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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
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Tesis Doctoral
Glicómica: la espectrometría deGlicómica: la espectrometría demasa UV-Maldi-Tof comomasa UV-Maldi-Tof como
herramienta en la determinación deherramienta en la determinación dela vía biosintética de esfingolípidosla vía biosintética de esfingolípidos
de hemoparásitosde hemoparásitos
Landoni, Malena
2010
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:
Landoni, Malena. (2010). Glicómica: la espectrometría de masa UV-Maldi-Tof comoherramienta en la determinación de la vía biosintética de esfingolípidos de hemoparásitos.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Cita tipo Chicago:
Landoni, Malena. "Glicómica: la espectrometría de masa UV-Maldi-Tof como herramienta en ladeterminación de la vía biosintética de esfingolípidos de hemoparásitos". Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2010.
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA
GLICÓMICA: LA ESPECTROMETR ÍA DE MASA UV-MALDI -
TOF COMO HERRAMIENTA EN LA DETERMINACIÓN DE LA
VÍA BIOSINTÉTICA DE ESFINGOLÍPIDOS DE
HEMOPARÁSITOS.
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires
en el área Química Orgánica.
Malena Landoni
Director de Tesis: Dra. Alicia S. Couto. Consejero de Estudios: Dra Alicia S. Couto. Lugar de trabajo: CIHIDECAR, Dp to. Química Orgánica, FCEyN, UBA. Buenos Aires, 2010.
A Salvador, mi gran amor, por compartir todo conmigo por su ayuda invalorable A Felipe, mi pequeño gran amor que llegó a tiempo
para compartir este momento
A mis padres, Julia y Osvaldo, por el apoyo incondicional en todo
la ayuda y el amor que me dan día a día por todo lo que me enseñaron A mi hermano, Kelo, por ser como es por su apoyo, a su manera
A la Dra. Couto, por enseñarme y ayudarme durante todos
estos años, por compartir conmigo todos sus conocimientos y experiencia, por hacerme sentir como en casa.
AGRADECIMIENTOS A las Instituciones y personas que durante estos años posibilitaron y contribuyeron a la realización del presente trabajo de tesis: Al CONICET y a la Agencia Nacional de Ciencia y Tecnología por las becas otorgadas para la realización de este trabajo. Al Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires donde se desarrolló el presente trabajo. A la Dra. Alicia Couto por su gran afecto, todas sus enseñanzas invalorables y los momentos compartidos. A la Dra. Vilma Duschak por su ayuda y gran colaboración y por su afecto. A la Dra. Rosa Erra-Balsells por su afecto. Por compartir su gran experiencia. Al grupo de trabajo del Dr. Nonami, de la Universidad de Ehime, Japón, por su especial colaboración en la realización de los espectros UV-MALDI de los esfingolípidos ácidos. Al Instituto Dr. Mario Fatala-Chaben por los cultivos de Trypanosoma cruzi. Al Dr. Alejandro Katzin y colaboradores de la Universidad de San Pablo, Brasil, por los cultivos de Plasmodium falciparum. Al Departamento de Química Biológica de la FCEyN, por el equipamiento prestado. A los Drs. Marks y Pagano de la Mayo Clinic Foundation, Rochester, U.S.A., por los anticuerpos anti-GCS humana gentilmente cedidos. A todos los profesores, auxiliares y no docentes del Departamento de Química Orgánica de la FCEyN por su cordialidad permanente. A mis compañeras de laboratorio: Mariana, Adriana, Tamara y Juliana. Por compartir alegremente el trabajo cotidiano. Por el compañerismo y la amistad que continúa. Por esas pequeñas ayudas en el momento justo. A mis compañeros del Dpto. de Química Orgánica por los momentos compartidos, especialmente a Ma. Florencia, Teresa, Marianela, Gastón, Laura y Lucia por la tan agradable convivencia diaria. A Diana, Luciana y Maximiliano, por la ayuda con los parásitos y los pequeños prestamos. A Carlos Lima por prestarme siempre las cubetas para el espectrofotómetro.
A mi familia, Mamá, Papá y Kelo, por apoyarme siempre en todos mis emprendimientos. A Salvador por formar parte de mi vida y ayudarme en todo momento. A Felipe por alegrarme la vida con su llegada. A mis suegros, cuñados, sobrinos y Abuelita, por su cariño. A mis amigos de siempre que siguen estando.
Indice
2
INDICE
Resúmen / Abstract 7
Abreviaturas 9
Introducción 11
1. Malaria y Plasmodium falciparum. 11
1.1. Malaria, la enfermedad. 11
1.2. El vector. 12
1.3. El agente etiológico. 14
1.3.1. Ciclo de vida de Plasmodium falciparum. 15
1.3.2. Morfología y estructura de las formas intraeritrocíticas. 17
1.4. La malaria en el mundo. 22
1.5. El problema de la malaria en la actualidad. 24
2. Esfingolípidos. 26
2.1. Esfingolípidos en mamíferos. 26
2.1.1. Metabolismo de los esfingolípidos. 28
2.1.2. Esfingolípidos biológicamente activos. 34
2.2. Esfingolípidos en parásitos. 37
2.2.1. Plasmodium falciparum. 37
2.2.2. Toxoplasma gondii. 41
2.2.3. Leishmania spp. 43
2.2.4. Trypanosoma brucei. 45
2.2.5. Trypanosoma cruzi. 47
3. Herramientas para el estudio de esfingolípidos. 50
3.1. Análogos de esfingolípidos. 50
3.2. Análogos fluorescentes. 51
Indice
3
Resultados y Discusión 57
1. Biosíntesis de esfingolípidos en Plasmodium falciparum. 57
Objetivos. 57
1.1. Glicoesfingolípidos neutros. 58
1.1.1. Efecto del tamoxifeno en la biosíntesis de glicoesfingolípidos
neutros.
67
1.2. Glicoesfingolípidos ácidos. 70
1.2.1. Efecto del DL-t-PPMP en la biosíntesis de glicoesfingolípidos
ácidos.
79
2. Biosíntesis de esfingolípidos en Trypanosoma cruzi. 84
Objetivos. 84
2.1. Biosíntesis de glicoesfingolípidos neutros. Efecto de diferentes
inhibidores.
85
3. Caracterización de la GlucosilCeramida Sintasa (GCS) de Plasmodium
falciparum.
92
Objetivos. 92
3.1. Purificación de la GCS de Plasmodium falciparum. 93
3.1.1. Inmunopurificación de la GCS de Plasmodium falciparum. 94
3.1.2. Purificación de la GCS de Plasmodium falciparum por afinidad a
colorantes.
98
3.2. Localización subcelular de la GCS de Plasmodium falciparum. 101
4. Caracterización de la GlucosilCeramida Sintasa (GCS) de
Trypanosoma cruzi.
106
Objetivos. 106
4.1. Determinación de la presencia de una GCS activa en Trypanosoma cruzi. 107
4.2. Caracterización de otros productos de la reacción in vitro. 112
4.3. Purificación de la GCS de Trypanosoma cruzi. 115
4.4. Localización subcelular de la GCS de Trypanosoma cruzi. 119
Indice
4
5. Actividad de Glucosilceramida Sintasa en otros parásitos. 121
Objetivos. 121
5. Actividad de GlucosilCeramida Sintasa en otros parásitos. 122
6. Análisis de esfingolípidos por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF.
124
Objetivos. 124
6. Análisis de esfingolípidos por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF. 125
7. Sintesis de conjugados proteína – hidratos de carbono.
134
Objetivos. 134
7. Sintesis de conjugados proteína – hidratos de carbono. 134
7.1. Preparación de conjugados proteína – hidratos de carbono. 135
7.2. Caracterización de oligosacáridos provenientes de la degradación de
heparina.
144
Materiales y Métodos 160
Reactivos y equipamiento utilizado. 160
Cultivo de Plasmodium falciparum. 161
Purificación de los diferentes estadios intraeritrocíticos. 161
Preparación de los complejos NBD-DHCeramida, NBD-Ceramida y NBD-
esfingomielina con seroalbúmina bovina.
161
Incorporaciones metabólicas en los estadios intraeritrocíticos de Plasmodium
falciparum.
162
Incorporación de sustratos fluorescentes 162
Incorporaciones de precursores radioactivos 162
Ensayos con inhibidores en cultivos de Plasmodium falciparum 163
Determinación de la IC50 del tamoxifeno en cultivos de Plasmodium falciparum 163
Cultivo de epimastigotes de Trypanosoma cruzi, cepas Tulahuen 2 y CL Brener 164
Incorporaciones metabólicas en epimastigotes de Trypanosoma cruzi 164
Ensayos con inhibidores en cultivos de Trypanosoma cruzi 164
Indice
5
Extracción y purificación de los esfingolípidos marcados 165
Extracción de los lípidos 165
Cromatografía de intercambio aniónico 165
Saponificación 166
Ensayo de actividad de la glucosilceramida sintasa (GCS) 166
Cromatografía en capa delgada 166
Cromatografía en capa delgada en fase reversa 167
Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) 167
Síntesis de N-(NBD-aminocaproil)esfinganina--D-galactosil (NBD-DHGalCer) y
N-(NBD-aminocaproil)esfinganina--D-glucosil (NBD-DHGlcCer)
168
Síntesis de N-(NBD-aminocaproil)esfingosina--D-galactosil-3-sulfato(NBD-
Sulfátido)
168
Inmunofluorescencia indirecta 169
Microscopia electrónica 169
Fraccionamiento subcelular de Trypanosoma cruzi 170
Purificación de inmunoglobulinas G presentes en un suero de conejo anti-GCS-
humana
171
Acoplamiento de las inmunoglobulinas G purificadas a Sepharosa 4B activada con
bromocianógeno
171
Inmunopurificación de la GCS de Plasmodium falciparum 172
Purificación de la GCS de Plasmodium falciparum por afinidad a colorantes 172
Purificación de la GCS de Trypanosoma cruzi 174
Obtención de una fracción enriquecida en membrana 174
Precipitación con sulfato de amonio 174
Ultracentrifugación 174
Cromatografía de afinidad a colorantes 175
Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) 176
Revelado con Nitrato de Plata 176
Ensayos de transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa y reacción con
antisueros (Western Blot)
177
Cuantificación de proteínas 178
Método de Bradford 178
Método de Lowry 178
Indice
6
Degradación de heparina con ácido nítrico 179
Cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detector de pulso
amperométrico (HPAEC-PAD, sistema DIONEX)
179
Síntesis de 1-aminomaltosa 179
Reacción de acople de hidratos de carbono a proteínas 180
Espectrometría de masa UV-MALDI-TOF 181
Equipo utilizado 181
Calibración 181
Matrices utilizadas 181
Preparación de la muestra 182
Conclusiones 184
Trabajos publicados 188
Referencias
189
Resumen
7
GLICÓMICA: LA ESPECTROMETRÍA DE MASA UV-MALDI -TOF COMO HERRAMIENTA EN LA DETERMINACIÓN DE LA VÍA BIOSINTÉTICA DE
ESFINGOLÍPIDOS DE HEMOPARÁSITOS.
Un estudio de “glicómica” sobre un sistema biológico en particular, intenta
determinar los hidratos de carbono que una célula u organismo en particular es capaz de sintetizar bajo condiciones fisiológicas específicas. Este tipo de estudio por lo tanto, refleja el perfil de expresión de genes que codifican glicosiltransferasas, glicosidasas y otros componentes dentro de un camino biosintético. La glicómica es un nuevo campo de investigación que permitirá determinar nuevos blancos para diseñar drogas que tendrán un impacto sobre problemas relevantes. La inherente complejidad de los hidratos de carbono exige la utilización de un gran número de técnicas para ese fin. En los últimos años, la espectrometría de masa de alta resolución UV-MALDI-TOF ha sido una de las herramientas más útiles.
El presente trabajo presenta un estudio glicómico en la vía biosintética de
glicoesfingolípidos de Plasmodium falciparum y Trypanosoma cruzi. Además de la caracterización estructural de los productos de dicha vía, se ha aislado y caracterizado la UDP-glucosa:ceramida glucosiltransferasa, enzima clave de este camino biosintético de ambos hemoparásitos y posible blanco quimioterapéutico.
Por otra parte el presente trabajo ha contribuido con el desarrollo de dos
metodologías de análisis por espectrometría de masa que trascienden el campo de la química de parásitos:
1- La utilización de esfingolípidos unidos covalentemente a un grupo fluorescente donde el mismo actúa como fotosensibilizador permitiendo el análisis directo por EM.
2- Siendo conocido que los hidratos de carbono pueden ser responsables de la antigenicidad de un glicoconjugado, se llevó a cabo la síntesis de diferentes conjugados carbohidrato-proteína y su caracterización por EM como herramienta para su utilización en ensayos biológicos.
Palabras claves: Glicómica, Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi,
Esfingolípidos, Glucosilceramida sintasa.
8
GLICOMICS: UV-MALDI-TOF MASS SP ECTROMETRY AS TOOL FOR THE DETERMINATION OF SPHINGOLIPIDS BIOSYNTHETIC PATHWAY IN
HEMOPARASITS.
A “Glycomic” study on a particular biological system, attempts to identify the carbohydrate in a particular cell or organism is able to produce under specific physiological conditions. This type of study therefore reflects the expression profile of genes that encode glycosyltransferases, glycosidases and other components in the biosynthetic pathway. The Glycomics is a new field of research that will identify new targets for designing drugs that may have an impact on relevant issues. The inherent complexity of the carbohydrate requires the use of a large number of techniques for this purpose. In recent years, high-resolution mass spectrometry, UV-MALDI-TOF has been one of the most useful tools. In this work we present a glycomic study on the biosynthetic pathway of glycosphingolipids of Plasmodium falciparum and Trypanosoma cruzi. In addition to the structural characterization of the products of this pathway, the UDP-glucose: ceramide glucosyltransferase has been isolated and characterized. This key enzyme of the biosynthetic pathway of both parasites arises as a putative chemotherapeutic target. Moreover this work has contributed to the development of two methods of analysis by mass spectrometry that exceeds the chemistry of parasites:
1 - The use of sphingolipids covalently bound to a fluorescent tag which acts as photosensitizer allowing direct analysis by MS.
2 - Being known that carbohydrates may be responsible for the antigenicity of a glycoconjugate, the synthesis of different carbohydrate-protein conjugates and their characterization by MS was carried out as a tool for use in biological assays
Key words: Glycomics, Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi, Sphingolipids,
Glucosylceramide synthase
Abreviaturas
9
ABREVIATURAS 3KSR 3-cetoesfinganina reductasa ADN ácido desoxirribonucleico AnhManOH anhidromanitol APMSF fluoruro de 4-amidinofenil-metansulfonilo -NAD -nicotinamida BODIPY 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diazo-s-indaceno BSA seroalbúmina bovina CCD Cromatografía en capa delgada Cdasa ceramidasa Cer ceramida CerS ceramida sintasa CGalT galactosilceramida sintasa CHCA ácido -ciano-4-hidroxicinámico CK ceramida kinasa CoA Coenzima A CPP ceramida-1-fosfato fosfatasa Da dalton DAG diacilglicerol DAPI 4',6-diamidino-2-fenilindol DDT 1,1,1-Tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)-etano (Dicloro Difenil
Tricloroetano), DEAE dietilaminoetil DHB ácido 2,4-dihidroxibenzoico DHCD dihidroceramida desaturasa DHCer dihidroceramida DHCerS dihidroceramida sintasa DHGlcCer glucosildihidroceramida DHHexosilcermidas hexosildihidroceramidas DMSO dimetilsulfóxido DTT ditiotreitol EM Espectrometría de masa GA ácido gentísico GalCer galactosilceramida GalCer-SO4 sulfogalactosilceramida GCS glucosilceramida sintasa GlcCer glucosilceramida GlcNAc N-acetil-D-glucosamina GlcNS N-sulfo-D-glucosamina GSL glicoesfingolípidos HPAEC-PAD Cromatografía de alta resolución de intercambio aniónico con detector de pulso amperométrico HPLC Cromatografía líquida de alta resolución IgG inmunoglubulina G IPC inositolfosfoceramida longitud de onda LacCer lactosilceramida LDI laser desorption/ionization (desorción/ionización laser)
Abreviaturas
10
MALDI matriz-assisted laser desorption/ionization (desorción/ionización laser asistida por matriz) mb membrana min. minutos NBD nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol nHo nor-Harmano NP-40 Nonidet P-40 PC fosfatidilcolina PI fosfatidilinositol PM peso molecular PNGasa F péptido: N-glicosidasa F Ppdo precipitado PPMP DL-threo-1-fenil-2-palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol rpm revoluciones por minuto S1P esfingosina-1-fosfato SDS-PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio SK esfingosina kinasa SM esfingomielina Smasa esfingomielinasa SMS esfingomielina sintasa Sn sobrenadante So esfingosina SPP esfingosina-1-fosfato fosfatasa SPT serin-palmitoil transferasa SSI esfingomielina sintasa insensible SSS esfingomielina sintasa sensible TAME N--p-tosil-L-argininmetil éster TBS Tris-buffer salino TFA ácido trifluoroacético THAP 2,4,6-trihidroxiacetofenona TOF time of flight (tiempo de vuelo) Tris 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol UDP-Galactosa uridina difosfogalactosa UDP-Glucosa uridina difosfoglucosa UV ultravioleta v volumen
Introducción
Introducción
11
1. Malaria y Plasmodium falciparum.
1.1. Malaria, la enfermedad.
La malaria es una de las enfermedades parasitarias más importantes en el mundo y
su historia se extiende hasta la antigüedad. Actualmente se acepta que la malaria surgió
en nuestros ancestros primates en África y ha evolucionado junto con el hombre,
dispersándose con las migraciones humanas dentro de las zonas tropicales y
subtropicales del Viejo Mundo y luego al Nuevo Mundo a través de misioneros,
exploradores y esclavos (Cox, 2002).
Las fiebres periódicas, características de la malaria, están registradas desde el
comienzo de la civilización con escritos Chinos del año 2700 a.C. y a través de escritos
Griegos, Romanos, Indios, Árabes y Europeos hasta el siglo XIX. Los primeros detalles
de los síntomas de la enfermedad son los mencionados por Hipócrates en el siglo V a.C.
A partir de ahí se encuentran numerosas referencias de la enfermedad en Grecia e Italia
y en todo el Imperio Romano. Durante este período se asocia la enfermedad a los
pantanos de donde deriva el nombre de la enfermedad (del Italiano “mala aria” que
significa “aire malo”) (Tuteja, 2007).
Sin embargo, el conocimiento de la malaria como enfermedad producida por un
organismo patógeno no comenzó hasta finales del siglo XIX. Luego del establecimiento
de la teoría de los gérmenes y el nacimiento de la microbiología, cuando se volvió
necesario descubrir la causa de la enfermedad que estaba amenazando a gran parte de
Europa.
El parásito responsable de la enfermedad fue visto por primera vez en 1880 por el
cirujano francés Alphonse Laveran. Posteriormente, en 1897, Ronald Ross, observó la
presencia del parásito en el mosquito anophelino, determinando que el mosquito
actuaba como vector de la enfermedad. Un año mas tarde se publicaba el ciclo de vida
del Plasmodium falciparum en el mosquito. Sin embargo, fue recién 50 años después
que se comenzó a elucidar el ciclo de vida del parásito dentro de hospedador vertebrado
(Harrison, 1978).
La malaria puede causar una gran variedad de síntomas, que pueden ir desde
síntomas muy leves a complicaciones serias de la enfermedad e incluso la muerte
(www.cdc.gov ).
Introducción
12
Luego de la picadura del mosquito, existe un período de incubación hasta que
aparecen los primeros síntomas. Este período puede ir de 7 a 30 días y depende de la
especie del parásito. Los síntomas que se manifiestan en los casos de la malaria sin
complicaciones son: fiebre en períodos cíclicos de 48 o 72 horas, acompañada de dolor
de cabeza, nauseas, vómitos y un malestar general.
La malaria severa ocurre cuando las infecciones debidas a Plasmodium falciparum
se complican por fallas serias en algún órgano o por anormalidades en el metabolismo
sanguíneo del paciente. Las manifestaciones de la malaria severa incluyen:
Malaria cerebral, comportamiento anormal, pérdida de conciencia, coma u
otras complicaciones neurológicas.
Anemia severa debida a la hemólisis (destrucción de los glóbulos rojos).
Hemoglobinuria (hemoglobina en sangre) debida a la hemólisis.
Edema pulmonar (fluido en los pulmones) o síndrome agudo respiratorio,
que puede manifestarse incluso después de que haya bajado el número de
parásitos en respuesta al tratamiento.
Problemas en la coagulación y trombocitopenia (disminución en las
plaquetas).
Colapso cardiovascular y shock.
Otras manifestaciones que pueden observarse son: la falla renal aguda,
hiperparasitemia (cuando más del 5% de los glóbulos rojos están infectados con
parásitos), acidosis metabólica (un exceso de acidez en la sangre y los fluidos tisulares)
e hipoglucemia (baja cantidad de glucosa en sangre).
La malaria severa ocurre más frecuentemente en personas que no tienen una
respuesta inmunológica a la malaria o en aquellas cuya inmunidad adquirida ha
disminuido fuertemente. Por lo tanto los grupos de mayor riesgo son las personas que
no residen en zonas donde la malaria es endémica y los niños pequeños y mujeres
embarazadas que habitan en zonas de alta transmisión de la enfermedad (Suh et al,
2004).
La malaria severa es una enfermedad seria que puede terminar en la muerte del
paciente y en consecuencia debe ser tratada urgentemente y de forma agresiva.
Introducción
13
1.2. El vector.
La malaria es transmitida a través de la picadura del mosquito del Género
Anopheles. Existen aproximadamente 400 especies de Anopheles alrededor del mundo,
siendo cerca de 60 las que actúan como vectores de la malaria en condiciones naturales
y 30 de las mismas son las de mayor importancia (Tuteja, 2007).
La transmisión de la enfermedad ocurre a través de la picadura de la hembra del
mosquito, la cual requiere la sangre para la correcta producción de sus huevos.
Como todos los mosquitos, los anophelinos atraviesan cuatro etapas durante su
ciclo de vida, huevo, larva, pupa y adulto. Las tres primeras etapas transcurren en el
agua y duran entre 5 y 14 días dependiendo de las especies y las temperaturas del
medioambiente, y se desarrollan en un amplio rango de hábitats prefiriendo cursos de
agua limpia y sin contaminación. Es en la etapa adulta cuando la hembra actúa como
vector de la malaria. Las hembras adultas pueden vivir hasta un mes en cautiverio pero
probablemente no vivan más de 1 o 2 semanas en la naturaleza.
El conocimiento de la biología y el comportamiento de los mosquitos Anopheles
puede ayudar a entender como la malaria se transmite y puede ser importante para el
diseño de estrategias de control apropiadas. Los factores que afectan la habilidad del
mosquito para transmitir la malaria incluyen la susceptibilidad innata a Plasmodium
spp., su fuente alimentaria y su longevidad.
No todas las especies de Anopheles se alimentan del hombre, existen algunas que
solo lo hacen de animales y otras que se alimentan de ambos. Las principales especies
de Anopheles que se encuentran en África, An. gambiae y An. funestus, se alimentan
casi exclusivamente del hombre lo que las hace vectores muy eficientes (Beier, 1998).
La longevidad del mosquito es importante para su acción como vector ya que una
vez que el parásito es ingerido por el mosquito, el mismo debe atravesar las diferentes
etapas hasta alcanzar la forma que es infecciosa para el hombre. El tiempo requerido
para el desarrollo del parásito en el hospedador invertebrado es de 10 a 21 días
dependiendo de la especie de Plasmodium y de la temperatura. Si el mosquito no vive
un tiempo mayor al tiempo requerido para la incubación, el mismo no será capaz de
transmitir la enfermedad (Aguilar et al, 2005; Boete, 2005).
Introducción
14
1.3. El agente etiológico.
El agente etiológico que causa la malaria es un parásito que pertenece al Phylum
Apicomplexa, Orden Eucoccidia, Familia Plasmodidae, Género Plasmodium. Solo 4
de las más de 100 especies de Plasmodium infectan al humano, Plasmodium
falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale y Plasmodium malariae, siendo la
primera la más letal.
Plasmodium falciparum: esta especie se encuentra en todo el mundo en zonas
tropicales y subtropicales. La enfermedad causada por esta especie se caracteriza por
presentar ciclos de fiebre alta a intervalos de 36 - 48 horas. Es la única especie capaz de
causar la malaria severa, potencialmente fatal y es en consecuencia la responsable de
todas las muertes (World Malaria Report, 2008). Es la especie predominante en África.
Plasmodium falciparum causa malaria severa debido a su habilidad de multiplicarse
rápidamente en la sangre causando una fuerte anemia por la lisis de los glóbulos rojos.
Además, los glóbulos rojos infectados pueden obstruir pequeños vasos sanguíneos
evitando la normal irrigación sanguínea de los tejidos y órganos. Cuando esto ocurre en
el cerebro, se denomina malaria cerebral, la cual es una complicación de la enfermedad
que puede llegar a ser fatal.
Plasmodium vivax: esta especie se encuentra principalmente en Asia, América
Latina y en algunas regiones de África. En este caso la fiebre producida se manifiesta
cada 48 horas. Mientras que P. vivax solo ocasionalmente causa la muerte (debido a la
ruptura del bazo por esplenomegalia), puede causar síntomas que son incapacitantes.
Por lo tanto, P. vivax contribuye al problema de la malaria generando un impacto social
y económico (al igual que P. ovale). Esta especie presenta estadios latentes en el hígado
(“hipnozoítos”) que pueden activarse e invadir la sangre (“recaída”) varios meses o
incluso años después de la picadura del mosquito infectado.
Las otras dos especies son considerablemente menos abundantes:
Plasmodium ovale: se encuentra principalmente en África (especialmente en el
oeste del continente) y en las islas del oeste del Pacífico. Es biológica y
morfológicamente muy similar a P. vivax. En este caso también la fiebre alta se
manifiesta cada 48 horas.
Plasmodium malariae: se encuentra en todo el mundo. Es la única especie que
infecta al hombre que tiene un ciclo de 72 horas. P. malariae causa una infección
crónica de larga duración que en algunos casos puede durar toda la vida del paciente. En
Introducción
15
algunos individuos, P. malariae puede causar complicaciones serias como el síndrome
nefrótico (Muller et al, 2007).
1.3.1. Ciclo de vida de Plasmodium falciparum.
El ciclo de vida del parásito Plasmodium falciparum presenta dos fases cada una
en un huésped diferente (Fig. 1.) (Bannister and Mitchell, 2003; Khan and Waters,
2004).
-Ciclo en el hospedador vertebrado: en esta fase del ciclo de vida del parásito ocurre
su reproducción asexuada. Este ciclo puede dividirse en la fase hepática y el ciclo
intraeritrocítico.
Al picar al hombre, el mosquito infectado inyecta una pequeña cantidad de
saliva que actúa como anestésico y anticoagulante, la cual contiene los esporozoítos.
Los esporozoítos entran de esta manera al torrente sanguíneo y luego de 15 a 45
minutos alcanzan el hígado e invaden las células hepáticas.
Una vez dentro del hepatocito, los esporozoítos se transforman en criptozoítos
de forma redondeada donde comienza la fase hepática siendo muy difícil la detección
del parásito durante esta etapa. Luego los criptozoítos se dividen dando lugar a los
esquizontes hepáticos. Este proceso de división celular no sexual tiene una duración de
seis días.
Los esquizontes hepáticos causan la lisis del hepatocito y la consiguiente
liberación de merozoítos directamente en los vasos sanguíneos del hígado. Muchos de
los merozoítos liberados son fagocitados y destruidos por las células de Kupffer pero los
que sobreviven invaden los glóbulos rojos de la sangre dando comienzo al ciclo
intraeritrocítico.
Los merozoítos que invaden los glóbulos rojos comienzan su desarrollo pasando
por los diferentes estadios intraeritrocíticos: anillos o trofozoítos jóvenes, trofozoítos
maduros y esquizontes. Con la ruptura de los esquizontes se liberan nuevos merozoítos
al torrente sanguíneo que infectarán nuevos glóbulos rojos dando continuidad al ciclo.
Como existe una excelente sincronización en el desarrollo de los parásitos, la lisis de los
eritrocitos infectados con la consecuente liberación de los merozoítos al torrente
sanguíneo, ocurre simultáneamente, dando lugar a una alta concentración de parásitos
Introducción
16
Invasión de los hepatocitos por los esporozoítos
Crecimiento de los trofozoítos hepáticos
Multi plicación
Formación de los merozoítos
Liberación de los merozoítos
ESTADÍOS HEPÁTICOS
MacrogametaMicro gameta
Formación del zigoto El oocineto penetra
en la pared celular
Desarrollo del oocisto
Liberación de los esporozoítos
Los esporozoítos invaden las glándulas
salivales
Infección del hombre por los esporozoítos
MOSQUITO
ESTADÍOS SEXUALES
HO
MB
RE
Figura 1. Ciclo de vida de Plasmodium falciparum en el hospedador vertebrado (hombre) e invertebrado (mosquito). (Adaptado de Bannister and Mitchell, 2003).
Invasión
CICLO INTRA-ERITROCÍTICO
Anillo
Trofozoíto
Esquizonte
Merozoítos
Liberación de
merozoítos
Macrogametocito
Microgametocito
Flagelación
ESTADÍOS SEXUALES
Introducción
17
libres en la sangre que se manifiesta por un período de fiebre alta en el hospedador.
Estos ciclos son extremadamente regulares con una duración de 48 horas.
Después de un tiempo y por factores todavía desconocidos, la forma anillo
diferencia a gametocito (masculino o femenino). Los gametocitos no sufren ninguna
división posterior y se encuentran en la sangre periférica siendo su vida media de
aproximadamente 60 días.
-Ciclo en el hospedador invertebrado: mientras que el mosquito macho solo se
alimenta de néctar y savia vegetal, las hembras necesitan sangre en su alimentación para
la maduración de sus huevos.
Cuando una hembra del mosquito Anopheles ingiere sangre de una persona
infectada que contiene las formas sexuales del parásito, gametocitos femeninos y
masculinos, se inicia la fase sexual dentro del tracto digestivo del mosquito. Las
gametas femeninas y masculinas se diferencian en macrogameta y microgameta
respectivamente, y luego de la fecundación de la macrogameta por la microgameta
ocurre la formación del zigoto u oocineto, pocos minutos después de la ingesta de la
sangre. El zigoto es la única forma diploide del ciclo de vida del parásito. El zigoto
migra a la pared del estómago del mosquito donde se aloja entre las células y la
membrana basal del epitelio. El oocineto se transforma en oocisto que queda
encapsulado y se multiplica en forma asexual dando lugar a numerosos esporozoítos.
Finalmente, los esporozoítos se liberan y migran a las glándulas salivares del mosquito,
los cuales serán inoculados en el huésped vertebrado.
La existencia de la reproducción sexual del parásito posibilita la recombinación
génica y con ello el surgimiento de nuevas cepas resistentes a las diferentes drogas que
se utilizan para el tratamiento de la enfermedad.
1.3.2. Morfología y estructura de las formas intraeritrocíticas.
El ciclo intraeritrocítico de Plasmodium falciparum tiene una duración de 48 horas
y durante el mismo se produce la reproducción asexuada del parásito. Comienza con la
invasión de un glóbulo rojo por un merozoíto, el cual evoluciona a la forma anillo al
Introducción
18
cabo de 30 minutos. Luego de 26 horas de la invasión el parásito se transforma en
trofozoíto maduro y finalmente en esquizonte (38 horas). A las 48 horas se produce la
lisis del glóbulo rojo liberándose una gran cantidad de merozoítos al torrente sanguíneo
que infectarán nuevas células para dar continuidad al ciclo (Bannister el al, 2000).
Merozoíto (Fig. 2, A)
El merozoíto tiene una forma ovoide con una longitud de 1,6 mm. En su extremo
anterior se encuentra el complejo apical que esta formado por las roptrias, micronemas y
gránulos densos. Este complejo apical es el responsable del proceso de invasión.
Los merozoítos entran a los glóbulos rojos a través de un complejo mecanismo de
invasión, el cual puede dividirse en cuatro etapas: (a) reconocimiento inicial y
acoplamiento reversible del merozoíto a la superficie del glóbulo rojo (Butcher et al,
1979); (b) reorientación y acoplamiento irreversible entre el extremo apical del parásito
y el eritrocito, y la posterior secretación de sustancias por las roptrias y micronema que
llevan a la formación de la vacuola parasitófora (Murphy et al, 2007); (c) invaginación
de la membrana del eritrocito alrededor del merozoíto acompañado de la perdida de
cubierta del mismo; y (d) sellado de la vacuola parasitófora y de la membrana del
eritrocito luego de que se completo la invasión por el merozoíto (Ward et al, 1993;
Miller et al, 1994).
La superficie del merozoíto esta recubierta por un envoltorio formado
principalmente por glicoproteínas lo que lo hace altamente inmunogénico. Presenta una
membrana plasmática simple recubriendo otra doble membrana interna.
En el interior del merozoíto existen microtúbulos que van de un polo al otro de la
célula. En el citoplasma están presentes varios ribosomas, el núcleo, una mitocondria
grande y un plástido no fotosintético llamado apicoplasto. Esta organela se encuentra
íntimamente asociada con la mitocondria y en los estadios posteriores desempeña un
papel muy importante en la biología del parásito, dado que en la misma ocurren diversas
vías metabólicas como la biosíntesis de ácidos grasos, de isoprenoides y del hemo
(Stuart et al, 2004). La mitocondria presente en el parásito no es una mitocondria típica
y parece no estar involucrada en la síntesis de ATP. La principal fuente de energía del
parásito es la glicólisis y la vía de las pentosas.
Introducción
19
Anillo (Fig. 2, B)
Luego de la invasión, las organelas del complejo apical desaparecen al igual que
los microtúbulos. Se comienza a desarrollar el citostoma que será el responsable de la
fagocitosis en las etapas siguientes. Al mismo tiempo, cerca del núcleo se empieza a
formar el retículo endoplásmico liso y rugoso. También se detecta la formación de un
complejo de Golgi no tradicional que se denomina estructura tipo Golgi. La
mitocondria y el apicoplasto se encuentran siempre unidos entre si por sus extremos.
A medida que el parásito crece, la vacuola parasitófora se ve aumentada en
tamaño y comienzan a formarse unas proyecciones de la membrana de la vacuola que se
extienden hasta la membrana del eritrocito formándose una red tubovesicular de
membranas (Elmendorf and Haldar, 1994; Tamez et al, 2008).
La forma del parásito va cambiando haciéndose más redondeada e irregular.
Trofozoíto (Fig. 2, C)
La distinción morfológica entre los estadios anillo y trofozoíto se basa
principalmente en el tamaño y forma celular más que en diferencias internas
fundamentales.
El crecimiento de los trofozoítos va acompañado de un mayor metabolismo que
incluye: la glicólisis de una gran cantidad de glucosa importada, la ingestión del
citoplasma de la célula hospedera y la proteolisis de la hemoglobina en sus aminoácidos
esenciales. El parásito no es capaz de degradar el hemo producido, el cual es tóxico para
el parásito. De esta forma, durante la degradación de la hemoglobina, la mayoría del
hemo liberado es polimerizado formando la hemozoína (pigmento malárico), una
sustancia cristalina que es almacenada en la vacuola digestiva.
El número de ribosomas libres aumenta ampliamente y el retículo endoplásmico
se agranda, dos cambios que marcan el aumento en la síntesis de proteínas. Asimismo
se observa una más compleja estructura del complejo tipo-Golgi. La mitocondria y el
apicoplasto, que continúan unidos, muestran también un gran crecimiento. El
apicoplasto muestra una enrevesada estructura de membranas y se pone en contacto con
la vacuola digestiva y otras organelas. Esta aproximación indica posibles interacciones
metabólicas.
Introducción
2
0
Extensión superficial Plástido Vacuola pigmentada
Vacuolas digestivas
Citostomas
Invaginación superficial
Vesículas exocíticas RE rugoso Complejo de
Golgi Núcleo
Membrana plasmática
Mitocondria
Ribosomaslibres
C
Plástido Mitocondria
Microtúbulos
Gránulos densos
Micronema
Anillos polares
Prominencia apical
Roptria
Cisterna pelicular Ribosomas
Membrana plasmática
Núcleo
A RE rugoso Complejo de Golgi
Vesículas exocíticas
Plástido
Mitocondria
Ribosomas libres
Núcleo
Membrana plasmática
Citostoma
Vacuolas digestivas pequeñas
B
Membrana del GR Citostoma
Vacuola digestiva
RE rugoso
Hendiduras
Hendiduras
Buds de los merozoítos
Roptria Complejo de Golgi
Huso mitótico
Núcleo
Mitocondría
Plástido
Knobs
D
Figura 2. Estructuras tridimensionales esquemáticas de las formas de Plasmodium falciparum durante el ciclo intraeritrocítico. A, Merozoíto; B, Anillo; C, Trofozoíto; D, Esquizonte. (Modificado de Bannister et al, 2000).
Introducción
21
Durante este período, además de aumentar el tamaño del parásito, comienzan a
observarse modificaciones en la superficie del glóbulo rojo infectado. Nuevas moléculas
son exportadas al eritrocito, donde algunas se ensamblan formando sacos membranosos
generando estructuras conocidas como Maurer’s Clefts (Tilley and Hanssen, 2008).
Otras interactúan con la membrana y el citoesqueleto del eritrocito formando pequeñas
protuberancias en su superficie que se denominan Knobs (Atkinson and Aikawa, 1990),
y otras son insertadas en la membrana del glóbulo rojo y son las responsables de la
citoadherencia de los glóbulos rojos infectados al endotelio de los vasos sanguíneos. De
esta manera el parásito evita ser eliminado del torrente sanguíneo por las defensas del
cuerpo a través del bazo. Si los glóbulos rojos infectados se adhieren a las paredes de
los vasos sanguíneos del cerebro se produce la malaria cerebral, mientras que si ocurre
en la placenta se puede ver afectado el crecimiento fetal.
Esquizonte (Fig. 2, D)
El esquizonte es un parásito intraeritrocítico que esta sufriendo o ha sufrido
repetidas divisiones celulares. De todas formas, la síntesis de algunas de las moléculas
necesarias para la multiplicación del parásito, incluyendo el ADN, se sabe que
comienzan en el estadio trofozoíto (White and Kilbey, 1996; Arnot and Gull, 1998).
En este momento también se observan cambios en la apariencia de los eritrocitos
infectados que se vuelven más angulosos debido a la distorsión del citoesqueleto y la
membrana plasmática producida por las proteínas exportadas del parásito. Además
aumenta el número de Knobs en la superficie del glóbulo rojo (Nagao et al, 2000).
La división nuclear es acompañada por numerosos cambios citoplasmáticos que
implicarán la formación de los merozoítos. Existe una gran proliferación del retículo
endoplásmico rugoso y los ribosomas, se produce la multiplicación de la mitocondria y
del apicoplasto y se genera una acumulación de una o más vacuolas lipídicas. Esta fase
es seguida por la aparición de centros para la formación de los merozoítos, en los cuales
se ensamblan los diferentes elementos que formarán la nueva célula, comenzando con
las organelas del complejo apical (Jaikaria et al, 1993). Antes de la completa
separación, un núcleo, una mitocondria y un apicoplasto se mueven desde el centro del
esquizonte hacia cada merozoíto en formación. Finalmente se separan los merozoítos
del cuerpo residual del esquizonte que contiene la vacuola digestiva (Vickerman and
Cox, 1967). Las membranas de la vacuola parasitófora y del glóbulo rojo se rompen
Introducción
22
liberando los merozoítos a la sangre, que se encuentran listos para infectar nuevos
eritrocitos (Bannister et al, 1986). Esta liberación de los parásitos es la causa del
aumento de la temperatura del hospedador durante la progresión de la enfermedad. Este
ciclo intraeritrocítico es continuo y toma cerca de 48 horas en el caso de Plasmodium
falciparum. Existe gran sincronización entre los ciclos dentro de los diferentes glóbulos
rojos lo que hace que los merozoítos sean liberados aproximadamente a la misma hora
del día. El contenido de los glóbulos rojos infectados que se libera en el momento de su
lisis estimula la producción del factor de necrosis tumoral y otras citoquinas que son los
responsables de las manifestaciones clínicas de la enfermedad (Tuteja, 2007).
1.4. La malaria en el mundo.
La malaria es la enfermedad parasitaria más importante en el mundo. Más del 40 %
de la población mundial vive en zonas donde la malaria es endémica. Los números
exactos no se conocen pero se estima que en el año 2006 se produjeron 250 millones de
casos produciéndose como resultado casi un millón de muertes. El 90% de las muertes
ocurren en África al sur del Sahara, y la mayoría corresponden a niños de menos de 5
años de edad (Guerra et al, 2006; Breman and Holloway, 2007).
La distribución geográfica de la malaria en el mundo depende principalmente de
factores climáticos como la temperatura, humedad y las precipitaciones que generan las
condiciones adecuadas para el desarrollo del mosquito vector (Fig. 3). De esta forma se
observa que la malaria ocurre generalmente en regiones tropicales y subtropicales donde
el mosquito Anopheles puede reproducirse y sobrevivir y de esta forma el parásito
puede completar su ciclo de vida. De las variables climáticas, la temperatura es
particularmente crítica ya que Plasmodium falciparum no puede completar su ciclo de
vida dentro del mosquito a temperaturas inferiores a 20ºC.
Sin embargo, la distribución de la malaria en el mundo no solo se debe a factores
climáticos sino que también se debe a causas socio-culturales, políticas y económicas
siendo los más afectados los países menos desarrollados que se encuentran en la zona
tropical. Más del 90% de los casos de malaria se reportan en África al sur del Sahara y
un 6% se encuentran en 6 países, India, Brasil, Sri Lanka, Vietnam, Colombia y las Islas
Solomon.
Introducción
23
La malaria afecta fundamentalmente regiones de extrema pobreza, donde la alta
morbilidad y mortalidad pueden atribuirse a la falta de tratamientos adecuados, el 60%
de las muertes ocurren dentro del 20% más pobre de la población mundial.
En la Argentina, la malaria no es generalmente grave o peligrosa para la vida del
paciente, pero es debilitante e incapacitante originando pérdidas de días de trabajo,
gastos médicos y pérdidas económicas que afectan a la familia. Los enfermos, además,
constituyen una fuente de infección para otros mosquitos manteniendose de esta manera
la transmisión de la enfermedad, con el consiguiente incremento en el número de
enfermos y familias que se ven afectadas.
