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Herramientas y Flujos de La Metabolómica: unaHerramientas y Flujos de Trabajo en Metabolómica y Análisis Comparativos
La Metabolómica: una-Ómica Clave en la
Investigación Biomédicay Análisis Comparativos por Espectrometría de Masas
Auditorio PRBB (Parc Recerca Biomèdica Barcelona
Organizan: Prof. Jordi Segura y Dr. Ricardo Gutiérrez Gallego - IMIM - Hospital del Mar. de Masas. Colaboran:
• Plataforma Metabolòmica CIBERDEM - IISPV – URV – Tarragona.• Grupos Uniiversitat Barcelona (UB):• Biomarcadors i Metabolòmica Nutricional i dels Aliments.• Bioquímica i Biologia Molecular.• Agilent Technologies.
Martes, 13 Diciembre 2011
Isidre MasanaEspecialista Producto LC-CE/MS
Agilent TechnologiesAgilent TechnologiesDivisión de Biociencia y Análisis Químico
Herramientas y Flujos de Trabajo en
Programa:de Trabajo en Metabolómica y Análisis Comparativos
1.- Introducción.- Importancia Metaboloma & Biomarcadores.
2 Flujos de Trabajo en Estudiosp
por Espectrometría de Masas.
2.- Flujos de Trabajo en Estudios Metabolómicos.
3.- Herramientas para Análisis pComparativos de Muestras.
- Cromatografía/ Espectrometría de Masas.
4 C l i4.- Conclusiones.
Página 2
INFORMACION• Ejemplos Resultados:
1 Optimización Proceso de ExtracciónINFORMACIONSUPLEMENTARIANo impartida en Seminario PRBB.
1.- Optimización Proceso de Extracción de Metabolitos de Glóbulos Rojos.2.-Estudio Metabolómico Infección
Ver final de este documento pg>36 Bacteriana en Arroz: Influencia líneas de Arroz y cepas Bacteriales.3.-Clasificación de Muestras. Autentificación de Vinos4.-Ejemplos Conclusiones de Varios Estudios MetabolómicosEstudios Metabolómicos5.- Ejemplo Control Calidad Anticuerpos Monoclonales:
I f ió V i• Información Varia:1.- Proceso Deconvolución 3D: MFE+AMDIS
2.- Descubrimiento de Biomarcadores en2. Descubrimiento de Biomarcadores en Proteómica.3.-Aspectos Clave en Estudios MetabolómicosMetabolómicos.
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Herramientas y Flujos de Trabajo en
Programa:de Trabajo en Metabolómica y Análisis Comparativos
1.- Introducción.- Importancia Metaboloma & Biomarcadores.
2 Flujos de Trabajo en Estudiosp
por Espectrometría de Masas.
2.- Flujos de Trabajo en Estudios Metabolómicos.
3.- Herramientas para Análisis pComparativos de Muestras.
- Cromatografía/ Espectrometría de Masas.
4 C l i4.- Conclusiones.
Página 4
La Importancia del Metaboloma
RNA GENÓMICA
Metabolómica: es el estudio i t áti d l ñ
DNA
RNA GENÓMICA
sistemático de las pequeñas moléculas orgánicas (metabolitos) presentes en un sistema biológico
CH OH
TRANSCRIPTÓMICA
p gCH2OH
Proteinas
PROTEÓMICA
METABOLÓMICA
Metabolitos
Metaboloma ~ Expresión final de las “-omicas”
Página 5
La Importancia del Metaboloma
Genoma
Metaboloma
Proteoma
El t di d biEl estudio de cambios en rutas metabólicas generados por agentes internos/externos
• Conocer mejor la biología• Conocer mejor la biología del organismo
• Prevenir futuras enfermedades.
P f t i d d /d d• Preveer efectos indeseados /deseados en fármacos
• Mejorar la salud.
•…..
