Post on 02-Feb-2019
PERGILLUS NIGER SOBRE SUS-
TRATOS AMILACEOS POR EL ME -
TODO KOJI "
q.b3b
'\ EVOLUCION EN LA PRODUCCION
DE PROTEASAS ACIDAS POR AS-
,
ALFmDO&SSI GUERRERO INGENIERIA BIOQUIMICA INDUSTRIAL DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD. UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD I ZTAPALAPA .
., _, ",. .." .~*"
I N D I C E
Objetivo - - - - - " " " - - " " ^ " " "~""""""""""""" 7
Metas
Sistema de - fermentacih
Pardmetros
Material
Método
Esquema de - trabajo
cslculos
Resultados
Discuci4n de Resultados
Conclusión
Referencias
"~"""""""""""""""""""""""" 7
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INTRODliCCION .. \ . 1
Tradicionalmente las fuentes de enzimas proteolfticas han sido - de origen animal ti vegetal, entre las primeras pueden citarse algunas
plantas tropicales como la papaya, el h i g o v la piña, que producen - - respectivamente la papaina, la ficina y la hromelina, Las de origen-
animal provienen de organos como el estomago A el páncreas, de donde-
pueden extraerse respectivamente pepsina y renina, asi como tripsina,
quimotripsina y carboxipeptidasas.
Actualmente el campo 'de las fermentaciones ha abierto horizontes
muy importantes en la producción de enzimas de origen microbiano, las
cuales Dresentan muchas ventajas para ciertos fines, dado que en gene
ral, son muy inespecjficas; no requieren cofactores, muy rara vez se-
encuentran como zimógenos, etc. (Hagihara, 1960)
-..
.
Se sabe que son muchas las clases de microorganismos que poseen
la capacidad de producir enzimas, entre ellas se encuentran las enzi
mas que hidrolizan proteínas y que reciben el nombre de enzimas nro-
teolíticas o proteasas, siendo uno de los primeros reportes, la iden - tificaci5n de proteasas alcalinas producidas por Asperqillus oryzas-
(Oshima, 1922).
Ikeda, ( 1 9 4 7 ) demostr6 que cuando Bacillus suhtilis se hace crecer - en un medio conteniendo como fuente de carbono 5cido acético produce
grandes cantidades de proteasas alcalinas,
En los iíltimos años ha tenido gran auge el estudio de enzimas - proteolíticas producidas por microorganismos, ya que son de ,gran uti I
lidad en los procesos industriales, tales como:
a.- Industria farmaceutica, sirven para la elaboracihn de preparacio c
nes a base de enzimas proteolfticas para combatir algunas infla-
maciones (Reed, 1966).
b.- Industria cervecera, se utilizan para ayudar a clarificar y madu - rar la cerveza, durante el perfodo de almacenamiento (Reed,1966),
c.- Industria cinematogr5.fica y fotogriifica, se utilizan para recue-
perar la plata empleada tanto en las cintas de pel4culas como en
cintas de fotograffa, solubilizando la gelatina que engoma a di-
chas cintas (Boidin and Effront, 1930).
d . - Industria alimenticia, sirven para la elaboracidn de hidroliza--
dos de proteínas de pescado, de cereales, y de leche; tambien se
utilizan para fabricar ablandadores de carnes,
J
c_ . . . - . _, "e
e.- Industria textil, con frecuencia s e usan amilasas y proteasas - dependiendo de la fabricacian y los tipos de engomado; por ejem - . plo durante el proceso de desengomado del ray6n se emplean enzi
mas proteolíticas porque por lo general esta tela se engoma - - con gelatina o caseína (Gale, 1941 ) .
-
f.- Otros usos incluyen el curtido de pieles (Jorgensen,' 1959) ; y - el empleo de éste tipo de enzimas en la D'roducci6n de,detergen-
tes biológicos (Keay y Col., 1973)
;La investigaci6n de estas enzimas ha sido enfotada .para tratar-
de encontrar nuevas aplicaciones y nuevas cepas de microorganismos-
que tengan la capacidad de producir grandes cantidades de enzimas - proteolíticas, ya que la demanda de éstas aumenta año con año,
Las enzimas proteolíticas se pueden dividir en tres grupos de - acuerdo al rango de pH en el que s u actividad es Bntima y son: prc
teasas ácidas, proteasas neutras y proteasas alcalinas,
Las proteasas ácidas son producidas por hongos, teniendo un m$-
ximo de actividad y estabilidad a un nH 2 a 5 , tienen un peso mole-
cular alrededor de 35000 y contienen una baja cantidad de aminofici-
dos básicos, Entre los microorganismos que las producen estbn: - - Aspergillus oryzae, Mucor pusillus y Aspergillus niRer, y su uso se
limita a las industrias ldcteas y de alimentos,
Las proteasas neutras son producidas nor dos tipos de microorg%
nismos: bacterias y hongos, su pH de actividad est5 entre 7 y 8 , y
presentan un peso molecualr aproximado de 40 O00 a 45 000, algunas*
de éstas enzimas requieren Zn y Mg, para incrementar s u actividad - (Griffin, 19731,
Las proteasas alcalinas, también l a s producen bacterias y hon ?
gos, s u m5xima actividad est5 entre ?I-l 10 y 11, tienen un peso
lecular de 20 O00 a 30 0 0 0 , s u uso se ha extendido enormemente en-
la industria de los detergentes, al curtido de pieles y en la in--
dustria alimenticia, Las enzimns mSs estudiadas son: ,Suhtilisina
Carlberg y Subtilisina Novo, producidas nor Bacillus subtilie (Ke-
ay y Col., 1972) .
También se han dividido las enzimas proteolZticas en: protef - nasas y peptidasas.
Las proteínasas catalizan la degradaci6n de proteEnas,'dando-
origen a la formación de peptonas y polipétidos a combinaciones - - m5s simples, como los amino5cidos.
Al grupo de las protefnasas, pertenece la pensina que se encu L)
entra en el jugo gástrico, con un pH ÓDtimo de 1,2 a2, la tripsina
que se halla en el intestino y tiene un pH óptimo de 8 a 9 , y la - papaina, que se encuentra en el jog0 lcicteo de Carica paDaya, que-
tiene un pH Bptimo de 4 a S .