Actualmente, los casos reportados en la Argentina son producidos por Plasmodium
vivax. Sin embargo, durante los años 1940 y 1945 se registraron también una gran
cantidad de infecciones por Plasmodium falciparum, las cuales fueron eliminadas en el
año 1960. En el país se han identificado 38 especies de Anophelinos potenciales
vectores de la enfermedad siendo los más importantes An. pseudopunctipennis y An.
darlingi.
El área de la Argentina afectada originalmente por la malaria comprendía regiones
de las provincias de Salta, Jujuy, Tucumán, Chaco y Formosa y en menor medida de
Figura 3. Distribución geográfica de la malaria en el mundo. (World Health Organization, 2007. Última información disponible).
Zonas de alta transmisión de malaria
Zonas de baja transmisión de malaria
Zonas de ausencia de la enfermedad
Introducción
24
Corrientes, Misiones, Catamarca, Santiago del Estero, San Juan, La Rioja, San Luis y
Córdoba (SENAPA-1959). Afortunadamente, se logró erradicar la enfermedad en el
96% de las zonas afectadas originariamente. La enfermedad en la actualidad es
endémica en las zonas tropicales de Salta y Jujuy y es epidémica en algunas zonas de las
provincias de Corrientes y Misiones (Min.de Salud de la Provincia de Jujuy ; Dantur
Juri et al, 2009).
La malaria sigue existiendo en la Argentina, es de interés nacional y de denuncia
obligatoria (Ley Nacional Nº22.585, Decreto 3550/40).
1.5. El problema de la malaria en la actualidad.
La malaria fue eliminada de los Estados Unidos y de la mayor parte de Europa
durante la primera mitad del siglo XX como resultado de cambios en el uso de la tierra,
las prácticas de agricultura, la construcción de casas y por medidas de control del
vector.
El desarrollo del insecticida DDT altamente efectivo para el control del mosquito,
inició un programa de erradicación global en los años 50 y 60 que fue efectivo
inicialmente en algunos países como Sri Lanka, India y algunos sectores de Asia. Sin
embargo este éxito no fue sostenido debido a los altos costos del programa, la
resistencia de diversas comunidades a rociar sus casas repetidamente con el insecticida
y a la aparición de la resistencia al DDT. Por otro lado, no se realizaron esfuerzos en
tratar de controlar la malaria en África.
La eliminación de la malaria de Europa y Estados Unidos y la falla en el programa
de erradicación mundial llevaron a una pérdida del interés en esta enfermedad por un
período de 25 años desde los comienzos de los años 1970 hasta finales de la década del
90. Solo 3 de las 1223 nuevas drogas desarrolladas entre los años 1975 – 1996, fueron
drogas antimaláricas (Greenwood and Mutabingwa, 2002; Rinaldi, 2004).
Las drogas que se utilizan actualmente en el tratamiento de la malaria son:
cloroquina, sulfadoxine-pyrimethamine (Fansidar®), mefloquina (Lariam®),
atovaquona-proguanil (Malarone®), quinina, doxiciclina, y derivados de la artemisina
(White, 2008; Peters, 1971). La quinina fue la primera droga utilizada. Su uso se
remonta al siglo XVII cuando llegó a Europa desde Perú. Se extrae de la corteza del
Introducción
25
árbol de la Cinchona. La quinina actúa sobre las formas sanguíneas maduras inhibiendo
la formación de la hemozoína. Sin embargo presenta efectos colaterales y está
contraindicada en pacientes con alteraciones cardíacas. La cloroquina es una droga
sintética, que se desarrolló durante la segunda guerra mundial en la búsqueda de un
mejor tratamiento contra la enfermedad. Su mecanismo de acción implica la
acumulación del hemo que es tóxico para el parásito. Esta droga tiene menos efectos
colaterales y fue muy ampliamente utilizada debido a su bajo costo, lo que generó la
aparición de resistencia en el párasito. Sin embargo, continua siendo la droga más usada
en la actualidad (Ridley, 2002).
Recientemente, la situación de la malaria ha empeorado y la mortalidad está
probablemente aumentando en África, especialmente en la zona al sur del Sahara. La
principal razón del recrudecimiento de la enfermedad es que Plasmodium falciparum ha
desarrollado resistencia a las drogas más baratas y más utilizadas como la cloroquina.
Otras causas que producen el recrudecimiento de la enfermedad son la resistencia del
mosquito vector a los insecticidas utilizados para su control y a los cambios sociales y
del medio ambiente.
De esta manera, es urgente la necesidad de encontrar una vacuna y nuevas drogas e
insecticidas (Holder, 1999; Carter et al, 2000). Los proyectos genoma del parásito, del
mosquito y del hombre están ayudando en la búsqueda de nuevas herramientas pero es
necesaria también la inversión económica y mecanismos de financiación para que estas
herramientas puedan desarrollarse en los países más pobres donde la malaria tiene las
peores consecuencias (Hoffman et al, 2002; Cooke and Coppel, 2004).
Introducción
26
2. Esfingolípidos.
2.1. Esfingolípidos en mamíferos
La denominación fue dada por J. L. W. Thudichum quien dedicaba su tiempo
libre al estudio de las esfinges de la mitología griega y nombró a los compuestos que
había aislado en 1884 como esfingolípidos debido a la naturaleza enigmática de sus
propiedades y funciones (Merril et al, 1997).
Los esfingolípidos continuaron siendo enigmáticos hasta hace relativamente
poco tiempo. Durante casi 100 años fueron considerados sólo como componentes
estructurales de membranas biológicas. Sin embargo, en los últimos 20 años, dos
descubrimientos fundamentales impulsaron las investigaciones sobre los mismos. El
primero fue la determinación de su capacidad para actuar como primeros y segundos
mensajeros en una gran variedad de mecanismos celulares de señalización y,
posteriormente se encontraron evidencias de que estos compuestos tienen roles
importantes dentro de los microdominios de membrana, denominados lipid rafts
(Futerman and Hannun, 2004).
Como la mayoría de los lípidos de membranas, los esfingolípidos son moléculas
anfipáticas que tienen propiedades hidrofílicas y también hidrofóbicas. Esta última
corresponde a una base esfingosínica unida por un enlace amida a un ácido graso de
cadena larga. El término base esfingosínica se refiere a las bases 2-amino-1,3-dihidroxi
alcano o alqueno. La más común de estas bases es la esfingosina (2-amino-1,3-
dihidroxi-4-octadeceno) (Fig. 4) (Merril, 2002). Las bases esfingosínicas presentan dos
centro asimétricos y por lo tanto existen cuatro estereoisómeros posibles, de los cuales
solo el isómero D-erythro (2S, 3R) es el que se encuentra en la naturaleza (Kok et al,
1997; Dragusin et al, 2003).
El esfingolípido más simple es la ceramida (Fig. 4) que contiene una región
hidrofílica pequeña que corresponde a los dos hidroxilos libres. Este compuesto tiene un
papel central en la señalización celular y es el precursor de una gran variedad de
esfingolípidos más complejos (Merril, 2002).
Los esfingolípidos complejos presentan regiones hidrofílicas de mayor tamaño
como por ejemplo, fosfato en el caso de la esfingosina-1-fosfato (S1P) y la ceramida-1-
fosfato, la fosfocolina en la esfingomielina (SM) y diferentes tipos de hidratos de
carbono en el caso de los glicoesfingolípidos (GSL) (Fig. 4). Los glicoesfingolípidos a
Introducción
27
su vez pueden ser clasificados en glicoesfingolípidos neutros (compuestos únicamente
por monosacáridos neutros) y glicoesfingolípidos ácidos, y estos últimos a su vez
pueden ser sialilados (conteniendo uno a más residuos de ácido siálico) o sulfatados. En
términos de complejidad, existen al menos 5 bases esfingosínicas diferentes en las
células de mamíferos, más de 20 especies de ácidos grasos (que varían en la longitud de
cadena, el grado de instauraciones y/o el grado de hidroxilación) que pueden unirse
Figura 4. Estrucuras de algunos de los esfingolípidos más comunes en células de mamíferos
Glucosilceramida (GlcCer) ((2S,3R)-1-O--glucosil-N-palmitoilesfingosina)
OH
NH
O
OHO
HOOH
OH
O
Esfingomielina (SM) ((2S,3R)-1-O-fosfocolina-N-palmitoilesfingosina)
P
O
O
O-
N+
O
OH
NH
O
Ceramida (Cer) (D-erythro-N-palmitoilesfingosina; (2S,3R)-2-amino-1,3-dihidroxi-N-hexadeciloctadec-4-eno)
OH
OH
NH
O
Esfingosina (So) (D-erythro-esfingosina; (2S,3R)-2-amino-1,3-dihidroxi-4-octadeceno)
OH
OH
NH2
Introducción
28
formando el enlace amida y cerca de 500 estructuras de hidratos de carbono descriptas
hasta el momento en los glicoesfingolípidos (Bell et al, 1993; Kolter et al, 2002).
Aunque generalmente existe una preferencia para la asociación de componentes en
esfingolípidos específicos (esto es, ciertos ácidos grasos se encuentran preferentemente
en ciertos glicoesfingolípidos) el número de potenciales combinaciones es
extremadamente amplio. Esta gran complejidad sería un indicio de que existe un
mecanismo de regulación altamente organizado y eficiente, el cual todavía no ha sido
completamente elucidado (Futerman and Hannun, 2004).
2.1.1. Metabolismo de los esfingolípidos.
En células de mamíferos, la biosíntesis de novo de los esfingolípidos (Fig. 5)
comienza con la condensación de palmitoil-CoA con serina por acción de la serin-
palmitoil transferasa (SPT) para dar lugar a la 3-cetoesfinganina (Hanada, 2003), sobre
la cual actúa la 3-cetoesfinganina reductasa (3KSR) obteniendose la esfinganina
(dihidroesfingosina). La esfinganina es posteriormente acilada con un acido graso
mediante la dihidroceramida sintasa (esfinganina N-acil transferasa, DHCerS)
formandose una amida: la dihidroceramida (Pewzner-Jung et al, 2006), en la cual
finalmente la dihidroceramida desaturasa/reductasa (DHCD) introduce un doble enlace
trans 4-5 para obtener la ceramida (Munoz-Olaya et al, 2008). Esta última actúa como
precursor de esfingolípidos más complejos y esta involucrada en importantes procesos
celulares. La ceramida es el centro del metabolismo de los esfingolípidos y es el primer
punto de acumulación significativa en la biosíntesis de novo de los esfingolípidos
(Merrill, 2002; Hannun and Obeid, 2002).
La ceramida puede ser fosforilada por una ceramida kinasa (CK) dando lugar a
la ceramida-1-fosfato (van Overloop et al, 2006), puede ser glicosilada para formar
glucosilceramida (Ichikawa et al, 1996 ; Paul et al, 1996) o galactosilceramida (Coetzee
et al, 1998; Sprong et al, 1998) o puede ser transformada en esfingomielina por la
acción de la esfingomielina sintasa que transfiere un grupo fosfocolina de la
fosfatidilcolina a la ceramida (Pagano, 1988) (Fig. 5).
La galactosilceramida, a su vez, es el precursor de los sulfátidos (GalCer-3-
sulfato), los cuales son los glicoesfingolípidos mayoritarios de cerebro en mamíferos,
Introducción
29
Figura 5. Biosíntesis de los esfingolípidos. Estructuras de los compuestos y enzimas involucradas en la ruta metábolica en células de mamíferos. SPT: serinapalmitoiltransferasa; 3KSR: 3-cetoesfinganina reductasa; DHCerS: dihidroceramida sintasa; CerS: ceramida sintasa; DHCD: dihidroceramida desaturasa; CK: ceramida kinasa; CPP: ceramida-1-fosfato fosfatasa; CDasa: ceramidasa; CGalT: galactosilceramida sintasa; GCS: glucosilceramida sintasa; SMS; esfingomielina sintasa; SMasa: esfingomielinasa; SK: esfingosina kinasa; SPP: esfingosina-1-fosfato fosfatasa.
SCoA
OHC
COO-
NH3+
CH2OH
+
Palmitoil-CoA L-serina
SPT
OH
O
NH23-Cetoesfinganina
3KSR
OH
OH
NH2Esfinganina
DHCerS
DHCS
OH
OH
NH
ODihidroceramida
OH
OH
NH
OCERAMIDA
CPP
R O
OH
NHR
O
P
O
OH
OH
CK Ceramida-1-fosfato
R O
OH
NHR
O
P
O
O
O-
N+
SMS
SMasa
Esfingomielina
CDasa
R OH
OH
NH2
R O
OH
NH2
P
O
OH
OH
CerS
SK SPP
Esfingosina
Esfingosina-1-fosfato
R
OH
NHR
O
O
HOOH
OHOH
O
CGalT
Galactosilceramida
Sulfátidos
R
O
OH
NHR
O
OHO
HOOH
OH
GCS
Glucosilceramida
Glicoesfingolípidos complejos
Introducción
30
donde presentan un rol importante tanto en la estructura como en las funciones de la
mielina, la cual es una estructura en forma de hoja que cubre los axones nerviosos.
Estos glicoesfingolípidos son los responsables de interacciones del tipo carbohidrato-
carbohidrato entre estas membranas, generando lo que se conoce como las glicosinapsis.
La cadena glicosídica de estos galactoesfingolípidos es raramente extendida.
La glucosilceramida, en cambio, es la base de los glicoesfingolípidos
complejos, los cuales son biosintetizados por adición sucesiva de diferentes residuos de
hidratos de carbono.
Los glicoesfingolípidos son degradados por la acción de hidrolasas específicas
que llevan a la formación de glucosilceramida nuevamente, la cual es sustrato de una -
glucosidasa específica que puede regenerar la ceramida. La esfingomielina también
puede ser hidrolizada para regenerar la ceramida por la acción de varias
esfingomielinasas (SMasa), de las cuales se conocen tres isoformas, la SMasa ácida, la
SMasa neutra y la SMasa alcalina, las cuales se encuentran distribuídas en diferentes
compartimientos celulares (Huitema et al, 2004; Tafesse et al, 2006) (Fig. 5).
Por otra parte, la ceramida puede ser degradada por la ceramidasa, lo que lleva a
la formación de la esfingosina la que tiene dos destinos posibles: la esfingosina puede
ser reciclada en la ruta metabólica de los esfingolípidos o puede ser fosforilada por la
esfingosina kinasa (SK). El producto esfingosina-1-fosfato puede ser desfosforilado
para regenerar la esfingosina por la acción de una fosfatasa específica (SPP).
Alternativamente, la esfingosina-1-fosfato es hidrolizada irreversiblemente por la
esfingosina-1-fosfato liasa dando como productos de degradación final
etanolaminafosfato y hexadecanal (Spiegel and Milstien, 2002).
En los últimos años, se han podido identificar molecularmente las principales
enzimas que actúan en el metabolismo de los esfingolípidos en levaduras primero
(Obeid et al, 2002) y luego en mamíferos. Se ha encontrado que varias de estas enzimas
presentan diferentes isoformas con localizaciones subcelulares específicas. Como se
podría esperar dada la naturaleza lipídica de los sustratos, las enzimas involucradas en la
biosíntesis de los esfingolípidos son proteínas integrales de membrana y se encuentran
localizadas principalmente en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi (Futerman
and Riezman, 2005 ; Delgado et al, 2006; Zheng et al, 2006; Lahiri and Futerman,
2007 ; Kitatani et al, 2008).
Los primeros pasos de la síntesis de novo de los esfingolipidos que llevan a la
formación de la ceramida ocurren en la superficie citosólica de la membrana del retículo
Introducción
31
endoplásmico (Michel and van Echten-Deckert, 1997). La ceramida así formada es
posteriormente sustrato de varias enzimas, las cuales tienen diferentes localizaciones
subcelulares. La ceramida es capaz de traslocar por difusión simple hacia la cara interna
del retículo endoplásmico (Ruggers et al, 2000 ; van Meer and Holthuis, 2000 ;
Montero et al, 2005) donde se encuentra el sitio activo de la galactosilceramida
transferasa que convierte a la ceramida en la correspondiente galactosilceramida. La
galactosilceramida puede posteriormente ser transportada por medio de un transporte
vesicular al complejo de Golgi, donde esta presente la sulfotransferasa responsable de la
transferencia de un grupo sulfato a la posición 3-OH de la galactosa (Honke et al, 1997;
Hirahara et al, 2000; Degroote et al, 2004; Yaghootfam et al, 2007).
Sin embargo, la síntesis de esfingomielina y glucosilceramida ocurre en el
aparato de Golgi, en el cual la esfingomielina es sintetizada en la superficie interna de la
membrana del trans-Golgi (Futerman et al, 1990; Jeckel et al, 1990) mientras que la
síntesis de la glucosilceramida ocurre en la cara citosólica de la región cis del aparato de
Golgi (Futerman and Pagano, 1991; Jeckel et al, 1992) (Fig. 6).
Debido a la estructura y a la alta hidrofobicidad de la ceramida, esta no es capaz
de traslocar entre diferentes membranas intracelulares (Simon et al, 1999) y por lo tanto
debe existir un mecanismo de transporte para que la ceramida alcance el Golgi para sus
posteriores modificaciones desde el retículo endoplásmico en donde es sintetizada.
Existen al menos dos mecanismos por los cuales la ceramida podría ser
transportada desde el retículo endoplásmico hacia el trans-Golgi para la síntesis de
esfingomielina: un mecanismo principal dependiente de energía y otro minoritario no
dependiente de energía que implicaría un transporte vesicular. En el año 2003, el grupo
de Hanada y colaboradores publicaron la identificación de una proteína citosólica
responsable del transporte de la ceramida (CERT) en forma dependiente de energía
exclusivamente para la posterior síntesis de esfingomielina (Hanada et al, 2003). Sin
embargo, la síntesis de glucosilceramida no esta relacionada con la ceramida
transportada por la proteína CERT lo que sugiere que la ceramida utilizada por la
glucosilceramida sintasa alcanza el Golgi por un mecanismo diferente que se ha
descripto como un mecanismo vesicular (Perry y Ridgway, 2005). La glucosilceramida
es sintetizada en la cara citosólica del aparato de Golgi por lo que posteriormente debe
translocar hacia la cara interna del trans-Golgi donde se encuentran las
glicosiltransferasas responsables de la síntesis de los glicoesfingolípidos complejos.
Introducción
3
2
Figura 6. Localización subcelular de los metabolitos y enzimas involucrados en la biosíntesis de los esfingolípidos. GSL, glicoesfingolípidos; SM, esfingomielina; GlcCer, glucosilceramida; DHCer, dihidroceramida; Sa, esfinganina; 3KSa, 3-cetoesfinganina; Ser, serina; So, esfingosina; S1P, esfingosina-1-fosfato.
Introducción
33
Hannun y colaboradores describieron en el 2007 la existencia de la proteína FAPP2 que
estaría involucrada en el transporte específico de la glucosilceramida sintetizada hacia el
sitio de acción de las sucesivas glicosiltransferasas (D’Angelo et al, 2007). La
translocación a través de la membrana para alcanzar la cara interna del trans-Golgi está
a cargo de otra proteína ubicada en dicha membrana que actúa como
transportador específico no dependiente de energía (Buton et al, 2002). Finalmente,
tanto la esfingomielina como los glicoesfingolípidos complejos son transportados desde
el trans-Golgi hacia la membrana plasmática por un mecanismo vesicular similar al
descripto para el tráfico de proteínas (Futerman, 2006).
La esfingomielina presente en la membrana plasmática puede ser hidrolizada por
las esfingomielinasas ácida y neutra que se encuentran como proteínas integrales de la
membrana para dar ceramida nuevamente, la cual es sustrato de la ceramidasa neutra
generándose esfingosina. Esta puede ser reciclada para obtener ceramida que entra
nuevamente en el metabolismo de los esfingolípidos o puede ser fosforilada por la
esfingosina kinasa citosólica para dar esfingosina-1-fosfato (Hannun and Obeid, 2002;
Kolenisk, 2002).
Por otra parte, los glicoesfingolípidos complejos y la esfingomielina de la
membrana plasmática son transportados hacia lisosomas ácidos por un mecanismo de
endocitosis (Riboni et al, 1997; Sharma et al, 2003). La degradación de los
glicoesfingolípidos ocurre en forma secuencial donde se van liberando una a una las
unidades de monosacáridos desde el extremo no reductor por acción de diferentes
exohidrolasas (Kolter and Sandhoff, 2005) obteniéndose como resultado ceramida. La
esfingomielina también es hidrolizada en el lisosoma por acción de una
esfingomielinasa ácida para generar ceramida. La ceramida, proveniente de ambas
degradaciones, es posteriormente desacilada por una ceramidasa específica para dar
lugar a la esfingosina, la cual puede atravesar la membrana del lisosoma y actuar como
sustrato de diferentes enzimas, tanto para ser reacilada generando una nueva ceramida o
para ser fosforilada.
El único punto de salida de los esfingolípidos del pool celular general es a través
de la degradación de la esfingosina-1-fosfato mediada por la enzima esfingosina-1-
fosfato liasa que da como productos el aldehído de cadena larga correspondiente y
fosfoetanolamina. Por lo tanto, la actividad de la esfingosina kinasa, enzima responsable
de la fosforilación de esfingosina, inicia la única vía bioquímica degradativa para la
eliminación de la ceramida de la célula.
Introducción
34
La localización subcelular de las enzimas del metabolismo de los esfingolípidos,
así como también los mecanismos de transporte específicos que actúan en la misma ruta
metabólica son determinantes para comprender la acción de los esfingolípidos
biológicamente activos ya que de acuerdo con su estructura estos lípidos se encuentran
principalmente formando parte de membranas y muestran poco movimiento entre
diferentes compartimientos intracelulares. Además, es interesante notar que los niveles
intracelulares de los diferentes esfingolípidos bioactivos son considerablemente
diferentes. Las concentraciones intracelulares de ceramida, esfingosina y esfingosina-1-
fosfato difieren en más de un orden de magnitud, donde la ceramida presenta la mayor
concentración y la esfingosina-1-fosfato el menor nivel. Por lo tanto, la hidrólisis de una
pequeña cantidad de la ceramida sintetizada de novo podría implicar un incremento
importante en los niveles de esfingosina. De la misma forma, la fosforilación de un 1-
3% de la esfingosina generaría un aumento al doble en la concentración de la
esfingosina-1-fosfato (Bartke y Hannun, 2008; Hannun y Obeid, 2008).
Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores se puede suponer que existe
una importante regulación de toda la vía metabólica para controlar las concentraciones
individuales de cada esfingolípidos y también de su interconversión metabólica,
considerando además que existen varias enzimas que pueden operar simultáneamente
sobre el mismo sustrato.
2.1.2. Esfingolípidos biológicamente activos
Los “lípidos bioactivos” son aquellos que producen consecuencias funcionales
en la célula debido a cambios en sus niveles intracelulares. En las últimas décadas se ha
demostrado que los esfingolípidos no son solamente compuestos estructurales de
membranas biológicas sino que además son lípidos bioactivos involucrados en la
regulación del citoesqueleto, de la endocitosis, del ciclo celular y de la apoptosis (Smith
et al, 2000). Los esfingolípidos más estudiados hasta el momento han sido la ceramida y
la esfingosina-1-fosfato que tienen roles importantes en diversos eventos celulares como
la proliferación (Adam et al, 2002), crecimiento y diferenciación celular (Okazaki et al,
1989) y apoptosis (Obeid et al, 1993; Venkatamaran and Futerman, 2000; Ogretmen
and Hannun, 2001). La ceramida está involucrada en la respuesta celular al estrés
Introducción
35
Respuesta biológica
Inductores
síntesis de novo
Esfingomielina (30000)
Ceramida (3000)
Esfingosina (100)
Esfingosina-1-fosfato (1)
SMasa CDasa SK
Senescencia Diferenciación Apoptosis Detención del ciclo celular
Apoptosis Detención del ciclo celular
Proliferación Mitogénesis Inflamación Migración Angiogénesis Protección de la apoptosis
Radiación UV Quimioterapia
Estrés Radiación UV Quimioterapia
Factores de crecimiento Citoquinas Hipoxia
Figura 7. Resumen de las funciones de los principales esfingolípidos bioactivos. Los esfingolípidos están metabolicamente conectados entre sí y en consecuencia debe existir un mecanismo de regulación específico. Estos lípidos bioactivos interaccionan con proteínas específicas como fosfatasas, kinasas y receptores acoplados a proteína G que son los efectores de las distintas respuestas celulares. Entre paréntesis se muestran las concentraciones celulares relativas de cada uno de los esfingolípidos (Modificado de Hannun and Obeid, 2008).
desencadenando la apoptosis y la senescencia celular (Venable et al, 1995), mientras
que la esfingosina-1-fosfato actúa sobre la supervivencia celular, migración e
inflamación (Hla, 2004). La ceramida y la esfingosina-1-fosfato tienen, entonces, roles
opuestos en los mecanismos de supervivencia y muerte celular de manera que el
destino de la célula está determinado por la relación de los niveles de estos dos
esfingolípidos bioactivos que están conectados metabólicamente (Maceyka et al, 2002 ;
Lahiri and Futerman, 2007) (Fig. 7).
Actualmente también están siendo objeto de estudio otros esfingolípidos como la
ceramida-1-fosfato que estaría involucrada en procesos de inflamación y el tránsito
vesicular (Chalfaut and Spiegel, 2005; Mitsutake et al, 2004; Hinkovska-Galcheva et al,
2005) y la glucosilceramida que actuaría en los mecanismos de transporte post-Golgi y
Introducción
36
en la resistencia a drogas (Radin et al, 1993; Gonaze-Andersson and Cabot, 2006).
Además existen evidencias de que los glicoesfingolípidos más complejos están
involucrados en la fisiología celular al actuar como antígenos (De libero et al, 2002),
mediadores de la adhesión celular y como moduladores de la transducción de señales
(Hakomori, 2002).
Por otra parte, los esfingolípidos tienen una gran importancia en la formación y
estabilidad de los microdominios de membrana (lipid rafts) (Futerman and Hannun,
2004), los cuales tienen una composición rica en esfingolípidos y colesterol (Munro,
2003). Estudios recientes mostraron que los diferentes microdominios contienen
diferentes proteínas y distintas especies de esfingolípidos que difieren en la longitud de
cadena y en los grupos polares (Brugger et al, 2004). Cada vez está más aceptada la
hipótesis de que los lipid rafts de la membrana plasmática estarían funcionando como
plataformas de señalización donde estarían localizados receptores y kinasas. Existen
evidencias significativas que muestran que algunos de los roles de la ceramida en la
señalización celular estarían relacionados con su presencia en estos microdominios
(Gulbins and Kolesnik, 2003) y que la generación de ceramida a través de la acción de
la esfingomielinasa ácida de la membrana estaría favoreciendo la formación de estos
lipid rafts (Cremesti et al, 2002; Saito and Yokasuka, 2006).
Los esfingolípidos son hoy considerados como importantes efectores de una
gran variedad de procesos celulares. La complejidad del metabolismo de los mismos y
la interconversión de los esfingolípidos bioactivos proveen a la célula con un amplio
repertorio de moléculas, no sólo para generar múltiples señales, sino también para
regular en forma precisa diversas respuestas específicas.
Introducción
37
2.2. Esfingolípidos en parásitos
2.2.1. Plasmodium falciparum
El estudio del metabolismo de lípidos en Plasmodium falciparum está limitado a
los estadios intraeritrocíticos del mismo. Luego de la invasión del glóbulo rojo, el
parásito se desarrolla dentro de la vacuola parasitófora (Murphy et al, 2007; Ward et al,
1993; Miller et al, 1994) y genera una red tubovesicular de membranas modificando el
citoplasma del glóbulo rojo infectado (Eldorf and Ferguson, 1993; Elemendorf and
Haldar, 1994; Haldar, 1998). A través de esta red de membranas el parásito exporta
proteínas hacia la membrana del glóbulo rojo e importa diferentes nutrientes desde la
célula hospedadora (Gero and Kirk, 1994; Haldar, 1994; Deitsch and Wellems, 1996).
Además de los cambios que ocurren dentro del citoplasma de los eritrocitos, la
composición lipídica de la membrana plasmática de los glóbulos rojos infectados se ve
modificada por la presencia del parásito. El análisis del contenido lipídico de los
eritrocitos infectados muestra un importante incremento de fosfatidiletanolamina y
fosfatidilcolina principalmente y una disminución significativa de esfingomielina
(aproximadamente 47%) (Holz, 1977; Maguire and Sherman, 1990; Hsiao et al, 1991).
Se sabe que los eritrocitos maduros que son infectados carecen de núcleo, organelas
intracelulares y estructuras con membrana y, además, son incapaces de la síntesis de
novo de proteínas y lípidos (Chasis et al, 1989). De todas maneras, en estas células se
generan nuevas membranas y hay modificaciones de los componentes lipídicos luego de
la infección por Plasmodium falciparum lo que sugiere que su formación es regulada
por el parásito aunque los mecanismos bioquímicos y moleculares todavía son, en su
mayoría, desconocidos.
A pesar de que el metabolismo y la actividad de los esfingolípidos están
ampliamente estudiados en mamíferos, muy poco es lo que se sabe sobre los mismos en
Plasmodium falciparum.
Los primeros trabajos publicados donde fueron realizados experimentos de
marcaciones metabólicas en Plasmodium falciparum utilizando serina y acido palmítico
marcados radioactivamente no mostraron cantidades detectables de esfingolípidos
marcados sugiriendo, en un principio, que el parásito era incapaz de sintetizar
esfingolípidos de novo (Vial et al, 1982; Ansorge et al, 1995; Elabbodi et al, 1997). Sin
embargo, experimentos utilizando análogos fluorescentes o ceramidas radioactivas de
Introducción
38
cadena corta evidenciaron la capacidad del parásito de sintetizar esfingomielina como
único producto, sugiriendo la existencia de una esfingomielina sintasa en Plasmodium
falciparum (Haldar, 1991; Ansorge et al, 1995; Lauer et al, 1995). La ausencia de
cantidades detectables de glicoesfingolípidos luego de las incorporaciones metabólicas,
especialmente de glucosilceramida, en los eritrocitos infectados llevó a la conclusión de
que la enzima responsable del primer paso de glicosilación estaba ausente en
Plasmodium falciparum o a una falta de reconocimiento del sustrato por la enzima del
parásito (Haldar, 1991).
En los últimos años, en el genoma de P. falciparum, se han encontrado dos
genes continuos que codifican para dos esfingomielina sintasas putativas (PFF1210w y
PFF1215w) (Welti et al, 2007). Simultaneamente, los estudios de caracterización
bioquímica de la esfingomielina sintasa de P. falciparum reveló que existen dos
isoformas de la misma con diferente sensibilidad al inhibidor PPMP (DL-threo-1-fenil-
2-palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol) el cual es un conocido inhibidor de la
esfingomielina sintasa de mamíferos (Vunnam and Radin, 1980; Inokuchi and Radin,
1987; Abe et al, 1992 ; Rosenwald et al, 1992). Las dos isoformas de la enzima del
parásito presentan, además de una diferente sensibilidad al inhibidor, una localización
intracelular específica. La esfingomielina sintasa sensible (SSS) (inhibida a bajas
concentraciones de PPMP) se encuentra en la red tubovesicular de membranas mientras
que la esfingomielina insensible (SSI) (inhibida a concentraciones mayores a 25 M de
PPMP) se localiza en la zona perinuclear dentro del parásito (Elmendorf and Haldar,
1994; Ansorge et al, 1995; Lauer et al, 1995; Haldar, 1996; Haldar, 1998). La
inhibición de la enzima sensible bloquea la correcta formación de la red tubovesicular
de membranas en el estadio anillo, haciendo que el parásito no pueda importar los
nutrientes necesarios y, en consecuencia, no pueda desarrollarse (Lauer et al, 1995 y
1997).
Las evidencias existentes indican la presencia de la enzima esfingomielina
sintasa en Plasmodium falciparum, pero todavía queda por determinar las fuentes de la
ceramida que utiliza dicha enzima para la síntesis de la esfingomielina propia del
parásito. Se ha propuesto que la ceramida podría provenir de la hidrólisis enzimática de
la esfingomielina de la célula hospedadora y/o de la hidrólisis de glicoesfingolípidos
complejos que son internalizados desde la membrana de la célula hospedadora (Hsiao et
al, 1991; Maguire et al, 1991; Lauer et al, 2000). Sin embargo, fue recién a principios
de esta década que dos grupos de investigadores independientes describieron la
Introducción
39
existencia de una actividad enzimática de Plasmodium falciparum correspondiente a
una esfingomielinasa dependiente de Mg2+ que se encuentra asociada a membrana
(Hanada et al, 2000; Lauer et al, 2001). Aunque la localización subcelular de esta
enzima continua siendo controversial, ensayos realizados por el grupo de Haldar y
colaboradores estarían indicando que la esfingomielinasa de Plasmodium falciparum se
encuentra en la membrana plasmática del parásito y por lo tanto la esfingomielina
proveniente de la célula hospedadora debe ser internalizada por medio de la red
tubovesicular de membranas (Lauer et al, 2001). Esta enzima, entonces, podría estar
generando la fuente de la ceramida necesaria para que el parásito re-sintetice su propia
esfingomielina en la red tubovesicular de membranas por acción de la esfingomielina
sintasa propia.
Sin embargo, a pesar de que en los comienzos no fue posible detectar la síntesis
de novo de glicoesfingolípidos en Plasmodium falciparum utilizando diferentes
precursores marcados, en el año 2001, Gerold y Schwarz presentaron las primeras
evidencias de que esta biosíntesis si ocurría en el parásito (Gerold and Schwarz, 2001).
Estos autores fueron capaces de identificar ceramida y glicoesfingolípidos como
productos de marcaciones metabólicas con serina y glucosamina marcadas. La síntesis
de novo en Plasmodium falciparum resultó ser también sensible frente a conocidos
inhibidores de la síntesis de ceramida y glucosilceramida en mamíferos (Platt and
Butters, 1995). De todas formas, la inhibición de la síntesis de los esfingolípidos resultó
no ser completa, indicando que los inhibidores utilizados, o bien no llegan
eficientemente al parásito que se encuentra dentro de la célula hospedadora, o que las
enzimas son menos sensibles a los inhibidores utilizados implicando cierto grado de
diferencia entre las enzimas del parásito y las de mamíferos de esta ruta metabólica.
La presencia de Fumonisina B1, un inhibidor de la dihidroceramida sintasa
(Vesper et al, 1999), inhibe eficientemente la síntesis de novo de glicoesfingolípidos
marcados a partir de serina mientras que la formación de esfingomielina se ve menos
afectada. Frente a estos resultados, los autores especularon que las diferencias en el
grado de inhibición de la síntesis específica del parásito de esfingomielina y otros
esfingolípidos se debe a que la esfingomielina, como ya ha sido demostrado, es esencial
para el desarrollo intraeritrocítico del parásito y por lo tanto la síntesis de novo no debe
ser la única fuente de ceramida para la enzima esfingomielina sintasa (Lauer et al,
1995).
Introducción
40
Fue interesante que el tratamiento con mioricina y cicloserina, inhibidores de la
serina palmitoiltransferasa, la primera enzima involucrada en la síntesis de novo, dieron
como resultado una disminución en la incorporación de glucosamina marcada,
implicando que los glicoesfingolípidos provienen de la síntesis de novo.
Simultaneamente a los efectos sobre la síntesis de los esfingolípidos, se
determinó que los inhibidores ensayados, mioricina y Fumonisina B1, producen, a altas
concentraciones, una inhibición de la multiplicación del parásito (39% mioricina y 18%
Fumonisina B1) indicando que la síntesis de novo de los esfingolípidos estaría
afectando a la multiplicación y viabilidad de P. falciparum en cultivos aunque todavía
no se conoce el mecanismo involucrado (Gerold and Schwartz, 2001).
Sin embargo, pese a la existencia de la síntesis de novo de esfingolípidos, la
inhibición de dicha vía no evita el crecimiento del parásito dentro de la célula
hospedadora, lo que estaría sugiriendo que la ceramida proveniente de la síntesis de
novo no sería la principal fuente de sustrato para la esfingomielina sintasa, cuyo
producto es esencial para la correcta formación de la red tubovesicular de membranas y
el desarrollo del parásito. Este hecho, en conjunto con las evidencias existentes de la
presencia de una actividad enzimática de esfingomielinasa propia del parásito, sugieren
que esta última es la fuente principal de ceramida en el parásito para la síntesis de
esfingomielina (Lauer et al, 2001).
Finalmente, el gran número de evidencias que involucran a la ceramida en una
gran variedad de procesos biológicos en células de mamíferos llevó al estudio de los
posibles roles de la ceramida en Plasmodium falciparum. Diferentes estudios realizados
demostraron que la ceramida tiene un efecto antimalárico (Pankova-Kholmansky et al,
2003; Pankova-Kholmansky and Flescher, 2006). Las evidencias encontradas sugieren
que el mecanismo de acción de la ceramida en la inhibición del crecimiento del parásito
sería una consecuencia de la disminución en el nivel de glutatión de la célula. Debido a
la digestión de la hemoglobina metabolizada, el parásito genera una gran cantidad de
ferriprotoporfirina tóxica. Cerca del 30% de la misma es convertida por polimerización
en hemozoína que no es tóxica para el parásito (Slater et al, 2001). El resto de la toxina
que queda libre debe ser degradada para poder garantizar la supervivencia del parásito,
para lo cual la ferroprotoporfirina debe salir de la vacuola digestiva para ser degradada
por el glutatión presente en el citoplasma (Atamna and Ginsburg, 1995; Famin et al,
1999), en consecuencia una disminución en el nivel de glutatión produce una
acumulación de la toxina y la consecuente muerte del parásito. De esta manera, la
Introducción
41
ceramida produce la muerte de Plasmodium falciparum al eliminar un mecanismo de
defensa fisiológico del parásito contra la ferroprotoporfirina.
2.2.2. Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado perteneciente al Phylum
Apicomplexa que puede invadir todas las células nucleadas del hospedador, incluyendo
al hombre. El parásito tiene dos estadios en su ciclo de vida: el tachizoíto que es la
forma replicativa y que se encuentra durante la infección aguda, y el bradizoíto que se
encuentran formando los quistes intracelulares latentes. Las infecciones con
Toxoplasma spp. son generalmente asintomáticas pero pueden causar lesiones severas
en personas inmunosuprimidas, especialmente en pacientes con el síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA) debido a la reactivación de la toxoplasmosis
crónica por ruptura de los quistes intracelulares (Kim and Weiss 2004; Montoya and
Liesenfeld, 2004).
El parásito se multiplica y desarrolla dentro de la vacuola parasitófora en el
citoplasma de la célula hospedadora (Mordue et al, 1999). La membrana de esta vacuola
se forma durante la invasión con componentes provenientes tanto del parásito como de
la célula hospedadora (Sibley et al, 1986; De Carvalho and De Souza, 1989; De
Carvalho and De Souza, 1990; Pfefferkorn, 1990). Durante el crecimiento del parásito,
la vacuola también aumenta su tamaño para lo cual es necesaria la síntesis y/u obtención
de los componentes para la formación de la misma.
Actualmente, el conocimiento acerca de los esfingolípidos en Toxoplasma
gondii es muy escaso. Los primeros estudios realizados acerca del metabolismo de los
esfingolípidos en estos parásitos se llevaron a cabo utilizando análogos fluorescentes de
ceramidas. Estos estudios mostraron evidencias de que los tachizoítos de T. gondii son
capaces de incorporar ceramidas desde la célula hospedadora, las cuales son
posteriormente metabolizadas y distribuidas en la membrana de la vacuola parasitófora
(de Melo and de Souza, 1996).
La primera evidencia de la síntesis de novo de esfingolípidos en el parásito fue
descripta en el año 2002, donde se encontró la presencia de ceramida, ceramidas
glicosiladas y esfingomielina marcados en los estadios replicativos utilizando como
Introducción
42
precursores serina y galactosa tritiadas (Azzouz et al, 2002). El análisis de los
esfingolípidos marcados mostró que los glicoesfingolípidos mayoritarios contienen dos
y tres unidades de monosacáridos y que la galactosa es transformada en N-acetil-
galactosamina antes de ser incorporada en los glicoesfingolípidos (Azzouz et al, 2002).
Por otra parte, el mismo trabajo mostró que la síntesis de novo de esfingolípidos
en T. gondii es sensible al inhibidor L-cicloserina, el cual bloquea la acción de la
primera enzima de la biosíntesis, y también al inhibidor PPMP, que actúa al nivel de las
enzimas responsables de modificar la ceramida para dar la esfingomielina y la
glucosilceramida, indicando que las enzimas del parásito deben presentar ciertas
similitudes con aquellas enzimas presentes en el hospedador mamífero. De todas
maneras, es necesaria una caracterización más detallada de las enzimas involucradas en
esta ruta metabólica para determinar el grado de similitud y diferencia entre las enzimas
del parásito y el hospedador a fin de de establecer si las mismas podrían ser utilizadas
como blancos de nuevas drogas antiparasitarias.
Estudios más recientes confirmaron nuevamente la existencia en Toxoplasma
spp. de diferentes ceramidas glicosiladas mediante el estudio de los productos obtenidos
a partir de las incorporaciones metabólicas de UDP-glucosa (Marechal et al, 2002) y
acetato (Bisanz et al, 2006) marcados radioactivamente. Otro trabajo mostró que T.
gondii presenta además fosfoesfingolípidos de los cuales se identificó el que se
encuentra en mayor proporción como ceramida-1-fosfoetanolamina (Welti et al, 2007),
el cual solo se presenta en muy pequeñas cantidades en células de mamíferos (Maurice
and Malgat, 1990). También se determinó que la cantidad de esfingomielina en las
células infectadas por el parásito es significativamente inferior que en las células no
infectadas, lo que estaría indicando la posible hidrólisis de la esfingomielina del
hospedador. El análisis del genoma de T. gondii mostró la presencia de un gen
(50.m03113) que codificaría para una esfingomielina sintasa putativa del parásito
aunque todavía no se tienen evidencias bioquímicas de esta actividad enzimática (Welti
et al, 2007).
Introducción
43
2.2.3. Leishmania spp.
Leishmania spp. es un parásito protozoario del Orden Kinetoplastida, familia
Trypanosomatidae, que causa una gran variedad de enfermedades en el hombre y otros
animales, conocidas conjuntamente como Leishmaniasis.