Página 6
Objetivos de la Investigación Biomédica ActualActual
- Identificación de nuevos BIOMARCADORESpara diagnóstico precoz de enfermedades, clasificación pacientes
E l i M di i di ó ti ti- Evolucionar Medicina diagnóstico-curativa (basada en el tratamiento de la enfermedad)
Medicina que promueva la salud (evite la enfermedad)
- Requiere el desarrollo de una Medicina:
Predictiva, Preventiva, Personalizada, Participativa
R i d t ll d i i t d l bi ló i /- Requiere un detallado conocimiento de los procesos biológicos/ bioquímicos que tienen lugar en el organismo y como éstos están influenciados por:
- el desarrollo de una enfermedad
- la ingesta de un fármaco
- la alimentación/ dieta seguidasla alimentación/ dieta seguidas
- Se deberá estudiar el impacto de estos factores en el perfil del genoma, proteoma y metaboloma del organismo.
• ……
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Herramientas y Flujos de Trabajo en
Programa:de Trabajo en Metabolómica y Análisis Comparativos
1.- Introducción.- Importancia Metaboloma & Biomarcadores.
2 Flujos de Trabajo en Estudiosp
por Espectrometría de Masas.
2.- Flujos de Trabajo en Estudios Metabolómicos.
3.- Herramientas para Análisis pComparativos de Muestras.
- Cromatografía/ Espectrometría de Masas.
4 C l i4.- Conclusiones.
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2 Tipos de Estudios Metabolómicos: Genéricos y EspecíficosEspecíficos
LC/MS-QTOFGC/MS-QTOF
LC/MS-QqQGC/MS-QqQ
Comparación de Comparación de Perfiles Específicosp
Perfiles Genéricos del Metaboloma
(metabolitos conocidos
Perfiles Específicos(metabolitos concretos)
S t b j á MS(metabolitos conocidos + desconocidos)
Se trabajará con MS
Se trabajará con MS (QTOF/QqQ) en modo
MS/MS o en MS en modo selectivoj
(TOF/QTOF) en modo espectral con masa exacta
Tí i
modo selectivo
Típico para Validación de Biomarcadores
Típico para Descubrimiento de
Nuevos BiomarcadoresCambios en ciclos
concretos del metabolismo
Página 9
metabolismo
15-20m
Fase Comparación Perfiles: Selectividad Cuantitativade Cromatogramas de Iones con Masa Exacta.
Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina
IC: 277.1 m/z - Ventana Extración 1 DaClenbuterol S/N = 14
Exactitud Masa (ppm)
Nº posibles fórmulas empíricas
Tecnología
165 ppm 209 QUAD/TRAP10 13 Clenbuterol S/N = 1410ppm 135 ppm 72 ppm 2 TOF /Q-TOF
Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z
Rango extracción típico Cuadrupolo
LC/MS-TOF Agilent 6210
IC: 277.087 m/z - Ventana Extración 0.016 Da +/- 30ppm S/N = 102
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Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de Perfilado Genérico (“Un-Targeted Metabolomics”)
S ft D l ió MFE
GC/MSD PCA
Extraer automáticamente la información para cuantificar
relativamente MILES de t d id
Soft. Deconvolución: MFE
compuestos desconocidos
Página 11
Avanzado Algoritmo de Deconvolución “LC/MS Mass Hunter Molecular Feature Extractor” para obtener por la p pMasa Exacta de ”todos” los Compuestos Ionizados en la Muestra Espectros Deconvolucionados
Forma parte del soft. de TOF y Q-TOF
TICIC’s0
Página 12
Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de Perfilado Genérico (“Un-Targeted Metabolomics”)
Buscar Correlaciones entre Grupos de Complejos Datos Espectrales
Intensidad, Tr, Masa exacta
GC/MSDPCA
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Mass Profiler Profesional: Herramientas de Comparación Estadística de Conjuntos de Muestras
Análisis Estadístico
Admite Experimentos:
• Estudios simples (A vs. B)
• Estudios en función del tiempo, de condicionesEstudios en función del tiempo, de condiciones múltiples, de dosificaciones varias, ….
