos verdes, 15 pN , cuadrados vacíos naranja y 20 pN ,
rombos vacíos azules) y en contra ( 4.21b: −5 pN , triánguos sólidos verdes, −10 pN , cuadrados sólidos naranja,
−15 pN , rombos sólidos azules, −20 pN , círculos sólidos rojos y −25 pN , pentágonos sólidos grises). Las líneas
sólidas corresponde al ajuste de los datos a la Ecuación 4.7 ( 4.21a: R2 = 0,998, 0,997, 0,998, 0,998, fuerza de
menor a mayor), ( 4.21b: R2 = 0,998, 0,995, 0,98, 0,98, 0,98, 0,993, fuerza de menor a mayor) . En ambas �guras
las barras de error representan el error estándar.
La dependencia de fuerza de los parámetros de Michaelis-Menten Vmax y Km puede ser usada para
identi�car el modo de inhibición de la fuerza y la identidad del paso dependiente de fuerza dentro del
ciclo de incorporación de nucleótidos. Un ajuste a los datos de velocidad sin pausas (Vsp) en función
de la concentración de dNTP, a diferentes fuerzas a favor y en contra (Figura 4.21) revela que Vmax
y Km presentan diferentes dependencias en fuerza: mientras que Vmax disminuye, Km aumenta con
la fuerza en contra.
75
Capítulo 4 Resultados
20
40
60
80
100
Vm
ax (
nt/s
)
Fuerza (pN)-25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20
20
40
60
80
100
120
140
Km
(μM)
(a) (b)
Figura 4.22: Dependencia de Km, Vmax y Kb con la fuerza. 4.22a: Dpendencia de Vmax(círculos vacíos rojos) y
Km (cuadrados vacíos verdes) en función de la fuerza, obtenidas a partir del ajuste de la Ecuación 4.7 a los datos
en la Figura 4.21. 4.22b: Dependencia de kb (Vmax/Km) con la fuerza. La lína roja representa un ajuste lineal a
los datos (pendiente = 0,065± 0,002 s−1µM−1pN−1).
Dado que la tasa de unión de nucleótidos efectiva se de�ne como kb = Vmaxε·d·Km (donde ε es la e�ciencia
de acoplamiento y δ el paso de translocación), la disminución de Vmax y el aumento de Km implica
que kb decrece sustancialmente con el aumento de la fuerza en contra (valores más negativos),
asumiendo ε = 1 hisdrólisis/pasos e independiente de fuerza (no existen reportes de hidrólisis fútil
en el caso de polimerasas de ADN ). Por tanto, la aplicación de una fuerza opuesta al movimiento
provoca la disminución tanto de la velocidad máxima de translocación (Vmax) como de la tasa efectiva
de unión de dNTP (la tasa a la que las moléculas de dNTP se incorporan al resto del camino de
hidrólisis) de la polimerasa.
76
5 Discusión
5.1. Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de
banda.
Nuestros datos muestran que el paso que limita la velocidad del ciclo de polimerización de la po-
limerasa de ADN de Phi29 no esta afectado por la tensión (por debajo de 14 pN) o la secuencia.
Sin embargo, la replicación a través de regiones del molde ricas en GC promueve la entrada a un
estado de pausa de corta duración (Pausa Corta P1), que es más frecuente (aproximadamente entre
2 y 4 veces) y presenta una dependencia en tensión más fuerte (aproximadamente 2 veces mayor)
en las condiciones de polimerización comparado con las condiciones de polimerización acoplada a
desplazamiento de banda (ka1GC (0) y da1GC ; Tabla 4.3). Estos resultados sugieren que la transloca-
ción a lo largo del molde de ADN puede verse interrumpida por arreglos particulares de las regiones
ricas en GC del molde (dígase, apilamiento de bases GG), el cual ocurría con menor probabilidad e
involucraría menos bases en las condiciones de desplazamiento de banda, debido al limitado número
de bases abiertas delante de la polimerasa. La extensión mecánica de la hebra molde podría prevenir
el apilamiento de las bases, limitando de esta manera la entrada en el estado de pausa de corta du-
ración. De hecho, otros factores conocidos por afectar la estabilidad del ADN, tales como la betaína
y el aumento de la temperatura, también disminuyen la frecuencia de pausas en las regiones ricas en
GC durante la extensión del primer, para la de Phi29 y otras polimerasas de ADN, apoyando esta
hipótesis Mytelka and Chamberlin (1996); Schwartz and Quake (2009); Kim et al. (2010a).
Por el contrario, la apertura de la doble hebra limita la translocación hacia adelante, tanto de la
polimerasa salvaje como la mutante ddb, aunque de manera diferente: Las posiciones más estables
de la horquilla provocan una disminución de la velocidad de la polimerasa salvaje pero pausan el
avance de la polimerasa mutante. A pesar de estas diferencias, la inclusión de la cinética de pausas en
un modelo utilizado para cuanti�car el mecanismo de apertura de la doble hebra reveló que ambas
polimerasas desestabilizan activamente las dos bases mas próximas en la juntura (M = 2) con una
77
Capítulo 5 Discusión
energía de desestabilización ∆Gd = 2 kBT por par de bases, Figura 4.4. La extensión del modelo de
Betterton y Jullicher, Betterton and Julicher (2005), presentada en este trabajo señala la importancia
de considerar la cinética de pausas y puede ser aplicada a la cuanti�cación del mecanismo de apertura
de otros motores de ácidos nucleicos con actividad de desplazamiento de banda en los que se conoce
que la cinética de pausas es relevante o que se espera que estas ocurran durante su actividad, Cheng
et al. (2007); Sun et al. (2008); Kim et al. (2010a); Ribeck et al. (2010).