El ciclo de vida del parásito tiene tres estadios diferentes en dos hospedadores:
los promastigotes procíclicos y metacíclicos flagelados en el tracto digestivo del vector
y los amastigotes no flagelados que son intracelulares y residen en el compartimiento
fagolisosomal ácido de los macrófagos de mamíferos (Chang, 1983; Molyneux and
Killick-Kendric, 1987; Socks, 1989). Todos los estadios están adaptados para
desarrollarse en ambientes hidrolíticos y hostiles, y se cree que las moléculas
específicas expresadas en la superficie de la membrana del parásito tienen una función
protectora fundamental (Chaudhuri et al, 1989; Turco, 1990). En Leishmania spp. están
presentes una amplia variedad de glicoconjugados con diferentes y complejas
estructuras. Todos estos compuestos presentan diferentes funciones en la progresión de
la enfermedad en los hospedadores vertebrados o directamente en el ciclo de vida del
parásito. Entre los gliconjugados de membrana más importantes se encuentran los
lipofosfoglicanos, glicoinositolfosfolípidos, proteofosfoglicanos y glicoesfingolípidos
(Descoteaux and Turco, 1999). Muchos de estos compuestos se encuentran dentro de
los microdominios de membrana resistentes a detergentes (lipid rafts) (Denny et al,
2001; Ralton et al, 2002) los cuales están enriquecidos principalmente en esfingolípidos
y esteroles (Denny et al, 2001).
Los principales esfingolípidos complejos en las diferentes especies de
Leishmania son la inositolfosfoceramida (IPC) y sus derivados glicosilados, en forma
similar a lo que ocurre en hongos y plantas (Lester and Dickson, 1993; Sperling and
Heinz, 2003) que representan un 5 a 10% de los lípidos totales de la célula (Kaneshiro
et al, 1998). La inositolfosfoceramida es sintetizada por la transferencia del grupo
fosforilinositol desde el fosfatidilinositol a la ceramida, proceso catalizado por la
enzima inositolfosfoceramida sintasa, la cual ha sido clonada y caracterizada
bioquímicamente en Leishmania major (Denny et al, 2006). Debido a que la
inositolfosfoceramida no se encuentra en las células de mamíferos ha sido considerada
como un posible blanco de nuevas drogas antiparasitarias y en consecuencia su
biosíntesis y características han sido ampliamente estudiadas y no abarcaremos el tema
en este trabajo.
Introducción
44
Dentro de los esfingolípidos presentes en Leishmania spp. se ha determinado
también la existencia de relativamente grandes cantidades de glicoesfingolípidos en las
formas amastigote mientras que en las formas promastigote, estos compuestos están
prácticamente ausentes (Straus et al, 1993). Este hecho estaría implicando un cambio
importante en la composición de la membrana plasmática del parásito que se encontraría
asociado al proceso de diferenciación. La modulación en la biosíntesis de los
glicoesfingolípidos y su expresión en amastigotes podrían estar relacionadas con la
supervivencia y proliferación del parásito dentro de los macrófagos del hospedador.
Estudios realizados para determinar las funciones de estos compuestos mostraron que
los mismos son importantes en el reconocimiento y adhesión entre el parásito y el
macrófago, ya que anticuerpos generados contra los glicoesfingolípidos de Leishmania
inhiben fuertemente la invasión (Straus et al, 1993).
Los primeros estudios sobre la biosíntesis de novo de esfingolípidos en
Leishmania spp. recién fueron publicados en la última década. Dentro de los mismos se
encuentran las publicaciones de dos grupos independientes que determinaron la
existencia en Leishmania spp. de la primera enzima del metabolismo de la ceramida, la
serin-palmitoiltransferasa (Zhang et al, 2003; Denny et al, 2004). Esta enzima se
expresa abundantemente en las formas replicativas promastigotes procíclicos mientras
que no es detectable en el estadio amastigote (Denny et al, 2004). Estudios de
silenciamiento e inhibición farmacológica de esta enzima mostraron que la síntesis de
novo de esfingolípidos no es necesaria para la supervivencia del parásito pero si para la
diferenciación de las formas procíclica a metacíclica y el correcto desarrollo del ciclo de
vida del paráasito (Zhang et al, 2003).
A pesar de la ausencia de la enzima serin-palmitoiltransferasa en las formas
amastigote, se conoce que el parásito, en este estadio, presenta cantidades considerables
de esfingolípidos, lo que sugiere la existencia de un mecanismo alternativo para
compensar la falta de síntesis de novo de estos esfingolípidos. Una teoría indica que
Leishmania spp. sería capaz de internalizar glicoesfingolípidos de la célula hospedadora
para suplir sus propias necesidades (Winter et al, 1994). Las evidencias indican que
Leishmania spp. internaliza esfingolípidos del hospedador que son hidrolizados y
posteriormente reciclados en especies propias del parásito, lo que estaría indicando que
los esfingolípidos contribuyen a la supervivencia del parásito (Zhang et al, 2005).
Alternativamente, en ausencia de la enzima, es posible que las formas amastigote
sinteticen esfingolípidos complejos utilizando precursores de fuentes alternativas, por
Introducción
45
ejemplo, Leishmania donovani estimula la producción de ceramida en el hospedador, la
cual es internalizada por el parásito para posteriores modificaciones (Ghosh et al, 2002).
Ambos mecanismos permitirían mantener la estructura de la membrana del parásito
pero no permitiría, en principio, regular la síntesis de los diferentes esfingolípidos que
cumplen roles importantes como mensajeros secundarios en diferentes células y por lo
tanto todavía falta mucho para comprender el metabolismo de los esfingolípidos en
Leishmania spp.
2.2.4. Trypanosoma brucei
Trypanosoma brucei es un parásito protozoario perteneciente al Phylum
Kinetoplastida, familia Trypanosomatidae. Trypanosoma brucei es el agente etiológico
de la enfermedad del sueño africana que afecta a una gran variedad de animales y
también al hombre. Esta enfermedad causa un debilitamiento físico severo y anemia,
pudiendo causar la muerte si no es tratada correctamente y en forma rápida (Tomlinson
and Raper, 1998).
El ciclo de vida de este parásito incluye diferentes estadios dentro del
hospedador vertebrado como en el tracto digestivo del vector pero, a diferencia de lo
que ocurre en los otros parásitos de la familia Kinetoplastidae, todos los estadios de T.
brucei son extracelulares (www.cdc.gov).
Dentro de los Trypanosomátidos, tanto Trypanosoma cruzi como Leishmania
spp. sintetizan inositolfosfoceramida como principal esfingolípido complejo (Kaneshiro
et al, 1986) y se ha asumido en forma general que esto ocurre en todos los parásitos de
esta familia (Denny and Smith, 2004; Denny et al, 2006; Heung et al, 2006; Sonda and
Hehl, 2006). Sin embargo, los estadios procíclicos de T. brucei contienen
inositolfosfoceramida (Guther et al, 2006; Fridberg et al, 2008), pero también
cantidades significativas de esfingomielina tanto en las formas procíclicas como en las
formas sanguíneas del parásito (Patnaik et al, 1993). Estudios posteriores demostraron
que la inositolfosfoceramida es sintetizada por Trypanosoma brucei únicamente en el
estadio procíclico mientras que la esfingomielina es sintetizada en ambos estadios del
ciclo de vida del parásito. Además, se demostró la presencia de ceramida-1-
fosfoetanolamina en las formas sanguíneas de este parásito (Sutterwala et al, 2008).
Introducción
46
El estudio de las bases esfingosínicas presentes en los esfingolípidos de T. brucei
mostró que se encuentran presentes la esfingosina y la esfinganina. Las cantidades
relativas de los esfingolípidos conteniendo estas bases varían en función del estadio del
parásito. La ceramida y los esfingolípidos complejos derivados de la misma son
predominantes en las formas sanguíneas de T. brucei, mientras que la dihidroceramida
es más abundante en las formas procíclicas, lo que estaría indicando la existencia de una
regulación o expresión diferencial estadio-dependiente de la enzima dihidroceramida
desaturasa que es la responsable de convertir la dihidroceramida en ceramida mediante
la incorporación del doble enlace trans 4-5 (Sutterwala et al, 2008).
Por otra parte, el estudio de los glicoesfingolípidos en T. brucei llevó a la
determinación de la presencia de glucosilceramida y lactosilceramida como principales
componentes de la fracción de glicoesfingolípidos neutros. El análisis estructural de la
porción hidrofóbica de los mismos reveló la presencia ácidos grasos hidroxilados y no
hidroxilados. Estos glicoconjugados se encuentran principalmente en la membrana del
parásito (Uemura et al, 2006).
Se sabe que los glicoesfingolípidos en las superficies celulares actúan como
determinantes antigénicos y como mediadores de la respuesta inmune (Thompson and
Tillack, 1985; Hakomori, 1991). Se ha demostrado que durante infecciones parasitarias
se producen anticuerpos específicos contra los glicolípidos del parásito (Sjoberg at al,
1991; Orinda et al, 1993) y en el caso de los esfingolípidos los anticuerpos específicos
reconocen únicamente las especies que contienen ácidos grasos hidroxilados en su
estructura (Nakamura et al, 1989). De esta manera, los glicoesfingolípidos de T. brucei
son de gran interés ya que podrían actuar como potenciales antígenos de reconocimiento
del parásito y en consecuencia es necesaria una mejor caracterización de estos
compuestos y su metabolismo.
Finalmente, los estudios de inhibición de los primeros pasos en la biosíntesis de
los esfingolípidos indicaron que los mismos son esenciales para la viabilidad de T.
brucei, a diferencia de lo que ocurre con Leishmania spp. Sin embargo, todavía queda
pendiente determinar cuales son las especies de esfingolípidos que cumplen un rol
fundamental para el correcto desarrollo del parásito (Sutterwala et al, 2007).
Introducción
47
2.2.5. Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi es un parásito protozoario perteneciente al Orden
Kinetoplástida, familia Trypanosomatidae. Trypanosoma cruzi es el agente causante de
la enfermedad de Chagas que afecta a millones de personas en América central y en
América del sur. En la Argentina es una enfermedad endémica y se extiende en una
amplia zona de nuestro territorio.
El ciclo de vida de T. cruzi se completa en dos hospedadores, el hombre y el
insecto vector. Dentro del tracto digestivo del insecto, el parásito se diferencia desde las
formas epimastigote replicativas y no infectivas a las formas trypomastigote
metacíclicos que son las responsables de la infección de las células del hospedador
vertebrado. Cuando el hombre es infectado, el parásito invade las células de diferentes
tejidos donde se diferencia a amastigotes y se multiplica. Finalmente, se produce una
diferenciación y se liberan a la sangre nuevos trypomastigotes que pueden infectar otras
células o ser ingeridos por el insecto vector para completar su ciclo de vida en el
hospedador invertebrado (Hutchinson and Fujii, 1995).
Al igual de lo que ocurre en Leishmania spp, los principales esfingolípidos de T.
cruzi son la inositolfosfoceramida y sus derivados glicosilados. La enzima responsable
de la síntesis de inositolfosfoceramida ha sido caracterizada bioquímicamente en T.
cruzi (Figueiredo et al, 2005) y se ha encontrado una secuencia génica que codifica para
una inositolfosfoceramida sintasa putativa por homología con la enzima de hongos
(Denny et al, 2006). En estos parásitos la inositolfosfoceramida es uno de lo principales
componentes de las anclas de membranas de diferentes proteínas. Se ha comprobado
que la acción de fosfolipasas liberan ceramida-1-fosfato a partir de la
inositolfosfoceramida de la membrana de las formas metacíclicas de T. cruzi. La
ceramida-1-fosfato puede ser hidrolizada para dar ceramida y/o esfingosina y ser
reciclada en el metabolismo de los esfingolípidos (de Lederkremer et al, 1996).
Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en Leishmania spp., en T. cruzi se ha
descripto la presencia de esfingomielina en las formas epimastigotes (Quinones et al,
2004).
Por otra parte, los glicoesfingolípidos neutros de T. cruzi han sido más
ampliamente estudiados. Los principales glicoesfingolípidos presentes son las
hexosilceramidas conteniendo tanto glucosa como galactosa y la lactosilceramida. El
análisis estructural de estos compuestos aislados de diferentes cepas de T. cruzi mostró
Introducción
48
que los glicoesfingolípidos presentan diferentes ácidos grasos saturados,
monoinsaturados y -hidroxiácidos (Barreto-Bergter et al, 1992 y 1985.).
Existen anticuerpos monoclonales que reconocen las monohexosilceramidas que
reaccionan específicamente con galactosilceramidas que contienen ácidos grasos
hidroxilados pero no con aquellas que estan compuestas por ácidos grasos no
hidroxilados. Estas observaciones indicarían que el epitope inmunólogico requiere tanto
la estructura glicosídica como la presencia de los ácidos hidroxilados en la porción no
hidrofílica de estos glicoesfingolípidos (Nakakuma et al, 1989). Además esto sugiere
que los glicoesfingolípidos que contienen los ácidos grasos hidroxilados podrían tener
mayor inmunogenicidad in vivo que aquellos que contienen ácidos grasos no
hidroxilados (Villas-Boas, 2005).
Por otra parte, se sabe que los pacientes que padecen la infección crónica de T.
cruzi pueden desarrollar una cardiomiopatía inflamatoria. Un mecanismo posible del
desarrollo de la misma es la inducción de una respuesta autoinmune específica del
corazón (Tibetts et al, 1994). Una posible explicación de esta autoinmunidad generada
por esta enfermedad es la reactividad cruzada de los anticuerpos generados frente a
ciertos antígenos del parásito. Esta hipótesis sugiere que T. cruzi y la célula
hospedadora comparten antígenos comunes y que los anticuerpos producidos en
respuesta a la infección reconocen también los antígenos propios. Estudios realizados
mostraron que existen glicoesfingolipidos comunes en T. cruzi y en las células de
corazón de ratón. Ambos presentan la misma porción glicosídica y varían solamente en
la estructura de los ácidos grasos presentes en la ceramida. Los ácidos grasos
predominantes en las monohexosilceramidas de las células de corazón y de T. cruzi son
C18:0 hidroxilado y C24:0 hidroxilado, respectivamente. Estos descubrimientos
sugieren que los glicoesfingolípidos de las células de corazón podrían constituir una
clase de antígenos con reactividad cruzada (Vermelho et al, 1997). Debido a que el
corazón es el órgano más afectado en la enfermedad de Chagas, estos
glicoesfingolípidos comunes podrían ser los responsables, solos o en conjunto con otras
moléculas, de la autoinmunidad descripta en la patogenicidad de esta enfermedad.
También ha sido descripta la presencia de sulfogalactocerebrósidos en las
formas epimastigote de T. cruzi (de Lederkremer et al, 1985, Petry et al, 1988). Estos
compuestos son abundantes en los nervios periférios del hospedador (Roberts, 1991). Se
han encontrado anticuerpos contra estos glicoesfingolípidos sulfatados en pacientes con
la enfermedad crónica los cuales también podrían estar involucrados en las reacciones
Introducción
49
de autoinmunidad generadas por la infección de T. cruzi (Avila et al, 1993; Feldman et
al, 1999).
Por otro lado, en las formas trypomastigote de Trypanosoma cruzi se han
realizado diferentes incorporaciones con precursores marcados radioactivamente que
llevaron a la descripción de la presencia de fosfolípidos (Uhrig et al, 1997; Agusti et al,
2000), inositolfosfolípidos (Uhrig et al, 1996), sulfoglicolípidos (Couto et al, 1991;
Uhrig et al, 1992) y sialoglicolípidos (Couto et al, 1985).
Sin embargo, todavía no hay estudios realizados sobre las enzimas involucradas
en los diferentes pasos de la biosíntesis de novo de esfingolípidos en Trypanosoma
cruzi.
Introducción
50
3. Herramientas para el estudio de los esfingolípidos.
3.1. Análogos de esfingolípidos.
En los últimos años, el interés en el metabolismo de diferentes clases de lípidos
ha aumentado considerablemente y junto con ello se han desarrollado diferentes
técnicas y herramientas para su estudio.
En el caso de los esfingolípidos, una de las herramientas más ampliamente
utilizadas son los llamados análogos moleculares. Estos análogos son compuestos que
presentan pequeñas diferencias frente a los compuestos naturales de interés pero donde
las propiedades físico-químicas más importantes permanecen virtualmente idénticas
aunque pueden presentar un comportamiento levemente diferente en ciertos aspectos.
Las modificaciones que presentan los compuestos análogos introducen, dentro de la
estructura molecular, algún grupo que sea fácilmente detectable por alguna técnica
conocida (Ghidoni et al, 1999).
Existen diferentes clases de análogos que pueden diferenciarse en dos grandes
grupos, los análogos estructurales y los análogos funcionales. Los primeros mantienen
una estrecha relación estructural con los compuestos naturales y presentan propiedades
físico-químicas similares, mientras que los segundos, son moléculas poco relacionadas a
nivel estructural pero que presentan el mismo comportamiento dentro de los sistemas en
estudio.
El uso de los análogos de esfingolípidos ha aumentado considerablemente en la
última década ya que los mismos presentan un amplio espectro de posibles usos tanto en
bioquímica como en biología celular. Estos análogos son utilizados principalmente en el
estudio de las propiedades biológicas, el metabolismo, el tráfico intracelular y las
posibles funciones biológicas de los esfingolípidos naturales. Para el esclarecimiento del
posible mecanismo durante el tráfico intracelular de los esfingolípidos se han utilizado
en algunos casos análogos no metabolizables para evitar de esta manera el catabolismo
de los mismos y tener así la seguridad de estar observando la localización de los
esfingolípidos de interés y no la de los posibles metabolitos derivados del mismo.
También son ampliamente utilizados los análogos de esfingolípidos que contienen
ciertas modificaciones químicas específicas (en los dobles enlaces, en la estereoquímica
y/o en el grado de hidroxilación) que constituyen una herramienta útil para comprender
las especificidades moleculares de las enzimas relacionadas con el metabolismo de los
Introducción
51
mismos o los requerimientos estructurales necesarios para cumplir una función
específica.
Entre los análogos de esfingolípidos más conocidos hasta el momento, se
encuentran los análogos de cadena corta y los análogos fluorescentes que son los más
utilizados. En todos ellos hay que tener en cuenta que las modificaciones estructurales
respecto de los compuestos naturales, pueden generar diferencias en los
comportamientos biológicos de los mismos (Fig. 8).
3.2. Análogos fluorescentes
Treinta años atrás, Simoni y colaboradores demostraban que el ácido parinárico,
una familia de ácidos grasos fluorescentes naturales de 18 átomos de carbono con 4
dobles enlaces cis y/o trans conjugados (Fig. 9), podía ser utilizado para el estudio de
las propiedades físicas de de los ácidos grasos y fosfolípidos tanto in vitro como in vivo
(Sklar et al, 1975, Rintoul and Simoni, 1977). Desde entonces se han utilizado
OR
OH
NH
OCambios en las cadenas
Modificaciones de la configuración
Acortamiento de cadenas laterales
Empaquetamiento lateral Metabolismo Transporte intracelular
Transporte intracelular Capacidad para atravesar la membrana
Reconocimiento enzimático Eventos de señalización
Figura 8. Posibles modificaciones de esfingolípidos para el diseño de diferentes clases de análogos. En cada caso se indican los posibles cambios en el comportamiento de los esfingolípidos debido a las modificaciones estructurales del compuesto original. (Modificado de Ghidoni et al, 1999)
Introducción
52
diferentes compuestos fluorescentes lipofílicos con longitudes de onda de excitación y
emisión dentro del espectro visible a diferencia de lo que ocurre con los ácidos
parináricos, simplificando las técnicas de detección necesarias. El principal uso de todos
estos análogos desarrollados es el estudio de las propiedades físicas de las membranas
celulares y la elucidación de los mecanismos de transporte de los lípidos celulares.
Un gran avance en el campo de los análogos fluorescentes fue la introducción de
los NBD-esfingolípidos por el grupo de Pagano y colaboradores a partir del año 1981.
El grupo fluorescente NBD (nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol) (Fig. 9) es pequeño y
relativamente polar lo que hace que los NBD-esfingolípidos sean más solubles en
medios acuosos que los respectivos compuestos naturales haciendo más fácil su
utilización en incorporaciones metabólicas en diferentes tipos celulares. El hecho
fundamental que promovió la utilización de esta familia de análogos fue que la NBD-
ceramida actúa como un marcador específico del aparato de Golgi en células vivas
(Pagano et al, 1981; Lipsky and Pagano, 1985). Luego de la publicación de estos
resultados, estos análogos han sido ampliamente utilizados por diferentes grupos de
trabajo generando una importante fuente de datos topológicos (Pagano and Sleight,
1985). Incluso el uso de los NBD-esfingolípidos generó las bases para la hipótesis de
los “lipid rafts” (van Meer et al, 1987). Por otra parte, estos lípidos fluorescentes se
asemejan estructuralmente lo suficiente a los esfingolípidos naturales de mamíferos, y
se ha establecido que los mismos son reconocidos por las enzimas involucradas en las
vías metabólicas celulares de esfingolípidos.
A pesar de la existencia de numerosos trabajos publicados, en el año 1995, la
función de la NBD-ceramida como marcador específico del aparato de Golgi fue
cuestionada (Putz and Schwarzmann, 1995). Fue demostrado que la marcación de la
membrana del Golgi luego de la incorporación metabólica de NBD-ceramida se debe
principalmente a la formación de dos metabolitos fluorescentes de la misma, la NBD-
esfingomielina y la NBD-glucosilceramida. Si no se produce la síntesis de estos dos
compuestos, es fundamentalmente la membrana citoplasmática la que adquiere la marca
fluorescente.
Otros estudios están focalizados en el metabolismo, transporte y distribución
intracelular de los lípidos en una amplia variedad de cultivos celulares utilizando
diferentes NBD-esfingolípidos. Todos estos estudios se basan en el hecho de que estos
análogos son transferidos espontáneamente desde fuentes externas hacia las membranas
biológicas (Pagano and Sleight, 1985), y que los mismos presentan un comportamiento,
Introducción
53
dentro de la célula, que es igual al comportamiento de los compuestos naturales
(Rosenwald et al, 1992). A pesar de que esto es verdad en la mayoría de las situaciones,
hay que tener presente que la porción hidrofóbica de los análogos está modificada
estructuralmente lo que genera la existencia de algunas diferencias entre los
esfingolípidos naturales y los NBD-esfingolípidos. La principal y más crítica de estas
OH
O
Ácido parinárico (Ácido (9E, 11E, 13E, 15E)-octadeca-9,11,13,15-tetraenoico) ex= 325 nm; em= 420 nm.
N
O
N
NO2
NH2
NBD (nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol) ex= 470 nm; em= 530 nm.
N+
B-N
F F
BODIPY (4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diazo-s-indaceno) ex= 503 nm; em= 512 nm.
Pireno ex= 340 nm; em= 376 nm.
Figura 9. Estructuras químicas de los grupos fluorescentes más utilizados.
Introducción
54
diferencias es el hecho de que los esfingolípidos naturales no se transfieren
espontáneamente entre membranas intracelulares.
Los espectros de absorción y emisión de fluorescencia, los rendimientos
cuánticos y los coeficientes de extinción de los diferentes conjugados con el grupo NBD
dependen fuertemente del solvente utilizado y, de hecho, muchos de los conjugados no
son fluorescentes en medios acuosos. Los máximos de excitación y emisión son 470 y
530 nm respectivamente. Una de las principales desventajas de este cromóforo es que a
altas concentraciones se produce la auto-extinción y por lo tanto se pierde eficiencia en
la emisión de fluorescencia (Nichols and Pagano, 1981; Barak and Webb, 1982). Los
esfingolípidos marcados con el grupo NBD tienden a interaccionar en la interfase lípido
– agua de las membranas. Estudios biofísicos mostraron que, en membranas artificiales,
las cadenas laterales que contienen al grupo NBD en los esfingolípidos fluorescentes no
quedan completamente incorporadas en la bicapa lipídica sino que este grupo queda
hacia fuera en la interfase con el agua debido a sus características relativamente polares
(Fig. 10) (Chattopadhyay and London, 1988; Chattopadhyay, 1990; Wolf et al, 1992).
Posteriormente y debido a que los NBD-esfingolípidos no se asemejan
completamente a los esfingolípidos naturales, se introdujo un nuevo grupo fluorescente
para generar una nueva familia de esfingolípidos marcados, el 4,4-difluoro-4-bora-
3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY) (Fig. 9), el cual es un muy buen cromóforo,
relativamente no polar que permite una mejor incorporación dentro de la bicapa lipídica
Figura 10. Estructura tridimensional de A, esfingolípidos naturales; B, NBD-esfingolípidos; C, esfingolípidos conteniendo el grupo pireno, y D, esfingolípidos conteniendo el ácido graso pentainsaturado derivado del ácido parinárico (Modificado de van Meer and Liskamp, 2005)
A B C D
Introducción
55
de las membranas (Chen et al, 1997). Este compuesto tiene un coeficiente de extinción
mayor que el NBD ( > 80000 cm-1 M-1), un rendimiento cuántico de fluorescencia más
elevado, un ancho de banda de emisión más estrecho y un tiempo de vida del estado
excitado relativamente largo (típicamente 4 ns o mayor) (Johnson et al, 1991). Los
máximos de excitación y emisión para el grupo BODIPY son 503 y 512 nm
respectivamente. Adicionalmente, cuando estos análogos se encuentran en altas
concentraciones en las membranas, el grupo fluorescente muestra un corrimiento del
máximo de emisión hacia el rojo debido a la formación de exímeros (dímeros en el
estado excitado). El hecho de que la fluorescencia es dependiente de la concentración
(Pagano et al, 1991) fue utilizado para obtener información de la concentración de los
glicolípidos en los microdominios involucrados en los mecanismos de endocitosis
(Sharma et al, 2003). Sin embargo, las propiedades físico – químicas de los BODIPY-
esfingolípidos son también diferentes a aquellas de los esfingolípidos naturales (Wang
and Silvius, 2000) y por lo tanto permanece la incertidumbre sobre si su localización
intracelular es la misma que la de los compuestos naturales.
Otros análogos fluorescentes que se han utilizado a lo largo de los últimos años
son los que contienen la estructura del pireno (Fig. 9). El pireno tiene un rendimiento
cuántico y un tiempo de vida medio del estado excitado elevados (0,65 y 410 ns
respectivamente a 293 K en etanol como solvente) y posee la ventaja de ser un grupo no
polar. Los máximos de excitación y emisión son de 340 y 376 nm respectivamente. A
bajas concentraciones, el pireno emite fluorescencia en la longitud de onda cercana al
violeta como monómero pero a altas concentraciones, que son fácilmente alcanzadas en
las membranas se forman exímeros que emiten luz en el rango de longitudes de onda
correspondientes al verde. Los derivados del pireno son, en algunos casos sensibles a la
luz y por lo tanto deben ser muy bien protegidos de la luz solar. Los ácidos grasos
conjugados con el pireno resultan estables y mantienen propiedades similares a las de
los compuestos naturales (Somerharju, 2002). La principal desventaja que presentan los
esfingolípidos marcados con el pireno para el estudio del metabolismo es la
internalización de los mismos en la célula ya que no pueden atravesar la membrana
libremente (Agmon et al, 1991).
Finalmente, en los últimos años los ácidos parináricos han vuelto ha ganar
importancia debido al descubrimiento de que la incorporación de un quinto doble enlace
conjugado desplaza los máximos de excitación y emisión hacia la región de la luz
visible del espectro. Estos ácidos grasos fluorescentes fueron los primeros en ser
Introducción
56
incorporados eficientemente en los esfingolípidos celulares demostrando su semejanza
con los compuestos naturales y generando una nueva herramienta para el estudio de la
localización y comportamiento intracelular de los esfingolípidos naturales (Knerschner
et al, 2005).
Resultados y Discusión
Resultados y Discusión
57
1. Biosíntesis de esfingolípidos en Plasmodium falciparum.
Objetivos:
Elucidación y caracterización de la ruta biosintética de esfingolípidos neutros y
ácidos en Plasmodium falciparum.
Estudio de los efectos de inhibidores en la biosíntesis de esfingolípidos en los
diferentes estadios intraeritrocíticos de Plasmodium falciparum.
Determinación estructural de glicoesfingolípidos de Plasmodium falciparum.
Resultados y Discusión
58
1. Biosíntesis de esfingolípidos en Plasmodium falciparum.
1.1. Glicoesfingolípidos neutros.
En las células de mamíferos, la biosíntesis de los glicoesfingolípidos complejos
involucra la acción secuencial de glicosiltransferasas, comenzando con la formación de
la glucosilceramida a partir de la ceramida. En consecuencia esta primera reacción de
glicosilación de la ceramida, catalizada por la glucosilceramida sintasa, tiene un papel
de gran importancia dentro del metabolismo de los glicoesfingolípidos.
La síntesis de esta clase de glicolípidos parece ser una característica de todas las
células eucariotas. Sin embargo, el conocimiento acerca de la biosíntesis, estructura y
posibles funciones de los esfingolípidos y de los glicoesfingolípidos en los parásitos
protozoarios es muy limitado.
Los primeros estudios llevados a cabo en Plasmodium falciparum utilizando
como precursores metabólicos serina y ácidos grasos radioactivos no mostraron la
presencia de esfingolípidos complejos (Vial et al, 1990). Sin embargo, la posterior
utilización de diferentes ceramidas radioactivas o análogos fluorescentes de las mismas,
permitieron la determinación de la presencia de esfingomielina marcada en el parásito
(Haldar et al, 1991; Ansorge et al, 1995). Estos trabajos fueron los primeros en
demostrar la existencia de una enzima esfingomielina sintasa específica del parásito
presente en las formas intraeritrocíticas de Plasmodium falciparum (Lauer et al, 1995).
El estudio más detallado de esta enzima mostró la existencia de dos enzimas
responsables de la actividad enzimática de esfingomilina sintasa que presentan una
localización subcelular diferente y una sensibilidad diferenciada a inhibidores: una
enzima sensible que es inhibida en presencia de pequeñas concentraciones del inhibidor
(5mM) y otra menos sensible, cuya actividad es inhibida utilizando concentraciones del
inhibidor del orden de 25 mM. Mientras que esta última enzima es similar a la que se
encuentra en las células de mamíferos, la primera es característica del parásito.
La ceramida que es utilizada como sustrato por la esfingomielina sintasa es
también, en las células de mamíferos, el precursor inmediato de la biosíntesis de la
glucosilceramida. Sin embargo, en Plasmodium falciparum, durante años no fue posible
determinar la presencia de glucosilceramida ni de glicoesfingolípidos más complejos.
Este hecho llevó a la conclusión de que la enzima no estaba presente en las formas
Resultados y Discusión
59
Figura 11. Esquema de la biosíntesis de esfingolípidos en células de mamíferos donde se muestran los sitios de acción de diferentes inhibidores (Modificado de Gerold ans Schwarz, 2001).
intraeritrocíticas de Plasmodium falciparum o que la enzima del parásito no estaba
reconociendo el sustrato (Haldar et al, 1991).
Fue recién en el año 2001 que Gerold y Schwarz mostraron que Plasmodium
falciparum era capaz de biosintetizar glicoesfingolípidos neutros de novo a partir de
diferentes precursores marcados.
Estos autores mostraron la presencia de diferentes glicoesfingolípidos marcados
luego de realizar incorporaciones metabólicas con serina y glucosamina tritiadas. El uso
de precursores específicos junto con el protocolo de extracción de los lípidos y la
estabilidad frente a la hidrólisis alcalina permitió a los autores caracterizar a los
glicolípidos marcados como glicoesfingolípidos.
La identificación fue confirmada mediante ensayos de sensibilidad a diferentes
inhibidores conocidos del metabolismo de los esfingolípidos en células de mamíferos
(Fig.11). Sin embargo, la inhibición de la biosíntesis de esfingolípidos, en el parásito,
no resultó completa. Este hecho estaría indicando que los inhibidores utilizados no
llegan eficientemente al interior del parásito que se encuentra dentro de la célula
hospedadora o que las enzimas de Plasmodium falciparum son menos sensibles a estos
inhibidores. La presencia de Fumonisina B1, que en mamíferos inhibe eficazmente la
síntesis de la dihidroceramida, en Plasmodium falciparum, inhibe la síntesis de
glicoesfingolípidos pero no la de esfingomielina. Por otro lado, el DL-threo-1-fenil-2-
palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol (DL-threo-PPMP) utilizado en bajas
concentraciones es capaz de inhibir la formación de glicoesfingolípidos complejos en el
Palmitoil-CoA + Serina
3-cetoesfinganina
Esfinganina
Dihidroceramida
Ceramida
Glucosilceramida Esfingomielina
Mioricina Ciclo-serina
Fumonisinas
DL-t-PPMP (5M)
DL-t-PPMP (25M)
Resultados y Discusión
60
parásito, mientras que en las células de mamíferos se necesitan concentraciones
mayores para inhibir la biosíntesis de la glucosilceramida (Gerold and Schwarz, 2001).
Por otra parte, nuestro laboratorio determinó recientemente la presencia de una
glucosilcermida sintasa activa en los estadios intraeritrocíticos de Plasmodium
falciparum que presenta una especificidad de sustrato diferente a la enzima de
mamíferos. En el caso del parásito, la enzima actúa preferentemente sobre la
dihidroceramida y no sobre el compuesto insaturado que es lo que ocurre con la enzima
de mamíferos. En el mismo trabajo, se realizaron marcaciones metabólicas con ácido
[14C]-palmítico y [14C]-glucosa y el posterior análisis de los glicoesfingolípidos neutros
obtenidos mostró que la base de cadena larga mayoritaria de estos compuestos es la
esfinganina en contraste con la esfingosina que es la base que se encuentra en los
esfingolípidos de los eritrocítos. Esto evidencia una actividad específica de la enzima de
Plasmodium falciparum. El estudio del efecto del DL-threo-PPMP, descripto
previamente como un inhibidor involucrado en el metabolismo de los esfingolípidos,
mostró una inhibición de la actividad in vitro de la enzima glucosilceramida sintasa del
parásito. El efecto de este inhibidor agregado a los cultivos detiene el desarrollo de los
parásitos con una consecuente desaparición de los glicoesfingolípidos neutros (Couto et
al, 2004).
Teniendo en cuenta estos antecedentes en este trabajo se realizaron
incorporaciones metabólicas utilizando como precursores marcados análogos
fluorescentes de ceramida (NBD-Cer) y dihidroceramida (NBD-DHCer). En ambos
casos los sustratos se agregaron al medio de cultivo de los parásitos acoplados a BSA,
para aumentar su solubilidad, en una concentración final de 5 M. Los parásitos fueron
incubados bajo estas condiciones durante 24 horas y luego se purificaron los diferentes
estadíos intraeritrocíticos. Los lípidos fueron extraídos con cloroformo: metanol y
fueron purificados por una columna de intercambio aniónico DEAE-Sephadex (forma
acetato), recuperándose la fracción que no interacciona con la resina correspondiente a
los lípidos neutros y zwiteriónicos. Esta fracción fue posteriormente analizada por
cromatografía en capa delgada utilizando el sistema A como solvente de desarrollo (Fig.
12).
El análisis de los lípidos provenientes de igual número de parásitos de cada
estadío mostró que todas las formas intraeritrocíticas de Plasmodium falciparum son
capaces de utilizar ambos precursores en la biosíntesis de esfingolípidos más complejos,
siendo el estadío esquizonte el que presentó una mayor incorporación de los precursores
Resultados y Discusión
61
fluorescentes en los diferentes compuestos. En la figura 12 se observa que la
incorporación con NBD-dihidroceramida da como resultado la aparición de una banda
de movilidad equivalente a la del estándar de NBD-glucosildihidroceramida mientras
que los parásitos incubados en presencia de NBD-ceramida como precursor metabólico
biosintetizan como producto principal la NBD-esfingomielina. También es interesante
notar, teniendo en cuenta que ambos compuestos fluorescentes son internalizados por
las células de una manera equivalente (Martin et al, 1993; Kok et al, 1997; Tomás et al,
2004), que mientras la NBD-dihidroceramida incorporada por los parásitos no es
completamente metabolizada, no se observa NBD-ceramida remanente, siendo ésta
última completamente utilizada por los parásitos en la biosíntesis de diferentes
productos, especialmente esfingomielina, marcando una diferencia importante entre
ambos sustratos.
Estos resultados indicarían la existencia en Plasmodium falciparum de dos rutas
metabólicas no interconectadas entre si. Por una parte, la biosíntesis de novo de
Figura 12. Análisis por cromatografía en capa delgada desarrollada en el sistema A de solventes de los lípidos neutros del estadio esquizonte de Plasmodium falciparum. Linea 1: Incorporación con NBD-DHCer; Linea 2: Incorporación con NBD-Cer. En ambos casos se analizaron los lípidos provenientes de 8x107 parásitos.
NBD-DHGlcCer/ NBD-GlcCer
NBD-Cer NBD-DHCer
NBD-LacCer
NBD-SM
1 2
NBD-ácido
Resultados y Discusión
62
glicoesfingolípidos conteniendo como esqueleto la dihidroceramida y, en forma
paralela, el parásito tendría la capacidad de sintetizar esfingomielina a partir de
ceramida.
Para confirmar la independencia de las estas dos vías metabólicas paralelas se
realizó una incorporación con NBD-esfingomielina. Los lípidos de los parásitos fueron
extraídos y purificados como se describió anteriormente. El análisis por cromatografía
en capa delgada de la fracción correspondiente a los esfingolípidos neutros provenientes
de esta incorporación metabólica mostró que el parásito no es capaz de sintetizar NBD-
glucosilceramida a partir de la ceramida obtenida por la hidrólisis de la esfingomielina
incorporada al cultivo del parásito (Fig. 13A). Para confirmar este hecho se realizó un
segundo análisis de los lípidos utilizando el sistema B como solvente de desarrollo
donde se confirma la ausencia de NBD-glucosilceramida (Fig. 13B).
Figura 13. Análisis de los lípidos neutros purificados de los diferentes estadios de Plasmodium falciparum incorporados metabólicamente con NBD-esfingomielina. A, Cromatografía en placa delgada utilizando el sistema A como solvente de desarrollo, Linea 1: eritrocítos no infectados; Linea 2: Anillos; Linea 3: Trofozoítos; Linea 4: Esquizontes, en todos los casos se analizaron los lípidos provenientes de 1,8x108 parásitos. B, Cromatografía en placa delgada utilizando el sistema D como solvente de desarrollo de los lípidos provenientes de 3x107 parásitos del estadio trofozoíto.
NBD-Cer
NBD-GlcCer
NBD-SM
B A
1 2 3 4
NBD-Cer
NBD-GlcCer
NBD-SM
Resultados y Discusión
63
La incorporación de la NBD-esfingomielina mostró la ausencia de NBD-
Glucosilceramida así como también la ausencia de NBD-ceramida, lo cual estaría de
acuerdo con trabajos previos en los cuales se encontró un efecto antimalárico de la
ceramida. Ha sido demostrado que el agregado de ceramida exógena o de la enzima
esfingomielinasa bacteriana, que aumenta el nivel de ceramida por hidrólisis de la
esfingomielina, producen una inhibición del crecimiento de Plasmodium falciparum de
una manera dependiente del tiempo y la dosis (Pankova-Kholmansky et al, 2003). Ha
sido sugerido que el efecto antimalárico de la ceramida es a causa de que la misma
produce una disminución en los niveles de glutatión en la célula. El glutatión es el
responsable de la degradación de la ferriprotoporfirina IX que es un compuesto tóxico
generado por el parásito durante la digestión de la hemoglobina (Pankova-Kholmansky
and Flescher, 2006). En base a estos hechos, el parásito sólo generaría ceramida por
hidrólisis de la esfingomielina por acción de la SMasa propia del parásito en cantidades
necesarias para su reutilización evitando la acumulación de la misma que tendría un
efecto negativo para la supervivencia del mismo.
La confirmación de la identidad de los productos obtenidos a partir de los
diferentes precursores utilizados fue realizada por espectrometría de masa UV-MALDI-
TOF. Las muestras de lípidos neutros se analizaron utilizando como matrices ácido -
cianohidroxicinámico y ácido 2,4-dihidroxibenzoíco. Los espectros fueron obtenidos en
modo reflectrón positivo en todos los casos (Fig. 14). Los lípidos obtenidos a partir de
los parásitos incorporados con NBD-dihidroceramida como precursor muestra una señal
a m/z 739,9 que se corresponde con una estructura de NBD-hexosildihidroceramida
(m/z calculado 740,4) mientras que en el caso del espectro obtenido de la fracción
lipídica neutra purificada luego de la incorporación con NBD-ceramida se observa una
señal a m/z 743,7 correspondiente a una estructura de NBD-esfingomielina (m/z
calculado 742,5). En este último caso no es posible observar la señal correspondiente a
la NBD-hexosilceramida (m/z calculado 738,4) (Tabla I).
Considerando la ruta metabólica de los esfingolípidos en las células de
mamíferos, la dihidroceramida es convertida en ceramida por acción de la enzima
dihidroceramida desaturasa, responsable de la formación del doble enlace en la posición
4 (Futerman and Riezman, 2005). Sin embargo, los resultados obtenidos hasta el
momento en Plasmodium falciparum indicarían que este paso de la biosíntesis de los
esfingolípidos más complejos no ocurre en el parásito. Para determinar la presencia o
Resultados y Discusión
64
m/z obs m/z calc Posible estructura
NBD-DHCer
739,9 740,4 [NBD·DHGlcCer+H]+
763,3 762,4 [NBD·DHGlcCer+Na]+
778,9 778,4 [NBD·DHGlcCer+K]+
781,8 780,4 [NBD·DHGlcCer+Na+H2O]+
926,1 925,2 [NBD·DHLacCer+Na]+
NBD-Cer 743,7 742,5 [NBD·SM+H]+
786,6 786,4 [NBD·SM+2Na]+
Tabla I. Posibles estructuras correspondientes a las señales obtenidas por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF en modo reflectrón positivo.
Figura 14. Análisis por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF en modo positivo de los lípidos neutros. A, Incorporación de NBD-DHCer; B, Incorporación de NBD-Cer
668.
5
RP G14 Lip Neutros DHCer\0_G14\1\1SRef Raw
0
500
1000
1500
2000
2500
Inte
ns.
[a.u
.]
RP E18 Lip Neutros Cer\0_E18\1\1SRef Raw
0
1000
2000
3000
4000
5000
Inte
ns.
[a.u
.]
50 700 750 800 850 900
m/z
652.
9
695.
8
711.
4
739.
8
754.
5 76
3.3
778.
9 781.
8
797.
4
824.
7
840.
3
867.
6
883.
2
910.
5
926.
1
668.