El pH 6ptimo de las peptidasas se encuentra por lo general - - cerca de 7, éstas enzimas son sintetizadas por vegetales, animales
y por varios microorganismos (jorgensen, 1959) .
La produccidn mundial de enzimas proteolíticas s e lleva a ca-
bo principalmente por algunas compañ.;las Europeas, de Estados Uni--
dos de Norteamérica y Jap6n (Keay y C o l . , 1972) .
Los procesos de producci6n de enzimas involucran fermentacio m
nes líquidas 6 fermentaciones sólidas, de esta iíltima podemos enten - . derla como el crecimiento de microorganismos y la formacirjn de pro-
ductos que ocurre en la superficie de sustratos sdlidos, es decir - con bajo contenido de humedad, (Mudgett, 1 9 8 6 ) . La fermentaci6n s6-
lida se ha venido utilizando desde hace muchos siglos en los passes
orientales para la producci6n de alimentos fermentados albase de - cereales como el arroz y la soya, en estos procesos intervienen al-
gunas enzimas extracelulares (Carrizales; 1982) .
Una gran cantidad de enzimas extracelulares son producidas - comercialmente a travez de una fermentaci6n sólida de origen japo-
nes llamado Koji, que es la preparaci6n de hongos filamentosos cre-
cidos en salvado u otro sustrato como arroz, trigo, etc. (Blain, - - 1 9 7 5 1 .
L a fermentaci6n Kojl s e na reallzado en diversos sistemas de
bandejas, tambores rotatorios, lechos fijos, etc, Generalmente el =
sustrato es colocado en condiciones asépticas en las bandejas e incu - bad0 a una temperatura adecuada,
Para la elaboracidn de productos fermentados en los países ori-
entales se utiliza la bandeja; de igual forma a nivel industrial se-.
utilizan estas con el fondo agujerado en donde la temperatura y la - humedad son controladas (Cannel y Moo-Young, 1 9 8 0 ) .
El presente trabajo est6 enfocado a la evoluci6n en la produ---
cciBn de prote5sas Scidas por el método Koji sobre diversos sustra--
tos amiliiceos; la técnica de Koji se ha implementado en columnas de-
vidrio, empacadas con el sustrato inoculado. Cada una de las colum.
nas se encuentran conectadas a un humidificador, a trdvez del cual -
Y
I
Y
U
*
.
se hace circular aire para mantener un contenido de humedad en el - sustrato y remover el calor generado durante In fermentaci6n. Todo
este sistema se encuentra sumergido en un baño de agua a temperatu-
ra controlada (Raimbault et al., 1985).
Se dispone para este trabajo de un2 cepa dc Aspergillus Niger-
lliperproductora de proteasa Bcida. Dicha cepa fue obteniga en'los-
laboratorios de Biotecnología de la Universite. de Technologie de - - Compiegne, desarrollada por el Doctor Chow y nroduce'una proteasa - cuyos ó?timos son: pH de 2.5 y temperatura de 47"grados. centígra"
dos.
1
7 U
OBJETIVO: E l obje t ivo de es te proyecto c s c l c s t u d i o clc la Evoluciiin . m en l a p r o d u c c l ó n de proteasas ficldas por Aspergillus Niger
sobre d is t intos sust ra tos r~mil5ceos .
m
METAS : i I . lmplementaci5n de l a t é c n i c a Koj i para la producci6n de-
Proteasa Acida en e l l a b o r a t o r i o ,
11. ProducclBn de Proteasa 5cida en fermentadores tubulares- s o b r e d i f e r e n t e s s b s t r a t o s a111ilaccos.
111. Evaluación de la Producclón de Proteasa de l o s s u s t r a t o s amllaceos.
n
2
W 01
ii >
I.
3
-. " "I
9
YARAME'lRO S ,
CONSTANTES:
Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ~ . b 3 3 0 C pM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ~ . . S . S
Flujo de aire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . ~ . . . . , 4 I/min. Tamaño de partícula del sustrato. sus trato. malla 10/20
Cantidad empacada por columna ...................,.......~..lO gr.
Hbmedad . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . e . . . . . * e 5 ~ ~
Inoculo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . e , , , . . , , l X l ~ 8 esp.
VARIABLES :
1'iempo de fermentaci6n ...................................... 24,36 y 48Hr. Sustratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , , . , ,a~~~~, soya -
trigo, mafz - ' quebrado, sor go y salvador de trigo,
. .l.l .11...-. - UI . . ....... I__*_,""".7
10
L
I
1
SISTEMA DE FERMENTACION - Columnas de vidrio (long. 20 cm., diam. lnt. a 2 cm.) humidlficadores de vidrio (long. I O cm., diam, int. Z cm) peseya (60X35X45 cm,) control de temperatura Haake e52 termometro vslvulas de bronce rotametro Cole-l'almer '
regulador de f l u j o Collhose Pneumatics flltro para. aire Collhose Pneumatics tapones de hule no. 4
ACUNDlCIUNAMIENTO UE SUSTIUTU Y CEPA
tamices malla 10 y 20 licuadora balanza granatarla esp5tulas pinetas de 5 ml. nacroscopio cgmara de Neubauer incubadora autoclave
- ANALlSIS
matraces hrlenmeyer de 1 0 0 0 , 500 v 2 5 0 ml, 11 atorados de .IO0 ml.
probetas de 25U, lU0 y 2 5 ml. cristalizadores pipetas de 25,lO y 1 ml. tubos de ensaye incubadora
. . "_ - 11
parrilla con agitacl6n msgn6tica espectrofot6metro Spectronic mini 20 potenci6mentro Corning termobalanza balanza analitlca macerador Ultraturrax balanza granataria
SUSTANCIAS.
HCL CH3COONa Nazco3
N aOH 6CidO tricloroacetico reactlvo de Folin Ciocalteau caselna tirosina agua destilada
METODO. 12
. -Preparacl6n del sustrato
~.-~etermlnar el % de humedad (Hl) a una.muestra de 10 gr. de Cada s u s trato.