Para explicar las observaciones anteriores proponemos un modelo para el mecanismo de acoplamien-
to entre la apertura de la doble hebra y la replicación del ADN. La desestabilización activa de la
juntura, promovida por la polimerasa de ADN de Phi29 es probable que se deba a las interacciones
particulares ADN - polimerasa en la juntura de la doble hebra ya que, a diferencia de otras poli-
merasas, el dominio de los dedos no parece estar involucrado en la reacción de apertura de la doble
hebra Fisher et al. (2003); Yin et al. (2004); Singh et al. (2007). Adicionalmente, no existe evidencia
de interacción entre la hebra desplazada y la polimerasa o de la existencia de diferentes modos de
translocación entre las actividades de desplazamiento de banda y extensión del primer Kamtekar
et al. (2004); Berman et al. (2007). Estudios estructurales de polimerasas replicativas durante la ac-
tividad de extensión del primer, incluida la polimerasa de ADN de Phi29, muestran que durante la
replicación, la hebra molde se encuentra fuertemente doblada (aproximadamente 90º) en el interior
de la polimerasa Berman et al. (2007), Figura 5.1. En el caso de la polimerasa de ADN de Phi29,
esta torsión de la hebra molde en el interior de la proteína se mantendría durante la actividad de
desplazamiento de banda gracias a la estabilidad del complejo ADN - polimerasa, resultado del paso
de dos nucleótidos de la hebra molde por el interior del estrecho túnel formado entre los dominios
TPR2 y exo, Berman et al. (2007). Por otra parte, el pequeño tamaño del túnel (10Å) promovería la
exclusión esteárica de la hebra complementaria, probablemente forzando una torsión en la vecindad
de la entrada del túnel. Debido a las propiedades elásticas del ADN de cadena sencilla Smith et al.
(1996), el doblamiento de las dos hebras podría conllevar a la generación de estrés mecánico en la
juntura de la doble hebra, promoviendo su desestabilización en las condiciones de desplazamiento
de banda, Figura 5.1.
Nuestros datos muestran que el mecanismo activo de apertura de la doble hebra del mutante ddb
falla (Pausa Corta P2) en los pares de bases más estables (regiones ricas en pares de bases GC )
de la horquilla, los cuales se encontrarán cerrados con mayor probabilidad Leroy et al. (1988). La
78
5.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
m=0
Estado Activo
TúnelTPR2-exo
TorsiónNdelNMolde
Exclusiónestérica
Estrés Mecánico
3m
5m3m
5m
1)
m=0
Pausa Larga P23)
m>0
Estado Activo2)
3m
5m3m
f
f5m
3m
5m3m
5m
PerturbaciónNdeNlaNInteracciónNADN-Proteína
AperturaNdelNADN
f
f
pRescateNMecánicop
ReplicaciónN+NDesplazamientoNdeNBanda
Figura 5.1: Mecanismo de apertura del ADN propuesto. La �gura muestra una representación esquemática de
la polimerasa de ADN de Phi29 con el substrato de ADN durante la actividad de apertura de la doble hebra
Kamtekar et al. (2004). La proteína se muestra en dos niveles. El nivel superior contiene los dominios exo (verde),
TPR2 (azul) y pulgar (naranja). El resto de la proteína se muestra como un círculo gris. 1) y 2): La torsión de la
hebra molde en el túnel TPR2 -exo y la exclusión estérica de la hebra complementaria pudiera promover la apertura
de los primeros dos pares de bases (azul, OTRO COLOR) debido al estrés mecánico generado en la vecindad de la
juntura de la horquilla. La unión e hidrólisis de dNTPs potencia la translocación de la polimerasa hacia adelante.
3) Para el mutante ddb, el estrés mecánico en la juntura durante la apertura de las posiciones más estables de la
horquilla (donde m = 0) pudiera conllevar a la desestabilización de la interacción entre la hebra molde y el túnel,
favoreciendo la entrada al estado de Pausa Larga P2. La desestabilización de la horquilla, mediada por la tensión
externa (f ), favorece la apertura del ADN previniendo la entrada al estado inactivo de pausa larga y promoviendo
la salida de éste. En 2) y 3) se muestra la posición inicial de la horquilla en línea discontinua gris.
dependencia de tensión del rate de entrada al estado de pausa larga P2 en las posiciones de la
horquilla ricas en GC, da2GC = 0, 5 ± 0, 3 nm (Tabla 4.3), se encuentra dentro del margen de
error de la dependencia de tensión encontrada cuando se considera toda la secuencia (da2 = 0, 7 ±
0, 3 nm, Tabla 4.1). En nuestras condiciones experimentales, la distancia promedio entre nucleótidos
de ssDNA (entre 3 y 13 pN) es de 0, 25 nm (Figura( 4.3b)). Por tanto, un cambio conformacional
de 0, 5 nm es compatible con la ganancia de 2 nucleótidos de ssDNA a lo largo de la coordenada
mecánica, de�nida por la dirección de estiramiento. En otras palabras, la apertura de 1 pb previene
la entrada al estado de Pausa Larga P2. De hecho, de acuerdo con nuestro modelo, la dependencia de
tensión del rate de entrada al estado de pausa larga puede ser explicada si se considera exclusivamente
que la entrada a este estado ocurre cuando el siguiente par de bases en la horquilla se encuentra
79
Capítulo 5 Discusión
cerrado (m = 0).
Las pausas de larga duración solo ocurren en el régimen de desplazamiento de banda, sugiriendo que,
al contrario de lo que se ha considerado en las ecuaciones anteriores, el rate de entrada a este estado
pudiera depender del número de pares de bases abiertos delante de la polimerasa, m. El escenario
más simple sería aquel en el que la entrada al estado de pausa P2 solo ocurriera cuando el siguiente
par de base se encuentra cerrado (m = 0), permitiendo la de�nición de un rate de entrada nuevo:
k̃a2GC (f) =ka2GC (f)
P0 (GC,m = 0, f)
donde P0 (GC,m = 0, f) = 1XGC ·L
∑pb(l+1)=GC P0 (l,m = 0, f). Este nuevo rate representa cuantas
veces la polimerasa entra en un estado de pausa larga P2 por tiempo sin pausa, en una posición
previa a un par GC cuando este se encuentra cerrado. El cálculo de este nuevo rate da k̃a2GC (0) =
0, 7± 0, 6 s−1 y d̃a2GC (0) = 0, 1± 0, 4 nm, indicando que cuando m = 0 el rate de entrada al estado
de pausa larga no presenta una dependencia de tensión signi�cativa. En otras palabras, nuestros
datos son compatibles con un modelo en el cual la entrada en el estado de pausa de larga duración
solo ocurre cuando el siguiente par de base en la juntura de la horquilla se encuentra cerrado.