4
727.
0
743.
7
771.
0
786.
6
A
B
Resultados y Discusión
65
ausencia de ceramida en las incorporaciones realizadas con NBD-dihidroceramida
como sustrato se realizó el análisis de la fracción de esfingolípidos neutros por
cromatografía en capa delgada en fase reversa (Fig. 15). El análisis de estos lípidos
mostró que la NBD-dihidroceramida no es biotransformada a NBD-ceramida. De la
misma forma, se observa que la incorporación metabólica de NBD-esfingomielina no
produce cantidades detectables de ceramida. Estos resultados confirmaron que
Plasmodium falciparum no es capaz de transformar la dihidroceramida en ceramida en
contraposición a lo que ocurre en células de mamíferos.
Finalmente, los datos obtenidos indican la existencia, en Plasmodium
falciparum, de dos vías metabólicas paralelas a diferencia de lo que ocurre en
mamíferos (Fig. 16). Por una parte, Plasmodium falciparum es capaz de biosintetizar
glicoesfingolípdos de novo a partir de serina y palmitoil-CoA. Sin embargo, la
estructura de estos glicoesfingolípidos sería diferente a la de los glicoesfingolípidos de
mamíferos ya que la base de cadena larga predominante en el parásito es la esfinganina
a diferencia de la esfingosina presente en los esfingolípidos de eucariotas superiores.
Paralelamente, el parásito sintetizaría su propia esfingomielina por medio de la
esfingomielina sintasa propia (Lauer et al, 2005; Haldar, 2001) utilizando como
precursor ceramida proveniente de la célula hospedadora. Esta ceramida, sería obtenida
a partir de la hidrólisis de la esfingomielina de la célula hospedadora por medio de la
NBD-CerNBD-DHCer
NBD-SM
1 2 3
Figura 15. Análisis de los esfingolípidos fluorescentes por cromatografía en capa delgada en fase reversa utilizando el sistema de solventes E. Linea 1, Incorporación de NBD-DHCer; Linea 2, Incorporación de NBD-Cer; Linea 3, Incorporación de NBD-SM.
Resultados y Discusión
66
esfingomielinasa propia del parásito que ya ha sido descripta (Hanada et al, 2000; Lauer
et al, 2001). Estas dos vías metabólicas son paralelas e independientes entre si debido a
la incapacidad del parásito de transformar la dihidroceramida sintetizada de novo en
ceramida. Este hecho estaría indicando la ausencia de la enzima responsable de este
paso de la biosíntesis. En efecto, es de destacar que esta enzima no se encuentra anotada
en la base de datos del genoma de Plasmodium falciparum (Plasmodb.org).
SCoA
OHC
COO-
NH3+
CH2OH+
Palmitoil-CoA L-serina
SPT
OH
O
NH23-Cetoesfinganina
3KS
OH
OH
NH2Esfinganina
DHCerS
OH
OH
NH
ODIHIDROCERAMIDA
GCS
R
O
OH
NHR
O
OHO
HOOH
OH
GLUCOSILDIHIDROCERAMIDA
Glicoesfingolípidos complejos.
SMasaPf
OH
OH
NH
O
R O
OH
NHR
O
P
O
O
O-
N+
Esfingomielina (Célula hospedadora)
CERAMIDA
R O
OH
NHR
O
P
O
O
O-
N+
Esfingomielina
Figura 16. Esquema de la biosíntesis de esfingolípidos propuesta para Plasmodium falciparum donde se muestran las dos rutas metabólicas paralelas que son independientes entre si.
Resultados y Discusión
67
1.1.1. Efecto del tamoxifeno en la biosíntesis de glicoesfingolípidos neutros.
El tamoxifeno, un derivado sintético del trifenileteno (Fig. 17), es un compuesto
no esteroide utilizado en el tratamiento del cáncer de mama debido a su capacidad de
actuar como antagonista del estrógeno al unirse competitivamente al receptor del mismo
(Coezy et al, 1982; Katzenellenbogen et al, 1983).
Sin embargo, ha sido demostrado que el tamoxifeno presenta una gran variedad
de actividades biológicas que aparentemente, no estarían relacionadas con el mecanismo
de acción como antagonista del estrógeno (Kellen, 1996). Algunas de estas actividades
son la protección contra la peroxidación de lípidos (Wiseman and Halliwell, 1994), la
inducción del factor de crecimiento (Knabbe et al, 1987), la modificación de la
actividad de proteína-kinasa C (O’Brien et al, 1985; Gundimenda et al, 1996; Lavie et
al, 1996), la activación de la señalización por lípidos como mensajeros secundarios
(Cabot et al, 1995) y la acción como antagonista de calmodulina (Rowlands et al,
1990).
A pesar de que ha sido demostrado que el tamoxifeno está involucrado en
diferentes aspectos del metabolismo de lípidos en diferentes células y tejidos, no se ha
encontrado todavía una clara evidencia de que esta droga este actuando sobre alguna
enzima en particular dentro de la ruta metabólica de lípidos. En 1996, Cabot y
colaboradores determinaron, en una línea celular de melanoma, que el tamoxifeno
inhibe la síntesis de glucosilceramida indicando que este compuesto tendría una acción
regulatoria sobre la biosíntesis de glicoesfingolípidos (Cabot et al, 1996).
O
N(CH3)2
Figura 17. Estructura química del tamoxifeno (2-[4-[(Z)-1,2-difenilbut-1-enil]fenoxi]-N,N-dimetiletanamina).
Resultados y Discusión
68
La existencia de otros mecanismos de acción del tamoxifeno independientes del
antagonismo con el estrógeno llevaron a un aumento en el interés sobre esta droga, ya
que la misma se encuentra en uso actualmente y por lo tanto están bien establecidos los
perfiles farmacológicos y farmacocinéticos de la misma.
Dentro de las enfermedades parasitarias, el tamoxifeno ha sido ensayado en el
caso de Leishmaniasis cutáneas, donde esta droga tiene un efecto anti-parasitario in
vitro (Miguel et al, 2007) e in vivo en ratones infectados (Miguel et al, 2008; Miguel et
al, 2009). En estos casos la acción del tamoxifeno es independiente de los receptores de
estrógeno pero todavía no se conoce cual sería el mecanismo efectivo de acción del
mismo.
En Plasmodium falciparum ha sido previamente estudiado el efecto que produce
el tamoxifeno sobre la internalización de diferentes metabolitos iónicos desde el exterior
de la célula hacia el parásito. Se sabe que los glóbulos rojos infectados aumentan la
permeabilidad de su membrana para una variedad de pequeños solutos polares que
incluyen aniones, cationes, aminoácidos, polioles y nucleósidos. Esto ocurre como
consecuencia de un nuevo mecanismo de transporte inducido por el parásito. Existen
evidencias que indicarían que este mecanismo es esencial para la adquisición de
nutrientes y el desecho de desperdicios producidos por el parásito por lo que la
inhibición de dicho transporte tendría importantes consecuencias en la supervivencia del
parásito (Kirk, 2001). Este transporte de nutrientes tiene características similares a las
de los canales iónicos clásicos (Kirk et al, 1994). Estos hechos llevaron a estudiar los
efectos de inhibidores de los canales iónicos sobre el transporte de nutrientes y la
inhibición del crecimiento del parásito entre los que se encuentran la mefloquina y el
tamoxifeno. Los resultados de estos estudios mostraron que estas drogas no tienen
implicaciones en el proceso de transporte de solutos como la colina y el lactato. Sin
embargo, la mefloquina presenta un efecto inhibitorio del crecimiento de Plasmodium
falciparum en cultivos mientras que el tamoxifeno no lo presenta en las concentraciones
ensayadas (Staines et al, 2004).
Teniendo en cuenta los antecedentes mencionados, se decidió probar el efecto
del tamoxifeno en el metabolismo de los glicoesfingolípidos de Plasmodium
falciparum. Para ello, se realizaron incorporaciones metabólicas con NBD-DHCer y
NBD-Cer como precursores de esfingolípidos más complejos, en presencia y ausencia
de tamoxifeno en el cultivo celular. Los lípidos fueron luego purificados a partir de cada
estadío intraeritrocítico como se describió anteriormente.
Resultados y Discusión
69
1 2 3 4
NBD-DHCer NBD-Cer
NBD-GlcCer
NBD-LacCer
NBD-SM
Figura 18. Análisis de los lípidos neutros de Plasmodium falciparum, formas esquizontes en presencia y ausencia de tamoxifeno. La cromatografía en capa delgada se desarrolló utilizando el sistema A de solventes. Línea 1, Incorporación de NBD-DHCer en ausencia de tamoxifeno; Línea 2, Incorporación de NBD-DHCer en presencia de tamoxifeno; Línea 3, Incorporación de NBD-Cer en ausencia de tamoxifeno; Línea 4, Incorporación de NBD-Cer en presencia de tamoxifeno. En todos los casos se analizaron los lípidos provenientes de 8x107 parásitos.
El análisis de los lípidos neutros fluorescentes provenientes del mismo número
de parásitos tratados y no tratados (Fig. 18) mostró que los esfingolípidos
biosintetizados aumentan en el caso de los parásitos tratados con tamoxifeno cuando se
utiliza como precursor la NBD-dihidroceramida, mientras que en el caso de incorporar
NBD-ceramida como sustrato, los lípidos fluorescentes resultantes se ven disminuidos
en una cantidad significativa. El perfil de esfingolípidos fluorescentes sintetizados a
partir de los dos precursores mostrado anteriormente se mantiene inalterado en
presencia de la droga, es decir, los principales esfingolípidos obtenidos a partir de la
NBD-dihidroceramida son los glicoesfingolípidos mientras que al utilizar la NBD-
ceramida como sustrato, no se observa NBD-glucosilceramida pero si una importante
cantidad de NBD-esfingomielina.
A pesar de que la cantidad de lípidos obtenidos a partir de la NBD-ceramida en
los parásitos tratados con la droga es considerablemente menor, es interesante observar
que todo el sustrato fluorescente incorporado es completamente metabolizado dado que
no se visualiza NBD-ceramida remanente. Considerando que el tamoxifeno no afecta la
Resultados y Discusión
70
incorporación de los precursores metabólicos fluorescentes, este hecho podría estar
indicando que la NBD-ceramida no es utilizada para la biosíntesis de esfingolípidos más
complejos, sino que la misma esta siendo convertida en esfingosina, la cual podría
entrar en la ruta de degradación completa. Es importante notar que la hidrólisis de la
NBD-ceramida para dar esfingosina implica la pérdida del grupo fluorescente utilizado
y, por lo tanto, no es posible, en estos experimentos, detectar el producto de esta
transformación.
Por otra parte, también se observó que la NBD-dihidroceramida utilizada como
precursor de la biosíntesis de esfingolípidos se mantuvo en exceso a pesar de que el
metabolismo de lípidos se vió aumentado en el caso del tratamiento con tamoxifeno.
Finalmente, a partir de los experimentos realizados con este inhibidor, se
observó que el tamoxifeno tiene una acción diferencial sobre cada una de las rutas
biosintéticas. Este hecho estaría corroborando la existencia de dos vías metabólicas
independientes, una que involucra a la dihidroceramida y los glicoesfingolípidos y la
otra que esta relacionada con la hidrólisis y biosíntesis de la esfingomielina (Fig. 16).
Paralelamente se realizaron ensayos del efecto de este inhibidor sobre el
crecimiento de los parásitos observandose que el tamoxifeno inhibe el crecimiento de
los parásitos en forma dependiente de la concentración. La concentración de tamoxifeno
que produjo el 50% de la inhibición en el crecimiento (IC50) fue de 1,7 mM a las 48 hs
de tratamiento.
1.2. Glicoesfingolípidos ácidos.
La presencia de glicoesfingolípidos ácidos ha sido determinada en una gran
variedad de células y tejidos. Dentro de los esfingolípidos ácidos, se encuentran
principalmente los ganglíosidos que contienen diferentes cantidades de ácido siálico en
su estructura y los sulfoglicoesfingolípidos que presentan monoésteres de sulfato. Estos
compuestos están presentes en la superficie de diferentes tipos celulares y ha sido
determinado que son participantes activos en procesos de adhesión celular en varios
sistemas. Existen evidencias que indican que estos esfingolípidos ácidos estarían
involucrados en la regulación de la proliferación celular, diferenciación y otros eventos
del desarrollo celular. Los glicoesfingolípidos sulfatados se encuentran como
componentes de la membrana plasmática de una gran variedad de células dentro de las
Resultados y Discusión
71
que se incluyen a los oligodendrocitos, las células renales tubulares y algunas células
tumorales. Estos glicoesfingolípidos parecen estar involucrados en la conducción
nerviosa y la adhesión celular aunque sus funciones fisiológicas específicas todavía
permanecen desconocidas (Pesheva et al, 1997; Kurosawa et al, 2000; Merten and
Thiagarajan, 2001; Merten et al, 2005; Shimazawa et al, 2005).
Existe una gran variedad de especies moleculares de sulfátidos en función de los
azúcares que contienen y de la estructura de la base esfingosínica que los compone, así
como también de los ácidos grasos que los conforman. La existencia de estas diferentes
especies parece estar relacionada con las funciones que los sulfátidos cumplen en
relación con la adhesón celular y su presencia en los microdominios de membrana
(Kobayashi et al, 1994).
Mientras que la biosíntesis y funciones de estos compuestos ha sido
ampliamente estudiada en células de mamíferos, los conocimientos acerca de los
mismos en parásitos protozoarios como Plasmodium falciparum son todavía muy
limitados.
Los antecedentes existentes en Plasmodium falciparum, indican que este
parásito no es capaz de biosintetizar ácido siálico (Schauer et al, 1984), lo cual
implicaría que este parásito no es capaz de biosintetizar gangliosidos propios.
En este trabajo se estudió la capacidad de sintetizar glicoesfingolípidos ácidos de
las formas intraeritrocíticas de Plasmodium falciparum, para lo cual los parásitos fueron
incorporados metabolicamente con ácido [14C]-palmítico, luego se extrajeron los lípidos
con cloroformo: metanol y los extractos obtenidos fueron fraccionados por
cromatografía de intercambio aniónico. La fracción correspondiente a los lípidos ácidos
fue eluída utilizando como solvente cloroformo: metanol: acetato de sodio 0,8M y
posteriormente hidrolizados en medio alcalino para eliminar los glicerolípidos
presentes. Las muestras provenientes de los tres estadios intraeritrocíticos se analizaron
por cromatografía en capa delgada mostrando en todos los casos la presencia de
compuestos marcados, además de las bandas de mayor Rf correspondientes a los ácidos
grasos marcados liberados durante la saponificación (Fig. 19). Cuando se analizaron los
lípidos provenientes de igual número de parásitos de cada uno de los estadios se
observó que se incorporó una mayor cantidad del precursor radioactivo en el estadio
esquizonte, en forma similar a lo que ocurre en los glicoesfingolípidos neutros (Couto et
al, 2004).
Resultados y Discusión
72
Paralelamente, se analizaron los glicoesfingolípidos ácidos provenientes de los
parásitos incorporados con [14C]-glucosa como precursor metabólico (Fig. 20A). En
este caso también se observaron compuestos marcados en los tres estadios
intraeritrocíticos de Plasmodium falciparum, sin embargo, la mayor incorporación de la
glucosa marcada fue observada en el estadio trofozoíto.
En ambas incorporaciones se determinó la presencia de dos compuestos
mayoritarios, SPf1 y SPf2, con una movilidad menor que el estándar de
sulfogalactosilceramida (GalCer-SO4) que resultaron de interés.
En otro experimento paralelo, se realizó la incorporación metabólica de un
análogo fluorescente de la ceramida como precursor (NBD-Cer). Los lípidos fueron
tratados de forma similar a la descripta anteriormente y la fracción correspondiente a los
lípidos ácidos fue analizada por cromatografía en capa delgada (Fig. 20B). Además de
los ácidos fluorescentes libres provenientes de hidrólisis parciales de los esfingolípidos,
fue posible determinar también la presencia de los compuestos SPf1 y SPf2, indicando
Figura 19. Análisis por cromatografía en capa delgada utilizando el sistema B de solventesde los lípidos ácidos de los diferentes estadios intraeritrocíticos obtenidos luego de la incorporación metabólica de ácido [14C]-palmítico. Linea 1, glóbulos rojos no infectados; Linea 2, Anillos; Linea 3, Trofozoítos; Linea 4, Esquizontes.
1 2 3 4
GalCer-SO4
SPf1
SPf2
Resultados y Discusión
73
que los mismos serían derivados de la ceramidas y confirmando, entonces, que
Plasmodium falciparum es capaz de sintetizar esfingolípidos ácidos.
Teniendo en cuenta los trabajos previos realizados en Plasmodium falciparum
que indican que el parásito no es capaz de sintetizar ácido siálico (Schauer et al, 1984) y
considerando que los inositolfosfolípidos fueron eliminados durante la saponificación a
la cual se sometieron las muestras, los compuestos obtenidos en las marcaciones
metabólicas realizadas podrían estar indicando la presencia de sulfoglicolípidos en
Plasmodium falciparum. Para determinar si estos compuestos presentan una naturaleza
de sulfoglicolípidos, se decidió realizar una incorporación metabólica con Na235SO4.
Los lípidos provenientes de los tres estadios intraeritrocíticos fueron extraídos y
purificados como se describió anteriormente. El análisis de los esfingolípidos ácidos
mostró compuestos marcados en todos los estadios (Fig. 21). En este caso, al igual que
en el caso de la incorporación de [14C]-glucosa, el Na235SO4 se incorporó en mayor
proporción en el estadio trofozoíto.
A
Figura 20. Análisis por cromatografía en capa delgada de los lípidos ácidos purificados a partir de las formas intraeritrocíticas de Plasmodium falciparum. A, Lípidos provenientes de la incorporación de [14C]-glucosa. La placa fue desarrollada en el sistema de solventes B. Línea 1, glóbulos rojos no infectados; Línea 2, Anillos; Línea 3, Trofozoítos; Línea 4, Esquizontes. B, Lípidos provenientes de la incorporación de NBD-Ceramida, formas trofozoítos. La placa fue desarrollada utilizando el sistema de solventes C.
1 2 3 4
SPf1
SPf2
GalCer-SO4
B
NBD-ácido
SPf1
SPf2
Resultados y Discusión
74
Cuando los lípidos fueron analizados por cromatografía en capa delgada (Fig.
21) se detectaron los dos mismos compuestos mayoritarios que en las dos
incorporaciones anteriores, SPf1 y SPf2. El hecho de que estos dos compuestos estén
presentes también en los lípidos obtenidos luego de la incorporación con sulfato
marcado hace suponer que los mismos serían sulfoglicolípidos.
En todos los casos, se realizaron incorporaciones de los mismos precursores
metabólicos marcados en eritrocitos no infectados y se analizaron los lípidos
provenientes de los mismos tratados de igual forma, observándose en todos los casos la
ausencia de compuestos marcados en cantidades significativas. Estos resultados
implican la existencia en Plasmodium falciparum de la maquinaria necesaria para la
biosíntesis de sulfoglicolípidos.
Para confirmar la naturaleza sulfolipídica del compuesto denominado SPf1, se
procedió a la desulfatación química del mismo. Para ello, se recuperó de la placa de
silicagel parte de este compuesto obtenido luego de la incorporación metabólica de los
parásitos con ácido [14C] palmítico, y se trató con 9mM H2SO4 en DMSO:Metanol
durante 3 horas a 80ºC. Luego de la correspondiente neutralización se analizaron los
productos obtenidos por cromatografía en capa delgada utilizando el sistema C como
Figura 21. Incorporación de Na235SO4 en los lípidos ácidos de los
estadios intraeritrocíticos de Plasmodium falciparum. A, Comparación de la radioactividad recuperada en la fracción de lípidos ácidos de cada uno de los estadios intraeritrocíticos; C, control de glóbulos rojos no infectados; A, Anillos; T, Trofozoítos; E, Esquizontes. B, Análisis de los lípidos ácidos marcados de los diferentes estadios por cromatografía en capa delgada desarrollada en el sistema de solventes B; Línea 1, Anillos; Línea 2, Trofozoítos; Línea 3, Esquizontes.
CP
M x
106 /
célu
la
0
1
2
3
4
5
6
7
C A T E
A
SPf2
SPf1
1 2 3
B
GalCer-SO4
Resultados y Discusión
75
solvente de desarrollo (Fig. 22). El análisis de los productos luego de la solvólisis
mostró la presencia de un nuevo compuesto de mayor movilidad que el compuesto
original SPf1 como consecuencia de la hidrólisis del grupo sulfato, confirmando la
naturaleza sulfolipídica de este compuesto,.
Continuando con la elucidación estructural de los dos compuestos, SPf1 y SPf2,
se llevó a cabo una metanólisis ácida para determinar los ácidos grasos componentes de
los mismos. Una vez realizada la hidrólisis y simultánea metilación de los ácidos grasos,
los mismos fueron extraídos y analizados por cromatografía en placa delgada de fase
reversa (Fig. 23). El análisis reveló la presencia de los ácidos grasos C16:0 y C18:0 en
SPf1 y C14:0 y C18:0 en SPf2, mayoritariamente.
Figura 22. Análisis de los productos luego de la solvólisis de SPf1. La placa se desarrollo utilizando el sistema C de solventes. Línea 1, SPf1 sin tratamiento; Línea 2, SPf1 luego de la hidrólisis.
SPf1
GalCer-SO4
1 2
C 14:0
C 16:0
C 18:0
C 20:0
1 2
Figura 23. Análisis por cromatografía en capa delgada en fase reversa desarrollada en el sistema de solventes F de los ácidos grasos metilados. Linea 1, ácidos grasos provenientes de SPf1; Línea 2, ácidos grasos provenientes de SPf2.
Resultados y Discusión
76
Con intención de realizar una mejor caracterización estructural de estos dos
compuestos biosintetizados por el parásito, se decidió realizar un análisis por
espectrometría de masa UV-MALDI-TOF. Para ello se realizó una extracción de los
lípidos provenientes de una muestra fría de Plasmodium falciparum de manera similar a
lo descripto previamente. Estos lípidos fueron purificados como se describió
anteriormente y la fracción correspondiente a los lípidos ácidos fue sometida a una
saponificación y analizada por cromatografía en capa delgada junto con una muestra de
lípidos proveniente de una incorporación metabólica con ácido [14C]-palmítico
procesada en forma idéntica a la anterior. Una vez revelada la placa, se extrajeron las
manchas correspondientes a SPf1 y SPf2 de la misma para ser analizadas por
espectrometria de masa UV-MALDI-TOF.
La muestra correspondiente al compuesto denominado SPf1 fue analizada en
modo lineal positivo utilizando como matriz ácido 2,4-dihidroxibenzoíco (Fig. 24). El
espectro mostró una señal a m/z 859,0 compatible con una estructura de
monohexosilceramida monosulfatada conformada por una base esfingosínica
monoinsaturada de 20 átomos de carbono (d20:1) acilada con un ácido graso saturado
de 18 átomos de carbono (C18:0) (m/z calculado 858,6; correspondiente al ión
molecular más sodio, [M+Na]+).
En contraste a estos resultados, el análisis por UV-MALDI-TOF de la muestra
correspondiente a SPf2 no mostró señales al realizar dicho análisis en el modo positivo.
Figura 24. Espectro de masa UV-MALDI-TOF en modo lineal positivo de SPf1 utilizando DHB como matriz.
[M+Na] +
masa/carga
Resultados y Discusión
77
Sin embargo, al realizar el análisis en modo negativo utilizando como matriz nor-
Harmano, tanto en modo lineal como en modo reflectrón (Fig. 25A y B), se obtuvieron
señales intensas que pudieron ser utilizadas para determinar la posible estructura del
compuesto. El espectro obtenido en modo lineal negativo muestra una señal a m/z 913.5
consistente con una monohexosilceramida disulfatada compuesta por una base
esfingosínica monoinsaturada d20:1 acilada en la posición 2 con el ácido graso C18:0
(m/z calculado, [M-H]- 914,5). El espectro realizado en modo reflectrón negativo
permitió obtener una mayor información acerca de la estructura de este compuesto al
mostrar algunas fragmentaciones inducidas por el láser dentro de la fuente
(fragmentaciones “in source”). La perdida del grupo sulfato genera una señal a m/z
817,7 (m/z calculado 817,6) correspondiente al ión [M-H-HOSO3]-. La pérdida
consecutiva de otro grupo sulfato da una señal a m/z 720,5 (m/z calculado 720,6) que
confirma la existencia de los dos grupos sulfato en el ión molecular. También se
observa la perdida de una molécula de agua a partir del ión molecular generando la
señal a m/z 895,7 (m/z calculado 896,5). Otras señales significativas son las que se
Figura 25. Espectro de masa UV-MALDI-TOF de SPf2 utilizando nor-Harmano como matriz. A, Modo lineal negativo; B, Modo lineal reflectrón.
B A
masa/carga
masa/carga
Resultados y Discusión
78
observan a m/z 647,5 correspondiente a la pérdida a partir del ión molecular del ácido
graso C18:0 (m/z calculado 648,3) y a m/z 629,7 que se genera del anterior por pérdida
de agua (m/z calculado 630,3). Estas últimas señales indican que el compuesto de
interés se encuentra acilado con el ácido graso C18:0 mayoritariamente y esta
información se encuentra en concordancia con la obtenida a partir de los ensayos de
incorporación metabólica con ácido [14C]-palmítico, que se mostraron anteriormente.
Finalmente, el ión más abundante que se observa a m/z 645,6 también corresponde al
fragmento obtenido por la ruptura de la base esfingosínica entre los carbonos C2 y C3.
El ión generado por esta ruptura corresponde a la hexosa disulfatada más el fragmento
C1 a C2 de la base esfingosínica incluyendo el ácido graso en la posición 2 (m/z
calculado 645,3) (Esquema I).
Finalmente, los estudios estructurales realizados permitieron identificar dos
sulfoglicolípidos biosintetizados por Plasmodium falciparum. Los mismos fueron
identificados como una monohexosilceramida monosulfatada y como una
monohexosilceramida disulfatada. En ambos casos la base esfingosínica presente
resultó ser la esfingosina, de manera similar a lo que ocurre en las células de mamíferos.
O
HN
OH
O
H(SO3)O
H(SO3)O
hex
m/z 645.3
m/z 817.6
m/z 720.6
m/z 648.3
- H2O
m/z 730.3
Esquema I
[M-H ]- = 914,5
Resultados y Discusión
79
1.2.1. Efecto del DL-t-PPMP en la biosíntesis de glicoesfingolípidos ácidos.
Teniendo en consideración los resultados anteriores, se decidió profundizar en el
estudio sobre los glicolípidos ácidos de Plasmodium falciparum y su ruta metabólica.
Para ello se decidió evaluar cuales son los efectos del inhibidor DL-threo-1-fenil-2-
palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol (DL-t-PPMP) (Fig. 26) en la biosíntesis de los
sulfoglicolípidos.
En Plasmodium falciparum, el DL-t-PPMP ha sido descripto como un potente
inhibidor del desarrollo intraeritrocítico. Los anillos formados en presencia de la droga
no contienen las estructuras tubulares que conforman la red de membranas tubulares, la
cual es indispensable para la continuidad del ciclo intraeritrocítico. Por el contrario, los
estadíos trofozoíto y esquizonte, que ya contienen esta red de membranas perfectamente
desarrollada, no se ven afectados por la presencia de la droga (Lauer et al, 1995 y 1997;
Gerold and Schwarz, 2001).
Por otra parte, trabajos previos de nuestro laboratorio mostraron que el
tratamiento con DL-t-PPMP inhibe eficientemente la la síntesis in vitro de
glicoesfingolípidos neutros (Couto et al, 2004).
Para determinar los efectos de este inhibidor en la síntesis de sulfoglicolípidos,
se realizaron ensayos de incorporaciones metabólicas en presencia de la droga. Se
OH
NH
N
O
(CH2)14-CH3
O
Figura 26. Estructura química del DL-threo-1-fenil-2-palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol (DL-t-PPMP).
Resultados y Discusión
80
SPf1
SPf2
1 2 3 4 5 6 7
Figura 27. Análisis de la fracción correspondiente a los lípidos ácidos purificados marcados con ácido [14C]-palmítico obtenidos a partir de los parásitos cultivados en presencia y ausencia de PPMP. Líneas 1, 3 y 5, lípidos correspondientes a los parásitos no tratados colectados en los estadíos anillo, trofozoíto y esquizonte respectivamente; Líneas 2, 4 y 6, lípidos correspondientes a los parásitos tratados con PPMP en los estadíos anillo, trofozoíto y esquizonte respectivamente; Línea 7, control de glóbulos rojos no infectados. La placa de silica gel fue desarrollada en el sistema de solventes B.
realizaron marcaciones utilizando [14C]-glucosa y ácido [14C]-palmítico en cultivos
tratados con DL-t-PPMP previamente durante 24 horas. Simultáneamente se realizaron
ensayos en ausencia de la droga como controles de las incorporaciones metabólicas. Los
lípidos fueron extraídos a partir de las diferentes formas intraeritrocíticas aisladas y
posteriormente purificados como se describió anteriormente para obtener la fracción de
los lípidos ácidos.
Como era esperado, se observaron alteraciones en el crecimiento en los parásitos
tratados con DL-t-PPMP. Como había sido demostrado previamente (Couto et al, 2004),
en este caso se observó que el tratamiento de los cultivos de parásitos con este inhibidor
detiene el desarrollo del parásito. De esta manera, los parásitos colectados en el estadío
anillo que fueron aquellos que recibieron la droga en el estadío trofozoíto
Resultados y Discusión
81
(aproximadamente 40 horas antes) se vieron muy poco afectados. Sin embargo, se
obtuvo una menor cantidad de parásitos en el estadío esquizonte ya que los mismos
recibieron el inhibidor en el estadío anillo y en consecuencia no fueron capaces de
desarrollar la red de membranas tubulares necesaria para su supervivencia. A pesar de
obtener una cantidad considerablemente menor de parásitos en el estadio esquizonte, el
hecho de que el ácido [14C]-palmítico es activamente incorporado en todos los estadios,
permitió realizar el análisis de los esfingolípidos ácidos provenientes del mismo número
de parásitos de los tres estadíos intraeritrocíticos por cromatografía en capa delgada
(Fig. 27). El análisis mostró un efecto importante en la biosíntesis de los
sulfoglicolípidos principalmente en los estadíos anillo y esquizonte donde se observa
una clara disminución en la biosíntesis de los diferentes esfingolípidos ácidos.
Por otro lado, la cantidad de [14C]-glucosa incorporada en los estadíos más
tempranos del ciclo intraeritrocítico tratados con DL-t-PPMP, no fue suficiente para
poder realizar una comparación de la biosíntesis de los glicolípidos ácidos en los
diferentes estadíos. De todas maneras, se pudo observar la presencia de los compuestos
Figura 28. Análisis por cromatografía en capa delgada desarrollada en el sistema de solventes C de la fracción correspondiente a los lípidos ácidos purificados marcados con [14C]-glucosa obtenidos a partir de los parásitos cultivados en presencia y ausencia de DL-t-PPMP. Línea 1, Lípidos provenientes de esquizontes no tratados; Línea 2, Lípidos provenientes de esquizontes tratados con PPMP.
SPf2
SPf1
1 2
Resultados y Discusión
82
SPf1 y SPf2 en la fracción de esfingolípidos ácidos proveniente de los esquizontes no
tratados, mientras que la fracción análoga proveniente de los esquizontes tratados con el
inhibidor mostró una clara disminución en los niveles de los esfingolípidos marcados
sintetizados (Fig. 28).
Para evaluar los efectos producidos por el DL-t-PPMP en los primeros pasos de
la biosíntesis de los glicoesfingolípidos ácidos, se realizó una incorporación metabólica
utilizando como precursor biosintético la NBD-dihidroceramida. El ensayo se realizó en
las mismas condiciones detalladas anteriormente y se obtuvieron los lípidos ácidos
correspondientes que se analizaron por cromatografía en capa delgada.
La incorporación del análogo de la dihidroceramida fue eficiente aunque no fue
posible obtener cantidades de parásitos viables suficientes para realizar el análisis en los
tres estadíos intraeritrocíticos debido al efecto del DL-t-PPMP. En consecuencia,
solamente se analizaron los lípidos ácidos en el estadío esquizonte, observándose una
disminución de los esfingolípidos biosintetizados por el parásito (Fig. 29).
Para profundizar el estudio de los efectos de inhibidores en la ruta metabólica de
los esfingolípidos ácidos del parasito, se realizó una incorporación metabólica de NBD-
Figura 29. Análisis de la fracción de lípidos ácidos provenientes de la incorporación de NBD-dihidroceramida en las formas esquizonte de Plasmodium falciparum. Línea 1, Parásitos control, Línea 2, Parásitos tratados con Tamoxifeno; Línea 3, Parásitos tratados con PPMP.
SPf1
SPf2
1 2 3
Resultados y Discusión
83
dihidroceramida en presencia de otro probable inhibidor, el tamoxifeno, que se había
utilizado previamente para el estudio de la biosíntesis de los esfingolípidos neutros. Los
parásitos fueron tratados con el tamoxifeno durante 24 horas y luego se agregó el
precursor marcado con el grupo fluorescente. Los lípidos se purificaron y se analizó la
fracción correspondiente a los esfingolípidos ácidos. Al igual que en el caso del DL-t-
PPMP, se determinó que el tamoxifeno produce una disminución considerable de la
biosíntesis de los esfingolípidos ácidos propios del parásito (Fig. 29).
Los resultados obtenidos permitieron determinar la estructura de dos
sulfoglícolípidos propios del parásito. Los mismos se encuentran presentes en los tres
estadíos intraeritrocíticos, y aunque son compuestos presentes en una pequeña
proporción podrían presentar un papel importante en la estabilización estructural y física
de la membrana o bien podrían estar involucrados en el fenómeno de adhesión que
presentan los glóbulos rojos infectados (Silamut et al, 1999). Finalmente, en este trabajo
se determinó que la biosíntesis de los sulfoglicolípidos tiene un comportamiento
diferencial en los tres estadíos intraeritrocíticos del parásito. Este hecho sugiere la
existencia de una regulación de los niveles de sulfátidos a lo largo del ciclo de vida del
parásito. Sin embargo, todavía se requieren más estudios para clarificar los posibles
roles biológicos de los sulfátidos en el desarrollo de Plasmodium falciparum y/o en la
patogénesis de la enfermedad.
Resultados y Discusión
84
2. Biosíntesis de esfingolípidos en Trypanosoma cruzi.
Objetivos:
Caracterización de la ruta biosíntetica de esfingolípidos en las formas
epimastigote de Trypanosoma cruzi.
Estudio de los efectos de diferentes inhibidores en la biosíntesis de
esfingolípidos en Trypanosoma cruzi.
Resultados y Discusión
85
2. Biosíntesis de esfingolípidos en Trypanosoma cruzi.
2.1. Biosíntesis de glicoesfingolípidos neutros. Efecto de diferentes inhibidores.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en Plasmodium falciparum, se
decidió estudiar la biosíntesis en otros parásitos protozoarios para poder determinar si
esta diferencia en las rutas metabólicas de los esfingolípidos es una característica
exclusiva de Plasmodium falciparum, o si es compartida por otros hemoparásitos. Se
decidió entonces realizar el estudio de la biosíntesis de esfingolípidos en formas
epimastigote de Trypanosoma cruzi, debido a la experiencia del laboratorio en el
estudio del mismo.
La biosíntesis de los esfingolípidos ha sido estudiada como posible blanco de
drogas antiparasitarias en algunas especies de Leishmania y Trypanosomas. El potencial
de esta ruta metabólica como blanco de drogas antiparasitarias en estas dos especies está
relacionado con la importancia que tienen estos compuestos en procesos celulares
claves como la diferenciación celular y la invasión de la célula hospedadora sumado al
hecho de que la vía biosintética de estos organismos es diferente de la que existe en
mamíferos (Salto et al, 2003; Zhang et al, 2003; Denny et al, 2004) (Fig. 30).
Sin embargo, se ha encontrado que Trypanosoma cruzi, además de biosintetizar
inositolfosfoceramida, es capaz de producir esfingomielina (Quinones et al, 2004) y
diferentes glicoesfingolípidos como galactosilceramida, glucosilceramida,
lactosilceramida y sulfogalactosilceramida. Estos últimos han sido extensamente
estudiados llevando a una identificación estructural detallada de los mismos que mostró
que dichos esfingolípidos están compuestos por una esfingosina de 18 átomos de
carbono y una amplia variedad de ácidos grasos (Barreto-Bergter et al, 1985; Petry et al,
1988; Barreto-Bergter et al, 1992). Sin embargo, todavía no se conocen las enzimas
involucradas en la biosíntesis de los mismos.
Teniendo en cuenta los antecedentes existentes sobre los glicoesfingolípidos de
T.cruzi, se infiere que en estos parásitos la biosíntesis de los esfingolípidos neutros es
similar a la de mamíferos y no a la de Plasmodium falciparum, ya que los
glicoesfingolípidos estudiados hasta el presente contienen como base de cadena larga la
esfingosina al igual de lo que ocurre en las células de mamíferos.
A partir de estos conocimientos se decidió profundizar en el estudio de la
biosíntesis de los esfingolípidos en formas epimastigote de Trypanosoma cruzi,
Resultados y Discusión
86
realizando incorporaciones metabólicas utilizando como precursor un análogo
fluorescente de ceramida (NBD-ceramida). Los parásitos fueron incubados en presencia
de este precursor por 24 horas y luego fueron cosechados por centrifugación. Los
lípidos fueron extraídos utilizando cloroformo: metanol y posteriormente purificados
por intercambio iónico en una columna de DEAE-Sephadex (forma acetato) para
obtener los esfingolípidos neutros en la primera fracción. El análisis por cromatografía
en capa delgada de los lípidos fluorescentes obtenidos a partir de este precursor mostró
la presencia de cantidades significativas de esfingolípidos fluorescentes entre los que se
encuentran glucosilceramida y esfingomielina (Fig. 31) confirmando la existencia de
una única vía metabólica a diferencia de lo que ocurre en Plasmodium falciparum.
Para obtener mayor información acerca de esta ruta metabólica en Trypanosoma
cruzi, se decidió ensayar el efecto de diferentes inhibidores del primer paso de
Figura 30. Rutas metabólicas alternativas de la biosíntesis de esfingolípidos en los diferentes organismos. PC: fosfatidilcolina; PI: fosfatidilinositol; DAG: diacilglicerol.
Mamíferos Kinetoplástidos, hongos y plantas
Serina + Palmitoil-CoA
Ceramida
Esfingomielina (SM)
Inositolfosfoceramida (IPC)
PC PI
DAG DAG
Glucosilceramida (GlcCer)
3-cetoesfinganina
Esfinganina
Dihidroceramida
Aureobasidina A
Resultados y Discusión
87
glicosilación en la biosíntesis de los glicoesfingolípidos. Los inhibidores elegidos
fueron DL-t-PPMP y tamoxifeno, ambos inhibidores de la glucosilceramida sintasa en
células de mamíferos (Radin et al, 1993). El DL-t-PPMP (Fig. 26) actúa como análogo
de la ceramida y produce la desaparición de los glicoesfingolípidos en las células de
mamíferos, al tiempo que produce un aumento importante en el nivel de ceramida que
se cree es el responsable de la citotoxicidad de este compuesto (Tifft and Proia, 2000).
Como consecuencia de la acción de este inhibidor se observa una inhibición del
crecimiento celular in vitro (Abe et al, 1995; Abe and Shayman, 1998; Lee et al, 1999).
Por otra parte, este inhibidor ha sido ensayado en Plasmodium falciparum donde se ha
visto que actúa sobre la biosíntesis de glicoesfingolípidos y también sobre la enzima
esfingomielina sintasa, produciendo una inhibición en el crecimiento del parásito (Lauer
et al, 1995 y 1997; Gerold and Schawrz, 2001; Couto et al, 2004).
El tamoxifeno, como se menciono anteriormente, ha sido propuesto en algunos
tipos de células de mamíferos como un inhibidor de la glucosilceramida en células de
mamíferos y además ha sido ensayado en Leishmania como inhibidor del crecimiento
del parárito (Miguel et al, 2007).
Para determinar los efectos de estos inhibidores en la biosíntesis de
esfingolípidos en Trypanosoma cruzi, se realizaron incorporaciones metabólicas con
NBD-ceramida en presencia de estos compuestos en una concentración de 10 M. Los
parásitos fueron cosechados y los lípidos fueron purificados como se describió
previamente y se analizaron los lípidos provenientes de igual número de parásitos por
cromatografía en capa delgada (Fig. 31). Los resultados mostraron que el perfil de
lípidos fluorescentes sintetizados a partir del precursor incorporado se mantiene igual en
ausencia o presencia de los inhibidores. Sin embargo, se observa un cambio en las
cantidades totales de los esfingolípidos sintetizados. El tratamiento con DL-t-PPMP
produce una pequeña disminución en la cantidad de esfingolípidos neutros sintetizados
por el parásito. Por el contrario, el tamoxifeno produce un aumento de la biosíntesis.
Debido a la magnitud de estas diferencias, las mismas son difíciles de determinar por
cromatografía en placa delgada por lo que se realizó el estudio de estas mismas
muestras por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). De esta manera, se
analizaron los esfingolípidos fluorescentes obtenidos a partir de igual número de
parásitos, utilizando un HPLC equipado con un detector de fluorescencia (Fig. 32). En
este caso se cuantificó la NBD-glucosilceramida biosintetizada en las diferentes
condiciones a partir de las áreas de los picos correspondientes. Los resultados
Resultados y Discusión
88
mostraron una clara inhibición de la biosíntesis de glucosilceramida en el caso del
tratamiento con DL-t-PPMP y un aumento de la síntesis de este compuesto en presencia
de tamoxifeno en el medio de cultivo (Fig. 33).
Paralelamente, durante las incorporaciones metabólicas y tratamientos con
inhibidores descriptas anteriormente, se monitoreó el crecimiento de los parásitos por
microscopía para determinar el efecto de estos compuestos en el crecimiento celular de
Trypanosoma cruzi. Luego de 48 horas de tratamiento se observó una disminución en el
crecimiento de los parásitos en presencia de los dos inhibidores aunque el efecto del DL-
t-PPMP sobre el crecimiento es significativamente mayor que el del tamoxifeno en las
Figura 31. Análisis por cromatografía en capa delgada en el sistema de solventes A de los lípidos neutros obtenidos a partir de la incorporación metabólica de NBD-ceramida en T. cruzi, formas epimastigote. Línea 1, Incorporación de NBD-Ceramida control; Línea 2, Incorporación de NBD-Ceramida en presencia de 10 M de t-PPMP; Línea 3, Incorporación de NBD-Ceramida en presencia de 10 M Tamoxifeno.