2.-A otra fracclBn de I O gr agregar un volumen (le solucl6n 0.01 N - de HCL (AL), para. obtener un pll de 5.5
3.-Esterilizar a 15 lb, por 15 min. 4.-Agregar un volumen de suzpensión de.es.poras (El),, t a l que la SE
ma Al + Al + El dé un su% d e humedad final.. s.-~omogeinizar la mezc1.a y dejar reposar 2 U min. 6.-Empacar la columna.
-Preparaci6n de la columna
1.- Colocal. un algoddn y un circulo de papel filtro en el fondo de la columna.
2. - Tapar la colcmna con algodón. 3 . - Marcarla 4.- ksterilizar a 1 5 lb. por 15 min.
-Tratamiento de las muestras
1.- Sacar el product0 y pesar 3 gr. 2.- diluir 1/10 con agua destilada 3.- Homogeinlzar en ultraturrax por 2 min. 4 . - tiuardar en refrigeración.
-
13 ANALISIS DE ACTIVIDAD PROTEASICA:
1, - Tomar 3 g r . de s u s t r a t o y hacer una d i l u c i ó n 1 : l O en agua 2 , - Coloc.ar en un tubo de ensaye y Homogenizar en u l t r a t u r r a x 3 . - D e j a r p r e c i p i t a r 10 minutos 4 . - Tomar 1 m l . de sobrenadante. 5 . - Adic iocer 1 m l . de c a s e í n a a l 2%
6 . - Incubar l U minutos a 3 O o C 7 . - Adicionar 2 m l . de TCA 8 . - F i l t r a r con papel Whartman No. 2 9 . - Tomar 1 m l . de f i l t r a d o
l o . - Adicionar 5 m l . de Na2 Cug 0.4M. t i o i o 5 1 . - Adic ionar 1 IPI. de s o l u c l 6 n F o l l i n , d e j a r a 4OO.C
1 2 . - Leer en Spectronic: 20 a b60 nm.
MODIFICACION AL METODO:
3 , - Tomar 1 ml. de so luc l6n de case ina y aa i . c lonar 2 m l . de TCA ( t r i c l o r o a c e t i c o )
2.- P e r m i t i r l a c o a g u l a c i 6 n 3 . - Adic ionar 1 ml. de sobrenadante 4 , - D e j a r r e a c c i o n a r 1 O minutos 5.- F i l t r a r con papel Whartman No. 2
b. - Tomar I m ] . de t i l t r a d o .
d 7 . - A d l c i o n a r 5 m l . d e Nazco3 ( C a r b o n a t o de s o d l o ) u Q 4 M
8 . - A d i c i o n a r lml. d e s o l u c i 6 n d e f o l l i n .
u 9 . - Leer a 66U n m . c
i
T r a t a m i e n t o de la curva s t d . d e t i r o s i n a I
Tu bo S o l . Sta. T l r o s i n a 1 m l 1
10
1 . - Tomar 1 m l . de cada tubo 2 . - A . d i c i o n a r 1 m l . de agua 3 , - A d i c i o n a r 2 m l . (le TCA 4 . - Tomar I m l . 5 . - A d i c i o n a r 5 m l . d e Sol. de Nazco3 6 . - A d i c i o n a r 1 ml. de SOI. F o l l i n (1 :2 J
7 . - Leer a 660 nm.
10 . o 8 *
6 *
6
2 Q
O 18,l
1 4
,
15
E S Q U E M A D E T R A B A J O
FERMENTACION SUSTRATO
ARROZ
TR I GO
SOYA
FERMEN'IACION SUSTRATO
1
2
3
SALVADO DE
TRIGO
MAIZ QuEBKADu sORtiO
MUESTRE0 PARA CADA FERMENTACION
NO. DL COLUMNA 'I IEMPO (HRS. )
O
2 4 36
4 8
COLUMNAS
' 4 4
4,
COLUMNAS
4
4
4
PARAMETROS
. . - ~._. - 16
-ANALISIS.
ACTIVIDAD PROTEASICA
-CRONOGRAMA
ACTIVIDAD
A) INOCULACION
B) MJESTREO
C) ANALISIS
DIA . -
1
2 , 3
4
1 7 d CALCULOS
LOS c % l c u l o s r e a l i z a d o s de l a s diferentes csntidades se basar6n en las s iguientes ecuaciones .
i
-SUSTRATO SECO: I
A=B ( O . 5 )
DONDE B=Sustrato que se desea tener un 5 0 % de humedad, un pH de 5,s y
1 X 1 O ESPORAS G R . MAT. SECA
-SUSTRATO FRESCO A EMPLEAR:
C=B (l+D)
DONDE
D= % de húmedad d e l s u s t r a t o I
í
-CANTIDAD TE AGUA ADICIONAL TOTAL PARA OBTENER UN 5 0 % DE HUMEDAD: I I
F = ( 6 ) B / 1 0
DONDE :
G= Cántidad de HCL 0 , O l N necesar io p a r a l l e v a r a un pH de 5 . 5 a 10 g r . de s u s t r a t o .
18
TAMAN0 DEL INOCULO:
H=I(lX108)/J(SOX104)K
DONDE :
K = D i l u c l 6 n
J = E s p o r a s c o r , t a d a s en c a d a c u a d r o
AJUSTE DE LA HUMEDAD AL 509,
E=F+kl+L
DONDE : L = C g n t l d a d d e a g u a n e c e s a r i a p a r a a j u s t a r a l 5 0 9
. .
.-"" -.__...,. ".- ...._... '"
R E S U L T A D O S .
FERMENTACION NO.l
CONDICIONES DE FERMBNTACION:
ESPORAS : I S O ( 2 S X I 0 4 ) ( 1 0 ) = 3 . 7 S X 1 0 8
Los siguientes cSlculos estan básados en 40gr. de sustrato ( a r r o z , soya - '
trigo) e indicar la cántidad de sustrato seco, sustrato. fresco, H20 t o t a l HCL en diferentes concentraciones, in6culo para sustrato y y,O a aditio-- nar para ajuste.