• Clasificación (/ Autentificación) de muestras
P i M P t t H i tProporciona Muy Potentes HerramientasEstadísticas y de Visualización Comparación:• Filtrado simple (test de frecuencia)
• Test de relevancia (t-test, ANOVA 1 o 2 vías)( )
• Análisis de Componentes Principales (PCA)
• Agrupación (“Clustering” K-means, SOM, QT clustering),
• Predicción de Clases (K-nearest neighbors / SVM)
• Árboles jerárquicos Complete, average and single linkage (w. bootstrapping)
• Gráficos Volcano, Diagramas de Venn, ……
• Incluye Herramientas de visualización de datos (cromatogramas, espectros,…)
• Permite exportar la lista de iones precursores para realizar MS/MS y confirmar la identificación de los metabolitos de interés con Q TOF’s de Agilentmetabolitos de interés con Q-TOF s de Agilent.
Página 14
Mass Profiler Professional: Interfase de Usuario
Un proyecto puede contener varios tipos de experimentos (p.e.combinar GC / MS y LC / MS)!!!y )
Navegador con flujo de trabajo para facilidad uso
Perfecto para inexpertos en bioestadística !!!en bioestadística !!!
Página 15
“Mass Profiler Profesional”: Ejemplo combinación de Análisis de PCA con ANOVA
Proporciona una mucha j dif i ió
LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta
ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables
mejor diferenciación de clases
7-INF 6-RES
2
3-INF7-INF
6-RES
2
3-INF5
5
3 Ensayos con Arroz salvaje 4 Ensayos con Arroz transgénico1 4
Permitiría evaluar si un tratamiento tiene un claro impacto en la composición de una muestra
12
3-INF
45
6-RES7-INF mod. genet.
“bacteria salvaje”
“control”
“sin tratar”
i f N t d A li ió M t b l i P fili f B t i l L f Bli ht i Ri 5989 6234EN+info: Nota de Aplicación Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice: 5989-6234EN
Página 16
Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de Perfilado Genérico (“Un-Targeted Metabolomics”)
Interpretación p
Resultados
GC/MSDPCA
Identificación metabolitos relevantes
Página 17
Fase Identificación de Metabolitos+24.000
metabolitos • LC/MS: búsqueda en Bases de datos de Metabolitosendógenos &
exógenos
LC/MS: búsqueda en Bases de datos de Metabolitos con Masa Exacta
• METLIN Personal DB:
• Instalada en PC
• 24.678 metabolitos (~8.000 lípidos)
Incluye ~670 RT’s
• Búsquedas en lotes o individuales
• Query basado en masa exacta monoisotópica.
• Editable: adicionar compuestos, tiemposde retención crear sub-bibliotecasde retención, crear sub-bibliotecas,…
• METLIN Personal DL: Bibliotecas con Espectros MS/MS-QTOF de ~2.286 metabolitos (8712 espectros)
• GC/MS: búsqueda en Bibliotecas de Espectros de Metabolitos por GC/MS con EI
• Biblioteca Fiehn de Metabolitos (GC/MS con EI):
• 665 metabolitos (1051 espectros MS)• Incluye: aminoácidos, azúcares, ácidos orgánicos,….• Incluye índice de retención basados en FAMES • Método con RTL (Congelación Tiempos de Retención)
• Bibliotecas genéricas: Wiley (+600K comp) , NIST (+200K comp)
Página 18
Mass Profiler Profesional: Importación y Visualizaciónde Rutas Metabólicas
Una vez identificados los metabolitos relevantes:
Página 19
Abundancias Diferenciales de 3 Metabolitos de la Ruta de la Arginasa (Ciclo Urea) en Eritrocitos infectados por M l i
A i i
Malaria.