NBD-GlcCer
NBD-Cer
NBD-LacCer
NBD-SM
1 2 3
Resultados y Discusión
89
NB
D-G
lcC
er
NB
D-C
er
NB
D li
bre
NB
D-L
acC
er
A
B
C
tr (minutos)
Flu
ores
cenc
ia
Figura 32. Análisis de los lípidos neutros por HPLC. A, Incorporación con NBD-ceramida; B, Incorporación con NBD-ceramida en presencia de 10 M DL-t-PPMP; C, Incorporación con NBD-ceramida en presencia de 10 M Tamoxifeno.
Resultados y Discusión
90
concentraciones ensayadas (Fig. 34). Las concentraciones utilizadas fueron aquellas que
están descriptas que no producen un efecto citotóxico visible en las células de
mamíferos (Radin et al, 1993).
Finalmente, se realizó un ensayo sobre los efectos de estos inhibidores en las
formas trypomastigote de ratones infectados (Tabla II). En este caso se encontró que las
concentraciones de estos compuestos utilizadas producen una lisis muy significativa de
las formas sanguíneas de este parásito.
Por consiguiente, los resultados obtenidos muestran que el DL-t-PPMP produce
una importante inhibición del crecimiento del parásito y además tiene un efecto
específico sobre la síntesis de glucosilceramida haciendo disminuir su concentración en
Tabla II. Efecto de los inhibidores DL-t-PPMP y tamoxifeno en trypomastigotes sanguineos de ratones infectados.
PPMP
Tamoxifeno
Inhibidor Concentración
(M)
10 - 50
10
Lisis de los parásitos (%)
79 – 95,5
90 0 %
2 0 %
4 0 %
6 0 %
8 0 %
1 0 0 %
1 2 0 %
Cont r ol PPM P T amoxi f enoControl +PPMP (10 M)
+Tamox. (10 M)
Cre
cim
ietn
o ce
lula
r (%
) 100%
62%
78%
Figura 34. Efecto sobre el crecimiento in vitro de los inhibidores DL-t-PPMP y tamoxifeno en las formas epimastigote de Trypanosoma cruzi.
Figura 33. Cuantificación a partir de las áreas correspondientes obtenidas durante el análisis por HPLC del efecto de los inhibidores sobre la biosíntesis de NBD-Glucosilceramida en Trypanosoma cruzi, formas epimastigote.
% a
ctiv
idad
0
20
40
60
80
100
120
140
Control PPMP Tamoxifeno
Resultados y Discusión
91
la célula. Esto podría estar indicando una estrecha relación entre la síntesis de
glicoesfingolípidos y la supervivencia del parásito, indicando que estos compuestos
serían indispensables para el parásito.
Finalmente, el tamoxifeno, presenta una muy alta eficiencia en la lisis de las
formas trypomastigote de Trypanosoma cruzi, al tiempo que genera un aumento de la
biosíntesis de glicoesfingolípidos. Esto estaría indicando que el tamoxifeno actua sobre
la biosíntesis de glicoesfingolípidos aunque probablemente este compuesto también este
afectando alguna otra ruta metabólica del parásito que resulte indispensable para su
supervivencia.
Resultados y Discusión
92
3. Caracterización de la GlucosilCeramida Sintasa (GCS) de Plasmodium
falciparum.
Objetivos:
Purificación de la enzima GlucosilCeramida Sintasa presente en los estadios
intraeritrocíticos de Plasmodium falciparum.
Caracterización y determinación de la posible localización subcelular de la
GlucosilCeramida Sintasa.
Resultados y Discusión
93
3. Caracterización de la GlucosilCeramida Sintasa (GCS) de Plasmodium
falciparum.
En la biosíntesis de los glicoesfingolípidos la primera enzima que actúa es la
glucosilceramida sintasa (UDP-Glucosa:Ceramida glucosiltransferasa, GCS), la cual es
responsable del primer paso de glicosilación de la ceramida y/o dihidroceramida. Esta
enzima cataliza la transferencia de glucosa desde UDP-glucosa hacia la ceramida
generando como resultado la glucosilceramida, el glicoesfingolípido más simple.
3.1. Purificación de la GCS de Plasmodium falciparum.
La glucosilceramida sintasa fue originalmente descripta por Basu y
colaboradores en el año 1968 en el cerebro de embriones de pollo (Basu et al, 1968).
Sin embargo, el estudio de esta enzima no fue una tarea sencilla debido a la dificultad
de solubilizar y purificar la misma. Algunos años después diferentes estudios sobre la
GCS determinaron la presencia de esta enzima en ratas (Durieux et al, 1990), la
existencia de dos isoformas de la enzima, una presente en cerebro y la otra en hígado
que presentan diferentes propiedades (Vunnam and Radin, 1979) y la existencia de un
compuesto capaz de inhibir la actividad enzimática específica (Inokuchi and Radin,
1987).
Actualmente se sabe que la glucosilceramida se encuentra esencialmente en
todos los animales y en una gran variedad de plantas (Nakayama et al, 1995; Lynch et
al, 1997). Por su parte, hasta la actualidad la glucosilceramida sintasa ha sido
identificada y clonada en varios organismos como humanos (Ichikawa et al, 1996),
ratón (Ichikawa et al, 1998), C. elegans, C. albicans, P. pastoris, M. grisea, G.
arboreum (Leipelt et al, 2001) y Drosophila melanogaster (Kohyama-Koganeya et al,
2004). Las enzimas descriptas hasta el momento no muestran similitud con ninguna otra
glicosiltransferasa descripta anteriormente. Adicionalmente, las secuencias de
aminoácidos de las diferentes glucosilceramidas sintasa presentan una muy baja
homología de secuencia entre sí.
Resultados y Discusión
94
En base a los antecedentes existentes y teniendo en cuenta los resultados previos
del laboratorio, que confirman la existencia de una glucosilceramida sintasa activa en
las formas intraeritrocíticas de Plasmodium falciparum, se decidió proceder a la
purificación de la enzima para poder realizar una caracterización más completa de la
misma. Previamente, nuestro laboratorio había determinado la presencia de una enzima
activa en el parásito con una especificidad de sustrato diferente a la enzima de
mamíferos, la cual actúa específicamente sobre ceramida presentando además una alta
estereoespecificidad. La GCS caracterizada en higado de rata es activa sobre el isómero
natural erythro- pero no sobre el isómero threo- de la ceramida (Paul et al, 1996). La
enzima de Plasmodium falciparum, en cambio, actúa, in vitro, específicamente sobre la
dihidroceramida y no sobre el sustrato insaturado (Couto et al, 2004). Estos resultados
fueron también corroborados mediante incorporaciones metabólicas in vivo que se
describieron anteriormente.
Se decidió realizar la purificación de la posible GCS del parásito utilizando dos
procedimientos en paralelo, mediante una inmunopurificación y una cromatografía de
afinidad a colorantes.
3.1.1. Inmunopurificación de la GCS de Plasmodium falciparum.
Se decidió comenzar el estudio de la enzima realizando la purificación de la
enzima del parásito por inmunoafinidad utilizando anticuerpos policlonales anti-GCS
humana, gentilmente cedidos por los Drs. Marks y Pagano. Estos anticuerpos fueron
desarrollados en conejo utilizando como antígenos polipéptidos sintéticos, construidos
en base a regiones hidrofílicas de la secuencia deducida de aminoácidos de la GCS
humana (Ichikawa et al, 1996; Marks et al, 1999).
La inmunopurificación se llevó a cabo a partir de formas esquizonte de
Plasmodium falciparum ya que es el estadío intraeritrocítico que muestra una mayor
actividad de síntesis de glucosilceramida (Couto et al, 2004). Los parásitos purificados
por centrifugación en gradiente de Percoll se lisaron mediante 3 ciclos de sonicado a
0ºC en buffer estabilizante (Buffer Hepes 50mM, 100 mM KCl, 20% glicerol
conteniendo inhibidores de proteasas) y se centrifugaron a 4ºC para eliminar células
Resultados y Discusión
95
enteras remanentes. La muestra sin ningún otro tratamiento se aplicó en una columna de
inmunoafinidad específica equilibrada previamente en buffer Hepes 50mM pH 7,4
conteniendo 0,5M NaCl.
Esta columna de inmunoafinidad fue preparada a partir de los anticuerpos
policlonales 1.2 (correspondientes a una zona cercana al extremo N-terminal de la GCS
humana) (Fig. 39) purificados por precipitación con sulfato de amonio al 33% y
posterior afinidad a proteína A-Sepharosa. Los anticuerpos fueron luego acoplados a la
matriz de Sepharosa activada con bromocianógeno. Luego de la realización de la
reacción de acoplamiento, se lavó la columna recuperando los anticuerpos excedentes.
La cuantificación de los anticuerpos antes y después de la reacción de acople se utilizó
para determinar el porcentaje de ligando acoplado a la matriz de Sepharosa y poder de
esta manera estimar la capacidad de la columna (Tabla III).
.
La muestra de parásitos aplicada en la columna de inmunoafinidad se dejó
interactuar durante toda la noche a 4ºC, posteriormente se eluyó con el mismo buffer
equilibrante para eliminar la fracción que no interactuó con los ligandos y luego se
realizó la elución de la fracción específica con buffer Hepes 50mM pH 7,4 con el
agregado de 2M MgCl2, colectandose fracciones consecutivas de 2 ml cada una (Marks
et al, 1999).
La purificación fue monitoreada por determinación de la actividad enzimática
específica (Fig. 35) y las fracciones que presentaban dicha actividad fueron analizadas
por SDS-PAGE y Western-blot (Fig. 36).
Tabla III. Cuantificacióna de las IgGs 1.2 anti-GCS humana y cálculo de la eficiencia del acople a la matriz de Sepharosa.
IgG 1.2
Antes Después Acopladas % acople
11,85 mg 2,43 mg 9,42 mg 79,5
Capacidadb
2,8 mg
a La cuantificación de las IgGs fue realizada por el método de Bradfrord. b La capacidad fue calculada en base al peso molecular teórico de la GCS humana.
Resultados y Discusión
96
La inmunopurificación realizada utilizando los anticuerpos anti-GCS humana
dió como resultado la obtención de una fracción que presenta la actividad específica de
glucosilceramida sintasa utilizando como sustrato la dihidroceramida. La misma
fracción mostró una única banda al ser analizada por SDS-PAGE seguida de una tinción
tradicional de plata. La misma banda fue reconocida por el anticuerpo correspondiente
al analizar la fracción por SDS-PAGE en condiciones reductoras seguido por un
Western-blot (Fig. 36). Estos hechos indican la existencia de una única proteína de peso
molecular aparente de aproximadamente 70000 Da responsable de la actividad
específica de glucosilceramida sintasa en las formas esquizonte de Plasmodium
falciparum. Este resultado establece otra diferencia entre la enzima del parásito y la de
mamíferos ya que se observó una gran diferencia entre los pesos moleculares de las
mismas. La enzima reconocida por este mismo anticuerpo a partir de un homogenato de
células de hígado de rata presenta un peso molecular aparente de 38 kDa (Marks et al,
1999) y el peso molecular teórico calculado a partir de la secuencia es de 44,8 kDa
Figura 35. Ensayo de actividad específica de GCS utilizando como sustrato NBD-DHCer. Los productos de la reacción se analizaron por cromatografía delgada en el sistema A de solventes. Línea 1, Lisado de formas esquizonte; Línea 2, Fracción correspondiente a la elución con 2M MgCl2.
NBD-DHGlcCer
NBD-DHCer
1 2
Resultados y Discusión
97
(Ichikawa et al, 1996). Esta pequeña discrepancia existente entre el peso molecular
experimental y el teórico es justificada por el grupo de Pagano como una consecuencia
de que la proteína migra en forma anómala en los geles de poliacrilamida debido a su
carácter fuertemente hidrofóbico (Marks et al, 1999).
Como ya ha sido determinado, la enzima del parásito presenta una especificidad
de sustrato diferente a la de mamíferos, indicando una importante diferencia entre estas
dos enzimas. Sin embargo, el anticuerpo realizado contra la GCS de mamíferos es capaz
de reconocer la enzima de Plasmodium falciparum indicando cierto grado de similitud.
La existencia de esta similitud entre las proteínas, de todas formas, no indica ni implica
una conservación de la secuencia de aminoácidos. Para que se produzca el
reconocimiento de la proteína por el anticuerpo empleado solamente es necesaria la
presencia de una región que mantenga una estructura tridimensional similar al epitope
utilizado en la preparación del anticuerpo. El hecho significativo de que la enzima de
Plasmodium falciparum no sea reconocida bajo condiciones no reductoras sería un
indicio de que el epitope reconocido por el anticuerpo utilizado se encuentra, en el caso
de la GCS del parásito, protegido por la estructura secundaria y/o terciaria de la proteína
o debido a la formación de oligómeros de la proteína como esta descripto en mamíferos
(Marks et al, 1999), impidiendo la correcta interacción entre el anticuerpo y la proteína,
durante el ensayo de Western-blot.
94 kDa 109 kDa
51,7 kDa
35,9 kDa
29,5 kDa
1 2
97,4 kDa
66,2 kDa
45,0 kDa
31,0 kDa
A B
Figura 36. A, Análisis por Western-blot de la fracción eluída con 2M MgCl2
utilizando para el revelado el anticuerpo 1.2 anti-GCS humana, Línea 1, Muestra sin reducir; Línea 2, Muestra reducida por tratamiento de -mercaptoetanol a 100ºC por 3 minutos; B, La misma fracción analizada por SDS-PAGE seguida de tinción de plata tradicional.
Resultados y Discusión
98
3.1.2. Purificación de la GCS de Plasmodium falciparum por afinidad a colorantes.
Paralelamente a la inmunopurificación de la GCS, se decidió realizar una
purificación alternativa de esta enzima por afinidad a colorantes utilizando una resina de
Green-dye agarosa. Ha sido descripto que algunos colorantes textiles se unen a
diferentes proteínas, especialmente aquellas que presentan sitios activos de unión para
nucleótidos (Haeckel et al, 1968; Kopperschlager, 1968). La afinidad de estos
colorantes por el sitio de unión a un nucleótido específico no puede ser predicha. Las
interacciones que existen entre las proteínas y los colorantes pueden deberse tanto a las
similitudes estructurales entre los sustratos/cofactores y los colorantes, como también a
propiedades hidrofóbicas o de intercambio iónico y por lo tanto no es posible
predecirlas. Esta descripto en la bibliografía que ciertas proteínas requieren el agregado
de cationes divalentes para que la unión con el colorante sea efectiva (Hughes et al,
1982). Por otra parte, los detergentes no iónicos son incompatibles con estas resinas ya
que encapsulan en micelas a los colorantes que se encuentran inmovilizados evitando
que las proteínas puedan quedar retenidas. En cambio, bajas concentraciones de
detergentes aniónicos son repelidos por las cargas negativas que presentan la mayoría de
estos colorantes y, por lo tanto, no interfieren con la afinidad de las proteínas
(Stellwagen, 1990). En función de estas consideraciones, el método más efectivo para la
determinación de la capacidad de unión de una determinada proteína consiste en realizar
un ensayo en pequeña escala con los diferentes colorantes disponibles (Scopes, 1986).
En nuestro caso, se decidió la utilización del colorante verde (Reactive Green) en base a
datos de literatura (Paul et al, 1996).
Esta purificación fue llevada a cabo a partir de formas esquizonte de
Plasmodium falciparum. Los parásitos fueron tratados en forma similar a lo descripto
anteriormente. La muestra fue aplicada en una columna conteniendo el colorante
inmovilizado y previamente equilibrada en buffer Hepes 50mM pH 7,4, a una velocidad
de 20 ml/hora para que las interacciones fueran efectivas. La columna fue luego eluída
secuencialmente con buffer Hepes 50mM pH 7,4 conteniendo 0,15M KCl; buffer Hepes
50mM pH 7,4 suplementado con 20mM UDP-Glucosa y 20mM -NAD y por último
buffer Hepes 50mM pH 7,4 conteniendo 1M KCl. La elución con UDP-Glucosa es un
paso de elución específica basado en la competencia del sitio de unión de la proteína por
el sustrato original y el colorante.
Resultados y Discusión
99
Las diferentes fracciones obtenidas durante la elución fueron analizadas por
SDS-PAGE seguido de una tinción de plata tradicional y un Western-blot empleando el
anticuerpo anti-GCS humana 1.2 para el revelado. Paralelamente, se realizó el ensayo
de la actividad específica de la enzima para determinar la presencia de la misma en las
fracciones obtenidas (Fig. 37).
Los resultados obtenidos mostraron la presencia de una proteína de peso
molecular aparente de 65500 Da, fácilmente visualizable por tinción de plata tradicional
en la fracción eluída de la columna de Green-dye agarosa en forma específica con UDP-
Glucosa. La misma banda fue reconocida por el anticuerpo anti-GCS humana solamente
en condiciones reductoras como fue observado anteriormente para la proteína purificada
Figura 37. A, Análisis por SDS-PAGE seguido por tinción de plata tradicional de las diferentes fracciones eluídas de la columna de Green-dye agarosa. Línea 1, Elución con 0,15M KCl; Línea 2, Elución con 20mM UDP-Glc + 20mM -NAD; Línea 3, Elución con 1M KCl. B, Análisis por Western-blot de la fracción eluída con UDP-Glucosa utilizando para el revelado el anticuerpo 1.2 anti-GCS humana, Línea 1, Muestra reducida por tratamiento de -mercaptoetanol a 100ºC por 3 minutos; Línea 2, Muestra sin reducir. C, Ensayo de actividad de GCS utilizando como sustrato NBD-DHCer de las mismas fracciones obtenidas luego de realizar la columna de afinidad a colorantes. Los productos de reacción fueron analizados por cromatografía en capa delgada con el sistema de solventes A. Línea 1, Elución con 0,15M KCl; Línea 2, Elución con 20mM UDP-Glc + 20mM -NAD; Línea 3, Elución con 1M KCl. Se indican los pesos moleculares de los estándares expresados en kDa.
31,0
66,2
45,0
97,4
1 2 3 A
1 2 3
NBD-DHCer
NBD-DHGlcCer
NBD-SM
C
35,9
94
51,7
109
B 1 2
Resultados y Discusión
100
por inmunoafinidad. La misma fracción también mostró actividad de GCS en las
condiciones ensayadas sugiriendo la identidad de la proteína como la posible
glucosilceramida sintasa de Plasmodium falciparum. Sin embargo, se observó una
pequeña diferencia en la migración de las proteínas purificadas por los diferentes
métodos durante el análisis por SDS-PAGE, posiblemente debido a las diferentes
condiciones de preparación de las muestras.
Con el objeto de realizar una mejor caracterización de la proteína responsable de
esta actividad enzimática, se decidió someter a la proteína purificada a diferentes
tratamientos. La proteína purificada por afinidad al colorante fue tratada en condiciones
desnaturalizantes (-mercaptoetanol y ditiotreitol, 3 minutos, 100ºC) y en paralelo se
realizó el tratamiento de la misma con una N-glicanasa (PNGasa F) para determinar la
presencia de glicosilación como una posible modificación post-traduccional de la
misma. Luego de los diferentes tratamientos se analizaron los resultados por SDS-
PAGE y las bandas fueron visualizadas por tinción de plata tradicional (Fig. 38).
Los resultados mostraron que tanto el tratamiento desnaturalizante por
calentamiento como por agregado de DTT, no afectan en forma significativa la proteína
estudiada. Sin embargo, el tratamiento con -mercaptoetanol muestra un corrimiento de
la banda correspondiente a la proteína hacia pesos moleculares más altos, lo que podría
estar implicando un cambio de conformación que hace que la proteína migre en forma
anómala. Finalmente, el tratamiento con la enzima N-glicanasa no mostró un
corrimiento apreciable de la banda de la proteína. Sin embargo, la apariencia de la
banda de la proteína se vio modificada observandose, en este último caso, una banda
Figura 38. Analisis por SDS-PAGE y visualización por tinción de plata de los diferentes tratamientos aplicados sobre la proteína purificada. Línea 1, Proteína sin tratamiento; Línea 2, Tratamiento en baño a 100ºC durante 3 minutos; Línea 3, Tratamiento con DTT en baño a 100ºC durante 3 minutos; Línea 4, Tratamiento con -mercaptoetanol en baño a 100ºC durante 3 minutos; Línea 5, Tratamiento con -mercaptoetanol en baño a 100ºC durante 3 minutos seguido de tratamiento con la enzima PNGasa durante 18 horas a 37ºC. Los pesos moleculares de los estándares utilizados están expresados en kDa.
1 2 3 4 5
97,4 66,2
45,0
31,0
PNGasa F
Resultados y Discusión
101
REGIÓN TRANSMEMBRANA
COOH NH2
5 6 2 1
11 32 33 52 57 78 257 280 372 394
H169
H193
H26
Figura 39. Esquema de la secuencia de la enzima GCS de mamíferos donde se muestran las secuencias correspondientes a los epitopes utilizados por el grupo del Dr. Pagano para obtener los anticuerpos policlonales anti-GCS. Los anticuerpos fueron denominados GCS-1; GCS-2; GCS-5 y GCS-6 y se muestran marcados en verde en la figura. (Modificado de Marks et al, 1999).
más definida. Este resultado, entonces, no sería concluyente para determinar la
presencia de N-glicosilación en esta proteína. Si la proteína presentara una baja
glicosilación, la eliminación de estas cadenas no produciría un cambio observable en el
peso molecular aparente determinado a partir de un análisis por SDS-PAGE pero si
podría observarse una banda más definida debido a la eliminación de la
microheterogeneidad que le confiere a la proteína las cadenas glicosídicas.
3.2. Localización subcelular de la GCS de Plasmodium falciparum.
Paralelamente a la caracterización de la actividad enzimática de la GCS de
mamíferos, ha sido determinado que la síntesis de la glucosilceramida ocurre en la
superficie citosólica del aparato de Golgi mientras que las posteriores reacciones de
glicosilación necesarias para la biosíntesis de los glicoesfingolípidos complejos tienen
lugar en la cara lumenal de la misma organela (Brandli et al, 1988; Futerman and
Pagano, 1991; Trinchera et al, 1991; Jeckel et al, 1992; Lannert et al, 1994). En base a
estos resultados, la glucosilceramida debería ser transportada hacia el interior del Golgi
para poder ser utilizada como precursor de los glicoesfingolípidos más complejos. Este
hecho ha generado un gran interés en el estudio de la topología de la GCS debido a que
la misma podría estar actuando como una flipasa al mismo tiempo de actuar como
glucosiltranferasa.
Resultados y Discusión
102
La utilización de programas para la predicción de la estructura de la proteína a
partir de la secuencia primaria de aminoácidos muestra que la misma tendría una
estructura tipo de clase III. Estas proteínas presentan un segmento N-terminal corto en
la región lumenal, un único segmento transmembrana y una larga porción ubicada en la
región citosólica (Spiess, 1995). Estos resultados serían consistentes con la orientación
citosólica de la enzima que ha sido propuesta en base a los resultados de estudios
realizados con proteasas y los anticuerpos policlonales dirigidos contra diferentes
epitopes (Marks et al, 1999) (Fig. 39). Estos resultados sugieren que el extremo N-
terminal de la GCS de mamíferos (epitope GCS-1) y un loop que contiene el epitope
GCS-6, ubicado inmediatamente después de la región transmembrana putativa, se
encuentran inmersos en un ambiente acuoso en la cara citosólica de la membrana del
aparato de Golgi ya que ambos epitopes son fácilmente asequibles por los anticuerpos y
son fácilmente degradados por la tripsina. En contraste, el epitope GCS-5 esta protegido
del ambiente acuoso por otras porciones de la proteína o por posibles interacciones con
la membrana (Marks et al, 1999).
Para obtener una primera aproximación sobre la localización subcelular de la
enzima GCS de Plasmodium falciparum se realizó un análisis por inmunofluorescencia
indirecta. Para ello se prepararon láminas finas de eritrocitos infectados sobre
portaobjetos que fueron fijadas en metanol frío. Luego de ser bloqueadas, las muestras
fueron incubadas con una dilución del anticuerpo de conejo anti-GCS humana y
posteriormente con el segundo anticuerpo anti-conejo conjugado con rodamina. En este
caso, se utilizaron dos anticuerpos correspondientes a dos fragmentos de la enzima
humana, el anticuerpo 1.2 que reconoce un segmento cercano al extremo C-terminal y el
anticuerpo 5.1 que reconoce una zona adyacente al extremo N-terminal.
Las mismas muestras fueron tratadas con marcadores fluorescentes de diferentes
estructuras intracelulares, Tracker Blue White como marcador de la estructura de tipo-
Golgi del parásito e ioduro de propidio como marcador del núcleo. Las muestras fueron
analizadas en un microscopio confocal de fluorescencia. Las células fueron iluminadas
con las longitudes de onda específicas de cada marcador fluorescente utilizado y
posteriormente las imágenes fueron superpuestas para determinar la localización de la
enzima GCS en Plasmodium falciparum. Paralelamente las células fueron visualizadas
por contraste de fases.
Los resultados obtenidos a partir de la superposición de las imágenes
correspondientes a los anticuerpos 1.2 y a los marcadores de las estructuras subcelulares
Resultados y Discusión
103
Figura 40. Localización subcelular de GCS de Plasmodium falciparum. Reconocimiento de trofozoitos y esquizontes tempranos por el suero de conejo policlonal anti-GCS humana y co-localización con el marcador de estructuras tipo Golgi. Reconocimiento de los estadios intraeritrocíticos por I -Anti GCS humana-Rodamina, II -marcador de estructuras tipo Golgi, III - imagen de contraste de fase, IV -superposición de las imágenes I y II.
I II
IV III
permitieron determinar la presencia de la enzima GCS en la estructura de tipo Golgi que
se encuentra presente en los estadios intraeritrocíticos de Plasmodium falciparum (Fig.
40). Como era de esperar, fue posible determinar la completa ausencia de la enzima en
el núcleo del parásito ya que no se observó co-localización al realizar la superposición
de las imágenes correspondientes (Fig. 41). Resultados similares se obtuvieron para el
anticuerpo 5.1.
Estos datos confirman, entonces, la presencia de la enzima en el parásito y
presentan evidencias de que la misma se encuentra localizada exclusivamente en la
Resultados y Discusión
104
Figura 41. Localización subcelular de GCS de Plasmodium falciparum. Reconocimiento de trofozoitos y esquizontes tempranos por el suero de conejo policlonal anti-GCS humana. Se observa la no co-localización con el marcador de núcleo. Reconocimiento de los estadios intraeritrocíticos por I -Anti GCS humana-Rodamina, II -marcador de núcleo, III - imagen de contraste de fase, IV -superposición de las imágenes I y II.
I II
III IV
estructura de tipo Golgi. Sin embargo, todavía son necesarios estudios complementarios
para determinar la topología de la GCS de Plasmodium falciparum y de esta manera
contar con mayor cantidad de información para realizar una completa comparación con
lo que ocurre con la enzima presente en las células de mamíferos.
Recientemente también ha sido clonada la enzima UDP-Galactosa:Ceramida
galactosiltransferasa de mamíferos, cuya secuencia muestra homología con las
glucuronosiltransferasas involucradas en el metabolismo de drogas (Schulte and Stoffel,
1993). Es interesante notar el hecho de que, aunque las enzimas glucosilceramida
sintasa y galactosilceramida transferasa catalizan reacciones muy similares, la
Resultados y Discusión
105
comparación de las dos secuencias correspondientes ha mostrado una extremadamente
baja homología (Schulte and Stoffel, 1993; Ichikawa et al, 1996). Se ha encontrado
además que la galactosilceramida transferasa tiene una importante homología con las
glucuroniltransferasas involucradas en el metabolismo de algunas drogas. Por otra parte,
la galactosilceramida transferasa se encontraría localizada en la cara interna del retículo
endoplásmico (Drake et al, 1992) a diferencia de lo que ocurre con la glucosilceramida
sintasa que se encuentra localizada en la membrana del aparato de Golgi. Estas dos
observaciones, la falta de homología de las secuencias y la diferente localización
subcelular, sugieren fuertemente que estas dos enzimas tienen distintos orígenes
evolutivos y, en consecuencia, funciones biológicas diferentes.
Resultados y Discusión
106
4. Caracterización de la GlucosilCeramida Sintasa (GCS) de Trypanosoma cruzi.
Objetivos:
Estudio de la GlucosilCeramida Sintasa en Trypanosoma cruzi.
Caracterización y determinación de la localización subcelular de la enzima
GlucosilCeramida sintasa del párasito.
Resultados y Discusión
107
4. Caracterización de la GlucosilCeramida Sintasa (GCS) de Trypanosoma cruzi.
4.1. Determinación de la presencia de una GCS activa en Trypanosoma cruzi.
Paralelamente al estudio realizado de la enzima GCS de Plasmodium
falciparum, se decidió ampliar el estudio de esta enzima en otros parásitos protozoarios,
comenzando por las formas epimastigote de Trypanosoma cruzi, debido a la experiencia
del laboratorio en el estudio del mismo.
Existen numerosas evidencias de la existencia de glicolípidos en formas
epimastigote (de Lederkremer et al, 1985) y trypomastigote (Couto et al, 1985; Couto et
al, 1991; Uhrig et al, 1992; Uhrig et al, 1996; Uhrig et al, 1997; Agusti et al, 2000) de
Trypanosoma cruzi. Los glicoesfingolípidos han sido estudiados estructuralmente en
Trypanosoma mega (Vermelho et al, 1986) y en Trypanosoma cruzi (cepa Y)
encontrándose en éste último la presencia de una gran cantidad de ácidos grasos 2-
hidroxilados (Barreto-Bergter et al, 1985). Dentro de los glicoesfingolípidos más
simples, ha sido descripta la presencia de galactosil- y glucosilceramida conteniendo
ácidos grasos hidroxilados y no hidroxilados. (Barreto-Bergter et al, 1992 y 1996).
También han sido descriptos en la cepa CL-Brener la existencia de
sulfogalactosilceramidas (Petry et al, 1988). Finalmente, se ha propuesto que podría
existir una estrecha relación entre los glicoesfingolípidos de T. cruzi y la autoinmunidad
generada durante la enfermedad de Chagas (Vermelho et al, 1997), sin embargo, el
mecanismo y las enzimas involucradas en la biosíntesis de los mismos no ha sido
todavía elucidado. Teniendo en cuenta que la glucosilceramida sintasa es la primera
enzima involucrada en la síntesis de una gran variedad de glicoesfingolípidos más
complejos en diferentes especies celulares, resulta de gran interés poder realizar una
caracterización de esta enzima en T. cruzi.
Como primer paso se determinó la presencia de una actividad de
glucosilceramida sintasa en las formas epimastigote de Trypanosoma cruzi de las cepas
Tulahuen 2 y CL-Brener. El ensayo de actividad fue llevado a cabo in vitro utilizando
como sustratos fluorescentes NBD-ceramida y NBD-dihidroceramida, y UDP-Glucosa
como donor de glucosa, analizándose luego la presencia de NBD-
glucosilceramida/NBD-dihidroglucosilceramida por cromatografía en placa delgada
(Fig. 42). La enzima de Trypanosoma cruzi mostró actividad con ambos sustratos
Resultados y Discusión
108
fluorescentes aunque se observó mayor actividad para el caso del sustrato insaturado, en
forma análoga a lo que ocurre con la enzima de mamíferos y en contraposición a lo que
se observó en Plasmodium falciparum.
Una vez determinada la presencia de esta actividad enzimática en el
homogenato total del parásito, se ensayaron diferentes condiciones de reacción,
variando la concentración de sustrato, proteína total, temperatura, presencia de
diferentes cationes y detergentes con el objeto de determinar las condiciones óptimas de
reacción para la enzima de Trypanosoma cruzi (Fig. 43). En todos los casos el ensayo
de actividad se realizó como se describió previamente y, en los casos en que fue posible,
se cuantificó la fluorescencia correspondiente al producto fluorescente de interés. De los
resultados obtenidos se desprende que la ceramida es mejor sustrato para la enzima que
el compuesto equivalente saturado ya que se obtiene una mayor cantidad de producto en
la reacción in vitro. La temperatura óptima para la reacción fue de 37ºC. La variación de
la actividad en función de la concentración del sustrato fluorescente muestra que la
NBD-GlcCer
NBD-DHCer NBD-Cer
1 2
Figura 42. Ensayo de actividad in vitro de Trypanosoma cruzi, formas epimastigote. Los productos de la reacción fueron analizados por cromatografía en capa delgada desarrollada en el sistema de solventes A. Línea 1, utilizando como sustrato fluorescente NBD-dihidroceramida; Línea 2, utilizando como sustrato fluorescente NBD-ceramida
Resultados y Discusión
109
Figura 43. Ensayo de actividad de GlucosilCeramida Sintasa bajo diferentes condiciones. A, Curva de actividad a diferentes temperaturas; B, Curva de actividad con diferentes cantidades de sustrato fluorescente; C, Curva de actividad utilizando diferentes cantidades de proteína total en el ensayo. Utilizando NBD-Ceramida como sustrato, Utilizando NBD-DHCer como sustrato fluorescente. D, Análisis por cromatografía en capa delgada (sistema de solventes A) de los productos obtenidos en el ensayo de actividad utilizando NBD-Cer como sustrato en presencia de diferentes detergentes. Línea 1, Homogenato total de Trypanosoma cruzi; Línea 2, Homogenato total con el agregado de 0,1% CHAPS; Línea 3, Homogenato total con el agregado de 0,1% Tween 20. E, Análisis por cromatografía en capa delgada, sistema de solventes A, de los productos de la reacción in vitro en presencia de diferentes cationes, Línea 1, MgCl2; Línea 2, ZnCl2; Línea 3, CuCl2; Línea 4, FeCl2.
0
5000
10000
15000
20000
25000
20 25 30 35 40 45
Temperatura (ºC)
0
5000
10000
15000
20000
25000
0 50 100 150
Sustrato (nmol)
0
5000
10000
15000
20000
25000
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Proteina (mg)
NBD-Cer
NBD-GlcCer
1 2 3
D
NBD-Cer
NBD-GlcCer
1 2 3 4
E
C
B
A
Resultados y Discusión
110
enzima alcanzó un máximo de actividad para luego comenzar con una
disminución de la actividad al continuar con el incremento de la cantidad de sustrato.
Finalmente se observó que la actividad de la enzima de interés mantiene un
comportamiento aproximadamente lineal dentro del rango de proteína utilizado.
Por otra parte, el uso de bajas concentraciones de detergentes mostró una
pequeña inhibición de la actividad enzimática como esta descripto en el caso de la
enzima de mamíferos donde se ha determinado que la presencia de detergentes es
necesaria para la solubilización de la enzima pero deben mantenerse las concentraciones
debajo de ciertos valores para evitar la inhibición de la actividad enzimática (Paul et al,
1996; Marks et al, 1999).
Finalmente el estudio del efecto de los diferentes cationes en la actividad mostró
un máximo en presencia de MgCl2, al igual de lo que se ha encontrado para la enzima
de mamíferos sobre la cual los cationes divalentes como el Mg2+, Mn2+ y Ca2+, tienen un
efecto estimulador de la actividad, siendo el Mg2+ el que produce el mayor efecto a una
concentración de 10 mM (Abe and Shayman, 1999).
Teniendo en cuenta datos de literatura se ensayó el efecto de la presencia de
agentes reductores en el medio de reacción (Fig. 44). En este caso fue posible
determinar un pequeño aumento en la actividad en presencia de 1% -mercaptoetanol
en el ensayo de actividad. Este hecho implicaría que el sitio activo de la enzima no se
Figura 44. Ensayo de actividad en condiciones no reductoras y reductoras. Los productos de la reacción in vitro se analizaron por cromatografía en capa delgada utilizando el sistema de solventes A. Línea 1, Reacción en ausencia de -mercaptoetanol; Línea 2, Reacción en presencia de 1% de -mercaptoetanol
NBD-Cer
NBD-GlcCer
1 2
Resultados y Discusión
111
encuentra expuesto en su totalidad para el acercamiento de uno o los dos sustratos
necesarios para que ocurra la reacción. En presencia de un agente reductor, este sitio
activo sería expuesto en mayor grado, ya sea por ruptura de enlaces disulfuro o por una
modificación en la estructura terciaria de la proteína (Marks et al, 1999 y 2001).
Finalmente se evaluó el efecto de diferentes inhibidores, PPMP y Tamoxifeno,
sobre la actividad enzimática in vitro. El porcentaje de glicosilación de la NBD-
ceramida en presencia del PPMP fue de solo el 40%, en forma similar a lo que ha sido
descripto para la enzima de mamíferos (Chujor et al, 1998). El tamoxifeno, por otra
parte, parece estar involucrado en diferentes aspectos del metabolismo de lípidos y ha
sido descripto como un inhibidor de la glucosilceramida sintasa en células de mamíferos
y diferentes tejidos (Cabot et al, 1996). En Trypanosoma cruzi, sin embargo, se observó
que el tamoxifeno produce un drástico aumento de la síntesis in vitro de la
glucosilceramida (Fig. 45). Este hecho se encuentra en concordancia con el resultado
obtenido anteriormente que mostró un aumento de la biosíntesis de los esfingolípidos
neutros en ensayos de incorporaciones metabólicas in vivo en presencia de la misma
droga.
Figura 45. Efecto sobre la actividad enzimática in vitro de los diferentes inhibidores ensayados. A, Análisis de los productos de la reacción enzimática por cromatografía en capa delgada, en el sistema de solventes A. Línea 1, Control en ausencia de inhibidores; Línea 2, Tamoxifeno (20 M); Línea 3, DL-t-PPMP (20 M). B, Porcentajes de inhibición de los diferentes compuestos en relación al control en ausencia de inhibidores, 1, Control; 2, Tamoxifeno; 3, DL-t-PPMP.
A
NBD-Cer
NBD-GlcCer
1 2 3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
1 2 3
100%
160%
44%
B
Resultados y Discusión
112
4.2. Caracterización de otros productos de la reacción in vitro.
A partir del análisis por cromatografía en capa delgada de los productos de la
reacción in vitro, realizada a partir de diferentes partidas de parásitos, fue posible
determinar la presencia de otros productos de reacción, además de la NBD-
glucosilceramida y la NBD-esfingomielina. Frente a la ausencia de estándares
comerciales correspondientes a los diferentes compuestos obtenidos en el ensayo se
decidió analizar los productos mayoritarios por espectrometría de masa UV-MALDI-
TOF para realizar su identificación. Las bandas de interés fueron recuperadas a partir de
la placa de silica gel por extracción con Cloroformo: Metanol: Agua. El solvente fue
posteriormente evaporado y las muestras fueron sembradas en el portamuestras del
equipo utilizando como matrices nor-harmano y ácido 2,4-dihidroxibenzoíco. Los
espectros obtenidos en modo positivo permitieron realizar la identificación de los dos
productos fluorescentes mayoritarios (Fig. 46).
La banda de mayor movilidad en cromatografía en capa delgada fue asignada a
una mezcla de NBD-glucosilceramidas aciladas con diferentes ácidos grasos (Tabla IV).
Las posiciones de los ácidos grasos presentes en el compuesto no fue determinado ya
que la información brindada por los espectros no fue la suficiente.
R1 R2 m/z calc. m/z obs.
H H 737,4 736,5
C20:2 h H 1043,6 1042,9
C22:1 H 1057,7 1057,1
C22:2 h H 1071,7 1072,1
C24:1 H 1085,8 1086,0
C24:2 h H 1099,7 1100,3
C20:2 h C24:1 1392,0 1392,3
C22:2 h C22:1
C22:2 h C24:1 1420,1 1420,7
C24:1 C24:1 1434,1 1434,9
Tabla IV. Probables estructuras para las NBD-glucosilceramidas aciladas.
Resultados y Discusión
113
Figura 46. Determinación estructural de diferentes productos obtenidos en el ensayo in vitro de Trypanosoma cruzi, formas epimastigote. A, Análisis por cromatografía en capa delgada, sistema de solventes A, de los productos de reacción; B, Espectro obtenido en modo positivo por UV-MALDI-TOF de la banda de mayor movilidad eluída de la placa (matriz: nor-harmano); C, Espectro obtenido en modo positivo por UV-MALDI-TOF de la banda de menor movilidad que la NBD-glucosilceramida eluída de la placa de silica gel (matriz: ácido gentísico).
O
O
O
(CH2)14CH3
O
NH
N
N
O
NO2
OP
O
OH
OOH
OH
OH OH
O
O
OH OH C
NH
OR1*
HN
O
N
N
O
NO2
OHO
HO OOH
OR2*
B
NBD-Cer
NBD-libre
NBD-GlcCer
A
Resultados y Discusión
114
La banda de menor movilidad que la NBD-glucosilceramida fue asignada como
NBD-fosfatidilinositol acilado (Esquema II), producto de una posible transacilación
que estaría transfiriendo el grupo fluorescente desde la ceramida hacia un
fosfatidilinositol.
OH
OH
OP
O
OH
OOH
OH
OH OH
OH
m/z (obs) 334.7 m/z (calc) 335.0
O
O
O
(CH2)14CH3
O
NH
N
N
O
NO2
OP
O
OH
OOH
OH
OH OH
O
O
OH OH
m/z (obs) 1024.3 m/z (calc) 1024.7
m/z (obs) 846.7 m/z (calc) 847.4
m/z (obs) 667.9 m/z (calc) 668.4
m/z (obs) 1202.8 m/z (calc) 1203.7
Esquema II
[M+H ]+
Resultados y Discusión
115
4.3. Purificación de la GCS de Trypanosoma cruzi.
Una vez realizada la purificación parcial de la glucosilceramida sintasa de
Plasmodium falciparum, se decidió realizar la purificación de la misma enzima a partir
de las formas epimastigote de Trypanosoma cruzi utilizando una metodología similar a
la descripta anteriormente. En este caso, fue necesario desarrollar una estrategia de
purificación más compleja debido a las características propias de la enzima y del
parásito.