SUSTRATO SECO SIJSTRATO FRESCO NOTA 0 . 0 9 ES LA HUMEDAD DEL VOLUMEN DE H20; VOLUMEN DE I-ICL; TAMARO DEL INOCULO;
H20 PARA AJUSTAR HUMEDAD
ARROZ
X = 4 0 ( 0 . 5 ) = 2 0 g r . Y = 2 0 ( 1 + 0 . 0 9 ) = 2 1 . 7 g r .
ARROZ DEL 9 % H 2 0 = 4 0 - 2 . 1 . 7 = 1 8 . 3 m l ,
tlCL= ( 2 , O ) ( 4 0 ) / 10=8ml, T 1 = 2 0 ~ 1 X l o 8 ~ / 1 5 0 (25x104) ( 1 0 ) = 5 , 3 3 m l . H 2 0 T = 1 8 . 3 - 1 0 - 5 . 3 3 = 2 . 9 7 ml.
" - - 20
FEKMENTAC ION NO, 2
CONDICIONES LA FERMENTACION:
ESPORAS : 25O(25XlO4) (1O)=6.25XlO8 ESPORAS/ml.
SUSTRATO SECO SUSTRATO FRESCO VOLLIMEN UE f-1 ,O VOLUMEN DE HCL 'I'AMANO DEL lNOCULO H20 PARA AJUSTAR HUPIEDAD
I
SUS'I'RA'I'O SECO SUSTRATO FRESCO VOLUMEN DE H20 VULUMEN DE HCL TAMANU DEL INUCULO H20 PARA AJUSTAR HUMEDAD
SUSTRAI'O SECO SUSTRATO FRESCO VOLUMEN DE H20 VOLUMEN DE HCL TAMARO DEL INOCULO H20 PARA AJUSTAR HUMEDAD
ARROZ
x=4u(O.S)=20grs.. ~=Zu(I+O.u9)=21 .7gr. H20=4.0-21.7gr.=r8.3m1. HCL=2,0(40)/10=8ml, T2=20~1Xlo8)/2500(25xlo4)=3,20ml, ~~OT=18.3-3.20-8ml.=7.lml.
TRIGO
x=4~(0,5)=20gr. Y=L0(1+0.09)=21.7gr. H20=40-21.7=18.3ml. HLL=L.5~40)/~U=~Um~, TI=LO(IXlU )/25UOXlO )=5.33ml. HZOT=18.3-~10-5,33=Z.97ml.
8 4
SOYA
X=40(0,5)=20grs, Y=20(1+O.U75)=21 .Sgrs. H20=40-21.5=18.S HCL=3(40)/10=12ml. TI=20(1X108)/2SOO(25X104)=5.~3ml. H20T=18.3-12-5.33=0.97ml.
21
FERMENTACION N O . 3
C O N D I C I O N E S DE LA FERMENTACION:
E S P O R A S :
1 6 0 ( 2 5 X 1 O 4 ) ( 1 0 ) = 4 , 0 X 1 0 8
SUSTRATO SECO SUST!!.Ll'O FRESCO VOLUMEN DE H20 VOLUMEN DE HCL TAMARO DEL 1 NOCULO H z O PARA AJUSTAR MlJMEDAD
SUSTRATO SECO SUSTRATO FRESCO VOLUMkN DE 1I2O VULUMEN UE HCL TAMARO DEL I NOCULO lizo PARA AJUSTAR HUMEDAD
SUSTRATO SECO SUST.RAT0 FRESCO VOLUMEN 1IE H 2 U VOLUMEN DE I-ICL
TAMAiJO DEL INOCULO H20 PARA A J U S T A R HUMEUAJI
ARI<OZ . . X = 4 0 ( 0 , 5 ) = 2 0 g r s . Y = 2 0 ( 1 + 0 . 0 9 ) = ? 1 . 7 g r s . 1 I 2 1 1 = 4 O - 3 1 . 7 = 1 8 . 3 m l , t-ICL=2 .O (413) / 1 0 = 8 m l , T I : 2 0 ( 1 X 1 0 ) / l h 0 0 ( 2 5 X 1 0 ) = 5 . 0 m l . H O T = l 8 . 3 - 8 - 5 . 0 = 5 . 3 m l .
8 4
2
X = 4 ~ ( 0 . 5 ) = 2 0 g r : , Y = 2 ~ ( 1 + 0 . 0 ! ) ) = 2 1 . 7 g r s ,
1 1 2 0 = 4 0 - 2 1 . 7 = 1 8 . 3 m l .
T I = 2 0 ( 1 X 1 0 ) 1 6 0 0 ( 2 5 X 1 0 ) = 5 . 0 ml. 8 4
H 2 0 T = : 1 8 . 3 - 1 O - s . O = 3 . 3 ml.
t - ¡ c L = 2 5 [ 4 0 J / l U = l U ml.
SOYA
X = 4 0 ( ~ . 5 ) = 2 u g r s . Y = 2 0 ( 1 + 0 . u 7 5 ~ = 2 1 , 5 q r s , 1-1 U = 4 0 - 2 1 . 5 = 1 8 . 5 ml.
IIC1,=3, O ( 4 0 ) / 1 0 = 1 2 m l , T I = 2 0 [ l X ~ 0 8 ~ / 2 5 0 0 ( ~ 5 X 1 0 4 J=5.33 ml, H 2 0 T = 1 8 . 3 = 1 2 - 5 . 3 3 = 0 . 9 7 0 ml.
2
2 2 FERhlIiNTAC ION N O , 4
CONDICIONES DE LA FERNENTACION
CONTEO : 2 1 0 ( 2 5 X 1 0 ) 1 0 = 5 . 2 5 X l U 4 8
SUSTIIATU SECO SUS'I'I4ATU FRESCO VOLUbtkN DL: H 2 U
VOLUMEN DE t l C L 10. U 1 )
TAMARU DEL INOCULO 1I2O PAPA AJUSTAR HuMEuAD
SUSTPATO SECU SUSTKATO FRkSCO
VOLUMhN Ilk I I Z O VOLUMEN DE I-ICI.