Las mutaciones D12A y D66A en el dominio exo del mutante ddb utilizado en este trabajo presumi-
blemente perturban el arreglo especí�co de los dominios TPR2 y exo Perez-Arnaiz et al. (2009), lo
cual a su vez afectaría la estabilidad del túnel que encierra a la hebra molde. De acuerdo con nuestro
modelo, este defecto le pudiera impedir al mutante mantener el estrés mecánico en la juntura cuando
esta se encuentra cerrada, lo cual provocaría la pérdida de las interacciones correctas con el molde
y favorecería la entrada al estado inactivo de pausa de larga duración (Figura 5.1). Una vez en el
estado de pausa, la presión de la juntura impediría el retorno de la hebra molde a al dominio de
polimerización lo cual evitaría esta unión funcional y di�cultaría la salida del estado de pausa.
De acuerdo con esta hipótesis la polimerasa mutante podría salir del estado de Pausa Larga P2 sólo
cuando la juntura se encuentra abierta (m > 0) y la polimerasa tiene la oportunidad de recuperar
el control de la hebra molde. En efecto, el rate de salida del estado de pausa de larga duración, k2a,
presenta una dependencia de tensión muy fuerte, d2a = −0, 7 ± 0, 4 nm, (Tabla 4.1), compatible
con el cambio conformacional resultante de la ganancia de entre dos y cuatro nucleótidos de ssDNA
a lo largo de la coordenada mecánica, lo cual sugiere que la salida del estado de Pausa Larga P2
está promovida por la apertura mecánica de aproximadamente 2 pb de la juntura. De acuerdo con
nuestro modelo, la dependencia de tensión del rate de salida del estado inactivo de larga duración
80
5.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.
puede explicarse cuando se considera que la salida solo ocurre cuando la juntura se encuentra abierta
delante de la polimerasa (m > 0). En este caso, podemos de�nir un nuevo rate,
k̃2a (f) =k2a (f)
1− P0 (GC,m = 0, f)
que representa cuantas veces la polimerasa sale de un estado de Pausa Larga P2 por tiempo sin pausas
cuando el siguiente par de bases está abierto. El cálculo de este nuevo rate da k̃2a (0) = 0, 14±0, 14 s−1
y d̃2a = −0, 2±0, 5 nm, indicando que cuandom > 0 el rate de salida de las pausas largas no depende
signi�cativamente de la tensión.
La polimerasa de ADN de Phi29 presenta una actividad de desplazamiento de banda más e�ciente
que otras polimerasas replicativas, tales como las de los bacteriófagos T4 y T7 o la procariota Pol III
Canceill et al. (1999); Yuan and McHenry (2009). Debido a que la interacción entre el dominio de
polimerización y la hebra molde en estas polimerasas es a través de un túnel abierto Doublié et al.
(1998); Franklin et al. (2001), es posible que al encontrarse un par de base cerrado en la juntura de
la horquilla, estas no puedan mantener la torsión de la hebra molde, lo cual impediría la progresión
de la actividad de polimerización (como ha sido observado en nuestros experimentos con el mutante
ddb). Por tanto, para poder replicar a través del ADN de doble cadena, estas polimerasas necesitan
trabajar en coordinación con sus respectivas helicasas que, mediante la exclusión esteárica de la
hebra adelantada (líder, conductora. ver traducción), aumentarían la probabilidad de apertura de
la juntura. El efecto combinado de la exclusión esteárica mediada por la helicasa y la fuerte torsión
inducida por la polimerasa en la hebra adelantada puede explicar la desestabilización e�ciente de la
juntura de la doble cadena durante la replicación del ADN.
En el caso de la polimerasa de ADN de Phi29 el túnel TPR2 - exo, que se anilla fuertemente a la he-
bra molde, le permite a esta proteína mantener tanto la torsión del molde como la exclusión esteárica
de la hebra complementaria en presencia de la juntura cerrada, promoviendo su desestabilización ac-
tiva. De hecho, la energía de desestabilización de la juntura (∆Gd = 2 kBT ) es aparentemente mayor
que las reportadas para helicasas de ADN hexaméricas, ∆Gd = 0, 05−1, 6 kBT Ribeck et al. (2010);
Johnson et al. (2007); Donmez et al. (2007); Lionnet et al. (2007) y polimerasas, ∆Gd = 1, 4 kBT
Kim et al. (2010b), estudiadas por separado. Estas características, además de la energía proveniente
de la hidrólisis e incorporación de dNTPs durante la replicación, le permitirían a la polimerasa de
ADN de Phi29 trabajar como un híbrido polimerasa-helicasa y acoplar e�cientemente las actividades
de replicación del ADN y apertura de la doble hebra en un mismo polipéptido.
81
Capítulo 5 Discusión
5.2. Mecanoquímica de la translocación.
Asimetría del efecto de la fuerza. Nuestros resultados muestran que la fuerza aplicada afecta de
manera diferente según sea favor o en contra de la dirección de translocación. En la con�guración a
favor la fuerza favorece la actividad ligeramente, mejorando la velocidad de replicación. Sin embargo,
la aplicación de fuerzas superiores a 20 pN provoca la pérdida de actividad. Curiosamente, esto no
signi�ca necesariamente la pérdida de la interacción ADNp-ADN.
Figura 5.2: Efecto de la fuerza en la estabilidad del complejo binario/terciario. La fuerza aplicada sobre la polime-
rasa y el AND (�echas azules) tiene diferentes efectos en la estabilidad del complejo ADNp-ADN según sea a favor
(Figura 5.2a) o en contra (Figura 5.2b) del movimiento. Un incremento de la fuerza, en la con�guración a favor,
provoca la pérdida del primer, lo que se traduce en la observación de una molécula híbrida de dsDNA y ssDNA
(fds (x) + fss (x)), en comparación con la molécula de dsDNA que se observa en el estado activo de polimerización
(fds (x)). En la con�guración de fuerza en contra no se observan cambios en la molécula anclada (en este caso
fds (x), terminada la actividad de extensión del primer) hasta que una fuerza muy alta rompe el enlace ADNp-
ADN . Figura 5.2c y Figura 5.2d Representación tipo cintas de la estructura de la polimerasa de Phi29 (Rodriguez
et al. (2005)). Las regiones donde se aplica la fuerza se muestran sombreadas en azul. La las �echas rojas señalan
la dirección de polimerización. Los dominios están representados con el mismo código de colores de la Figura 1.7.