La purificación fue realizada en base a la experiencia previa adquirida durante la
purificación de la enzima de Plasmodium falciparum y en base a datos presentes en la
literatura (Paul et al, 1996). En este caso, los parásitos fueron lisados por 3 ciclos de
congelado-descongelado y resuspendidos en una solución de sacarosa para luego ser
sometidos a una centrifugación para obtener un extracto enriquecido en los
componentes de membrana del parásito debido a que esta descripto que la
glucosilceramida sintasa de varios organismos es una proteína integral de membrana
(Paul et al, 1996). A continuación se realizó una precipitación con solución saturada de
sulfato de amonio hasta alcanzar una concentración final de 50%. El precipitado
obtenido fue resuspendido en un buffer conteniendo CHAPS y UDP-Glucosa para
ayudar a la correcta solubilización y estabilidad de la enzima. En esta etapa fue
importante mantener la concentración de proteína en la solución en un valor aproximado
de 1 mg/ml, obteniéndose en este paso un alto grado de purificación de la enzima (Tabla
V). Posteriormente, se realizó una ultracentrifugación a 100000g para eliminar el
material no soluble. La fracción que permaneció solubilizada fue aplicada en una
columna de afinidad a Green Dye agarosa previamente equilibrada en un buffer
conteniendo el detergente y UDP-Glucosa. En estas condiciones se esperaba que la
enzima de interés no interaccione con la matriz de la columna ya que la misma se
encontraría formando el complejo con el sustrato UDP-Glucosa y por lo tanto no tendría
disponible el sitio activo para interaccionar con el colorante. De esta manera se eliminan
las proteínas que interaccionan inespecíficamente con este colorante. Para continuar con
el proceso de purificación fue necesario eliminar de esta fracción la UDP-Glucosa. Para
ello se aplicó la muestra en una columna de BioGel P2, obteniéndose en el volumen
muerto las proteínas de la muestra. Finalmente se realizó un paso de purificación
específico utilizando una columna de Green Dye agarosa en ausencia de UDP-Glucosa.
En este caso, la enzima interactúa específicamente con la matriz y es eluída en forma
Resultados y Discusión
116
específica de la misma. La elución, en este caso, se realizó secuencialmente con: 1-
0,15M KCl en el buffer equilibrante conteniendo 0,1mM fosfatidilcolina; 2- 20 mM
UDP-Glucosa en el mismo buffer y 3- 1M KCl, también en el mismo buffer. La elución
de la columna fue seguida por cuantificación de proteína realizada por el método de
Bradford (Fig. 47). Todo el proceso de purificación fue realizado a 4ºC y monitoreado a
través del ensayo de actividad específico para la GCS (Fig. 48).
Es interesante notar que la actividad enzimática se mantiene a lo largo de todo el
proceso de purificación. En el último paso de purificación, se aumenta
considerablemente la actividad específica de la enzima ya que la cantidad de proteína
recuperada en el paso de elución de la columna de Green-dye agarosa con UDP-Glucosa
se encuentra cercana al límite de detección del método.
El análisis de las diferentes fracciones por SDS-PAGE seguido de tinción de
plata tradicional (Fig. 49) mostró la presencia de una triple banda de peso molecular
aparente de aproximadamente 65000 Da, la cual sería responsable de la actividad de
glucosilceramida sintasa. Para poder observar esta triple banda fue necesario concentrar
la fracción eluída específicamente con UDP-Glucosa debido a la baja concentración de
proteína obtenida en dicha fracción.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 10 20 30 40 50 60Volumen eluído (ml)
Pro
teín
a to
tal (
g)
0,15M KCl 20mM UDP-Glc 1M KCl
Figura 47. Perfil de elución de proteínas de la segunda columna de Green Dye agarosa. La elución fue realizada secuencialmente con 0,15M KCL, 20mM UDP-Glc y 1M KCl en buffer estabilizante conteniendo 0,1 mM fosfatidilcolina. El eluído fue recuperado en fracciones de 2 ml cada una.
Resultados y Discusión
117
El proceso de purificación de la enzima de GCS de Trypanosoma cruzi es
sensiblemente más complejo que en el caso de Plasmodium falciparum, y esto puede ser
debido a las diferentes estructuras que presentan estos dos parásitos.
En este caso se encontró que el agregado de UDP-Glucosa en los primeros pasos
de la purificación, desde la preparación del homogenato hasta la primera columna de
afinidad a colorantes, y de fosfatidilcolina durante la elución de la segunda columna de
green dye-agarosa ayudan a la conservación de la actividad enzimática, como esta
descripto en la bibliografía para el caso de otras glucosiltransferasas (Matern et al,
1990).
Figura 48. Control de la actividad de GlucosilCeramida sintasa durante las diferentes etapas de la purificación. Los productos de la reacción in vitro se analizaron por cromatografía en placa delgada utilizando el sistema de solventes A. Línea 1, Fracción enriquecida en membrana (50 mg de proteína); Línea 2, Precipitado con sulfato de amonio (50 mg de proteína); Línea 3, Sobrenadante de la ultracentrifugación (50 mg de proteína); Línea 4, Fracción no unida a la primera columna de Green Dye agarosa (50 mg de proteína); Línea 5, Volumen muerto de la columna de BioGel P2 (50 mg de proteína); Línea 6, Fracción eluída de la segunda columna de Green Dye agarosa con 0,15M KCl (3,45 mg de proteína); Línea 7, Fracción eluída de la misma columna específicamente con 20 mM UDP-Glucosa (0,15 mg de proteína); Línea 8, Fracción eluída de la misma columna con 1M KCl(3,45 mg de proteína).
NBD-Cer
NBD-GlcCer
6 7 8
NBD-ácido
1 2 3 4 5
NBD-Cer
NBD-GlcCer
NBD-ácido
Resultados y Discusión
118
En la tabla V se muestran los valores de recuperación y purificación para los
distintos pasos del proceso de purificación, donde se observó que la fracción eluída con
UDP-glucosa presentó el mayor grado de enriquecimiento.
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 PM 9
97400 Da
66200 Da
45000 Da
31000 Da
97400 Da
66200 Da
45000 Da
21500 Da
31000 Da
Figura 49. Análisis por SDS-PAGE y tinción de plata tradicional de las diferentes etapas del proceso de purificación de la GCS. Línea 1, Precipitado con sulfato de amonio 50% (0,73g de proteína); Línea 2, Sobrenadante de la ultracentrifugación (0,99g de proteína); Línea 3, Fracción no unida a la primera columna de Green-Dye agarosa (0,71g de proteína); Línea 4, Volumen muerto de la columna de BioGel P2 (1,30g de proteína); Línea 5, Fracción no unida de la segunda columna de Green-Dye agarosa (1,8g de proteína); Línea 6, Elución con 0,15M KCl (0,74g de proteína); Línea 7, Elución con UDP-Glucosa (0,02g de proteína); Línea 8, Elución con 1M KCl (0,66g de proteína); Línea 9, Eluído con UDP-Glucosa concentrado (0,16g de proteína). PM: Estándares de pesos moleculares.
a La cuantificación de la proteína total presente en cada fracción fue determinada por el método de Lowry. b La actividad específica de cada fracción fue calculada como la fluorescencia correspondiente a la NBD-glucosilceramida producida en el ensayo en unidades arbitrarias de fluorescencia por unidad de proteína calculada en miligramos.
Proteína totala
Recuperación Actividad Específicab
Enriquecimiento
mg % unidades/mg veces
Homogenato 728 100 22,24 1
Fracción rica en mb. 402 55 24,56 1,1
Ppdo (NH4)2SO4 50% 7,3 1,8 731 29
Sn 100000g 4,9 67 583 0,8
Dye-agarosa 1 1,46 9,4 618 1,1
BioGel P2 1,45 99 569 0,92
Dye-agarosa 2 0,43 30 1867 3,3
0,15M KCl 0,27 18 3254 5,7
UDP-Glc 0,013 0,93 111333 195
1M KCl 0,19 13 2652 4,6
Tabla V. Purificación de la GCS de formas epimastigotes de Trypanosoma cruzi.
Resultados y Discusión
119
4.4. Localización subcelular de la GCS de Trypanosoma cruzi.
Para determinar la localización subcelular de la enzima GCS presente en la
formas epimastigote de Trypanosoma cruzi, se realizó una primera aproximación a
partir de un fraccionamiento subcelular realizado con carburo de silicio y posteriores
centrifugaciones diferenciales (Duschak and Cazzulo, 1991). Las diferentes fracciones
corresponden a la fracción nuclear, las fracciones de gránulos grandes y pequeños
conformadas por vesículas mitocondriales, lisosomas y glicosomas en diferente
proporción, la fracción microsomal conteniendo esencialmente el retículo endoplásmico
y fragmentos de la membrana plasmática y finalmente la fracción soluble compuesta por
el citosol y el contenido soluble de las organelas rotas como la mitocondria (Bontempi
et al, 1989). Las diferentes fracciones subcelulares obtenidas fueron analizadas por
SDS-PAGE seguido de un análisis por Western-blot utilizando como anticuerpo
primario el anticuerpo 1.2 anti-GCS humana (Fig. 50).
El análisis mostró la presencia de dos bandas mayoritarias en la fracción
microsomal sugiriendo que la enzima de Trypanosoma cruzi sería una proteína de
membrana en forma similar a lo que ocurre en las células de mamíferos. La existencia
de dos bandas podría estar implicando la existencia de complejos de proteínas junto con
la GCS o la formación de oligómeros como se ha descripto para la enzima de mamíferos
(Marks et al, 1999).
En orden de obtener mayor información acerca de la localización subcelular de
la GCS del parásito se realizó una inmunomicroscopía electrónica. A partir de los
parásitos cosechados se realizó una fijación para poder obtener luego una serie de
203 kDa
123 kDa
80 kDa
48 kDa
1 2 3 4 5
Figura 50. Análisis por SDS-PAGE y Western-blot de las diferentes fracciones subcelulares obtenidas por tratamiento con carburo de silicio y posteriores centrifugaciones secuenciales. Línea 1, Fracción nuclear; Línea 2, Fracción de gránulos grandes; Línea 3, Fracción de gránulos pequeños; Línea 4, Fracción microsomal; Línea 5, Fracción soluble.
Resultados y Discusión
120
láminas finas que fueron incubadas con el anticuerpo anti-GCS humana y un segundo
anticuerpo conjugado con pequeñas partículas de oro (Fig. 51). Paralelamente se realizó
un tratamiento con OsO4 como control para observar las estructuras subcelulares del
parásito.
La microscopía electrónica confirmó la presencia de la enzima en Trypanosoma
cruzi asociada a membrana como se esperaba. La señal correspondiente se observó
principalmente en el complejo de Golgi del parásito así como también en la membrana
plasmática del mismo, incluyendo la membrana del flagelo. La señal observada en la
membrana se encontró, en algunos casos, concentrada en ciertas regiones que formaban
pequeñas protuberancias de la membrana, las cuales podrían ser estructuras de tipo
“lipid rafts”.
Figura 51. Microscopía electrónica de Trypanosoma cruzi, formas epimastigote. K, Kinetoplástido; G, Complejo de Golgi; FP, Bolsillo flagelar; F, Flagelo.
G 0,15 m
F
F FP
0,2 m
0,1 m
G
K G
0,1m
Resultados y Discusión
121
5. Actividad de Glucosilceramida Sintasa en otros parásitos.
Objetivos:
Determinación de la presencia de la enzima GlucosilCeramida Sintasa en
Leishmania amazoniensis y Toxoplasma gondii.
Resultados y Discusión
122
5. Actividad de Glucosilceramida Sintasa en otros parásitos.
A partir de la determinación de la actividad de GCS en Plasmodium falciparum
y Trypanosoma cruzi, se decidió extender el estudio a otros parásitos protozoarios. Se
realizó el ensayo in vitro utilizando homogenatos completos para determinar la
presencia de esta actividad en Leishmania amazoniensis y Toxoplasma gondii (Fig 52).
Como era de esperar, en base a los resultados obtenidos anteriormente, se observó la
biosíntesis de glucosilceramida en ambos parásitos a partir de los sustratos fluorescentes
utilizados. Cabe destacar, que en los casos de Leishmania y Toxoplasma, se observó
actividad tanto con el sustrato saturado como con el sustrato insaturado, al igual de lo
que había sido encontrado en el caso de Trypanosoma cruzi.
Figura 52. Ensayo de actividad in vitro de Glucosilceramida Sintasa con diferentes sustratos fluorescentes en diferentes parásitos. Los productos de la reacción in vitro se analizaron por cromatografia en capa delgada en el sistema A de solventes. Línea 1, Leishmania amazoniesis utilizando NBD-ceramida como sustrato; Línea 2, Leishmania amazoniesis utilizando NBD-dihidroceramida como sustrato en el ensayo de actividad; Línea 3, Toxoplasma gondii con NBD-ceramida como sustrato; Línea 4, Toxoplasma gondii con NBD-Dihidroceramida como sustrato para la enzima. En todos los casos se utilizaron 2,4x107 parásitos para realizar el ensayo.
NBD-Cer/NBD-DHCer
NBD-GlcCer/NBD-DHGlcCer
1 2 3 4
Resultados y Discusión
123
Es interesante notar que se obtuvo una mayor actividad enzimática en el caso de
Toxoplasma gondii y que este parásito estaría utilizando preferentemente el sustrato
insaturado al igual que Trypanosoma cruzi y a diferencia de lo que ocurre en
Plasmodium falciparum. Por otra parte, Leishmania amazoniesis mostró una pequeña
cantidad de producto fluorescente y no se observaron diferencias significativas entre los
dos sustratos ensayados.
Resultados y Discusión
124
6. Análisis de esfingolípidos por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF.
Objetivos:
Determinacón de las condiciones óptimas para el análisis de glicoesfingolípidos
por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF.
Estudio de la capacidad de la NBD-Ceramida como matriz para el análisis de
diferentes analitos por espectrometria de masa UV-MALDI-TOF.
Resultados y Discusión
125
6. Análisis de esfingolípidos por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF.
En la actualidad, la espectrometría de masa (EM) UV-MALDI-TOF es,
probablemente, la técnica analítica más utilizada en el análisis de glicoconjugados como
las glicoproteínas y los glicolípidos (Zhigilei et al, 1997 y 1998). Sin embargo, esta
técnica presenta una importante limitación experimental que esta dada por la
preparación de la muestra, la cual es fundamental para obtener un resultado exitoso. Las
muestras se aplican en forma de finas láminas sobre un portamuestras adecuado donde
son irradiadas por un láser de pulsos para producir la vaporización e ionización del
analito (Horneffer et al, 1999; Dreisewerd, 2003). Este proceso ocurre mediante la
absorción de energía por parte de la matriz utilizada, la cual transfiere parte de esa
energía a las moléculas de analito que se encuentran en sus proximidades. Por lo tanto,
no es sorprendente, que una de las características fundamentales de los compuestos que
actúan como matrices en esta técnica, es que deben absorber a la longitud de onda
emitida por el láser utilizado (Patricelli et al, 2003; Berkers et al, 2005). Sin embargo,
todavía no han sido perfectamente esclarecidos los procesos por los cuales ocurre la
volatilización/ionización de la muestra. De esta manera la elección de la matriz es un
procedimiento completamente experimental, ya que no se ha encontrado hasta el
momento cual es la relación entre la estructura química de la matriz y su efectividad en
la obtención de buenos resultados por espectrmetría de masa UV-MALDI.
Durante la realización de este trabajo, se realizaron múltiples aproximaciones
para el análisis de esfingolípidos por EM-UV-MALDI. En algunos casos, se realizó el
análisis de esfingolípidos provenientes de incorporaciones metabólicas con análogos
fluorescentes, NBD-ceramida y NBD-dihidroceramida. Para ello fue necesaria la
búsqueda de las condiciones óptimas para la preparación de las muestras, y en ese
contexto se investigó si ciertos NBD-esfingolípidos podían ser analizados sin el
agregado de una matriz externa, ya que el mismo compuesto podría ser capaz de
absorber la energia a las longitudes de onda del láser utilizado y actuar
desorbiendo/ionizando los compuestos.
Inicialmente, para el análisis de los esfingolípidos, se probaron diferentes
matrices descriptas en la bibliografía, ácido -ciano-4-hidroxicinámico (CHCA), ácido
2,4-dihidroxibenzoíco (DHB) y nor-harmano (nHo), tanto en modo positivo como en
modo negativo. Sin embargo, en la mayoría de los casos, solo se obtuvieron señales
correspondientes a las matrices y no a los analitos de interés. Considerando estos
Resultados y Discusión
126
primeros resultados negativos y considerando la presencia del grupo fluorescente en los
NBD-esfingolípidos cuya estructura de anillos aromáticos le confiere una alta eficiencia
de absorción de energía de la longitud de onda del láser del equipo de UV-MALDI
utilizado, se decidió realizar una determinación en ausencia de una matriz externa.
Cuando se analizó una muestra de NBD-ceramida patrón se obtuvieron espectros
de gran calidad, tanto en modo positivo (Fig. 53) como en modo negativo (Fig. 54). Fue
interesante observar que el espectro realizado en modo positivo mostró una señal
intensa a m/z 552,0 correspondiente a la estructura [M+Na-NO2]+ pero no fue posible
determinar la presencia del ión molecular. Por otra parte, el análisis en modo negativo
mostró una señal de gran intensidad a m/z 574,3 correspondiente al ión molecular
[(NBD-Cer)-H]-. En este caso también se observaron otras señales de menor intensidad
correspondientes a la pérdida sucesiva de protón y un radical hidroxilo ([(NBD·Cer)-H-
HO]-., m/z 558,3) y a productos de descomposición del grupo fluorescente de la
molécula.
0 0
0.5
1.0
1.5
4x10
Inte
ns. [
a.u
.]
00 450 500 550 600 650
m/z
495.
080
523.
150
552.
0
[(NBD·Cer)+Na-NO2]+·
Figura 53. Espectro UV-MALDI-TOF de la NBD-Ceramida en modo positivo sin el agregado de una matriz externa. [(NBD·Cer)+Na-NO2]
+· , m/z calculado 551.218.
Resultados y Discusión
127
El análisis de NBD-dihidroceramida, por su parte, dio señales de la misma
naturaleza, obteniéndose la señal de mayor intensidad para el ión molecular con un
valor de m/z 576,3 y la correspondiente señal a m/z 560,3 compatible con la pérdida
sucesiva de protón y radical hidroxilo. Adicionalmente, el análisis de una muestra de
NBD-Ceramida acetilada en condiciones de peracetilación dió una señal de gran calidad
a m/z 657,6 correspondiente al la NBD-Ceramida-1,3-diacetilada (Fig. 55).
Considerando los buenos resultados obtenidos se decidió extender el análisis a otros
esfingolípidos. Se analizaron en modo reflectrón negativo la NBD-glucosilceramida, la
NBD-glucosildihidroceramida y la NBD-esfingomielina obteniendose señales a m/z
736.4 y 738.5 correspondientes a [(NBD-hexosilceramida)-H]- y a [(NBD-
hexosildihidroceramida)-H]-, respectivamente (Fig. 55), y, en el caso de la
esfingomielina se detectó una buena señal a m/z 740.0 correspondiente al ión molecular
[(NBD-SM)-H]- (Fig. 56).
Figura 54. Espectro UV-MALDI-TOF de la NBD-Ceramida en modo negativo sin el agregado de una matriz externa. [(NBD-Cer)-H] -, m/z calculado 574,2; [(NBD·Cer)-H-HO]-., m/z calculado 557,4.
0
500
1000
1500
2000
Inte
ns.
[a.u
.]
00 520 540 560 580 600 620 640
m/z
[(NBD·Cer)-H] -
574.
3
558.
3
Resultados y Discusión
128
Figura 55. Espectros UV-MALDI-TOF en modo negativo sin el agregado de matriz externa. A, NBD-1,3-diacetilceramida; B, NBD-glucosilceramida; C, NBD-glucosildihidroceramida.
0
50
100
150
200
250
Inte
ns.
[a.u
.]
00 550 600 650 700 750
m/z
[(NBD·GlcCer)-H] -
736.
4
720.
3
574.
2
0
100
200
300
400
500
600
Inte
ns.
[a.u
.]
00 550 600 650 700 750
m/z
[(NBD·DHGlcCer)-H] -
722.
4
576.
3
738.
4
0
100
200
300
400
500
600
Inte
ns.
[a.u
.]
00 520 540 560 580 600 620 640 660 680
m/z
[(NBD-1,3-diacetilCer)-H]-
641.
6
657.
6 A
B
C
Resultados y Discusión
129
Teniendo en cuenta los espectros de alta calidad obtenidos para los diferentes
esfingolípidos fluorescentes analizados, se decidió realizar el estudio de una muestra de
origen biológico para determinar si esta metodología resultaba de utilidad. Se procedió
al análisis por espectrometría de masa UV-MALDI-TOF sin el agregado de una matriz
externa de una muestra de lípidos purificada proveniente de una incorporación
metabólica de NBD-ceramida en un cultivo de formas epimastigote de Trypanosoma
cruzi (Fig. 57). El espectro realizado en modo reflectron negativo mostró señales a m/z
636.7 y 647.7 correspondientes a [(NBD-Cer-1-PO4)-H2O-H]- y [(NBD-
fosfatidilinositol-K)-H]-, respectivamente. También se observaron dos señales
superpuestas a m/z 737.6 and 739.6 correspondientes a NBD-glucosilceramida y NBD-
esfingomielina. Todos los compuestos detectados en la muestra son componentes
mayoritarios de Trypanosoma cruzi de acuerdo con lo descripto en la bibliografía
(Barreto-Bertger et al, 1992; Figueiredo et al, 2005), indicando que el análisis es de
gran utilidad para el análisis directo de muestras complejas.
De esta manera, los compuestos fluorescentes utilizados presentaron una gran
versatilidad ya que los mismos pueden actuar como marcadores metabólicos en
diferentes ensayos y actuar posteriormente como fotosensibilizadores para el análisis de
estos compuestos por espectrometría de masa UV-MALDI. En este caso, al no ser
agregada una matriz externa, el proceso de volatilización/ionización es producido
Figura 56. Espectro UV-MALDI-TOF en modo reflectron negativo de la NBD-esfingomielina.
20
40
60
80Inte
ns. [a
.u.]
00 550 600 650 700 750
m/z
740.
0
[(NBD·SM)-H] -
Resultados y Discusión
130
directamente por el láser (UV-LDI). Sin embargo, a pesar de que dicha técnica es un
método ionizante fuerte, en este caso, se han obtenido espectros muy limpios. Esta
aplicación es, por lo tanto, de gran interés ya que es posible localizar y caracterizar
diferentes metabolitos en un solo experimento disminuyendo considerablemente el
tiempo de análisis requerido y aumentando la sensibilidad y versatilidad con una
mínima preparación de la muestra.
Considerando otro aspecto de la utilidad del grupo fluorescente utilizado, se
decidió comprobar si la NBD-ceramida podía ser utilizada como una matriz externa en
el análisis de diferentes analitos. Para evaluar su capacidad de acción como una matriz
útil para espectrometría de masa UV-MALDI, se realizó el análisis de diferentes
ceramidas y glicoesfingolípidos no fluorescentes. Los espectros de diferentes ceramidas
d18:1 aciladas con una variedad de ácidos grasos mostraron señales de alta calidad tanto
en modo positivo como en modo negativo al utilizar la NBD-ceramida como matriz
(Fig. 58). También se evaluó el rendimiento de la NBD-ceramida como matriz en el
caso de diferentes glicoesfingolípidos. En esto casos se obtuvieron espectros con una
excelente relación señal/ruido en el modo positivo (Fig. 59).
Figura 57. Espectro obtenido por UV-MALDI-TOF en modo negativo de los lípidos neutros obtenidos luego de incorporación metabólica con NBD-ceramida en las formas epimastigote de Trypanosoma cruzi.
Inte
ns. [
a.u
.]
10
20
00 620 640 660 680 700 720 740 760 780
m/z
647.
7
636.
7
[(NBD-Cer-1-PO4)-H2O-H] -
[(NBD-hexosilCer)-H]-
737.
9 73
9.6
[(NBD-SM)-H] -
[(NBD-fosfatidilinositol-K)-H] -
Resultados y Discusión
131
Figura 58. Espectros obtenidos por EM-UV-MALDI-TOF para diferentes esfingolípidos utilizando como matriz NBD-ceramida. A, Ceramida d18:1, C18:0, en modo positivo; B, Ceramida d18:1, C16:0, en modo positivo; C, Ceramida d18:1, C18:0, en modo negativo; D, Ceramida d18:1, C16:0, en modo negativo.
0
1000
2000
3000
Inte
ns.
[a.u
.]
460 480 500 520 540 560 580 600 620 640
m/z
588.
3
[(Cer d18:1 C18:0)+Na]+
A
0
500
1000
1500
Inte
ns. [
a.u
.]
460 480 500 520 540 560 580 600 620 640
m/z
560.
3
[(Cer d18:1 C16:0)+Na]+
B
0
1000
2000
3000
4000
Inte
ns. [
a.u.
]
460 480 500 520 540 560 580 600 620 640
m/z
564.
4 57
4.4
[(Cer d18:1 C18:0)-H]-
C
0
1000
2000
3000
4000
Inte
ns.
[a.u
.]
460 480 500 520 540 560 580 600 620 640
m/z
536.
4
574.
2
510.
5
488.
3
[(Cer d18:1 C16:0)-H]-
D
Resultados y Discusión
132
0
500
1000
1500
2000
2500
Inte
ns.
[a.u
.]
50 875 900 925 950 975 1000 1025 1050 1075
m/z
912.
6
928.
6 94
0.6
[(LacCer d18:1 C18:0)+Na]+
[(LacCer d18:1 C18:0)+K]+
[(LacCer d18:1 C20:0)+Na]+
0
100
200
300
400
500
Inte
ns.
[a.u
.]
00 900 1000 1100 1200 1300 1400
m/z
1277
.7
[(Gg4Cer d18:1 C18:0)+Na]+
20
40
60
Inte
ns.
[a.u
.]
00 800 1000 1200 1400 1600
m/z
1360
.0
[GbO4 d18:1 C24:1)+Na]+
A
B
C
Figura 59. Espectros obtenidos por EM-UV-MALDI-TOF en modo positivo para diferentes glicoesfingolípidos utilizando como matriz NBD-ceramida. A, Lactosilceramida; B, Asialo GM1; C, Globotetraósido.
Resultados y Discusión
133
Teniendo en cuenta todos estos resultados en conjunto, fue posible determinar
que el grupo fluorescente de la NBD-ceramida utilizada actúa como matriz produciendo
la desorción/ionización de los mismos compuestos conteniendo el grupo fluorescente
unido covalentemente y de diferentes glicolípidos. Tratandose en el primer caso de un
análisis de muestras sin el agregado de una matriz externa mientras que en el segundo
caso la NBD-ceramida estaría actuando como matriz para el análisis de analitos de
estructura química similar. Sin embargo, fue posible determinar que la eficiencia de
desorción/ionización decrece al aumentar la polaridad de los analitos o el número de
unidades de monosacáridos presentes aunque se observó que no hay relación con el tipo
de azúcar presente en la molécula.
Resultados y Discusión
134
7. Sintesis de conjugados proteína – hidratos de carbono.
Objetivos:
Preparación simple de conjugados proteína – hidratos de carbono.
Caracterización de los compuestos obtenidos por espectrometría de masa UV-
MALDI-TOF.
Obtención y caracterización de pequeños oligosacáridos a partir de la heparina.
Resultados y Discusión
135
7. Síntesis de conjugados proteína – hidratos de carbono.
Teniendo en consideración que en este trabajo se han estudiado diferentes
glicoconjugados presentes en Plasmodium falciparum y Trypanosoma cruzi y que los
hidratos de carbono presentan generalmente una fuerte antigenicidad, se decidió intentar
desarrollar una técnica que permitiese determinar la participación de las cadenas
glicosídicas en la antigenicidad. Esta participación se estudia generalmente con ensayos
de ELISA y/o de Dot-blot, para lo cual el resto oligosacarídico debe ser unido a una
membrana de nitrocelulosa para ser presentados a los diferentes anticuerpos. Es
conocido que los hidratos de carbono no se unen eficientemente a estas membranas por
lo cual los resultados suelen no ser reproducibles. Para ello se decidió realizar un acople
de oligosacáridos de diferentes estructuras a proteínas comerciales seguido de su
caracterización estructural. Adicionalmente, se realizó la caracterización de
oligosacáridos provenientes de una degradación de heparina como fuente de cadenas
oligosacarídicas sulfatadas para incorporar al estudio.
7.1. Preparación de conjugados proteína – hidratos de carbono.
Debido a la naturaleza hapténica de los hidratos de carbono, fue necesario
desarrollar y optimizar una síntesis simple y rápida para preparar conjugados de estos
compuestos con proteínas no inmunogénicas para obtener conjugados que puedan
desencadenar una respuesta inmune en un organismo. Para ello, se decidió comenzar
utilizando hidratos de carbono y proteínas comerciales simples.
La reacción de unión entre los hidratos de carbono y las proteínas se llevó a cabo
mediante una condensación de glutaraldehído con dos grupos amino, uno perteneciente
al azúcar y el otro a alguna cadena lateral básica de los aminoácidos de las proteínas. De
esta manera, fue necesario en primer lugar realizar la modificación de algunos hidratos
de carbono de manera de introducir un grupo amino en el carbono anomérico (Esquema
III).
La síntesis de las glicosaminas fue realizada en un solo paso utilizando
carbamato de amonio en metanol (Hackenberger et al, 2005) modificando el método
tradicional que utiliza bicarbonato de amonio en agua (Takeda et al, 1990). Las
glicosilaminas son inestables y tienden a formar dímeros, hidrolizarse e isomerizarse.
Resultados y Discusión
136
Estas reacciones secundarias de las glicosilaminas hacen que su purificación sea dificil
y, en consecuencia, se utilizan para reacciones posteriores sin previa purificación
(Manger et al, 1992; Vetter and Gallop, 1995; Bejugam and Flitsch, 2004).
La reacción de aminación selectiva sobre azúcares no protegidos utilizando
como reactivo el carbamato de amonio en metanol ha sido recientemente descripta
(Hackenberger et al, 2005) donde se mostró la aplicabilidad de esta reacción para
diferentes mono- y disacáridos. La mayor ventaja de este procedimiento es la fácil
purificación del producto de reacción. La glicosilamina formada por la reacción con el
amoníaco generado por la disociación del carbamato, precipita como la sal del ácido
carbámico en las condiciones de reacción utilizadas (Esquema IV). La formación de
esta sal previene la hidrólisis y la formación de dímeros. Finalmente, la amina libre es
obtenida por tratamiento con bases o en condiciones de alto vacío.
NH4CO2NH2 (4equiv.)
MeOHO
HO
HO
OHOH
OH
OHO
HO
OHNH2
OH
NH2N
H2N NH2
N N
OHO
HOOH
N
OH
OHO
HOOH
N
OH
OHO
HOOH
N
OH
BSA
NH2H2N
H2N NH2
H2N NH2
BSA
Buffer Fosfato 50 mM pH= 7,4
Glutaraldehído
NH4CO2NH2 (4equiv.)
MeOHO
HO
HO
OHOH
OH
OHO
HO
OHNH2
OH
NH2N
H2N NH2
N N
OHO
HOOH
N
OH
OHO
HOOH
N
OH
OHO
HOOH
N
OH
BSA
NH2H2N
H2N NH2
H2N NH2
BSA
Buffer Fosfato 50 mM pH= 7,4
Glutaraldehído
Esquema III
Precipita en metanol
O HR
H O
R
H ON H 2
N H 4 C O O N H 2
-C O 2
N H 3 N H 4C O O N H 2
-N H 3
R
H ON H 2 ·H O O C N H 2
R
H ON H 2
Esquema IV
Vacío o Bases
Resultados y Discusión
137
La unión de las glicosilaminas a las proteínas comerciales fue realizada en un
solo paso utilizando las glicosilaminas, cuando fue necesario, sin purificación previa
(Esquema III).
Las proteínas que se utilizaron fueron seroalbúmina bovina (BSA), Ubiquitina y
Citocromo C que presentan diferentes pesos moleculares y contienen una gran cantidad
de residuos básicos (Tabla VI).
Las proteínas modificadas por la incorporación de los diferentes hidratos de
carbono modificados apropiadamente fueron analizadas por EM-UV-MALDI-TOF para
determinar el número de residuos de azúcares que se unieron covalentemente. Las
muestras fueron sembradas en el portamuestras mediante el método mezcla utilizando
ácido sinapínico como matriz. Los espectros fueron obtenidos en modo lineal positivo y
la cantidad de residuos incorporados fue calculada como la diferencia de los pesos
moleculares de la proteína tratada y sin tratar dividido la masa del residuo del azúcar
utilizado (incluyendo el glutaraldehído que actúa como separador) (Salih and Zenobi,
1998; Lu and Zenobi, 2000).
La reacción fue realizada en diferentes condiciones con el objetivo de obtener
las condiciones óptimas de reacción. La reacción se llevó a cabo en buffer fosfato 0,1 M
pH 7,4 (Dhénin et al, 2007) y en consecuencia fue necesario realizar la diálisis de todas
las muestras para eliminar las sales de fosfato que interfieren en el proceso de
ionización/volatilización por UV-MALDI de las muestras (Papac et al., 1998).
Inicialmente se probaron diferentes relaciones molares de los reactivos utilizando como
proteína la seroalbúmina bovina y como azúcar la -1-O-metil-6-glucosamina (Fig. 60).
Tabla VI. Peso molecular y número de residuos básicos de las proteínas comerciales utilizadas.
Número de residuos básicos.
Arginina Lisina Histidina
Número de residuos básicos toalesa.
Peso molecular.
Ubiquitina 4 7 1 13 8564
BSA 20 55 17 93 66300
Citocromo C 2 18 3 24 12230
a Incluye el amino terminal.
Resultados y Discusión
138
La reacción se llevó a cabo durante 24 horas a temperatura ambiente con agitación
magnética constante.
A partir de los espectros obtenidos y del cálculo del número de residuos
incorporados, se corroboró que no todos los grupos básicos de la BSA están disponibles
para reaccionar con el glutaraldehído para dar lugar a la imina. Se observó que el
número de residuos incorporados está en relación con la cantidad de azúcar que se
agrega al medio de reacción, siendo menor al trabajar en presencia de cantidades más
pequeñas del azúcar como era esperable. La cantidad de glutaraldehído utilizada no
parece afectar considerablemente la tasa de reacción de los grupos básicos, ya que en
69
26
4.0
30
34
61
0.6
11
0 0
0.5
1.0
1.5
4x10
Inte
ns.
[a.u
.]
30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000
m/z
72
31
8.6
20
36
16
3.5
03
0 0
0.5
1.0
1.5
4x10
Inte
ns.
[a.u
.]
30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000
m/z
73
50
3.7
09
36
76
9.4
95
0 00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
4x10
Inte
ns.
[a.u
.]
30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000
m/z
66
43
3.7
77
33
20
7.8
12
0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
4x10
Inte
ns.
[a.u
.]
30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000
m/z
BSA
BSA/Glutaraldehído/-O-metil-6-glucosaminopiranósido, 1: 10: 100 (relación molar) 27
BSA/Glutaraldehído/-O-metil-6-glucosaminopiranósido, 1: 50: 100 (relación molar) 24
BSA/Glutaraldehído/-O-metil-6-glucosaminopiranósido, 1: 50: 50 (relación molar) 11
Nro de residuos incorporados
Figura 60. Espectros UV-MALDI-TOF obtenidos en modo lineal positivo para la seroalbúmina bovina comercial y las proteínas modificadas obtenidas luego de la reacción con-1-O-metil-6-glucosamina en diferentes relaciones molares.
Resultados y Discusión
139
Figura 61. Espectros UV-MALDI-TOF obtenidos en modo lineal positivo de A, BSA; B, BSA + glutaraldehído + GlcNH2, 24 hs.; C, BSA + glutaraldehído + GlcNH2, 48 hs.; D, BSA + glutaraldehído + GlcNH2, 72 hs.
66
596
.52
0
333
01
.40
3
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000Inte
ns.
[a.u
.]
30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000
m/z
70
787
.92
5
354
30
.88
9
0
1000
2000
3000
4000
Inte
ns.
[a.u
.]
30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000
m/z
704
62
.70
1
352
01
.75
6
0
1000
2000
3000
4000
5000
Inte
ns. [
a.u
.]
30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000
m/z
70
16
3.6
24
35
04
4.4
71
0
1000
2000
3000
4000
5000
Inte
ns. [
a.u
.]
30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000
m/z
[M+2H] ++
(m/z 33310)
[M+H] +
(m/z 66596) [M+H] +
(m/z 70787)
[M+2H] ++
(m/z 35502) [M+2H] ++
(m/z 35417)
[M+H] +
(m/z 71049) [M+H] +
(m/z 70939)
[M+2H] ++
(m/z 35430)
ningún caso se observó la completa desaparición del glutaraldehído agregado en el
medio de reacción.
A continuación se decidió determinar el tiempo de reacción óptimo para la
obtención de los conjugados de una manera reproducible. Se dejó la mezcla de reacción
manteniendo la relación molar de los reactivos en 1: 50: 50, BSA: glutaraldehído:
glucosamina, durante 24, 48 y 72 horas (Fig. 61) para determinar si la cantidad de
residuos incorporada alcanzaba un equilibrio. Los residuos incorporados en cada caso
fueron de 17, 14 y 10 respectivamente, indicando que existe un equilibrio para la
reacción y que un mayor tiempo de reacción no aumenta el número de grupos básicos
de la proteína disponibles para la condensación.
Resultados y Discusión
140
Figura 62. Espectros UV-MALDI-TOF en modo lineal positivo de los productos luego de 24 horas de reacción de acople de A, BSA + glutaraldehído + 2-GlcNH2; B, BSA + glutaraldehído + -1-O-metil-6-glucosamina; y C, BSA + glutaraldehído + 1-aminomaltosa; D, BSA + ácido 1-aminogalacturónico.
71
04
9.8
12
35
50
2.0
55
0
2 0 0 0
4 0 0 0
6 0 0 0
8 0 0 0
Inte
ns.
[a.u
.]
3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 5 0 0 0 0 6 0 0 0 0 7 0 0 0 0 8 0 0 0 0 9 0 0 0 0
m /z
70
78
7.9
25
35
43
0.8
89
0
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
Inte
ns.
[a.u
.]
3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 5 0 0 0 0 6 0 0 0 0 7 0 0 0 0 8 0 0 0 0 9 0 0 0 0
m /z
70
93
9.6
86
35
41
7.8
20
0
2 0 0 0
4 0 0 0
6 0 0 0
8 0 0 0
Inte
ns.
[a.u
.]
3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 5 0 0 0 0 6 0 0 0 0 7 0 0 0 0 8 0 0 0 0 9 0 0 0 0
m /z
70787
70163
70462
0
20
40
60
80
100
Inte
ns.
[a.u
.]
000 40000 50000 60000 70000 80000 90000
m/z
75008
A
B
C
D
Resultados y Discusión
141
Habiendo establecidos las mejores condiciones para llevar a cabo la reacción con
BSA como proteína, se decidió evaluar los resultados obtenidos en dichas condiciones
con diferentes ligandos. Se realizó la reacción utilizando 2-glucosamina, -1-O-metil-6-
glucosamina, 1-aminomaltosa y ácido 1-aminogalacturónico. El análisis de los
productos de reacción por EM-UV-MALDI-TOF (Fig. 62) mostró que en las mismas
condiciones de reacción se incorporaron 17, 14, 10 y 35 residuos respectivamente. Estos
resultados mostraron que la reactividad de los azúcares neutros es similar mientras que
los residuos ácidos son incorporados en mayor grado. Es interesante notar que existe
una pequeña disminución en el número de residuos del disacárido indicando la
existencia de un mayor impedimento estérico para que ocurra la reacción de
condensación.
Finalmente, se decidió ensayar la misma reacción con otras proteínas
comerciales de menor peso molecular y con un menor número de grupos básicos en las
cadenas laterales de los aminoácidos potencialmente disponibles para reaccionar. Las
proteínas ensayadas fueron ubiquitina y citocromo C. En este último caso, la relación
molar y el tiempo de reacción se mantuvieron constantes y se calcularon los residuos
incorporados para dos ligandos diferentes, -1-O-metil-6-glucosamina y 1-
aminomaltosa (Fig. 63). A partir de las señales obtenidas en modo lineal positivo para el
citocromo C y para los productos de reacción se calcularon el número de residuos
incorporados, siendo de 5 en ambos casos.
0
1000
2000
3000
Inte
ns. [
a.u.
]
000 11000 12000 13000 14000
12406.8
200
300
400
500
600
Inte
ns. [
a.u.
]
000 13000 14000 15000 16000 17000
m/z
14508.9
400
600
800
1000
1200
Inte
ns. [
a.u.
]
000 11000 12000 13000 14000 15000
m/z
13590.4
Figura 63. Espectros UV-MALDI-TOF obtenidos en modo lineal positivo de A, Citocromo C; B, producto de reacción del acople de Citocromo C con -1-O-metil-6-glucosamina; y C, producto de reacción del acople de Citocromo C con 1-aminomaltosa.
A B C
Resultados y Discusión
142
En el caso de la Ubiquitina se decidió estudiar la reacción utilizando un azúcar
sulfatado cargado como la glucosamina-6-sulfato y se decidió realizar la reacción a
tiempos más cortos debido al menor número de grupos amino disponibles para
reaccionar que contiene la proteína. La reacción se llevo a cabo manteniendo las
relaciones molares en 1: 50: 50 y se tomaron alícuotas a 0, 5, 15 y 50 minutos. Luego de
dializar las muestras se analizaron por EM-UV-MALDI-TOF (Fig. 64) y se determinó
el número de residuos incorporados que fue de 0, 5, 5 y 6 respectivamente. Estos
resultados mostraron que en aproximadamente 1 hora la reacción alcanza el equilibrio y
que no todos los grupos básicos de la proteína se encuentran disponibles para
reaccionar. En este caso, fue posible observar la señal correspondiente a la ubiquitina
sin reaccionar en todos los casos. Es interesante notar que la intensidad relativa de la
señal de la proteína tal cual va disminuyendo con el tiempo de reacción.
En resumen, fue posible determinar las condiciones óptimas para la reacción de
acople de las proteínas con los diferentes hidratos de carbono. De todas las condiciones
ensayadas se determinó que las relaciones molares óptimas fueron 1: 50: 50, proteína:
glutaraldehído: azúcar. Los resultados de la reacción que se observaron a las 24 horas se
mantuvieron aproximadamente constantes para reacciones realizadas durante períodos
de tiempos mayores, indicando que la misma alcanza una situación de equilibrio que no
se ve modificada por el paso del tiempo. Además, se determinó que en el caso de
proteínas con pocos grupos básicos disponibles para reaccionar en su estructura, el
tiempo necesario para alcanzar la situación de equilibrio es considerablemente menor,
siendo de aproximadamente una hora.