TAMANO DEL 1NOCULO 1120 PARA AJUSTAR HUMEUAD
SUSTI'ATU SECO
SUSTKATO FRESCO VULUNEN UE 1H20 VOLUMEN DE l l C L
'I'AMANO DEL l N O C U L U
H 2 0 PARA AJUSTAR HUMEDAD
X = 4 0 ( C . 5 ) = 2 0 g r . Y.=20 (1 + U , !)9) =2 1 . 7 p r s , 1 I 2 ~ ~ = 4 0 - 2 1 . 7 = I 8 . 3 1 1 C 1 , = 2 . ~ ~ ( . l u ) / 1 0 = n n l l ; ~ ~ ~ I = 2 0 ( 1 X l u y ) / 2 1 u O ( ~ S X l X l u 4 )=3,80m1. H20T=l8.3-8-3.YO=6.5n~1,
SOYA
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23
FERMENTACION NO. 5
CONDICIONES DE FERMENTACION
ESPORAS :
2O0(25x1O4) (10)=5.0X10~
SORGO
SUSTRATO SECO : SUS'lRA'lO FKESCO : VOLUMEN DE H20: VULUMEN UE HCL: TAElAmO DEL INOCULO : Hz@ PARA AJUSTAR HUhEUAD
SUSTRATO SECO: SUSTRATO FRESCO : VOLUMEN DE H2U : VULUMEN UE HCL: TMíARO DEL INOCULO: H20 P A W AJUSTAR HUFIEDAU:
X=4U(0,5)=20gr. Y=20(1+0.08)=21 . 6gr , . H20=40-21.6=18.4ml. I I
~CL=2.3(40)/10=9,2ml. TI=í!O(lklO )/2~00(25~10~,=4,0~1. 8
H20T=18.4-9.2-4.0=5.2rnl. , !
MAIZ QUEBRADO i
x=:40 (O, 5) =20gr, ~=:2O(~+U.0~)=21 . 7 g r , HZO=40-21.7=18.3ml, ~cL=2.4 (40)/10=9,6ml. TI=20(1Xlu~)/2~00(25X10 4 )=4,0ml. H20T=18,3-9.6-4.0=4.7ml.
2 4
SALVADO DE TRIGO
SUSTKATu SECO:
SUSTRATO FRESCO:
VOLUMEN DE H20:
VOLUMEN LIE HCL:
x = 4 0 ( O . S)=20gr.
~=20(1+O.u75)=21,5gr.
TAMARO DkL INOCULO: T I = 2 0 ( l X l o 8 ~ / 2 0 0 ~ ( 2 5 X l ~ 0 4 ~ = 4 . 0 m l .
H 2 0 PARA AJUSTAR HllMEUAD: H20T=~8.5-10-4=4.Sml.
"I
2 5
FERMENTACION NO, 6
CONDICIONES DE FERMENTACION
180 (25x1 04) (1 O) =4,5X'I O8
SORGO
SUSTRATO SECO: SUSTRATO FRESCO : VOLUMEN DE H 2 0 : VOLUMEN DE HCL: TAMANO DLL INOCULO: H20 P A R A AJUSTAR HUMEDAD:
X=40 (O. 5) =20gr. Y=2~(1+0.~8)=21,hgr, . H20=40-21-6=18.4ml. HCL=L.3(40)/lu=9,2ml, TI=20(1X10 )/180(,!5X10 )(10)=4.44ml, 8 4
€I20T=18.4-9.2-4,4=4.75
MAIZ QUEBRADO
SUS'lRAlO SECO : X=40(U.5)=2Ugr. SUSTRATO FRESCO: Y=zO(1+0.09)=21.7gr. VOLUMEN DE H20: M20=4u-?1.7=18.3ml. VULIJMEN DE HCL: HCL=2,4(4U)/I0=~,6ml. TAMARO DEL INOCULO: *rI=zO(lXlu )/18u(25X104) (10)=4,44ml. €izo PARA AJUSTAR HUMEDAD: H20T=18.3-9.6-4.44=4.26ml.
8
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~~~ ~
SALVADO DE TRIGO
26
SUS'I'RAI'O SECO : X = 4 0 ( ~ . 5 ) = 2 u g r .
SUSTRATO FRESCO:
VULUMEN UE H z O : .H20=40-21.5=18,5 m l . ,
VULUMEN UE I-ICL: H C ~ = 2 . 5 ( 4 0 ) /lot10 ml,
TAMANO DEL INOCULO: TI=20 (1x10 ) / 1 8 0 ( 2 5 ~ 1 0 ~ ) ( 1 0 ) = 4 . 4 r n l . 8 - hl2O PARA AJUSTAR HUMEDAD: H Z u T = i 8 . 5 - I O - 4 . 4 = 4 . 1 ml.
FERMENTACION NO, 7
27
CONDICIONES DE FERMENTACION
ESPORAS :
Z I O ( Z S X I U ~ ) 1 1 O ) = 5 . 2 5 X 1 O 8
SORGO
SUSTRATO SECO:
SUSTRATO FRESCO:
VULUMEN UE H 2 0 :
VOLUbiEN DEs HCL:
TAMARO uEL 1NOcULu:
H20 PAKA AJUS'1P.K HUMLDAU:
SLhTRATO SECo :
SUS'I'RA'I'O FKEScO :
VULUMEN UE H20:
V O L L I W N DB HCL :
TAMARO DEL INOCULO:
H2u PARA AJUSTAR HUMEUAI):
y = 2 0 ( 1 + 0 . 0 8 ) = 2 1 . 6 g r .
H 2 0 = 4 0 - 2 1 . 6 = 1 8 . 4 ml,
H C L = ~ . 3 ( 4 0 ) / 1 0 ~ 9 . 2 m1
M A l Z QuEBKADU
x = 4 0 I(!, 5) =20gr.
~ ~ 0 = 4 0 - 2 1 , 7 = 1 8 . 3 ml.