El ADN modelado se muestra en la representación de esferas sólidas con los colores: cadena primer creciente en
gris, cadena molde en amarillo y cadena desplazada en verde.
Como ha sido reportado para la polimerasa de Phi29 (Ibarra et al. (2009)), la tensión mecánica en
82
5.2 Mecanoquímica de la translocación.
el ADN promueve una actividad exo procesiva, presumiblemente debido a que altera la estructura
correcta del primer en el interior de la polimerasa y simula de esta forma la presencia de un nucleótido
incorrecto. La transición del estado pol al exo implica la transferencia intramolecular del primer,
pasando presumiblemente por un estado intermedio de polimerización sensible a tensión y unido
más débilmente al ADN. En nuestros experimentos, en la con�guración de fuerza a favor, es posible
que la tensión en el ADN, a partir de 20 pN tenga un efecto similar en la actividad de la proteína.
Sin embargo, en este contexto mecánico, un estado de unión débil al ADN sería incapaz de soportar
la tensión, provocando la pérdida del primer. Curiosamente, la gran estabilidad del túnel corriente
abajo del primer, permitiría que la proteína se mantuviera unida al ADN, Figura 5.2c. En esta
con�guración, al estirar la molécula de ADN, se observa un aumento de la distancia que puede ser
asociado a un deslizamiento del ADN por el interior de la polimerasa, Figura 5.2a.
En la con�guración de fuerza en contra, la fuerza tiene un efecto más marcado en la velocidad. En
los mismos primeros 20 pN la velocidad decae mucho más. Sn embargo, en esta con�guración, la
polimerasa es capaz de replicar en contra de 45 pN como promedio, a 50 µM , habiéndose observado
eventos de replicación en contra de 53 pN . Esta es una fuerza alta, comparada con la fuerza de aper-
tura mecánica del ADN (∼ 14 pN); la fuerza máxima que desarrolla el motor de empaquetamiento
viral de Phi29 (∼ 57 pN), que trabaja en contra de una alta presión interna al empaquetar el ADN
en el interior de la cápsida de forma cuasi cristalina y comparada con la fuerza máxima desarrollada
por polimerasas de ARN (15-25 pN) en contextos experimentales similares. Curiosamente, en esta
con�guración, sólo se pierde la interacción funcional cuando se rompe la unión entre el ADN y la
polimerasa (los múltiples enlaces dig-antidig han sido probados anteriormente y resisten fuerzas su-
periores a 80 pN y la interacción biotina-estreptavidina soporta tensiones aun mayores) y se pierde
por tanto el enlace, Figura 5.2b.
Es probable que los planos paralelos que forman las bases apiladas de la doble hélice de ADN corriente
arriba del sitio activo y la misma forma que tiene el sitio activo, provean de un asiento más estable
al aplicar una fuerza en contra, por lo que no se observa pérdida de actividad. Adicionalmente,
en esta con�guración el túnel corriente abajo impediría que el dúplex saliera del interior de la
proteína. Esto solo ocurriría a altas fuerza y provocaría la pérdida total de la unión del complejo
ADNp-ADN,Figura 5.2c. Estas observaciones sugieren que la base estructural para la unión fuerte
del complejo binario ADNp-ADN, se encuentra en el túnel corriente abajo y no en la región del
dúplex corriente arriba.
83
Capítulo 5 Discusión
Mecanoquímica de la translocación El efecto de la tensión en el ADN en el rango de 0 a 25 pN
es el de linealizar el polímero. A partir de 30 pN , para describir correctamente la curva de fuerza
extensión del ADN de cadena doble hay que tener en cuenta a pérdida de helicidad. Adicionalmente,
en los experimentos de tensión en el ADN (Ibarra et al. (2009)) la tensión no parece afectar la
estructura del ADN en el interior de la polimerasa en el rango de 0 a ∼ 20 pN . Por otra parte
en nuestros experimentos, en la con�guración de fuerza a favor, la interacción funcional se pierde
de manera abrupta. Lo anterior hace suponer que en el rango de −20 a 20 pN , la polimerasa no
siente la deformación del ADN en su interior, por lo que la coordenada mecánica, en este rango, se
corresponde con la translocación de la proteína a lo largo de la cadena molde de ADN.
El ciclo de polimerización varía de una polimerasa a otra, pero tiene elementos comunes: Un paso
reversible de unión débil a nucleótido para seleccionar entre el correcto y el incorrecto, un paso
irreversible de unión fuerte, presumiblemente después de la transición de cierre de los dedos, un paso
de hidrólisis (irreversible) y un paso de liberación del producto pirofosfato (irreversible en nuestras
condiciones):
E : p/t + dNTP+1−1E : p/t : dNTP
2⇀ E′ : p/t : dNTP
3⇀ E′ : p+1/t : PPi
4⇀ E : p+1/t + PPi
El efecto de la fuerza en cada uno de estos pasos va a dar como resultado un comportamiento distinto
de los parámetros cinéticos con la fuerza. Nuestros datos indican que Vmax disminuye con la fuerza en
contra y Km aumenta. El hecho de que la constante de unión aparente aumente con la fuerza indica
que la fuerza está actuando como un competidor al proceso de unión a substrato. Sin embargo, la
velocidad máxima, Vmax disminuye con la fuerza, lo que indica que a concentraciones saturantes de
substrato no se corrige este efecto, como sería el caso si sólo el paso reversible de unión a substrato
dependiera de fuerza.
Enmarcados en el ciclo de polimerización, esta combinación de efectos sería compatible con que la
fuerza actúa en alguno de los pasos intermedios entre la unión débil a nucleótidos (no incluida) y
el paso irreversible de liberación de pirofosfato (no incluida). Por otra parte, el efecto de la fuerza
sobre el ciclo de polimerización, debido al diseño experimental, es exclusivamente sobre el paso que
genera movimiento. Esto implicaría que el paso que genera el movimiento es el paso de unión fuerte
a nucleótido y que cuando ocurre la hidrólisis la polimerasa ya ha translocado.