De esta manera, fue posible poner a punto un método sencillo y la
caracterización de los productos por EM-UV-MALDI-TOF para obtener
glicoconjugados con diferentes cantidades de hidratos de carbono como herramientas
para el estudio de los diferentes mecanismos en que están involucrados los hidratos de
carbono.
Resultados y Discusión
143
250
500
750
1000
1250
1500
Inte
ns. [
a.u.
]
00 8500 9000 9500 10000 10500 11000 11500
m/z
10097.9
8567.6
500
1000
1500
2000
2500Inte
ns. [
a.u.
]
00 8500 9000 9500 10000 10500 11000 11500
m/z
10344.6
8567.6
200
400
600
800
1000
1200Inte
ns. [
a.u.
]
00 8500 9000 9500 10000 10500 11000 11500
m/z
10109.3
8567.6 85
67.6
02
428
2.60
3
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
00 5000 6000 7000 8000 9000 10000
m/z
8567.6
Figura 64. Espectros UV-MALDI-TOF obtenidos en modo lineal positivo de los productos de la reacción de condensación entre la ubiquitina y la glucosamina-6-sulfato a distintos tiempos. A, 0 minutos; B, 5 minutos; C, 15 minutos; y D, 50 minutos.
A
B
C
D
Resultados y Discusión
144
7.2. Caracterización de oligosacáridos provenientes de la degradación de
heparina.
Con el objetivo de obtener pequeños oligosacáridos con diferentes
estructuras para posteriormente realizar la reacción de unión a proteínas, se decidió
realizar una degradación química de la heparina comercial. La degradación de la
heparina se llevó a cabo con ácido nitroso por exactamente 5 minutos para obtener
oligosacáridos medianos. El método arrojó resultados totalmente reproducibles que
fueron controlados por análisis de los fragmentos resultantes por cromatografía de
intercambio iónico de alta resolución (HPAEC). El perfil de elución de las muestras se
mantuvo constante en experimentos sucesivos, lo que permitió purificar una pequeña
cantidad de los diferentes fragmentos (Fig. 65).
0,0 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 8,8 10,0 11,3 12,5 13,8 15,0 16,3 17,5 18,8 20,0 21,3 22,5 23,8 25,0 26,3 2-1
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
min
1 - 20,384
2 - 21,067
3 - 21,417
4 - 22,184
5 - 22,584
23,717
7 - 24,417
8 - 24,9509 - 25,317
26,300
1
23
45
x
x
x x
6
16,3 17,5 18,8 20,0 21,3 22,5 23,8 25,0 26,3
1 - 20,384
2 - 21,067
3 - 21,417
4 - 22,184
5 - 22,584
23,717
7 - 24,417
8 - 24,9509 - 25,317
26,300
1
23
45
x
x
x x
6 A B
t (min)
nC
Figura 65. A, Perfil de elución por HPAEC-PAD de los fragmentos de la degradación de la heparina; B, Ampliación de la zona de interés. Se analizaron las fracciones numeradas de 1 a 6. (X = fracciones no analizadas en detalle).
Resultados y Discusión
145
Las fracciones purificadas fueron posteriormente analizadas por EM-UV-
MALDI-TOF en modo negativo en diferentes condiciones de preparación de las
muestras. Se ensayaron tres matrices y las muestras fueron, en algunos casos, sembradas
en el portamuestras con al agregado de 5 mM de formiato de butilamonio, debido a que
esta descripto que el agregado de sales de amonio favorece y mejora la
desorción/ionización de las muestras (Antonopoulos et al, 2005). Debido a la naturaleza
polianiónica de los glicosamaminoglicanos la obtención de buenos espectros resulta
dificultoso. La necesidad de utilizar un método de volatilización/ionización lo
suficientemente suave para que los grupos sulfato lábiles queden retenidos en la
molécula dando lugar a buenas señales correspondientes a los iones moleculares, pero
que al mismo tiempo produzca fragmentaciones dentro de los anillos para poder
determinar la posición de los grupos sulfato es el mayor problema que hace que la
determinación estructural de este tipo de compuestos no sea, hasta el momento, un
análisis de rutina. El desarrollo de nuevas matrices en los últimos años ha convertido a
la espectrometría de masa UV-MALDI en una herramienta muy útil para su análisis
(Nonami et al., 1998; Wheeler y Harvey, 2001; Fukuyama et al., 2002). Entre las
matrices alternativas desarrolladas se encuentra el compuesto 7-amino-4-metil-
coumarín para el análisis de disacáridos monosulfato, y la combinación con 6-azo-2-
tiotimina permitió el análisis de trisacáridos y tetrasacáridos sulfatados, así como de
oligosacáridos sialilados (Dai et al., 1997). Otros autores demostraron que la utilización
de -carbolinas como matrices en modo negativo resulta muy efectiva en la detección
de especies sulfatadas. En particular las -carbolinas harmano y nor-harmano son
capaces de producir aniones a partir de polisacáridos altamente sulfatados purificados
de algas (-carragenenos), y de oligosacáridos comerciales derivados de los mismos
(Nonami, et al., 1997 y 1998; Erra-Balsells and Nonami, 2002; Fukuyama et al., 2002).
A partir de los espectros obtenidos fue posible realizar la determinación
estructural de los compuestos mayoritarios presentes en las fracciones numeradas de 1 a
6 (Fig. 65). Las fracciones marcadas con X en la figura 65 corresponden a mezclas de
compuestos no resueltas por la cromatografía de intercambio iónico. Esto se determinó
durante el análisis de dichas fracciones por EM-UV-MALDI-TOF por la presencia de
múltiples señales en la región del ión molecular del espectro.
Resultados y Discusión
146
Compuesto 1 (Esquema V)
Se determinó la estructura de este compuesto como un tetrasacárido
tetrasulfatado conteniendo un grupo N-acetilo a partir de las señales observadas
correspondientes a la sal del ión molecular conteniendo cuatro sodios y un potasio, m/z
1165.7; la sal trisódica, m/z 1104.9 y la sal monosódica, m/z 1082.9. En el esquema V
se muestran las principales fragmentaciones para el compuesto 1. En todos los casos se
utilizó la nomenclatura propuesta por Domon y Costello que se muestra en la Fig. 66
(Domon and Costello, 1988). Los fragmentos B2 y Z2 (m/z 539.9 y m/z 504.4,
respectivamente) (Fig. 67b) indican la presencia de dos grupos sulfato en cada
disacárido resultante. 0,3A3 (m/z 642.7) y 2,5A3 (m/z 656.8) (Fig. 67b) son consistentes
con la presencia de un grupo sulfato en la posición 2 de la unidad de ácido urónico
(tercer residuo desde el extremo no reductor) y en consecuencia el segundo grupo
sulfato debería estar sobre la unidad de AnhManOH, donde sería más probable que se
encuentre en la posición 6 que en la 3. La posición de los dos grupos sulfato
correspondientes al disacárido del extremo no reductor no queda inequívocamente
establecida a partir de las señales obtenidas, siendo probable que se encuentren en las
posiciones señaladas en el esquema V.
Otras señales presentes son: m/z 1040.6 (pérdida de CH2CO desde m/z 1082.9,
Fig. 67b); m/z 1003.6 (pérdida de 2SO3 desde m/z 1165.7, Fig. 67a); m/z 608.3 (3,5A3-
H2O).
OO H
O H
O H
C H 2 O H
O
O H
O H
C H 2 O H
O
O H
O H
C H 2 O H
O O
O R
Z0 Z1 Z2
C3 C2 C1
Y2 Y1 Y0
B1 B2 B3
2,5A32,4A2
0,2A1
1,5X1
Figura 66. Nomenclatura de los iones generados por la fragmentación de ologosacáridos (Domon and Costello, 1988).
Resultados y Discusión
147
Compuesto 4 (Esquema V)
Las señales a m/z 1187.8 (M-H, sal pentasódica) y m/z 1165.7 (M-H, sal
tetrasódica) pueden ser asignadas a un tetrasacárido pentasulfatado (Fig. 68a). El tiempo
de retención observado en la purificación por cromatografía de intercambio iónico es
consistente con esta estructura propuesta, al compararlo con el compuesto 1. Los
fragmentos 0,2X3 (m/z 941.7)(Fig. 68b), 2,5A3 (m/z 781.7) y 0,2A3 (m/z 731.8)(Fig. 68a)
indican que ambos residuos de ácido urónico contienen dos grupos sulfatos. La señal a
665.5
33
695.4
45
1003
.635
1165.7
76
841.3
23
1067
.624
1055
.586
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Inte
ns. [a
.u.]
00 600 700 800 900 1000 1100 1200
m/z
*
*
*
*
1003.6
1165.7
A
501.7
24
656.8
52
539.9
11
642.7
50
719.4
42
1040.6
10
0
1000
2000
3000
4000
5000Inte
ns. [a
.u.]
500 600 700 800 900 1000 1100 1200
m/z
*
504.4
539.9
642.7
1040.6
*
*
B
Figura 67. Espectros UV-MALDI-TOF en modo negativo del compuesto 1 utilizando A, DHB como matriz; y B, DHB como matriz y con el agregado de formiato de butilamonio. Las señales marcadas con * corresponden a diferentes aductos de matriz.
Resultados y Discusión
148
Figura 68. Espectros UV-MALDI-TOF en modo negativo del compuesto 4 utilizando A, DHB como matriz y B, nor-harmano como matriz. Las señales marcadas con * corresponden a diferentes aductos de las matrices.
1056
.203
731
.893
781
.764
894.
109
1005
.096
850.
924
842
.186
118
7.815
116
5.7
33
1026.
210
1012
.821
1232
.454
125
5.2
82
0
500
1000
1500
Inte
ns.
[a.u
.]
00 800 900 1000 1100 1200
m/z
* *
*
731.8
892.7 1165.7
1187.8
1056.2
781.7
A
548.4
61
733.9
26
570.6
12
756.0
95
592.7
99
778.2
94
576.6
97
800.5
32
941.6
56
965.7
626
14.
985
1008.0
07
986.3
89
0
200
400
600
800
1000
Inte
ns.
[a.u
.]
00 600 700 800 900 1000
m/z
*
548.4
733.8
941.7
592.8 576.7
965.7
986.3 1008.0
614.9
756.1
B
m/z 892.7 (Fig. 68a) correspondiente a la fragmentación 1,3A4 sugiere la presencia de un
grupo sulfato en la unidad de AnhManOH, siendo necesario que la posición 3 no se
encuentre sustituída.
Los fragmentos C2 (m/z 592.8) y B2 (m/z 576.7) (Fig. 68b) confirman la
presencia de tres grupos sulfato en el disacárido del extremo no reductor. Sin embargo,
Resultados y Discusión
149
la señal correspondiente a m/z 548.4 (Fig. 68b) puede ser asignada al fragmento Z2
conteniendo tres iones sodio, en forma análoga a lo que ocurre con el fragmento Z2 del
compuesto 1 (m/z 504.4).
Otras señales: m/z 1056.2 (M - SO3 - CO)(Fig. 68a), m/z 965.7, 986.3,
1008.0(0,2X3 - Na, - 2Na, - 3Na, respectivamente), 756.1 (1,4X2 - Na), 614.9 (C2 -
Na)(Fig. 68b).
Esquema V
HOO
COOH
HO O
OO
HO NH
OO
COOH
HO O
O
O
OH
Ac
OO
OH
SO3HSO3H
SO3H SO3H
0,3A3642
539B2
Z2 (+Na) 504
Che
2,5A3656
Compuesto 1
Fórmula química C21H41NO34S4
Peso molecular exacto = 1039.0
M + 4Na + K = 1164.9 M + 3Na = 1105.0 M + 2Na = 1083.0
HOO
COOH
HO O
OO
HO NH
OO
COOH
HO O
O
O
OH
SO3H
OO
OH
SO3HSO3H
SO3H SO3H
0,2A3 (+Na) 732
1,5A2548
0,2X3 942
C2593
1,3A48922,5A3
(+4Na) 782
1,4X2 (+K+2Na) 733
Z2 (+3Na)
548
Ch
B2577
Compuesto 4
Fórmula química C24H39NO36S5
Peso molecular exacto = 1077.0
M + 5Na = 1186.9 M + 4Na = 1164.9
Resultados y Discusión
150
Compuesto 2 (Esquema VI)
Las señales a m/z 1218.0 (M-H-H2O, sal monosódica) y m/z 1195.7 (M-H-
CH2CO, sal monosódica) sugirieron la presencia de un hexasacárido disulfatado mono-
N-acetilado. El fragmento C5-H2O (m/z 1050.3) indica que la unidad de anhidromanitol
no se encuentra sulfatada. El ión C4 (m/z 893.1) es consistente con la presencia de una
unidad de ácido urónico no sulfatado, unido directamente a la unidad de AnhManOH
Resultados y Discusión
151
Figura 69. Espectro UV-MALDI-TOF en modo lineal negativo del compuesto 2 utilizando, A, DHB como matriz, y B, nor-harmano como matriz. Las señales marcadas con * corresponden a diferentes aductos de las matrices.
0 00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
4x10
Inte
ns.
[a.u
.]
500 600 700 800 900 1000 1100 1200
m/z
491.0
519.1
729.7
751.7
773.8
790.7934.8
956.71118.8
B
68
5.9
95
66
3.8
646
53.2
85
84
2.5
97
10
50
.33
7
89
3.5
62
71
4.7
15
10
19
.20
91
04
0.2
76
10
79
.31
2
12
18
.06
4
11
95
.74
51
17
4.4
49
0
1000
2000
3000
4000
5000
Inte
ns. [
a.u
.]
00 600 700 800 900 1000 1100 1200
m/z
* *
663.8 685.9
842.5
893.1
1018.1
1040.2
1050.3
1195.7
1218.0
A
Esquema VI
Compuesto 2
OO
COOH
HO OH
OO
HO NH
OO
COOH
HO OH
O
O
OH
SO3H
OHO
OH
HOO
COOH
HO OH
OO
HO NH
Ac
OH
SO3H
Z4841
Z3(+Na)
665
C4892
2,5X4(+2Na+K)
1017
C5(-H2O)1050
Chemical FormuExact Ma
2,5A3 (+Na) 519
2,5X5 (+Na) 1119
M + Na – CH2CO = 1195.2 M + Na – H – H2O = 1219.1
Fórmula química: C38H60N2O38S2 Peso molecular exacto: 1216.2
M + 4Na = 1506.1 M + 5Na = 1527.0
OO
COOH
HO O
OO
HO NH
OO
COOH
HO O
O
O
OH
Ac
OO
OH
HOO
COOH
HO OH
OO
HO NH
Ac
OH
SO3H
SO3H
SO3H
SO3H
2,5X5(+2Na)
1343
Y5(+4Na)1328
0,2X4(+2Na)
1165
2,5X3(+Na)
942
1,4A3548
1,4X2(+K+2Na)
733
2,5X4(+3Na)
1203
Z2(+3Na)
548
Chemical Formula:Exact Mass
Compuesto 3
Fórmula química: C40H62N2O45S4 Peso molecular exacto: 1418.2
Resultados y Discusión
152
(Fig. 69a). Por otra parte, los fragmentos 2,5X5, 2,5X4, y Z4 (m/z 1118.8, Fig. 69b, m/z
1017.1 y 841.5, Fig. 69a, respectivamente) junto con la señal a m/z 663.8 (Y3-Na-H2O,
Fig. 69a) apoyan la presencia de un grupo acetilo en la primera unidad de glucosamina
(desde el extremo no reductor) en lugar de un grupo sulfato. Por lo tanto, teniendo en
cuenta esta última señal, los dos grupos sulfatos deben estar en la otra unidad de
glucosamina. Las fragmentaciones dentro de esta GlcN (0,3A4, 3,5A4 y 1,4X2 a m/z 790.7,
729.7 y 491.0 respectivamente) apoyan la hipótesis de que los grupos sulfatos se
encuentran en el N y en la posición 6 (Fig. 69b).
Otras señales: m/z 1040.2 (m/z 1081.1 - Na, Fig. 69a); m/z 956.7 (2,5X4 - Na);
m/z 934.8 (2,5X4); 773.7 (3,5A4 - 3Na); 751.7 (3,5A4 - 2Na) (Fig. 69b); m/z 685.9 (m/z
663.8 - Na) (Fig. 69a), m/z 544.8 (3,5X2 - K); m/z 566.7 (m/z 544.8 - Na) (Fig. 69b).
Compuesto 3 (Esquema VI)
El ión molecular observado (m/z 1505.8) podría corresponder a la sal tetrasódica
de un hexasacárido tetrasulfatado, di-N-acetilado y la señal a m/z 1526.8 correspondería
al ión conteniendo cinco sodios. El fragmento 2,5X5 (m/z 1342.9) apoya esta hipótesis.
El ión Y5 (m/z 1329.0) sugiere que el estremo no reductor no se ecuentra sulfatado y el
fragmento 0,2X4 (m/z 1165.5 y m/z 1188.2 [m/z 1165.5 - Na]) indica que el grupo
sulfato no podría estar ubicado sobre el disacárido del extremo no redutor, de manera
que los cuatro grupos sulfato debería estar ubicados sobre las unidades 4-6 (Fig. 70a y
b). De manera similar, los iones m/z 1180.5 y 1204.2 corresponderían al fragmento 2,5X4
sin y con sodio. Finalmente, la señal a m/z 942.7 correspondiente al ión 2,5X3 apoya esta
asignación (Fig. 70c).
Las señales a m/z 548.1 o 548.4 (Fig. 70a y c, respectivamente) correspondientes
a la fragmentación 1,4A3, permite localizar un grupo sulfato en la posición 2 del segundo
residuo de ácido urónico (unidad 3). Este fragmento también se correlaciona con el
fragmento Z2 como se describió para el compuesto 4, compartiendo el mismo disacárido
conteniendo una unidad de anhidromanitol. El fragmento 1,4X2 (m/z 733.9, Fig. 70c) es
consistente con la presencia de un grupo sulfato en la posición 6 de la segunda unidad
GlcNAc y no en la posición 3. De esta manera, los dos grupos sulfatos restantes deben
estar ubicados sobre el disacárido reductor. La ubicación de los mismos sería en la
posición O-2 del ácido urónico y otro en la posición O-6 (o O-3) del anhidromanitol, o
los dos grupos sulfato podrían estar sustituyendo ambas posiciones del anhidromanitol
Resultados y Discusión
153
548.4
43
57
0.5
97
73
3.9
44
75
6.1
25
592.7
58
778.2
58
942
.710
0
250
500
750
1000
1250
1500
Inte
ns.
[a.u
.]
00 550 600 650 700 750 800 850 900 950
m/z
548.4
570.5
592.7
733.9
756.1
942.7
*
Figura 70. Espectros UV-MALDI-TOF en modo negativo del compuesto 3 utilizando A, DHB como matriz; B, ampliación del espectro A desde m/z 1100 a 1600; y C, nor-harmano como matriz. Las señales marcadas con * corresponden a aductos de las moléculas de matriz en todos los casos.
10
04
.04
8
84
1.8
21
98
9.0
03
11
66
.50
7
13
29
.07
31
34
2.9
66
54
8.1
75
15
05
.85
9
0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
Inte
ns.
[a.u
00 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500
m
*
* *
548.1 1004.0
1165.5
1329.0
1342.9
1505.8
*
A
11
66
.50
7
13
29
.07
3
11
80
.55
3
13
42
.96
6
15
05
.85
9
12
44
.33
9
14
07
.53
2
15
26
.83
4
0 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500
m
B
1180.5
1165.5
1329.0
1342.9
1407.5
1505.8 1188.2
1204.2
1526.8
1244.3
C
Resultados y Discusión
154
(en este último caso la degradación con ácido nitroso debería haber hidrolizado el sitio
de unión de la heparina conteniendo una unidad de glucosamina N,3,6-trisulfatada). No
fue posible obtener señales adicionales que permitieran la diferenciación entre estas dos
posibilidades.
Otras señales: m/z 1244.3 (m/z 1342.9 - SO3 - H2O, Fig. 70b); m/z 1407.5 (M -
SO3 - H2O, Fig. 70b); m/z 1004.0 (m/z 1165.5 - 2SO3, Fig. 70a); m/z 756.1 (m/z 733.9 -
Na); m/z 570.5 (m/z 548.4 - Na); m/z 592.7 (m/z 570.5 - Na, Fig. 70c).
Compuesto 5 (Esquema VII)
Se observó el ión molecular a m/z 1536.9 como sal disódica correspondiente a
un hexasacárido hexasulfatado y a m/z 1513.8 como la sal monosódica. A partir de los
calculos de masas realizados se determinó que no están presentes grupos acetilos pero si
se pudo determinar que ambas glucosaminas contienen grupos sulfato como N-sulfatos.
La señal a m/z 1351.2 (C5+Na-H2O) (Fig. 71a) indica que la unidad de AnhManOH
terminal no se encuentra sulfatada como ocurre en el compuesto 2. El fragmento Y3
(m/z 837.8, Fig. 71c) se corresponde con un trisacárido incluyendo al anhidromanitol
conteniendo tres grupos sulfatos. Los fragmentos C2 y 1,5A2 (m/z 593.0 y 548.0,
respectivamente, Fig. 71b) sugieren la presencia de dos grupos sulfatos adicionales
sobre el disacárido del extremo no reductor. La presencia de los grupos sulfato en la
posición 2 del ácido urónico y en la posición 6 de la N-sulfoglucosamina conforman el
disacárido más abundante dentro de los oligosacáridos de la heparina. El fragmento 3,5X2-H2O a m/z 568.1 (Fig.71b) concuerda con la presencia de un grupo sulfato en la
posición 6 de la unidad GlcNS. El grupo sulfato faltante podría estar localizado en la
posición 2 del residuo de ácido urónico o, menos probablemente, en la posición 3 de la
glucosamina. Adicionalmente, los fragmentos 0,2A3 (m/z 732.4, 754.5 y 776.7, Fig. 71b)
son similares a los obtenidos para el Compuesto 4.
Otras señales son: m/z 1337.6 (M - H - 2SO3 - H2O, sal monosódica), m/z
1196.6 (M - H - 4SO3, sal monosódica), m/z 1173.7 (M - H - 4SO3, ácido libre), m/z
1011.8 (M - H - 6SO3) (Fig. 71a), m/z 902.3 (1,4X3 - 2K - 2H), m/z 886.4 (1,4X3) (Fig.
71c), m/z 615.4 (C2 - Na) (Fig. 71b).
Resultados y Discusión
155
Figura 71. Espectro UV-MALDI-TOF en modo negativo del compuesto 5 utilizando, A, DHB como matriz, B, nor-hamano como matriz, y C, expansión del espectro mostrado en B desde m/z 800 a 940. Las señales marcadas con * corresponden a aductos moleculares de las matrices.
83
4.2
05
99
7.34
7
133
7.6
65
117
3.7
39
101
1.8
82
84
8.15
1
119
6.6
34
135
1.2
27
15
13.8
44
153
6.9
62
0
100
200
300
400
Inte
ns.
[a.u
.]
00 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500
m/z
*
*
1011.8
1173.7
1196.6
1337.6
1351.2 1513.8
1536.9
A
57
0.7
21
59
3.0
40
61
5.4
96
54
8.0
92
75
6.5
39
77
9.7
51
73
4.4
46
0
500
1000
1500
2000Inte
ns.
[a.
00 550 600 650 700 750 800
m
886
.434
902
.32
0
837
.81
5
820 840 860 880 900 920 940
837.8
886.4
902.3
548.0
568.1
593.0
615.4
732.4
754.5
776.7
B C
Resultados y Discusión
156
Compuesto 6 (Esquema VII)
En este caso no fue posible observar la señal correspondiente al ión molecular y,
en consecuencia, las asignaciones realizadas no han podido ser confirmadas. La
estructura propuesta ha sido teniendo en cuenta el orden de elución de este compuesto
Y4(+2Na) 1039
OO
COOH
HO O
OO
HO NH
OO
COOH
HO OH
O
O
OH
SO3H
OO
OH
HOO
COOH
HO O
OO
HO NH
SO3H
O
SO3HSO3H
SO3H SO3H Chemical Formula: C36H58N2O52S7Exact Mass: 1574.0
1,5X4 (+2Na) 1068
0,2X3 (+2Na) 906
0,2A3 (+2K) 786
1,5X2 (+Na) 469
2,5X2 (+Na) 578
Y3 (+Na+2K) 837
2,5A3694
SO3H
Y0243
2,5A2 (+3Na) 505
Compuesto 6
Fórmula química : C36H58N2O52S7
Peso molecular exacto : 1574.0
OO
COOH
HO OH
OO
HO NH
OO
COOH
HO O
O
O
OH
SO3H
OHO
OH
HOO
COOH
HO O
OO
HO NH
SO3H
O
SO3H
SO3H
SO3H
B5 (+Na) 1352
C2 593
SO3H
1,5A2 548
Y3 (+2K+Na) 837
3,5X2(-H2O) 568
2,5X3 (+4Na)
886
Chemical Formula: C36H58N2O49S6Exact Mass: 1494.0
Fórmula química : C36H58N2O49S6
Peso molecular exacto : 1494.0
M + 2Na – H = 1537.0 M + Na – H = 1515.0
Compuesto 5
Esquema VII
C5
(+Na-H2O) 1351
Resultados y Discusión
157
en el perfil de elución en HPAEC. Al eluir a un mayor tiempo de retención que el
Compuesto 5, el Compuesto 6 debe contener al menos siete grupos sulfatos en su
estructura. La presencia de señales correspondientes a diferentes fragmentos están de
acuerdo con la estructura del hexasacárido heptasulfatado que se muestra en el esquema.
El ión 2,5A2 (m/z 505.2, Fig. 72c) indica un ácido urónico terminal unido a una unidad
de glucosamina N,6-disulfatada. También se observaron las señales correspondientes a
los fragmentos 1,5X4 (m/z 1068.0, Fig. 72a) y Y4 (m/z 1039.6, Fig. 72b) que apoyan la
asignación realizada anteriormente. Asimismo, fue posible observar la misma
fragmentación pero con la carga negativa retenida en el otro residuo dando lugar al
fragmento B2 (m/z 599.7, Fig. 72c, m/z 665.2 sal trisódica, Fig. 70b).
Las señales correspondientes a los fragmentos 2,5X2 sal monosódica, 2,5X2 y 1,2X2
(m/z 578.4; 557.5, Fig. 72c; y 469.6, Fig. 72b, respectivamente) indican la presencia de
un grupo sulfato adicional en el disacárido del extremo reductor, teniendo en cuenta que
la glucosamina se encontraría N-sulfatada. También se observó la señal correspondiente
al fragmento Y1 (m/z 243.5) que indicaría la presencia de un residuo de anhidromanitol
sulfatado en la posición O-3 ó O-6. Por otra parte, el ión Y3 (837.3, Fig. 72c) permitió
localizar el grupo sulfato en la posición 6 de la unidad central de N-sulfoglucosamina.
Además, los dos iones provenientes de la ruptura del mismo enlace pero dejando la
carga en cada uno de los fragmentos, 0,2X3 (m/z 906.4, Fig. 72a) y 0,2A3 (m/z 786.2, Fig.
72a), permitieron establecer que la unidad central de ácido urónico se encuentra
sulfatada en la posición 2. Esta estructura se ve confirmada por la presencia de la señal a
m/z 694.3 correspondiente al fragmento 2,5A3 (Fig. 72c).
Otras señales son: m/z 707.8 (3,5A3 - Na), m/z 730.7 (3,5A3 - 2Na), m/z 808.0
(m/z 786.2 - Na) (Fig. 72a), m/z 890.6 ( m/z 1068.0 - 2SO3 - H2O), m/z 868.5 ( m/z
890.6 - Na), m/z 687.3 (m/z 868.5 - 2SO3 - Na), m/z 487.8 (m/z 665.2 - 2SO3 - H2O)
(Fig. 72b).
La optimización de la degradación con ácido nitroso, seguida de una separación
por HPAEC-PAD permitió obtener diferentes oligosacárido sulfatados a partir de la
heparina comercial de un modo rápido y sencillo. Debido a la simplicidad y bajo costo,
esta reacción podría ser una buena alternativa a las degradaciones enzimáticas para
obtener este tipo de oligosacáridos.
Resultados y Discusión
158
707.870
730.700
808.016
786.290
906.466
1068.033
0
1000
2000
3000
4000
Intens. [a
.u.]
00 500 600 700 800 900 1000 1100
m/z
*
*
*
*
*
786.2
707.8
730.7
808.0 905.4 1068.0
A
487.867
469.676 68
7.38
8
578.48
0
103
9.683
665
.231
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Intens. [a
.u.]
00 500 600 700 800 900 1000 1100
m/z
868.5
890.6
469.6 487.8
578.4
665.2
687.3
1039.6
B
*
567.5 599.7
694.3
505.2
837.3
C
0
200
400
600
Intens
. [a.u.]
00 550 600 650 700 750 800 850 900 950
m/z
Figura 72. Espectros UV-MALDI-TOF en modo negativo correspondientes al compuesto 6 utilizando, A, DHB como matriz, B, DHB como matriz con el agregado de formiato de butilamonio, y C, nor-harmano como matriz con el agregado de formiato de butilamonio. Las señales marcadas con * corresponden a aductos de las matrices.
Resultados y Discusión
159
En este caso fue posible determinar las estructuras de seis oligosacáridos,
purificados por HPAEC-PAD, a partir del análisis por EM-UV-MALDI-TOF en modo
negativo utilizando tres matrices diferentes. La columna ProPac PA1 utilizada permite
la separación de los diferentes fragmentos en función de la cantidad de grupos
sulfato presentes en el oligosdacárido, lo que a su vez depende del tamaño del mismo.
Las fracciones analizadas en este caso consisten en tetra- y hexasacáridos, donde para
cada serie las estructuras deducidas a partir del análisis de los espectros de EM-UV-
MALDI-TOF corresponden con el orden de elución esperado, donde las especies más
sulfatadas son eluídas a mayores concentraciones de sales. Esta correlación sugiere que
los fragmentos diagnósticos no sufren una extensa desulfatación y en consecuencia fue
posible determinar el número total de grupos sulfato presentes en cada oligosacárido.
La ausencia de desulfatación se debe probablemente al alto contenido de iones sodio
presentes en la muestras adquiridos durante la etapa de purificación por HPAEC-PAD,
los cuales estabilizan los grupos sulfato previniendo la eliminación de los mismos
durante el proceso de volatilización/ionización (Tissot et al, 2007).
Se observó que el agregado de formiato de butilamonio permitió una mejor
desorción de la muestra, que se debe probablemente a una modificación en la co-
cristalización de la muestracon la matriz en el portamuestras. Al realizar los espectros
en diferentes condiciones y con el uso de distintas matrices no fue necesario un análisis
del tipo EM/EM para determinar las estructuras. Solamente en algunos casos no fue
posible determinar inequivocamente la posición de algunos grupos sulfato.
La técnica utilizada para el análisis de los oligosacáridos involucró la utilización
de varias matrices para la preparación de las muestras, sin embargo, solo fueron
necesarios los espectros obtenidos con dos matrices (DHB y nHo) para realizar la
asignación estructural de los mismos. El uso de DHB como matriz permitió la
visualización de la señal correspondiente al ión molecular en casi todos los casos. Esta
información resultó de gran utilidad para determinar el número total de grupos sulfato
presentes en cada oligosacárido. Adicionalmemente, con esta matriz fue posible
identificar l señales correspondientes a algunos iones desulfatados.
Por otra parte, el uso de nor-harmano como matriz dió como resultado la
obtención de fragmentos, que en su gran mayoría conservaron el grupo sulfato haciendo
que estos iones sean de gran importancia para la determinación de las posiciones de los
estos grupos sulfatos. En algunos casos, los espectros obtenidos utilizando nor-harmano
como matriz no resultaron de utilidad por la ausencia de las señales correspondientes a
Resultados y Discusión
160
este tipo de iones (Compuesto 1), en este caso se utilizó el agregado de formiato de
butilamonio y DHB como matriz para generar este tipo de fragmentos de interés.
Finalmente, es interesante destacar que mientras en el análisis de oligosacáridos
neutros, los iones más abundantes corresponden a las fragmentaciones de las uniones
glicosídicas (B, C, Y y Z), mientras que en el caso de los oligosacáridos sulfatados
analizados en este caso, las señales mayoritarias correspondieron a fragmentaciones
dentro de los anillos (A y X). Estas fragmentaciones claves para la asignación
estructural se vieron favorecidas con el aumento del número de grupos sulfato presentes
en la molécula. Las unidades internas de ácido urónico sulfatado en la posición 2 mostró
múltiples fragmentaciones del anillo, fundamentalmente involucrando la unión C2 – C3
(2,5X, 2,5A, 0,2A), mientras que la unidad de ácido urónico del extremo no reductor casi
no mostró fragmentaciones. Adicionalmente, las unidades de GlcNAc y GlcNS,
mostraron principalmente fragmentaciones C5 – O (2,5X, 2,5A, 1,5X, 1,5A). La
fragmentación de la unidad de anhidromanitol solo se detectó en el caso del Compuesto
4 (1,3A4).
Aunque todavía son necesarios nuevos estudios para que el análisis glicólico de
este tipo de compuestos sea un análisis de rutina, este trabajo presenta una forma simple
de obtención y análisis de oligosacáridos estructuralmente definidos. Esta metodología
podría resultar de interés para el estudio de otras glicoproteínas de origen natural.
Materiales y Métodos
Materiales y Métodos
161
Reactivos y equipamiento utilizado
En todos los casos se utilizaron solventes de grado analítico o similar. Se utilizó
agua deionizada grado MilliQ (resistividad 18,2MTodos los reactivos fueron de grado de pureza analítica.
Los anticuerpos anti-GCS humana fueron gentilmente cedidos por los Drs.
Marks y Pagano de la Mayo Clinic and Foundation, U.S.A. Los anticuerpos fueron
obtenidos a partir de la inmunización de conejos con péptidos sintéticos basados en la
secuencia de aminoácidos predicha para la enzima humana. Para este trabajo se
emplearon dos anticuerpos que reconocen diferentes regiones de la proteína. El
anticuerpo 1.2 reconoce una zona cercana al extremo C-terminal, mientras que el
anticuerpo 5.1 reconoce una región del extremo N-terminal de la proteína.
Materiales y Métodos
162
Cultivo de Plasmodium falciparum
Las formas intraeritrocíticas del clon 3D7 de Plasmodium falciparum se
cultivaron en botellas de cultivo (75 cm2) conteniendo medio RPMI 1640 suplementado
con 25 mM Hepes, 21 mM bicarbonato de sodio, 370 M hipoxantina, 11 mM glucosa,
40 g/ml gentamicina y 10% (v/v) de suero humano, donde se agregaron glóbulos rojos
humanos de tipo O+ lavados hasta una concentración del 5%. Los cultivos se incubaron
a 37ºC bajo una atmósfera controlada conteniendo 5,05% CO2, 4,93% O2 y 90,2 N2 con
cambios diarios del medio de cultivo (Trager and Jensen, 1976; Kimura et al., 1996). El
crecimiento y multiplicación de los parásitos fue monitoreado por observación al
microscopio de muestras teñidas con Giemsa. Estos cultivos fueron realizados en la
Universidad de San Pablo, Brasil.
Purificación de los diferentes estadios intraeritrocíticos
Los parásitos fueron cosechados y los diferentes estadios intraeritrocíticos
fueron purificados por centrifugación a 15000 g en un gradiente discontinuo 40/70/80 %
de Percoll durante 30 minutos a 25ºC. Luego de la centrifugación se separaron las
diferentes fracciones, la banda superior (40%) que contiene los esquizontes, una banda
intermedia (interfase 70-80%) que contiene los trofozoítos y el precipitado que contiene
los estadios anillos (Braun-Breton et al., 1986).
Preparación de los complejos NBD-dihidroceramida, NBD-ceramida y NBD-
esfingomielina con seroalbúmina bovina
Cada uno de los esfingolípidos comerciales marcados con el grupo fluorescente
nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD) se disolvieron en cloroformo: metanol, 1:2, v/v,
hasta una concentración final de 1g/l. Se tomaron 50 l de dicha solución y se
secaron bajo corriente de N2, seguido de 30 minutos en desecador con vacío. Luego se
redisolvieron en 20 l de etanol y esta solución se agregó muy lentamente y con
agitación continua a 166 l de una solución 0,5 mM de seroalbúmina bovina (BSA)
Materiales y Métodos
163
delipidizada en buffer Tris-HCl 10 mM, pH 7,4 obteniendose una solución de NBD-
esfingolípido/BSA de concentración 0,5 mM (Marks et al., 2000)
Incorporaciones metabólicas en los estadios intraeritrocíticos de Plasmodium
falciparum
Incorporación de sustratos fluorescentes
Se realizaron incorporaciones metabólicas de NBD-dihidroceramida, NBD-
ceramida y NBD-esfingomielina. Los diferentes NBD-esfingolípidos, previamente
acoplados a seroalbúmina bovina, fueron agregados a los cultivos de los parásitos en
una concentración de 5 M en medio RPMI 1640. Los parásitos fueron marcados por 24
horas y luego se cosecharon. Posteriormente se purificaron los diferentes estadios
intraeritrocíticos, como se detalló anteriormente y se analizaron los esfingolípidos.
Paralelamente se realizaron, como controles, las mismas incorporaciones en un número
equivalente de glóbulos rojos no infectados que fueron procesados de igual manera.
Incorporaciones de precursores radioactivos
Se realizaron incorporaciones de [U-14C]-ácido palmítico, D-[U-14C]-glucosa y
Na235SO4.
El [U-14C]-ácido palmítico (Amersham, 822 mCi·mmol-1, 2.91 mCi·mg-1),
originalmente disuelto en tolueno se llevó a seco con N2, se redisolvió en etanol y se
acopló con seroalbúmina bovina delipidizada en una relación molar 1:1, como se
describió anteriormente. Los parásitos (5.7% anillos, 5.7% trofozoitos, 4% esquizontes)
fueron incubados durante 18 horas en medio de cultivo RPMI 1640 conteniendo 6.25
Ci/ml del precursor radioactivo, 0,5% Albumax y 0,05% seroalbúmina bovina.
La D-[U-14C]-glucosa (Amersham, 291 mCi·mmol-1, 1,54 mCi·mg-1) fue
incorporada en una concentración de 6,25 mCi/ml en medio RPMI 1640 sin el agregado
de glucosa (Uhrig et al, 1996). Los parásitos (5.9% anillos, 5.4% trofozoítos, 3.7%
esquizontes) fueron incubados en estas condiciones por 18 horas.
Materiales y Métodos
164
El Na235SO4 (Amersham, 1 mCi·mmol-1, 2.2 mCi·ml-1) fue incorporado en una
concentración final de 12,5 mCi/ml en medio RPMI 1640. Los parásitos (6.3% anillos,
7.3% trofozoítos, 4.6% esquizontes) fueron incubados durante 18 horas.
En todos los experimentos, la viabilidad de los parásitos fue verificada por
evaluación en el microscopio de muestras teñidas con Giemsa. Luego de las
incorporaciones, los diferentes estadios intraeritrocíticos fueron purificados como se
describió previamente.
En todos los casos, se realizaron incorporaciones metabólicas de los diferentes
precursores radioactivos de muestras de igual número de glóbulos rojos no infectados
como control.
Ensayos con inhibidores en cultivos de Plasmodium falciparum
Se realizaron ensayos de incorporaciones metabólicas en presencia y ausencia de
dos inhibidores conocidos del metabolismo de esfingolípidos en mamíferos,
DL-threo-1-fenil-2-palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol (PPMP) (Matreya) y 2-[4-
[(Z)-1,2-difenilbut-1-enil]fenoxi]etil-dimetilazanio (Tamoxifeno) (Gador). En este caso
se realizaron los tratamientos con los inhibidores previamente a la incorporación de los
precursores marcados. Los inhibidores fueron agregados a los cultivos de los parásitos
en una concentración final de 10M en medio RPMI. Luego de 24 horas de incubación
se agregaron al medio de los cultivos los diferentes precursores marcados y se
incubaron durante 24 horas más antes de la cosecha y purificación de los diferentes
estadios.
Determinación de la IC50 del tamoxifeno en cultivos de Plasmodium falciparum
Se utilizaron diluciones de tamoxifeno a partir de una solución madre en etanol
(10 mM). Los ensayos fueron llevados a cabo en microplacas de cultivos de fondo plano
según el método propuesto por Desjardins et al. para determinar la concentración que
produce el 50% de inhibición en el creciemiento. Los valores de IC50 fueron calculados
por análisis probit (Minitab Statistical Software 13.30 TM; Minitab Inc.).
Materiales y Métodos
165
Cultivo de epimastigotes de Trypanosoma cruzi, cepas Tulahuen 2 y CL Brener
Las formas epimastigote de Trypanosoma cruzi fueron cultivadas durante 10
días a 28ºC en un medio bifásico axénico en erlenmeyers de 250 ml. El medio bifásico
consta de una fase sólida constituída por 3% de agar nutritivo (Difco), esterilizado por
autoclave durante 20 min a 1 atmósfera de presión, y 2% de sangre desfibrinada de
conejo y una fase líquida constituída por 3,7% de infusión cerebro-corazón (Difco)
(Cazzulo et al., 1985).
Los parásitos se cosecharon por centrifugación a 7000 rpm y se lavaron 2 veces
con buffer fosfato salino.
Estos cultivos fueron realizados en el Instituto Nacional de Parasitología Mario
Fatala-Chaben, ANLIS-Malbran, Min. de Salud, Buenos Aires, Argentina.
Incorporaciones metabólicas en epimastigotes de Trypanosoma cruzi
En el día 6, los cultivos de epimastigotes de Trypanosoma cruzi se traspasaron a
medio líquido suplementado con 10% de suero fetal bovino y se agregó la NBD-
ceramida o la NBD-dihidroceramida previamente acopladas a BSA en una
concentración final de 5 M. Posteriormente los parásitos se cosecharon como se
describió anteriormente.
Ensayos con inhibidores en cultivos de Trypanosoma cruzi
Se realizaron ensayos de incorporaciones metabólicas en presencia y ausencia de
dos inhibidores conocidos del metabolismo de esfingolípidos en mamíferos, DL-threo-1-
fenil-2-palmitoilamino-3-morfolino-1-propanol (PPMP) (Matreya) y 2-[4-[(Z)-1,2-
difenilbut-1-enil]fenoxi]etil-dimetilazanio (Tamoxifeno) (Gador). En este caso, los
parásitos fueron traspasados a medio líquido suplementado con 10% de suero fetal
bovino el día 5, donde se agregaron los inhibidores en una concentración final de 10M.