T I = 2 0 ( 1 X l u ) ~ ( 2 1 0 ) ( 2 5 ~ 1 0 ~ ) ( l 0 ) = 3 , ~ ml. 8
- Ir
2 0
SALVADO DE TRIGO
i i
SUSTRATO SECO:
SUSTRATO FRESCO:
VOLUMEN DE H Z O :
VULUMEN uE I-ICL:
'I'AMANO UEL INOCULU:
H20 PARA AJUSTAR HUMEDAD:
y = 2 u ( 1 + 0 . u 7 5 ) = 2 1 J g r .
~ ~ 0 = 4 0 - 2 1 ; 5 = 1 8 . 5 m l .
' H C L = 2 . 5 ( 4 0 ) / 1 0 = 1 0 m l .
TI=20(1X1~~)/21'0(25X10~) 1 1 0 ) = 3 . 8 m l .
H 2 0 T = 1 8 . 5 - 1 0 - 3 - 8 = 4 . : ml,
I
FERMENTACION NO. 8
CONDICIONES UE FhRMkNTACIUN
ESPORAS :
1 7 0 ( 2 5 X 1 0 4 ) ( 1 0 ) = 4 . 2 5 X 1 0 H
' SORGO
SUSTRATO S E C O : SUSTRATO F R E S C O : VOLUMEN DE l 1 7 C l :
VOLUMEN m I I C L :
TAMAflO DEL INUClJLO :
H 2 0 PARA AJIJSTAH IIIJMEDAII :
X = 4 0 ( 0 . S) = 2 O g r . Y = 2 0 ( 1 + 0 . 0 ~ ) = 2 1 .O g r .
I I 0 = - 1 0 - 2 l . O= I H . 4 m1 , l l C L = 2 . 3 ( 4 0 ) 1 O=!>. 2 m1 , T I = 2 0 ( 1 X 1 0 ) / 1 7 0 ( 2 5 X 1 0 ) ( 1 U ) = 4 . 7 ml.
M 2 0 T = l X . 4 - ~ ~ . 7 - 4 . 7 = 4 , 5 m l .
2
8 4
Y A 1 2 QUEBI<ADO
29
SUSTRATO SECO : SUS'I'RA'I'O FKESCO : VOLUMEN 1)E 1I2O: VOLUMEN DL.; 1ICL:
'I'AMAÑO DEL T 'JOCULO : H20 PARA AJIIS'I'AR MIJMLDAU :
X=:40 ( O . 5 ) = ? 0 g r . Y=í!u(1+0.[1?)=21 . 7 g r .
f l , C l = 4 0 - 2 1 . 7 = 1 8 . 3 n i J .
I l l ; L = 2 , 4 ( 4 O ) 1 O=!>. 6m1 , T I = 2 0 ( 1 X 1 0 ' ) / ( 1 7 0 ) ( 2 5 x 1 0 ) ( 1 0 ) = 4 . 7 m l .
4 4
SU5TRATO SECU:
SUS'I'RA'I'O FRESCO :
V O L W l t N Dt H 2 0 :
30
SALVADO DE TRIGO
X=40 10.5) =20 gr. b
Y = 2 u ( l + O . u 7 5 ) = 2 1 . S g r .
~ ~ 0 = 4 0 - 2 1 . 5 = 1 8 . 5 ml.
VULUMEN UE HcL: H C L = ~ . S (40) 10-1 O m l .
H 2 0 PllR.4 AJUSTAR HUMEDAD: H 2 0 = 1 8 . 5 - 1 0 - 4 . 7 = 3 . 8 m l .
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. TIEMPO DE HUMEOAO S US TRATO
FERMENTACKlh 50 O h A R R O Z
P. H. LECTURA NOR.
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24 HRS.
48 HRS.
36 HRS. CORRIDA NUMERO I
o HRS. I ! 1
24 HRS.
48 HRS. 36 HRS.
CORRIDA NUMERO 2
O HRS. :.- 1 24 HRS.
48 HRS. 36 HRS.
CORRIDA NUMERO 3
0 HRS.
3.57
5 .50 1 . 1 5 3.02
0.87 2 .SS 0.90
0.1 2
3.3 7
5.50
0.42 3.09 0.84 3.26 0.65
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5 .so o. 85 4.0 I
0.4 5 4.05
0.5 6
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24 MRS. CORRIDA NUMERO 4 36 HRS.
48 HRS. O HRS.
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LCTURA MOD. NlTROGENO So( CONC. A S CfflC.TlROSINA
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82.6 S3 5.9726
I 14.1 65 3.87 I 8 o. I o 6 .8868 o. 200
0.2 I 0.605
0.480
0.2 I o
43.05
O. 504 4 1.418
7.0175 2 0.7 6
3.2 I 6 3 3.391 2 . 1198
I .7438 I 1.65306
2.2633 o. I 3 7 7
0.86 I 0 .06782 0.4 I S2
0 .02836
O. 44 0.35
0.7 7 o. 19
o. S
o. 3
O. 3 0.35
6.820166
O. 7635 1 o. 5058
I , I 2 3 8 5 ,4578
O. IOOS
2.1 6143 0 .004026
47.71 22
24.1 835 4 7 . 7 1 2 9 63.0070
2 8 . I 050 67.3207
4 . 5 7 5 6
O. 684 I
O. I 3 6 4 0
o.toe1 56 0.2101 16 O. 04302
0.954244 1.3464 I
J.bSOl4 I O. 4836 7
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0.077436 0.1 1945
0.0?743 6 0.004
0.042596 0.064326 o. I 40 as 0.01008
0.0020 I
0.002 I 6 3 0.00420 2 O.OOO09 8 5
0.09 I 5 0.86 2 I 0.95 42 0.01 aoe
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TIEMPO DE ZRMEN1M;fOl
SOLIDA
S U S T R A T O T R I G O
24 MRS. 36 HRS.
48 HRS. O HRS.
24 HRS. 36 HRS. 48 HRS.
O HRS.