84
6 Conclusiones
1. Hemos desarrollado un sistema experimental basado en la técnica de pinzas ópticas, que per-
mite detectar, a nivel de moléculas individuales, el efecto que tiene la tensión desestabilizadora
en la juntura de la doble hebra y la secuencia del ADN en las actividades de extensión del
primer y desplazamiento de banda de la polimerasa de ADN de Phi29 salvaje y un mutante
de�ciente en desplazamiento de banda.
2. Durante el proceso de desplazamiento de banda, la apertura de la doble hebra es el paso
limitante y dependiente de fuerza de la reacción, el cual limita moderadamente el avance
a través de la horquilla de la polimerasa salvaje y fuertemente el avance del mutante. Se
detectaron pausas cortas con características similares en las actividades de extensión del primer
y desplazamiento de banda de la polimerasa salvaje y en la de extensión del primer de la
polimerasa mutante, lo que sugiriere que la naturaleza del estado inactivo de corta duración es
el mismo para ambas polimerasas y está relacionado con el ciclo bioquímico de replicación. La
apertura de las regiones más estables de la horquilla (mayor concentración de pares de bases
GC) ralentiza la translocación de la polimerasa salvaje y promueve la entrada del mutante en
un estado de pausa de larga duración.
3. Hemos extendido la descripción física de Betterton y Jullicher para cuanti�car la actividad de
apertura de la doble hebra de la polimerasa salvaje y del mutante de�ciente en desplazamiento
de banda incluyendo la cinética de pausas observada. El ajuste del modelo a la dependencia en
fuerza y secuencia de la velocidad de replicación de las polimerasas salvaje y mutante reveló
que ambas enzimas utilizan el mismo mecanismo activo de apertura de la doble hebra: la
polimerasa desestabiliza al menos dos pares de bases en la juntura con una energía por par de
bases de ∆Gd = 2 kbT .
4. Hemos desarrollado un sistema experimental basado en la técnica de pinzas ópticas, que permi-
te inmovilizar a la polimerasa de Phi29 en una super�cie y detectar la actividad de replicación
85
Capítulo 6 Conclusiones
mientras se aplican fuerzas directamente sobre la polimerasa en las direcciones a favor y en
contra del movimiento y a diferentes concentraciones de dNTPs.
5. Hemos encontrado que la velocidad catalítica máxima, Vmax, disminuye y la constante de
unión de nucleótidos aparente, Km, aumenta con la fuerza en contra de modo que la constante
efectiva de unión, kb = Vmax/Km, también disminuye con la fuerza en contra. Estos resultados
indican que el paso dependiente de fuerza en el ciclo de polimerización está relacionado con el
proceso de unión de nucleótido y no con el de liberación de pirofosfato.
86
Agradecimientos
En estos momentos toca hacer recuento de estos años y de todas las personas e instituciones que han
aportado a la consecución de esta tesis. Es imposible mencionar a todos, pero sí me gustaría decir que
con todas las personas con las que he interactuado en este período, ya sea directamente relacionadas
con mi trabajo o simplemente porque hemos coincidido en espacio, he tenido una relación siempre
positiva.
Quiero agradecer explícitamente a mis directores de tesis, Borja Ibarra y José L. Carrascosa. Espe-
cialmente a Borja, por todo, por la paciencia, por enfocar los esfuerzos, por la certeza del camino a
seguir y por enseñarme lo que signi�ca el método cientí�co.
Quiero agradecer también a los colaboradores con que hemos contado en la realización de este
trabajo. Al grupo de Margarita Salas y en especial a José Mari Lázaro, del CBMSO-CSIC, por
cedernos amablemente las muestras con las que se realizó esta tesis. A nuestro colaborador Fran
J. Cao, del departamento de Física Atómica, Molecular y Nuclear de la Universidad Complutense
de Madrid, por su aporte a la compresión y cuanti�cación de los problemas que hemos tratado y
de manera particular, por las interminables y muy estimulantes discusiones de física. A José M.
Valpuesta, del CNB-CSIC por su apoyo a la construcción de las pinzas ópticas. A Stephan Grill del
Instituto Max Plank de Biología Celular y Genética por permitirnos utilizar su sistema de pinzas
ópticas de alta resolución. A Ricardo Arias por ser un apoyo y por introducirme en el mundo del
instrumento de pinzas ópticas. Al departamento de instrumentación del CNB, especialmente a Carlos
por su ayuda en el mantenimiento del equipo.
Me gustaría mencionar a los miembros del grupo de pinzas ópticas: Elías, Rebeca, Adriana y es-
pecialmente a Silvia, por estar ahí en el día a día del laboratorio. Al grupo de Fernando Moreno,
especialmente a Benjamín, Carolina y Maru por hacer piña alrededor del tema de single molecule
en los seminarios de grupo. A todos los integrantes del S0 y S1 que siempre han tenido una cara
amable que ofrecer. A las personas del S5, del despacho, J.R. Castón, Dani Luque y especialmente
a Jaime, capaz de sacarme una sonrisa aun en los momentos más agobiantes. A los compañeros de
87
Agradecimientos
poyata, Ana, Mariana y Carlos, por la música, las bromas y en general por hacer del ambiente de
trabajo un lugar placentero.
A los amigos, por las comidas, las barbacoas y por estar ahí en los momentos difíciles. A Álvaro y
Amy, por su atención y cariño para con un recién llegado a un país extranjero. A Elena, por los
cigarros. . . y lo que se habla en los cigarros. A Jorge, por su apoyo leal y siempre constructivo. A
Srdja simplemente por �estar � un buen amigo y �ser � siempre ahí y a Mateja, por su complicidad.
A Josué, por ser un buen compañero de viaje y no dejarme olvidar mi parte cubana, a pesar de
sus gustos deportivos. A Sara, por ser mi pareja de baile, siempre atenta a los estudios teóricos. A
David, Djorge y Milena, Bego y Pedro.