Materiales y Métodos
166
Luego de 24 horas se agregaron los esfingolípidos fluorescentes y los parásitos se
cosecharon el día 7 como se describió anteriormente.
Extracción y purificación de los esfingolípidos marcados
Extracción de los lípidos
Luego de las incorporaciones metabólicas, los parásitos fueron liofilizados. Los
lípidos fueron extraídos con cloroformo: metanol, 2:1, v/v (2 veces), y posteriormente
con cloroformo: metanol, 1: 2, v/v (2 veces). Los extractos se juntaron y se secaron bajo
corriente de N2.
Cromatografía de intercambio aniónico
Las muestras conteniendo los lípidos fluorescentes fueron disueltas en una
mínima cantidad de cloroformo: metanol: agua (30:60:8, v/v/v) y se fraccionaron por
intercambio aniónico utilizando una columna de DEAE-Sephadex A-25 (forma acetato)
(1,3 x 5 cm), previamente equilibrada en el mismo solvente. Los lípidos neutros y
zwiteriónicos fueron recuperados en la primera fracción utilizando como solvente
cloroformo: metanol: agua (30:60:8, v/v/v). Los lípidos ácidos fueron eluídos con
cloroformo: metanol: 0,8M acetato de sodio, (30: 60: 8, v/v/v). Ambas fracciones
fueron llevadas a seco por evaporación a presión reducida.
La fracción de los lípidos ácidos fue posteriormente desalada utilizando una
columna pre-armada de fase reversa RP-18 (Supelco). Para ello, la muestra fue disuelta
en agua y aplicada sobre la columna previamente equilibrada en agua. La columna se
eluyó con 5 volúmenes de agua para eliminar las sales y luego se recuperaron los lípidos
con 5 volúmenes de metanol seguidos de 5 volúmenes de metanol: cloroformo, 1:1, v/v.
Las fracciones conteniendo los lípidos se juntaron y se evaporó el solvente a presión
reducida.
Materiales y Métodos
167
Saponificación
Las muestras de lípidos provenientes de las incorporaciones con los precursores
radioactivos fueron tratadas con 0,1M NaOH en metanol (500l) durante 3 horas a
37ºC. Las mezclas fueron neutralizadas con HCl 1M en presencia de 50 l de buffer
fosfato 50 mM pH 7 para evitar la sobreacidificación. Luego de la evaporación del
solvente por destilación a presión reducida, se eliminaron las sales por cromatografía en
fase reversa utilizando columnas pre-armadas (Supelco) como se describió
anteriormente.
Ensayo de actividad de la glucosilceramida sintasa (GCS)
La reacción de actividad de la enzima GCS fue realizada en buffer Tris-HCl 50
mM, pH 7,4, conteniendo 25 mM KCl, 5 mM MnCl2, 0,1% Chaps, 2 mM -NAD, 2,5
mM UDP-Glucosa y 5 nmoles de NBD-ceramida o NBD-dihidroeramida (Sigma)
conjugada con seroalbumina bovina como sustrato en un volumen final de reacción de
200 l. Luego de 60 minutos de incubación a 37ºC la reacción se detuvo por
enfriamiento y se extrajeron los lípidos por agregado de 1,2 ml de cloroformo: metanol,
1:1, v/v y 0,52 ml de solución ácida salina (0,9% NaCl y 15mM HCl). La fase orgánica
se separó y se eliminó el solvente bajo corriente de N2 (Futerman and Pagano, 1991;
Paul et al., 1996). Los lípidos se resuspendieron en 30 l de cloroformo: metanol, 1:1,
v/v y se analizaron por cromatografía en capa delgada.
Cromatografía en capa delgada
Para el análisis de los esfingolípidos se utilizaron placas de silica gel- 60 sin
indicador (Merk). Como solventes de desarrollo se utilizaron: Sistema A: cloroformo:
metanol: agua, (40:10:1, v/v/v); Sistema B: cloroformo: metanol: agua, (65:25:4, v/v/v);
Materiales y Métodos
168
Sistema C: propanol: amoníaco: agua, (75:5:5, v/v/v); Sistema D: cloroformo: hexano:
tetrahidrofurano: isopropanol: metanol: agua, (35:35:0,35:40:5:4, v/v/v/v/v/v).
Los esfingolípidos fluorescentes fueron visualizadas utilizando un analizador de
imágenes FujiFilm Las1000 equipado con una Intelligent Dark Box II y un software
FujiFilm Las1000pro.
En el caso de las muestras conteniendo esfingolípidos marcados
radioactivamente, las mismas fueron reveladas por fluorografía a -70ºC utilizando
EN3HANCE (NEN) y radiografías Kodak X-OMAT AR.
Cromatografía en capa delgada en fase reversa
Para el análisis de los esfingolípidos en fase reversa se utilizaron placas de silica
gel 60 RP-18 (Merk). Como solventes de desarrollo se utilizaron metanol: agua (90:10,
v/v) (Sistema E) y acetonitrilo: ácido acético (1:1, v/v) (Sistema F).
Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)
Las muestras de esfingolípidos provenientes de las incorporaciones metabólicas
se analizaron por cromatografía líquida de alta resolución utilizando un equipo Waters
600 equipado con un detector de fluorescencia Waters 2475, Multi Fluorescence
Detector.
Para el análisis se utilizó una columna de fase reversa RP-18 (Supelco, 5m) y
como fase móvil se empleó metanol: agua, 9:1, v/v, con un flujo de 0,5 ml/min. La
longitud de onda de excitación del detector fue fijada en 465 nm y la de emisión en 530
nm. El volumen de inyección de cada muestra fue de 20 l. Se utilizaron patrones de
NBD-ceramida, NBD-dihidroceramida, NBD-glucosilceramida, NBD-lactosilceramida
y NBD-esfingomielina.
Materiales y Métodos
169
Síntesis de N-(NBD-aminocaproil)esfinganina--D-galactosil (NBD-DHGalCer)
y N-(NBD-aminocaproil)esfinganina--D-glucosil (NBD-DHGlcCer)
La -D-galactosilesfingosina o la -D-glucosilesfingosina fueron hidrogenadas
en metanol bajo atmósfera de hidrógeno (30 psi) a temperatura ambiente en presencia
de 10% de catalizador de Pd/C en un hidrogenador Parr. La reacción fue monitoreada
por cromatografía en placa delgada. La reacción fue completa luego de 2 horas. La -D-
hexosilesfinganina obtenida fue posteriormente N-acilada por reacción con el derivado
N-succinimidil del ácido C6-NBD (ácido (6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-
il)amino)hexanoico)) (Molecular Probes, Eugene, OR) en dimetilformamida y di-
isopropilamina. La reaccion de amidación fue llevada a cabo en la oscuridad a 30ºC
durante 48 horas (Schwarzmann et al, 1987). Los productos de reacción fueron
purificados por cromatografía en capa delgada preparativa utilizando como solvente de
desarrollo cloroformo: metanol: agua (40: 10: 1, v/v/v). Las NBD-
hexosildihidroceramidas fueron eluídas de la placa utilizando metanol que fue luego
eliminado por evaporación bajo corriente de N2.
Síntesis de N-(NBD-aminocaproil)esfingosina--D-galactosil-3-sulfato (NBD-
Sulfátido)
A partir de una muestra comercial de sulfátidos (Sigma) se realizó la de N-
deacilación de los mismos por tratamiento con KOH 1M en metanol bajo atmósfera de
nitrógeno durante 18 horas. La mezcla de reacción se neutralizó con ácido acético 2N y
se secó bajo corriente de N2. El curso de la reacción se siguió por CCD utilizando como
solvente n-propanol: amoníaco: agua (75: 5: 5, v/v/v). Las placas se revelaron con
H2SO4 10% en etanol y con ninhidrina 2% en acetona (Neuenhofer et al, 1985).
El liso-sulfátido obtenido fue posteriormente N-acilado utilizando el derivado N-
succinimidil del ácido C6-NBD (ácido (6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-
il)amino)hexanoico)) (Molecular Probes, Eugene, OR) como se describió anteriormente.
Materiales y Métodos
170
Inmunofluorescencia indirecta
Para los estudios de inmunofluorescencia indirecta se prepararon láminas finas
sobre portaobjetos de vidrio de eritrocitos infectados con Plasmodium falciparum que se
fijaron con metanol durante 1 minuto a -20ºC. Las muestras fueron luego bloqueadas
con TBS conteniendo 3% de BSA durante 30 minutos e incubadas con el anticuerpo de
conejo anti–GCS humana en una dilución 1:50. Posteriormente, la muestra se incubó
con el segundo anticuerpo, anti–conejo conjugado con rodamina en una dilución 1:200.
Para la marcación de las diferentes estructuras intracelulares se utilizaron
marcadores comerciales: Tracker Blue White (THG, Molecular Probes) como marcador
de la estructura del tipo Golgi y retículo endoplásmico ya que reconoce a la ATPasa del
parásito e ioduro de propidio (DAPI, 4',6-diamidino-2-fenilindol) como marcador del
núcleo debido a su capacidad de unión con el ADN.
Las células fueron iluminadas con un láser de argón de 488 nm para la
excitación de la rodamina y un láser de helio-neón de 543 nm para la excitación de los
marcadores utilizados. La emisión de fluorescencia fue colectada con filtros de 560 nm
para rodamina y 505 – 530 nm para THG y DAPI.
Las imágenes fueron realizadas con un objetivo 40x con un microscopio
confocal de fluorescencia LSM 510 Laser Scanning Microscope (Carl Zeiss, Germany)
equipado con el software LSM 510 versión 2.5.
Microscopia electrónica
La localización intracelular de la enzima GCS en Trypanosoma cruzi, formas
epimastigote, se determinó por inmunomicroscopía electrónica. En este caso, se
cosecharon los parásitos por centrifugación y se lavaron con buffer fosfato salino. Los
parásitos fueron fijados por inmersion en paraformaldehido 4%, glutaraldehido 0,25%
en buffer fosfato 0.1M, pH 7,5, durante 24hs.
Los bloques fueron lavados con sacarosa al 10% en el mismo buffer y
deshidratados por inmersión en soluciones de alcohol etílico 50 % y 70%
sucesivamente. Se realizaron 3 cambios de 20 minutos cada uno a 4º C y luego se
sumergieron en resina pura LR White resin monomer (48hs a 50ºC).
Materiales y Métodos
171
Posteriormente se realizaron cortes para obtener secciones ultrafinas que fueron
levantadas en grillas de niquel de 300 mesh e incubadas en una solución bloqueante de
suero normal de cabra 3% en buffer Tris-HCl salino 0,05M, pH 7,8, conteniendo 1%
seroalbúmina bovina y 0,05% Tween 20 durante una hora. Luego se incubaron en
paralelo diferentes secciones con los anticuerpo anti-GCS humana 1.2 y 5.1 en una
dilución 1: 500 en el buffer bloqueante durante 24 hs a 4ºC. Las secciones fueron
lavadas con el mismo buffer realizando 6 cambios de 2 minutos cada uno y
posteriormente incubadas con el anticuerpo secundario, anti-conejo acoplado a
partículas de oro de 10 nm o 5 nm, en una dilución 1:50 durante 1 hora a temperatura
ambiente. Finalmente, las secciones fueron lavadas y contrastadas en acetato de uranilo
al 0,5% y solución de Reynolds.
Las imágenes fueron obtenidas utilizando un microscopio electrónico Siemens
Zeiss C10 (Siemens, Germany) y las fotografías fueron tomadas utilizando una película
Kodak electron imaging film (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).
Fraccionamiento subcelular de Trypanosoma cruzi
Los parásitos se cosecharon y se lavaron con TBS y se resuspendieron en
solución de sacarosa 0,25M, KCl 1mM y EDTA 1mM. La suspensión se homogeneizó
en un mortero con carburo de silicio y luego se centrifugó a 500 rpm a 4ºC durante 10
minutos para eliminar las células enteras y el carburo de silicio. Las fracciones
subcelulares se obtuvieron luego por centrifugación diferencial: fracción nuclear
(sedimentada a 1000 g durante 10 minutos), gránulos grandes (5000 g, 10 minutos),
gránulos pequeños (14500 g, 10 minutos), fracción microsomal (100000 g, 60 minutos)
y fracción soluble (sobrenadante final) (Duschak and Cazzulo, 1991).
Materiales y Métodos
172
Purificación de inmunoglobulinas G presentes en un suero de conejo anti-GCS-
humana
Las inmunoglobulinas G (IgG) anti-GCS humana 1.2 fueron purificadas a partir
de un suero anti-GCS humana desarrollado en conejo. Para ello se realizó primero una
precipitación con sulfato de amonio al 33% a temperatura ambiente y luego se
centrifugó por 15 minutos a 15000 rpm a 25ºC. El precipitado obtenido se redisolvió en
buffer fosfato 0,1M, pH 8 y se dializó contra buffer fosfato 0,1M, pH 8 durante toda la
noche a 4ºC.
Posteriormente las IgGs fueron purificadas a través de una columna de Proteína
A-Sepharosa 4B Fast Flow (Sigma) previamente estabilizada en el mismo buffer
fosfato. La muestra se sembró a 20 ml/hora, se lavó con buffer fosfato 0,1M, pH 8 y
luego se eluyeron las IgGs con buffer citrato 0,1M pH 3,5. Se recolectaron fracciones de
1 ml sobre 0,4 ml de buffer Tris-HCl 0,5M, pH 8,5. Se leyó la absorbancia a 280 nm y
se juntaron las fracciones de absorbancia mayor de 0,2 (Lindmark, 1983).
Acoplamiento de las inmunoglobulinas G purificadas a Sepharosa 4B activada
con bromocianógeno
Las IgGs previamente purificadas se disolvieron en NaHCO3 0,1M, pH 8,3 con
0,5M de NaCl (Buffer de acople) y se mezclaron con la Sepharosa 4B previamente
lavada con HCl 0,1M y estabilizada en el mismo buffer de acople. Se utilizaron
aproximadamente 5-10 mg de ligando por ml de matriz y se agitó cabeza-cola durante
60 minutos a temperatura ambiente.
Una vez realizado el acople se recuperó el sobrenadante y se lavó la matriz
acoplada con buffer Tris-HCl 0,1M pH 8 y tres ciclos consecutivos de pH alternado
(Buffer acetato 0,1M pH 4 con 0,5M NaCl y Buffer Tris-HCl 0,1M con 0,5M NaCl)
(Richard et al, 2004).
Materiales y Métodos
173
Inmunopurificación de la GCS de Plasmodium falciparum
Las formas esquizonte purificadas por gradiente de Percoll, como se describió
anteriormente, se resuspendieron en buffer estabilizante con inhibidores de proteasas
(Buffer Hepes 50mM pH 7,4 conteniendo 100mM KCl, 20% glicerol, 10 g/ml
Aprotinina, 10g/ml Leupeptina, 10 g/ml TAME, 1g/ml Antipaína, 1g/ml
Pepstatina y 25 M APMSF). Los parásitos se lisaron por 3 ciclos de sonicación en
baño de hielo por 2 minutos y luego se centrifugó la muestra 2 minutos a 7000 g para
eliminar los restos de células enteras. El sobrenadante obtenido se aplicó en una
columna conteniendo 1ml de Sepharosa acoplada con las IgGs anti-GCS humana
previamente equilibrada con buffer Hepes 50mM pH 7,4 con 0,5M NaCl. La muestra se
dejó interactuar con la fase de la columna durante toda la noche a 4ºC. Luego se lavó la
columna con el mismo buffer. Como buffer de elución se utilizó buffer Hepes 50mM
pH 7,4 conteniendo 2M de MgCl2. Se recolectaron fracciones de 2 ml que fueron luego
dializadas contra buffer Hepes 5 mM pH 7,4 y posteriormente concentradas por
liofilización (Marks et al., 1999).
Purificación de la GCS de Plasmodium falciparum por afinidad a colorantes
Las formas esquizonte purificadas por gradiente de Percoll, como se describió
anteriormente, se resuspendieron en buffer estabilizante con inhibidores de proteasas
(Buffer Hepes 50mM pH 7,4 conteniendo 100 mM KCl, 20% glicerol, 10 g/ml
Aprotinina, 10 g/ml Leupeptina, 10 g/ml TAME, 1g/ml Antipaína, 1g/ml
Pepstatina y 25 M APMSF). Los parásitos se lisaron por 3 ciclos de sonicación en
baño de hielo por 2 minutos y luego se centrifugó la muestra 2 minutos a 7000 g para
eliminar los restos de células enteras. La muestra se aplicó con un flujo de 20 ml/hora
en una columna de Green Dye-Agarosa (Sigma) de 2 ml equilibrada con buffer Hepes
50mM pH 7,4. El procedimiento se repitió 3 veces con el material que no interaccionó
con la fase y luego se lavó con 5 volúmenes de buffer Hepes 50mM pH 7,4.
Posteriormente se realizó una elución secuencial con buffer Hepes 50mM pH 7,4
conteniendo 0,15M KCl (10 volúmenes), buffer Hepes 50mM pH 7,4 conteniendo
Materiales y Métodos
174
20mM UDP-Glucosa y 20mM -NAD (5 volúmenes) y buffer Hepes 50mM pH 7,4
conteniendo 1M KCl (5 volúmenes). Las distintas fracciones se dializaron contra buffer
Hepes 5 mM pH 7,4 y se concentraron por liofilización (Paul et al., 1996).
Materiales y Métodos
175
Purificación de la GCS de Trypanosoma cruzi
Obtención de una fracción enriquecida en membranas
La ruptura de los parásitos se realizó por 3 ciclos de congelado a -20ºC –
descongelado a temperatura ambiente, siendo el último paso de congelado de más de 12
horas luego del cual los parásito se descongelaron y resuspendieron en una solución de
Sacarosa 0,25M, KCl 5 mM en una concentración aproximada de 10 g de parásitos por
cada 25 ml de solución. El homogenato resultante se centrifugó a 7000 rpm durante 10
min a 4ºC. El sobrenadante se separó y el precipitado se solubilizó con otro volumen de
la solución de sacarosa y se volvió a centrifugar a 12000 rpm durante 10 min a 4ºC. El
precipitado obtenido constituye la fracción enriquecida en membrana (Cazzulo et al.,
1985).
Precipitación con sulfato de amonio
La fracción enriquecida en membrana se resuspendió en buffer Tris-HCl 50 mM,
pH 7,4, conteniendo 100 mM KCl, 10 g/ml Aprotinina, 10 g/ml Leupeptina, 10
g/ml TAME, 1 g/ml Antipaína, 1 g/ml Pepstatina y 25 M APMSF, se sonicó
durante dos 2 min en baño de hielo y se centrifugó a 10000 rpm durante 15 min a 4ºC.
Se separó el sobrenadante y se repitió el procedimiento dos veces más juntando los tres
sobrenadantes obtenidos. Esta fracción se precipitó con una solución saturada de sulfato
de amonio pH 7 que se agregó gota a gota, con agitación en baño de hielo hasta alcanzar
un 50% de saturación. La suspensión se centrifugó a 15000 rpm, 15 min a 4ºC y el
precipitado obtenido se disolvió en buffer Tris-HCl 50mM pH 7,4 y se dializó contra el
mismo buffer, realizando varios cambios durante toda la noche. (Cazzulo et al., 1989)
Ultracentrifugación
El extracto obtenido se llevó a una concentración final de proteínas de
aproximadamente 1g/l por agregado de buffer Tris-HCl 50mM pH 7,4 conteniendo
Materiales y Métodos
176
20% glicerol, 0,02% azida sódica, 1% Chaps, y 1mM DTT (Buffer B) con el agregado
de 1mM UDP-Glucosa, para solubilizar las enzimas de membranas. Luego de agitar
durante una hora a 4ºC se realizó una ultracentrifugación a 100000g a la misma
temperatura durante 60 minutos utilizando una Ultracentrifuga Beckman XL-90, con un
rotor SWSS Ti, reservándose el sobrenadante obtenido para continuar con la
purificación (Paul et al., 1996).
Cromatografía de afinidad a colorantes
Se realizaron dos cromatografías secuenciales de afinidad a colorantes. En un
primer paso la muestra se aplicó en una columna de Green Dye-Agarosa (Sigma) de
1x15 cm previamente equilibrada con Buffer B suplementado con 1mM UDP-Glucosa.
Se recolectó la fracción de la muestra que no interaccionó con el colorante.
Para poder continuar con la purificación fue necesario separar la UDP-Glucosa
de la muestra por cromatografía de exclusión de tamaño en un BioGel P2 (BioRad)
equilibrado en el buffer B. La separación se realizó utilizando una columna de 1x4 cm
empacada por centrifugación a 500 rpm durante 2 minutos. La muestra fue aplicada y se
recuperaron las fracciones realizando centrifugaciones de 1 minuto a 300 rpm. Las
fracciones correspondientes al V0 se juntaron y se dializaron contra el mismo buffer
diluido 5 veces y luego se concentraron por liofilización.
Para la segunda columna de afinidad se utilizó una columna de 1,4 x 4 cm
conteniendo 5 ml de Green Dye-Agarosa equilibrada en buffer B. Luego de aplicar la
muestra, la columna se lavó con 5 volúmenes de buffer B y posteriormente se eluyó
secuencialmente con 10 volúmenes de buffer B conteniendo 0,15M KCl, 7 volúmenes
de buffer B conteniendo 20mM UDP-Glucosa y 20mM -NAD y finalmente con 7
volúmenes de buffer B conteniendo 1M KCl (Paul et al., 1996).
Las diferentes fracciones obtenidas se lavaron y concentraron por ultrafiltración
utilizando filtros de tamaño de corte de 50kDa (Centriprep, Millipore).
Materiales y Métodos
177
Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Las muestras se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida
discontinuos de 7,5; 10 o 12 % (de acuerdo al rango de resolución deseado) en
condiciones desnaturalizantes (Laemli et al., 1969).
Las muestras se disolvieron en buffer de siembra, se hirvieron a 100 °C durante
3 min y se sembraron. Los geles se corrieron a un voltaje constante de 110 volts. La
estimación de los pesos moleculares se realizó haciendo referencia a los patrones de
peso molecular comerciales (Bio-Rad) corridos en paralelo.
Revelado con Nitrato de Plata
Luego de la separación, los geles se fijaron con una solución de metanol: ácido
acético: agua (25:5:20, v/v/v) durante 10 min, se pasó a una solución de metanol: ácido
acético: agua (3,5:2,5:44) durante 10 min y se lavó luego con abundante agua
deionizada durante 10 min. A continuación se incubó con una solución de
Glutaraldehído 10% durante 15 min. Se descartó la solución y se lavó con abundante
agua deionizada durante 40 min, haciendo varios cambios. Se agregó el reactivo de
plata, recién preparado, se incubó 10 min, se descartó y nuevamente se lavó con agua
deionizada durante 5 min. Se incubó con la solución reveladora hasta la aparición de
manchas de la intensidad deseada y el revelado se detuvo por agregado de una solución
de ácido acético 10%.
- Reactivo de Plata: 1 ml de NH3 se mezcló con 1 ml de NaOH 1M, se llevó a 10 ml con
agua deionizada y se tituló, gota a gota y con agitación magnética, con 2 ml de solución
acuosa de nitrato de plata 20 % recién preparada. Se llevó a 50 ml finales con agua
deionizada.
- Revelador: 25 μl de formaldehído 37 % se mezclaron con 50 μl de ácido cítrico (50
mg/ml) y se llevaron a 50 ml con agua deionizada.
Materiales y Métodos
178
Ensayos de transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa y reacción
con antisueros (Western Blot)
Las proteínas separadas por SDS-PAGE fueron electrotransferidas a membranas
de nitrocelulosa (Amersham Biosciences) durante 45 min a 300 mA en buffer Tris-
Glicina, metanol 20 %.
Para el revelado, las membranas se bloquearon durante 30 min con TBS-leche
descremada 3 % y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente con los
anticuerpos específicos, anti-GCS humana, en una dilución 1:500. Luego se lavaron con
TBS, 2 veces por 10 minutos y una vez con TBS con 0,05% NP-40. Posteriormente las
membranas fueron incubadas con anticuerpos anti-conejo acoplados a peroxidasa en una
dilución de 1:50000 por 60 minutos a temperatura ambiente. El revelado se realizó
utilizando el reactivo ECL (Amersham Biosciences) en un analizador de imágenes
FujiFilm Las1000.
Materiales y Métodos
179
Cuantificación de proteínas
Método de Bradford
Se utilizó la técnica en microescala, para la cuantificación de proteínas en
solución. Las muestras se llevaron a 500 μl con agua, se agregaron 500 μl del reactivo
comercial Bradford (BioRad), se agitó y determinó la absorbancia a 595 nm. Para la
curva de calibración se utilizaron diluciones de una solución madre de BSA 1 mg/ml
(Bradford, 1976).
Método de Lowry
Cada muestra se llevó a 200 μl con agua, se le agregó 1ml de la solución de
trabajo, se agitó y dejó reposar durante 10 min a temperatura ambiente. Luego se
agregaron 100 μl del reactivo de Folin 1N (Sigma), se agitó e incubó en oscuridad
durante 40 min. La absorbancia se determinó a 750 nm. La curva de calibración fue
realizada utilizando diluciones de una solución patrón de BSA 1mg/ml (Lowry et al.,
1951).
-Solución de trabajo: esta solución se realiza en el momento de usar mezclando 20 ml
de solución A (Carbonato de sodio 2 % en NaOH 0,1 N) con 0,4 ml de solución B
(sulfato de cobre 0,5 % en tartrato de sodio y potasio 1 %).
Materiales y Métodos
180
Degradación con ácido nítrico.
La heparina porcina comercial (Synthex SA) se disolvió en una solución de
nitrito de sodio 50 mM para obtener una concentración final de 100 mg/ml. La solución
fue acidificada hasta pH 1,5 por agregado de HCl 6N y se mantuvo a dicho pH durante
exactamente 5 minutos a temperatura ambiente. Los oligosacáridos obtenidos fueron
reducidos en condiciones alcalinas con borohidruro de sodio.
Cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detector de pulso
amperométrico (HPAEC-PAD, sistema DIONEX) (Hardy y Townsend, 1994)
El análisis de los oligosacáridos se realizó en un sistema Dionex ICS-3000
equipado con un detector electroquímico ED50 utilizado en el modo de pulso
amperométrico para la detección de azúcares (PAD) usando un electrodo de referencia
de AgCl y un electrodo de trabajo de Au. Los parámetros del detector se fijaron en:
+0.05 V (desde t = 0 a t = 0.40 s, la detección comenzó a t = 0.20 s, y finalizó a t = 0.40
s), + 0.75 V (potencial de oxidación para limpiar el electrodo, desde t = 0.41 a t = 0.60
s), y -0.15 V (desde t = 0.61 a t = 1.00 s).
El análisis de los oligosacáridos se realizó utilizando una columna
semipreparativa Prozac PA1 (9 x 250 mm) con un flujo de 4,7 ml/min. El volumen de
inyección para cada análisis fue de 100 l. El gradiente de elución utilizado fue: 0 a 7
minutos: NaOH 80 mM, 7 a 15 minutos: gradiente desde 80 a 100 mM de NaOH, 15 a
60 minutos: 100 mM NaOH más un gradiente de 0 a 500 mM de Acetato de sodio.
Síntesis de 1-aminomaltosa
La reacción se llevó a cabo en un balón cerrado conteniendo 1 equivalente de
maltosa y 4 equivalentes de carbamato de amonio disueltos en 500 l de metanol. La
solución se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. La reacción fue monitoreada
por CCD utilizando como solvente acetato de etilo: metanol, 1: 1, v/v. Las placas fueron
reveladas utilizando H2SO4 10% en etanol y ninhidrina 2% en acetona, Rf (maltosa) =
Materiales y Métodos
181
0,7 y Rf (1-aminomaltosa) = 0,3. El producto obtenido fue utilizado para la reacción de
acople a proteínas sin posteriores purificaciones.
Reacción de acople de hidratos de carbono a proteínas
La reacción se realizó en un solo paso. Se partió de una solución de
concentración 4mg/ml de proteína preparada en buffer fosfato pH 7,4, 0,2 M a la cuál se
le incorporó el azúcar de interés disuelto en una mezcla metanol: agua, 1: 1, v/v, y
finalmente se agregó el glutaradehído. La solución resultante se llevó a volumen para
obtener una concentración final de la proteína en solución de 2mg/ml y una
concentración salina final de 0,1 M. La mezcla se agitó magnéticamente por diferentes
períodos de tiempo y posteriormente se dializó contra agua durante 24 horas con
sucesivos cambios y finalmente se concentró por liofilización.
Matriales y Métodos
182
Espectrometría de masa UV-MALDI
Equipo utilizado
Los análisis fueron realizados utilizando un espectrómetro de masa Ultraflex II
TOF/TOF equipado con un láser de estado sólido de alto rendimiento ( = 355 nm) y un
reflector. El sistema fue operado a través del software Flexcontrol 3.0 (Bruker Daltonics
GmbsH, Bremen, Germany).
Para el análisis de los glicoesfingolípidos ácidos de Plasmodium falciparum se
utilizó un espectrometro de masa Kompact MALDI 4 TOF (Shimadzu, Kyoto, Japón)
equipado con un láser pulsado de nitrógeno ( = 337 nm).
Las muestras fueron irradiadas con una potencia de láser de entre 50 y 60% y los
espectros fueron adquiridos tanto en modo lineal como en modo reflectron en los modos
positivo y negativo. Los espectros obtenidos fueron la suma de 100 a 500 disparos
simples del láser, dependiendo de las condiciones de las muestras.
Calibración
En todos los experimentos se utilizaron calibrantes externos, presentes en el
mismo electrodo donde se depositó la muestra a analizar. En este caso, se usaron las
proteínas comerciales bradikinina 1-7, PM 757.399; angiotensina I, PM 1296.685; e
insulina, cadena , PM 3494.6506 con CHCA como matriz en los modos positivo y
negativo.
Cuando fue necesario, se realizaron espectros de las diferentes matrices
utilizadas para poder conocer las señales propias de las mismas.
Matrices utilizadas
Como matrices se usaron ácido -ciano-4-hidroxicinámico (CHCA), ácido 2,5-
dihidroxibenzoico (DHB, o ácido gentísico, GA), nor-harmano (nHo), 2, 4, 6-
trihidroxiacetofenona (THAP) y ácido sinapínico en diferentes concentraciones.
Matriales y Métodos
183
Para el análisis de los esfingolípidos fluorescentes se prepararon las siguientes
soluciones: 77 mg/mL DHB, 0.1% TFA (ácido trifluoroacético) en acetato de etilo; 20
mg/mL DHB en etanol 50%; 10 mg/mL DHB en etanol: agua 1:9, v/v; 2 mg/mL nHo en
metanol: agua 1:1, v/v; solución saturada de CHCA en acetonitrilo: 0,1% TFA, 2:1, v/v;
y solución saturada de THAP en acetonitrilo: 0,1% TFA, 2:1, v/v.
El análisis de los esfingolípidos ácidos se llevó a cabo utilizando soluciones de
DHB y nHo preparadas disolviendo 1 mg de matriz en 0,5 ml de agua: metanol, 1: 1,
v/v.
Para el análisis de los oligosacáridos provenientes de la degradación de la
heparina comercial se utilizaron las siguientes soluciones de matrices: 1 mg de DHB,
nHo, o CHCA in 100 l de acetonitrilo: agua, 3: 2, v/v.
Para el análisis de las muestras de proteínas conjugadas con los diferentes
hidratos de carbono se utilizó una solución de ácido sinapínico 200 mM en acetonitrilo:
TFA 0,1%, 33: 66, v/v.
Preparación de la muestra
Para el análisis de los esfingolípidos fluorescentes se prepararon soluciones
frescas de las diferentes muestras en una concentración aproximada de 10g/ml en
metanol o en metanol: agua, 1:1, v/v.
Las muestras fueron sembradas en un portamuestras de acero inoxidable sin
pulir (MTP 384 ground steel; Bruker Daltonics GmbsH) utilizando el método mezcla.
Se mezclaron volúmenes iguales de solución de matriz y analito y luego se colocó una
alícuota de 1 l en la superficie del electrodo portamuestas. La mezcla se dejó secar a
temperatura ambiente en desecador.
En algunos casos, para el análisis de los NBD-esfingolípidos, las muestras
fueron sembradas en el electrodo portamuestras sin el agregado de una matriz externa.
Para ello se sembró una alícuota de la soluciones patrones de los analitos preparadas en
metanol, se dejó secar la muestra a temperatura ambiente al aire y se repitió el
procedimiento.
Matriales y Métodos
184
Por otro lado, los esfingolípidos ácidos fueron disueltos en una mezcla de
cloroformo: metanol, 1: 1, v/v, en una concentración de aproximadamente 0,05
mg/0,025 l. En este caso las muestras fueron aplicadas en el portamuestras según el
método sándwich. Se aplicó, en primer lugar, 0,5 l de la solución de matriz y se dejó
secar a temperatura ambiente al resguardo de la luz. Luego se aplicó sobre la matriz una
alícuota de 0,5 l de la solución de análito, se dejó evaporar el solvente y se aplicaron
posteriormente dos capas más de solución de matriz, dejando evaporar el solvente entre
las mismas, siempre a temperatura ambiente y en oscuridad.
Para las determinaciones realizadas sobre los oligosacáridos de la heparina, las
muestras fueron sembradas en el portamuestras mediante el método mezcla con una
pequeña variación. Una vez sembrada la mezcla análito/matriz, se dejaron secar las
muestras y se agregó una alícuota más de solución de matriz, haciendo que la muestra
ya sembrada se redisuelva parcialmente y se dejó secar nuevamente.
Las muestras de proteínas comerciales modificadas con hidratos de carbono se
sembraron mediante el método mezcla. Se mezclaron volúmenes iguales de la solución
de analito preparada en agua y de la solución de matriz correspondiente y se aplicó 1 l
de la mezcla generada sobre el electrodo portamuestras. La muestra se dejó secar a
temperatura ambiente en un desecador al reparo de la luz.
Conclusiones
Conclusiones
185
CONCLUSIONES:
Resultados prévios de nuestro laboratorio indicaban que Plasmodium falciparum
biosintetiza glicoesfingolípidos y que presenta, en los estadíos intraeritrocíticos, una
glucosilceramida sintasa activa con una especificidad de sustrato diferente a la enzima
de mamíferos. En el presente trabajo se realizaron incorporaciones metabólicas de
NBD-ceramida, NBD-dihidroceramida y NBD-esfingomielina. En base a los resultados
obtenidos se determinó que Plasmodium falciparum presenta dos rutas metabólicas: la
biosíntesis de novo a partir de ácido palmítico y serina que formarán diferentes
intermediarios hasta llegar a dihidroceramida, la cual es directamente glicosilada para
dar glucosildihidroceramida y glicoesfingolípidos más complejos. Por otra parte, el
parásito hidroliza la esfingomielina del eritrocito a fin de obtener ceramida que luego
utilizará para biosintetizar su propia esfingomielina. El tratamiento de los parásitos con
tamoxifeno permitió establecer la independencia de estas dos vías metabólicas.
Paralelamente se estudiaron los glicoesfingolípidos ácidos. Se determinó por
primera vez la presencia de sulfoglicoesfingolípidos en los tres estadíos
intraeritrocíticos y se realizó la caracterización estructural por EM UV-MALDI-TOF.
Teniendo en cuenta que los sulfoglicolipidos están involucrados en procesos de
adhesión, los resultados obtenidos permitirán estudiar su participación en los fenómenos
de agregación descriptos en malaria severa.
A partir de los resultados obtenidos en el estudio biosintético, la
glucosilceramida sintasa con su particular especificidad de sustrato, surge como un
posible blanco para el desarrollo de nuevas drogas antimaláricas. Por lo tanto se
procedió a la extracción, purificación y caracterización de la enzima. En este trabajo se
desarrollaron dos protocolos de purificación de la GCS: utilizando cromatografia de
afinidad a colorantes y por immunoafinidad. Se realizó la localización subcelular y la
caracterización de la actividad enzimática.
Teniendo en cuenta las características particulares de la GCS de Plasmodium
falciparum se decidió estudiar la presencia de la enzima en otros parásitos. Así fue
posible determinar por primera vez la presencia de una GCS activa en Trypanosoma
cruzi, Leishmania amazoniesis y Toxoplasma gondii. Fue interesante determinar que a
diferencia de la enzima de Plasmodium falciparum, los tres parásitos analizados
presentaron actividad con los dos sustratos, ceramida y dihidroceramida, siendo mayor
Conclusiones
186
la actividad con el sustrato insaturado en forma similar a lo que ocurre con la enzima de
mamíferos.
Resultó interesante entonces caracterizar una GCS con una actividad de sustrato
diferente a la de P. falciparum, y para ello se eligió Trypanosoma cruzi dada la
experiencia del laboratorio con el estudio de dicho parásito. Durante este trabajo se
extrajo, purificó y caracterizó la GCS de formas epimastigote de Trypanosoma cruzi. Se
realizaron estudios de localización subcelular de la enzima y se caracterizaron por EM
UV-MALDI-TOF otros productos obtenidos en el ensayo de la actividad in vitro.
Debe aclararse que a pesar de los esfuerzos realizados hasta el momento, no fue
posible llegar a la determinación de la secuencia peptídica de la GCS purificada de
ninguno de los dos parásitos. Es conocido que la GCS presenta una muy baja homología
de secuencia en los diferentes sistemas. Este hecho impide la identificación de la
proteína por huella peptídica y debe realizarse la secuenciación de novo, para lo cual es
necesario contar con una mayor cantidad de la proteína purificada. El estudio
proteómico de la enzima no constituyó un objetivo de esta tesis.
Por otra parte, el presente trabajo ha contribuido con el desarrollo de dos
metodologías de análisis por espectrometría de masa que trascienden el campo de la
química de parásitos:
1- Se ha utilizado un grupo fluorescente unido covalentemente a una
esfingosina, no solo como un marcador selectivo sino también como fotosensibilizador
(matriz) para el análisis por espectrometría de masa UV-MALDI. El hecho de no
agregar matriz externa indica que el proceso que tiene lugar es una desorción/ionización
por láser (UV-LDI). Fue interesante determinar que aunque el proceso LDI es un
método de ionización fuerte, se obtienen espectros muy limpios. Esta aplicación resulta
particularmente útil ya que permite la localización y caracterización de metabolitos en
un único experimento, disminuyendo los tiempos de análisis y aumentando la
sensibilidad y versatilidad con un mínimo de preparación de muestra. Además fue
determinado que la NBD-ceramida puede ser utilizada como matriz externa para el
análisis de otros lípidos no marcados. Fue posible demostrar que muestras biológicas
pueden ser primero analizadas por técnicas no destructivas basadas en fluorescencia y
luego las mismas muestras sin pasos adicionales y sin necesidad de búsqueda de una
matriz adecuada, analizados por UV-LDI. Sin embargo, fue determinado que la
Conclusiones
187
eficiencia de ionización disminuye con el aumento de la polaridad de la muestra aunque
no resultó dependiente del tipo de azúcar.
2- Siendo conocido que los hidratos de carbono pueden ser responsables de la
antigenicidad de un glicoconjugado, se llevó a cabo la síntesis de diferentes conjugados
carbohidrato-proteína y su caracterización por EM como herramienta para su
utilización en ensayos biológicos.
En un primer acercamiento se buscaron las condiciones óptimas de relación
molar carbohidrato: proteína, tiempo de reacción y tamaño de proteína para que el
conjugado obtenido presente una relación carbohidrato: proteína similar a la presente en
una glicoproteína natural. De esta forma fueron sintetizados conjugados de
seroalbúmina bovina unida a maltosa, glucosamina, -1-metil-6-glucosamina y ácido
galacturónico conteniendo 10, 17, 14 y 35 unidades de azúcar por mol de proteína
respectivamente. Por otra parte se sintetizaron conjugados de los mismos azúcares a
Citocromo C y Ubiquitina, ambas proteínas de bajo PM (12230 y 8564
respectivamente). Todos estos conjugados serán utilizados en ensayos de dot-blot y
Elisa con anticuerpos de interés.
Paralelamente se planteó la obtención de oligosacáridos sulfatados a partir de
heparina comercial para ser acoplados a proteínas. Con ese objetivo se optimizó una
degradación de heparina con ácido nitroso seguido de una separación por HPAEC como
método rápido de obtención de los oligosacáridos sulfatados. Debido a su simplicidad y
bajo costo la reacción provee una buena alternativa a las degradaciones enzimáticas que
han sido ampliamente utilizadas, produciendo oligosacáridos sulfatados modificados
con una unidad de anhidromanitol. El análisis por EM UV-MALDI-TOF en modo
negativo utilizando dos matrices diferentes permitió la determinación estructural
prácticamente completa de seis oligosacáridos. La separación por HPAEC fue útil no
sólo para la obtención de oligosacáridos puros sino también para estabilizar los
sustituyentes acídicos como sales de sodio permitiendo la detección de las especies
ionizadas de las moléculas intactas sin la pérdida de los grupos sulfato. Fue utilizado el
agregado de formiato de butilamonio que permitió en algunos casos una mejor
desorción de la muestra probablemente modificando la co-cristalización de los
oligosacáridos sulfatados con la matriz. El uso complementario de los datos obtenidos
con las diferentes matrices hizo innecesario el análisis por MS/MS. Sólo en algún caso
la posición de un grupo sulfato entre la posición O-3 y el oxígeno adyacente quedó sin
determinar requiriéndose experimentos adicionales para llegar a la completa asignación
Conclusiones
188
estructural. Fue interesante determinar que cuando se utilizó DHB como matriz, se
detectó en casi todos los casos el ión molecular. Esta información fue útil para
determinar el número total de sulfatos presente en cada oligosacárido. Adicionalmente
algunos iones correspondientes a pérdidas de sulfato fueron detectados. En contraste,
cuando se utilizó nor-harmano como matriz, se detectaron fragmentos que retenían los
grupos sulfato. Estos iones fueron esenciales para la asignación de la posición de los
grupo sulfato en cada residuo.
A pesar de que todavía debe ser más estudiado este campo para llegar a un
análisis glicómico rutinario de este tipo de compuestos, este trabajo presenta una forma
simple de obtención de oligosacáridos estructuralmente definidos y un análisis rápido.
Esta metodología podría ser de interés para el estudio de glicoproteínas de otras fuentes.
Trabajos publicados
189
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UV-MALDI Mass Spectrometry Analysis of NBD-Glycosphingolipids without an
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