CORRIDA NUMERO I
CORRIDA NUMERO 2
24 HRS. 36 HRS.
48 HRS. O HRS ,
24 HRS . 36 HRS . 48 HRS. O HRS.
CORRIDA NUMERO 3
CORRIDA NUMERO 4
HUMEDAD tEMPERATUR(I 50 Orb 3 t * C
P. H. LECTURA MOD LECTURA NOR.
3.63
o. I 9 o. 22 5.50 I . 2 4 1.80 3.8 O
o. 85 o. 90 3.8 5 1 .13 I . I 6
3.55
o. I 45 O. I 70 5.50 0.4 I 5 I .375 4.0 3 I .o5 1.375 3.75
O. 64 5 O. 7 5
3.1 2
1.15 1. I50 3.95
0.30 0.830 3.89 1.00 I .I30
5.50 0.3 3 0.450
3.1 5
0.1 o 0.30 5. 50 I .20 0.40 3.95 1 . 1 o 0.90 3.90 0.65 0.6 O
SONC.TIROSINI ___ ~-
117.317 87. 905
I28.67 I 3.735
48.1 7 75.58 2 9.16 0.942 98
12.b735 3 A3962
14.2665 3.2872
35.9482 67.3207 28.1 05091
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C ON C. A S NITROQENO SO
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1.6468 1.2932
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0.24747 O. O 7079
0.2863 0.06574
0.718964 1.3464 I 4 O.a'e2l 0.09 I8
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0.0 19 4 O. I 82478 0.5 I 8 6 0.00043 4 7
0.08625 0.45 I 6 3 4 1.380 I 0.00 I 3 7
0.02788 0.010782 0.28533 0.02886
0.013082 0.02692 8 0.875826 0.0269
TIEMPO M . S U S T R A T O : FERMENT#CK)IY S O Y A
SOLIDA
24 HRS.
48 HRS. 36 HRS.
CORRIDA NUMERO I
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24 HRS.
48 HRS. 36 HRS.
CORRIDA NUMERO 2
O HRS.
24 HRS.
48 HRS. 36 HRS.
CORRIDA NUMERO 3
O HRS.
2 4 HRS. CORRIDA NUMERO 4 36 HRS . . 48 HRS.
O HRS.
I P. H. LECTURA NOR.
4 . 7 5 I . I O 4 .4 3 I . 3 0
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83 .9900 7 I S200 87.bl00 5. 07a0
14.01 4 I 14.2866 14.2666 6. m60 -
61.3 200 59.4160 71.2420 35.9482
TEMPERATlSA 33 .C J l mol Tyr
Gr.. Mat Soca
CONC. A S NlfROG€NOSO
8 7. 905 0.60264 6 72.849 0.0 I 7637
2 1.340 I .o22 80 o 66.807 -
10.5263 24.41 52
1.8798
0.10146 0.9064 I .S502 - I .4b84
3.16 I2 0.2 ? 8 4.2970 0.2 26
0.00314 0.157406 0.200 6 .O630
1
16.34000 1.7464 8.49120 1.18952
24.18360 0.71896 4.57S60 I ,4t404
-. "
HUMEDAD SUSTRATO
ACTIVIDAD PROl
0.2 I O S 0.4883 - 0.016 I 2
0.63224 oass40 1.21260 0.1 3692
0.32680 0.1 6890 0ue367 0.091 50
TIEMPO DE ERMENTlLCOI
-~
24 HRS.
36 HRS. 48 HRS.
O HRS.
24 MRS. 36 MRS. 48 HRS.
O HRS.
24 HRS. 36 HRS. 48 HRS.
O HRS.
24 HRS . '36 HRS. 48HRS.
O HRS.
S U S T R A T O : S O R G O
TEMPERATW I 33oc
1 P.H. ~
3.75 CORRIDA NUMERO I 3.00
5.50
2.93
$
3.92 CORRIDA NUMERO 2
3. I O 3.15
5.50
4.10 C O R R I D A NUMERO 3
2.95 3.70
5 .SO
3.60 C O R R I D A NUMERO 4
5.50 3.1 O
2.90
.ECTURA MOD. ~ ~~
o. I 5
0.35 0.90
o. I o
0.30 0.55 0.80 0.07
O. I6 0.40 0.65 0.08
0.2 5 0.60 0.98 0.0 7
.ECTURA NOR.
0.2 S
0.60 1 . 1
0.1 7
- lL mol litro
CONC.TYK)SMA
6.6929 22.440 65.74 2.7S59
CONC. A 8
0.4960
2.6220 1.0133 0.8 937
0.40 O. 75 I .O o. I5
0.35 0.60 I .20 o. I 5
0.30 0.80 o. 90 o. I5
I 8 .S00 38. I 88 57.87
1 .e685
7.480 26.3 77 46.06
1.1811
14.567 42.126 6 9 .685
0.3937
2.1 S59 10.629
10.629 1.181 I
9.8425 10.629 38.1 88
0.3937
10.62 O
1.1811
ITRWXNO SOLACTlVDAO PROl
o. I 3 0.00992
9.44 88
0.:088 I I 8 0.038266 I S 1.48 0.04624
0.007874
0.'170
0.02362 0.0363 0.2 I258 1.1574 0.21 SS8 0.76370 0.043 I I8
o. I496
0,007874 0.0236 0.76376 0.92 I2 0.21288 0.82154 o. 10685
0.'3 I34 0.84252 0.2 I8 68
0.00787 0.02362
1 CTMRAO PR
TIEMPO OE S U S T R A T O :ERMENTAC SALVADO DE TR IGO
SOLIDA
HUMEDAD 50 orb
P. H.
TEMPERATURl
- ll mol lltro
:ONC.TIROSINA C O N C. A S
2 8 .940
52 .O500 32.84s
52.0500 29.000 63.5800 36.685
13.6075
UITROGENO SU I I I
0.60
I , 35 I . I O
1.15
0.40
0.50 O. 40
0.4 5
0.57880
0.73 376 0.58~000
0.65686
O HRS. CORRIDA NUMERO I
24 HRS. 36 HRS. 4 8 HRS.
0.272 I S 1.27160 1.04100
1.04100
5 .so 4 . 8 5 4 .65 4 .70
CORRIDA NUMERO 2 0.42050 0.964256 o. 5800 O 0
0.733700
O HRS. 24 HRS. 36 HRS. 48 HRSr
O HRS. 24 HRS. 36 HRS. 48 HRS.