Finalmente, quiero agradecer al Instituto Madrileño de Estudios Avanzados en Nanociencia (IMDEA
Nanociencia) por la �nanciación otorgada para la realización de esta tesis doctoral. Al CNB-CSIC
por proporcionar el soporte material con el que se ha realizado esta investigación. A la Organización
Europea de Biología Molecular (EMBO) por concederme una beca de tres meses (ASTF 276 � 2012)
para ir al MPI-CBG. Al proyecto CEAC por concederme, en colaboración con el CSIC, un año de
entrenamiento previo a la realización de esta tesis.
A mis padres, artí�ces silenciosos de lo que soy hoy. A Lari y Mauro, por ser la razón por la que me
levanto todos los días.
88
Capítulo 7 Anexos
7 Anexos
7.1. Ensayo bioquímico de actividad de polimerización,
exonucleólisis y desplazamiento de banda de la polimerasa de
Phi29 etiquetada con biotina en el extremo amino-termial.
7.1.1. Ensayo acoplado de polimerización/exonucleólisis (pol/exo).
Figura 7.1: Ensayo acoplado de polimerización/exonucleólisis (pol/exo). Una molécula de dsDNA (15bp) marcada
con 32P con extremo protuberante de 6 nucleotidos se usó como substrato para la polimerización dependiente de
ADN. La mezcla de incubación contiene, en un volumen de 12,5 ul, 50 mM Tris�HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1
mM DTT, 4% (v/v) glycerol, 0.1 mg/ml albúmina del serum bovino (BSA), 1.2 nM del dsDNA etiquetado en el
extremo 5´, 30.3 nM de la polimerasa salvaje o biotinilada de Phi29 y las concentraciones crecientes de los cuatro
dNTPs indicadas. Después de incubar a 25ºC por 10 min, la reacción fue detenida añadiendo EDTA hasta una
concentración �nal de 10nM.Las muestras fueron analizadas por autoradiografía después de electroforesis en gel de
acrilamida al 20% con 8 M de urea. La polimerización o la exonucleólisis en la dirección 3'-5' se detecto como una
aumento o disminución, respectivamente, en el tamaño del (15mer) primer marcado en el extremo 5' con 32P.90
7.2 Determinación de las energías de enlace entre pares de bases AT y GC.
7.1.2. Ensayo de desplazamiento de banda acoplado a la replicación del ADN M13.
Figura 7.2: Desplazamiento de banda acoplado a la replicación del ADN M13. La mezcla de reacción contiene, en
un volumen �nal de 25 ul, 50 mM Tris�HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 4% (v/v) glicerol, 0.1 mg/ml albúmina del serum
bovino (BSA), 10 mM MgCl2, 40ul de cada uno de los cuatro dNTPs, [α-32P]dATP (1 μCi), 4.2 nM de M13 ssDNA
con un solo primer y 16.8 nM de la polimerasa salvaje o biotinilada de Phi29. Después de incubar a 25ºC durante el
tiempo indicado, la reacción fue detenida añadiendo EDTA hasta una concentración �nal de 10nM y SDS a 0.1%
(w/v). Después de �ltrar a través de una columna giratoria Sephadex G-50, se determinó la radiación �erenkov del
volumen excluido para calcular los valores de actividad relativa. Para el análisis de tamaño, el ADN etiquetado fue
desnaturalizado mediante un tratamiento con 0.7 M NaOH y sometido a electroforesis en gel de agarosa alcalina
0.7% (w/v) y posteriormente las muestras fueron analizadas por autoradiografía. La posición indicada, en unidades
de la longitud del ADN de M13 (7250 bp), de la migración se detectó mediante tinción con bromuro de etidio.
7.2. Determinación de las energías de enlace entre pares de bases
AT y GC.
A partir de las curvas experimentales de apertura mecánica de la doble hebra (en ausencia de la
polimerasa), se determinaron las energías de enlaces promedio para los pares de bases AT y GC
mediante el ajuste de estas a un modelo, basado en mecánica estadística del equilibrio. El modelo
describe la fuerza que experimenta la microesfera en la trampa óptica en función de la distancia entre
91
Capítulo 7 Anexos
ambas microesferas, xexp, en la con�guración geométrica típica de estos experimentos, Figura 7.3a,
a partir de la función de partición Huguet et al. (2010); Bockelmann et al. (1997, 1998):
Z (x0) =∑
j,d exp(−ETot(j,d,x0)
kBT
)(7.1)
determinada por la energía libre, ETot (j, d, x0) = Epb (j) + 2Eext (j, d) + Etrampa (j, d, x0) como
función del estado del sistema, determinado éste por el número de bases abiertas, j (pares de bases,
pb), la extensión entre extremos de la molécula de ADN abierta, xss (d) (nm), y la distancia entre la
posición de equilibrio de la microesfera en la trampa óptica y la posición de la microesfera localizada
en la micropipeta, x0. kB es la constante de Boltzmann y T la temperatura absoluta.
La energía necesaria para separar las dos hebras de la doble hélice (Epb (j)) incluye las contribuciones
de las energía de apareamiento, apilamiento y reordenamiento de las bases, así como la interacción
de cada par de bases con sus vecinos más próximos, Huguet et al. (2010). Por simplicidad hemos
considerado este término sólo dependiente de la identidad del par de bases, introduciendo los valores
efectivos de las energías de apareamiento de un par AT (EAT ) y GC (EGC) como parámetros de
ajuste en el modelo: Epb (j) =∑j
i=1Epb (i), siendo Ebp (i) = EAT o Ebp (i) = EGC según se
trate de un par de bases AT o GC.
La segunda contribución se debe a la energía elástica almacenada en las hebras de ADN de cadena
sencilla liberadas progresivamente durante el proceso de apertura: Eext (j, d) = f (xss (d))xss (d) −
j´ f
0 df′xss (f ′), siendo f (xss (d)) la característica fuerza-extensión promedio por nucleótido para el
ADN de cadena sencilla. Esta magnitud se determinó experimentalmente, Figura 4.3 y en el cálculo
de Eext se despreció la contribución a la extensión total debida a la molécula espaciadora de doble
hebra entre la microesfera atrapada y el inicio de la horquilla, Figura y MM.
La tercera contribución corresponde a la energía elástica de la trampa óptica, modelada con un
potencial cuadrado Jahnel et al. (2011): Etrampa (j, d, x0) = 12ktot · (x0 − 2jxss (d))2, siendo ktot
(pN/nm) la constante elástica efectiva de la trampa, Figura 7.3a.
A partir de la función de partición (Ecuación 7.1) es posible calcular la fuerza de equilibrio, f teo,
para el proceso de apertura mecánica según:
< f teo >=
∑j,d−ktot · (2jxss (d)− x0) · exp
[−ETot(j,d,xo)
kBT
]Z (x0)
(7.2)
Los valores de EAT y EGC que mejor se ajustan a las curvas experimentales se determinaron mini-
92
7.2 Determinación de las energías de enlace entre pares de bases AT y GC.
x0
(a)
0,60,50,40,30,20,10,0
20
18
16
14
12
10
6
8
Ten
sión
(pN
)
Distancia (μm)
f teof exp
100 200 300 4000 500
% G
C
Posición en el Molde (nucleótidos)
(b)
100
80
60
40
20
0
120
1,61,41,21,00,8 1,8 2,0
EAT (kBT)
Conteos
(c)
40
20
04,54,03,53,02,5
Conteos
EGC (kBT)(d)
Figura 7.3: Determinación de las energías de enlace entre pares de bases AT y GC . 7.3a: Representación esque-
mática (no a escala) y notación del modelo utilizado para calcular el patrón de fuerza-extensión del proceso de
apertura mecánica de la doble hebra en nuestras condiciones experimentales. La respuesta mecánica del sistema
molecular anclado entre las microesferas atrapada ópticamente y sujeta en la micropipeta depende de el número de
pares de bases abiertos, j, de la característica fuerza-extensión de la porción de ADN de cadena sencilla liberada
progresivamente (j · .xss (f)) y de la desviación de la microesfera en la trampa óptica con respecto a su posición de
equilibrio, x0− 2 · j · xss (f). 7.3b: Curvas de fuerza-extensión experimentales (negro, Nexp = 5) y predichas por el
modelo, con distintas combinaciones de EAT y EGC , (naranja, Nteo = 10) de un total de Nexp = 44 y Nteo = 662.
El patrón presenta picos espaciados que concuerdan con las regiones ricas en pares GC de la horquilla (interior,
azul, cálculo en una ventana de X nueclótidos). 7.3c: Histograma de los valores de EAT seleccionados según el
criterio DCM ≤ 0, 3 pN2 (Ecuación 7.3). El ajuste a la función gaussiana (rojo, R2 = 0, 991) revela una media
de EAT = 1, 44 kBT y una desviación estándar de σEAT = 0, 17 kBT . 7.3d: Histograma de los valores de EGC
seleccionados según el criterio DCM ≤ 0, 3 pN2 (Ecuación 7.3). El ajuste a la función gaussiana (rojo, R2 = 0, 98)
revela una media de EGC = 3, 23 kBT y una desviación estándar de σEGC = 0, 52 kBT . 7.3c y 7.3d: La escala del
eje de las abscisas se corresponde con el rango de valores simulados en cada caso.
93
Capítulo 7 Anexos
mizando la desviación cuadrática media entre las curvas experimentales (fexpi ) y las curvas teóricas
f teoi (EAT , EGC , ktot):
DCM =1
N
N∑i=1
(fexpi − f teoi (EAT , EGC , ktot)
)2 (7.3)
donde N es el total de puntos experimentales y simulados.
El espacio de parámetros fue muestreado de manera homogénea (NC ∼ 5887 combinaciones) para
valores de EAT entre 0, 50 y 2, 46 kBT y EGC entre 2, 50 y 4, 46 kBT , Johnson et al. (2007); Cocco
et al. (2001); Strick et al. (1999), con un paso de 0, 07 kBT . Los valores de la constante elástica
efectiva de la trampa óptica (ktot) se seleccionaron de acuerdo con el orden de magnitud de los valores
experimentales observados en experimentos individuales, en un rango entre 0, 1 y 0, 4 pN/nm con un
paso de 0, 05 pN/nm. Las curvas teóricas fueron comparadas con curvas experimentales individuales
(Nfexp = 44) alineadas previamente (Figura 7.4) y se seleccionaron aquellas con un valor de DCM
menor que 0, 3 pN2. Los valores obtenidos de EAT = 1, 44 ± 0, 17 kBT y EGC = 3, 23 ± 0, 52 kBT
están en concordancia con los reportados en otros estudios con condiciones experimentales similares
a las nuestras Johnson et al. (2007).
La discrepancia entre las curvas teóricas y experimentales (acentuada en el último pico, Figura 7.3b)
se puede explicar teniendo en cuenta que en el modelo no se han considerado las interacciones entre
vecinos más próximos. Debido a que la secuencia de la horquilla contiene pares de bases GC aislados
a lo largo de las regiones ricas en AT y pares de bases GC agrupados, el procedimiento de ajuste
es incapaz de reproducir ambas situaciones, observándose la mayor discrepancia en la barrera de
12 GC s (existen más regiones con pares aislados que agrupados). Esta desviación conlleva a una
subdeterminación de EGC , la cual es más importante en las barreras de GC. Este comportamiento
también explica la forma más dispersa del histograma de EGC , (σEGCσEAT
∼ 3).
Alineamiento de las curvas experimentales de apertura mecánica Previo a la comparación con
las curvas generadas con el modelo, las curvas experimentales de apertura mecánica fueron alineadas
entre sí. La dispersión entre diferentes curvas proviene de tres causas fundamentales: i) En el proceso
de unión de la molécula a la microesfera inmovilizada en la micropipeta, diferentes puntos de unión
generan curvas ligeramente desplazadas entre sí; ii) el efecto no homogéneo que tienen las variaciones
en la concentración de sales en el tampón sobre la elasticidad de la molécula de ssDNA genera
curvas que, a pesar de tener todos los elementos que identi�can la horquilla diseñada (Figura 4.1b),
94
7.3 Modelo de Betterton y Julicher
0,50,40,30,20,10,0
20
18
16
14
12
Ten
sión
(pN
)
Distancia (μm)(a)
0,50,40,30,20,10,0
20
18
16
14
12
Distancia (μm)
Ten
sión
(pN
)
(b)
Figura 7.4: Alineamiento de las curvas experimentales de apertura mecánica de la doble hebra. El proceso de
alineamiento selecciona, de un conjunto de ∼ 30000 curvas modi�cadas a partir de cada curva experimental (Nexp =
44), aquella que minimiza la Ecuación 7.3. 7.4a: Selección de 15 curvas experimentales antes de aplicar el proceso
de alineamiento. En rojo y azul se señalan las curvas más separadas entre sí. 7.4b: Resultado del procedimiento de
alineamiento.
presentan longitudes �nales diferentes y iii) las variaciones, entre experimentos independientes, de
la constante elástica efectiva de la trampa óptica provoca que tanto la altura como el ancho de los
picos característicos varíe entre experimentos, Bockelmann et al. (1997, 1998); Huguet et al. (2010).