5 . 5 0 4 . 6 0 4 . 3 5 4 .40
S . s o 4 . 9 3
4 .51 4 .70
o. 8s 1.20 I .o0 1. I O
O. 75 I .30
0.90 I .o5
2 I .o20 48.2 I 2 8 29.00 2 7 36 A86 O
2 I .o200 63.5800
44.37 O 8 52.050 O
25.1080 40.5288 44.37oa 36.6850
I 7.4400 32.8447
21.3 16734 25,160750
0.502 1779 0.8 I05000 0.8874160 0.7337000
0.348803
0.426300 0.603200
0.5 o 0.6 5 0.4 O
0.50
0.50
0.85
0.6 O 0.70
CORRIDA NUMERO 3 0.420500 I ,27 1600
O. 807400 I e041000
0.60
1.30 0.90
1.10
0.55
0.70 0.55
0.60
2. I02700 44,370800 25. I60750
36,686700
0.497200 1.041 O00
b.8lOSOO
0.087400
O HRS. CORRIDA NUMERO 4 24 HRS. 36 HRS. “4.35
48 HRS.
2 4.860 O
52.0500 40.5990
44.3708 -
0.0 4 2050
0.8874 I6 0.5032 Id 0.73 3734
I
S U S T R A T O : M A 1 2 O U E B R A D O
24 HRS. 36 HRS. 48 HRS. o HRS;
CORRIDA NUMERO I
24 HRB. 36 HRS. 48 nRS.
O HRS.
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24 HRS. 36 HRS. 48 MRS.
O HRS.
CORRIDA NUMERO 2
CORRIDA NUMERO 3
CORRIDA NUMERO 4
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5.5
5.5
5.5
ECTURA NOR. I LECTURA MOO.ICONC.TIROSINA I 0.80 '
I 4.62 b 8 0.2 7 5 0.40 16.5750 0.300 0.4 5 6.8406 0.1 75
0.1 5 3.72 24 0.1 36
umdiyr olr. Motkc0
CONC. A S 80C.KTNI)o PRO1 NITR00ENO
2.9465 O. I 3 6 8
0.06803 I 4 0.292576 2.94 6 5 0.087872 0.33 I56 4.8936 0.058936
0.0744
0.3 5
0.09 o. I 5 0.1 5 0.2 5 0.20 0.225 o. I o
O. 2 70
0.160 o. I 90
0.1 25 O. 250 0.1 50 O.2SO 0. l25
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o. 999 5 8.76 76 4.8936 O. 2 207
2.94667 4.8936 2.0463
0.990 53
6.8406 2.9465
12.681 776 0 .2636 0.01990 2.0465752 0.999532 7
0.0589a O.I?5752
0.0044 0.0044 I43 0.2207 0.0 I e @BO( 0.0978 7
4.50 42 0.090084 0.058 9 0.009532 0.1eoo06 o . o o n 7 2 2.9465732
0.0 04 4 I 0.01 99 0.2207 I
0.0589 0.0S893
1.3 889 0.001 1 78 0.06893 2.9465 0.002766 O. I 3 68 12
NITROGEN0 SOLUBLE EN SORGO
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NITROGEN0 SOLUBLE EN MAIZ QUEBRADO
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FERMENTACION 8
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31
DISCUSION UE RESULTADOS
. - L a .implementación del método Soji sobre tolumnas empacadoras en
e l 1 a b o r a . t o r i o t u e s a t i s f a c t o r i o , d e b i d o a l f á c i l manejo del s istema
e n e l que a pesar de t r a t a r s e de un c u l t l v o s 6 1 i d 0 , l o s m i c r o o r g a n i s - mos tuvieron un buen d e s a r r o l l o .
La evolucidn en l a Froaucción de proteasas 5c idas a n i v e l de l a - borator io sobre d . iversos sustratos amilaceos reDorta escasa informa-
c i ó n s i n embargo l a prclduccidn a c t u a l de proteasas s e l l e v a a cabo -
sobre soya y salvado de t r i g o , e s d e c i r s u s t r a t o s cor. un a l t o c o n t e -
n ido prote ico ; l o que j u s t i i i c a l a mayor producclSn de proteasas, no
a s í en s u s t r a t o s cor; una mayor cantldad de Elmldones como e l a r r o z , -
y e l s o r g o , que los hace adecuados en l a produccio'n de ami lasas .
E l t r i g o posee un mayor contenido proteico que el arroz y e l s o r - g o , pero no a s í con e l Salvad0 de t r l g o y l a s o y a , dando p o r r e s u l t a -
do upa produccl6n de prote5sas 5cidas intermedia.
32
En estudios que deban realizarse posteriormente ser5 posible
determinar el tiempo óptimo de producci6n en sustratos tales como
el salvado de trigo y la soya y seleccionar el sustrato adecuado-
y su tiempo optimo de producci6n de proteasas’áciaas.
3 3
. CONCLUSIONES :
1 . - Es p o s i b l e l a r e a l i z a c i ó n d e l m4todo K o j i sobre columnas empacadas b
c? nive l de laborator io .
2.- E l salvado de t r i g o e s e l s u s t r a t o con e l que se obtlene una mayor
producción de proteSSas Scidas, d. i f lere en 0 . 4 3 unldades con res . - -
p e c t o a l t r i g o er? promedio a l a s 4 8 Hrs. , dicnos resultados sugie- i
ren tomar en cuenta diversos factores, dentro de l o s c u a l e s e l f a c - tor cos to en condiciones diferentes sera determinante en su s e l e c -
c ión.
3 . - Los sustratos sorgo, y arroz p o r su mayor contenido de almidones - r e s u l t a r í a n a d i f e r e n c i a de l o s demás mejores en l a producción de-
a lmi lásas , que en l a producción de proteásas ácidas.
-.
34
. REFERENCIAS :
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