Para corregir estos efectos, se determinaron, a partir de las curvas experimentales, fexpj , curvas
modi�cadas fexp−modij según la expresión: fexp−modij (xi) = fexpj (xi) con xi = xj + g (i) · xj + h (i),
donde xj contiene los valores de las abscisas experimentales y xi los modi�cados según un factor
de escala g (i) y un factor de desplazamiento h(i). Los valores de tensión no fueron alterados. La
elección de este procedimiento de modi�cación permite aplicar desplazamientos puros (g (i) = 0),
escalados puros (h (i) = 0) así como escalados crecientes a lo largo de la curva (g (i) 6= 0). Para cada
curva experimental se seleccionó aquella modi�cada que minimiza la Ecuación 7.3 con respecto a un
molde preseleccionado. Como molde, se utilizó primeramente una curva experimental arbitraria y
posteriormente el promedio de todas las experimentales.
7.3. Modelo de Betterton y Julicher
Durante el ciclo de replicación del ADN la polimerasa se mueve hacia adelante con un rate k+, pro-
pulsada por la energía obtenida de la unión, hidrólisis e incorporación del nucleótido complementario
95
Capítulo 7 Anexos
al que encuentra a su paso. En las condiciones de desplazamiento de banda, para poder avanzar, es
necesario que uno o varios pares de bases de la doble hebra que encuentra a su paso se abran. Este
proceso pudiera ser independiente de la polimerasa o por el contrario pudiera estar favorecido por
la interacción entre la juntura y la enzima. La velocidad de replicación global, si no consideramos el
efecto de las pausas, viene dada por: ka (l, f) =∑L−l
m=0 k+ (l,m, f) · P0 (l,m, f) donde k+ (l,m, f) es
el rate de translocación de la polimerasa hacia delante cuando esta se encuentra en la posición l de
la hebra molde, m bases se encuentran abiertas delante de ella y la tensión aplicada en el ADN es
f . P0 (l,m, f) es la probabilidad de encontrar a la polimerasa en el estado con valores l, m y tensión
aplicada f y L es la longitud del substrato. Esta magnitud está determinada por la energía de Gibbs
∆G (l,m, f) necesaria para abrir m pares de bases por delante de la posición l del molde:
P0 (l,m, f) =exp [−∆G(l,m,f)/kBT ]∑L−lm=0 exp [−∆G(l,m,f)/kBT ]
(7.4)
estando ∆G compuesta por tres contribuciones:
∆G (l,m, f) =l+m∑i=l+1
∆Gpb (i)− 2m
ˆ f
0xss(f ′)df ′ −
m∑i=1
∆Gint (l, i, f)
i. La energía de apareamiento de las m bases abiertas, ∆Gpb.
ii. La tensión desestabilizadora externa aplicada sobre la juntura: ∆Gf = 2m´ f
0 xss (f ′) df ′.
iii. La energía de interacción entre la polimerasa y la juntura de la doble hélice ∆Gint.
Mecanismo de apertura pasivo El modelo pasivo asume que la polimerasa no interactúa con los
pares de base en la juntura, aumentando la probabilidad de que estos se abran, i.e., ∆Gint = 0. Por
el contrario, la enzima espera a que el par de bases se abra de manera espontánea para avanzar y de
esta manera estabilizar la posición translocada. En este caso, el rate al que se da un paso de longitud
δ viene dado por:
k+ (l,m, f) =
0, m < δ
k0, m ≥ δ
siendo k0 la velocidad de replicación en la actividad pol. El modelo pasivo no ajusta los datos
obtenidos para ninguna de las polimerasas en estudio.
96
7.4 Artículos publicados durante el periodo de tesis
Mecanismo de apertura activo Un modelo activo, asume que existe una interacción entre la
polimerasa y la juntura de la doble hélice en frente de su posición, dentro de un rango de longitud
M (pares de bases), i.e, ∆Gint(l,m, f) para 0 < m ≤ M . En particular, siguiendo el criterio de
Johnson et al:
∆Gint (l,m, f) =
∆Gd, 0 < m ≤M
0, m > M
donde ∆Gd parametriza la intensidad de la interacción e implica:
m∑l=1
∆Gint (l,m, f) =
m ·∆Gd, 0 < m ≤M
M ·∆Gd, m > M
La interacción entre la polimerasa y la juntura, además de aumentar la probabilidad de apertura
de la juntura, implica una reducción en la velocidad de translocación hacia adelante de la enzima,
según:
k+ (l,m, f) =
0, m < δ
k0 · exp [−a·min(M,δ)·∆Gd/kBT ] , δ ≤ m < max (M, δ)
k0 · exp [−a·(M+δ−m)·∆Gd/kBT ] , max (M, δ) ≤ m < M + δ
k0, M + δ ≤ m
donde a (0 < a < 1) es un coe�ciente adimensional determinado por localización relativa de la
barrera de activación del proceso de dar un paso.
7.4. Artículos publicados durante el periodo de tesis
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Capítulo 7 Anexos
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Nomenclatura
ADN Acido Desoxiribnucléico
db Desplazamiento de Banda
ddb De�ciente en Desplazamiento de Banda
DMP Dimetil pimelimidato dihidrocloruro
dNTP deoxy Nucleotido Tri Fosfato
nt Nucleótidos
pb Pares de bases
PBS Tampón fosfato salino
pol Polimerización
ssADN ADN de cadena sencilla
wlc Worm Like Chain
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