Ciclo de la UreaArgininaOrnitinaCitrulina
Ver en que rutas metabolicas están involucrados los
metabolitos
Ciclo de la Urea
metabolitos relevantes del
estudio diferencial
Células sangreInfectada
L-Arg
1500
2000
2500
Citrul.Ornit.
0
500
1000
No infectados
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2 Tipos de Estudios Metabolómicos: Genéricos yEspecíficosEspecíficos
LC/MS-QTOF
LC/MS-QqQ
Comparación de Comparación de Perfiles Específicosp
Perfiles Genéricos del Metaboloma
(metabolitos conocidos
Perfiles Específicos(metabolitos concretos)
Se trabajará con QqQ/QTOF en modo(metabolitos conocidos
+ desconocidos)
Se trabajará con MS
QqQ/QTOF en modo MS/MS o en MS
(QTOF/TOF) en modo selectivo (masa exacta)
j(TOF/QTOF) en modo
espectral con masa exacta
Tí i
Típico para Validación* de Biomarcadores
Cambios en ciclos Típico para
Descubrimiento de Nuevos Biomarcadores
concretos del metabolismo
*Se corroborarán los resultados de PCAcon perfiles específicos de un elevado
Página 21
con perfiles específicos de un elevado nº de individuos.
Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de Perfilado Especifico (“Targeted Metabolomics”)
LC-QqQ
GC-QqQ
Página 22
“Pathway to Database Tool”
C i t l i f ió d l t b lit i l d l t l i dConvierte la información de los metabolitos involucrados en las rutas seleccionadas en una Agilent “Personal Compound Database” (PCDB). Ésta se utiliza para cuantificar relativamente esos metabolitos en un conjunto de muestras adquiridas con masa exacta (modo MS):
• Permite seleccionar las rutas metabólicas de interés.• Elimina metabolitos redundantes.• Búsqueda en la web información adicional de los metabolitos:
CAS ID N b IUPAC E t t• CAS ID, Nombre IUPAC, Estructura
Página 23
Cuantificación Relativa de Metabolitos Involucrados en Rutas Metabólicas de Interés
Cambios de expresión del metaboloma inesperados pueden revelar p p ptoxicidad o efectos indeseados en el tratamiento con un fármaco, dieta,…
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Herramientas y Flujos de Trabajo en
Programa:de Trabajo en Metabolómica y Análisis Comparativos
1.- Introducción.- Importancia Metaboloma & Biomarcadores.
2 Flujos de Trabajo en Estudiosp
por Espectrometría de Masas.
2.- Flujos de Trabajo en Estudios Metabolómicos.
3.- Herramientas para Análisis pComparativos de Muestras.
- Cromatografía/ Espectrometría de Masas.
4 C l i4.- Conclusiones.
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Herramientas: Hardware y Software Bioinformáticopara -Ómicaspara Ómicas
para Descubrimiento y Seguimiento de Biomarcadores
1.- Genoma- aCGH ArraysChIP on Chip
2.-Transcriptoma- Gene Expression Arrays; Splicing-Arrays RNA ChIP on Chip
Arrays - GS Genotyping
CGH AnalyticsChIP Analytics
Arrays- GeneSpring GXResolver
DNA
RNA
y
CH2OHProteínas
3.- ProteomaTécnica análisis:
LC/MS Metabolitos 4.- MetabolomaLC/MS Spectrum Mill,
Mass Profiler Pro(GeneSpring MS)
Metabolitos
Metabolómica comparte:Instrumentación LC/MS con Proteómica
4. MetabolomaTécnica análisis:
LC/MS & GC/MS RMN
Mass Profiler ProBioinformát: GeneSpring & MPP con Prot. & Genóm. (GeneSpring MS)
Página 26
GeneSpring and MPPAnálisis Integrado de Rutas.Análisis Integrado de Rutas.
GeneSpring GX/ MPP
Análisis NO dirigidos
Correlacionar metabolomacon transcriptoma
Análisis DIRIGIDO
del proteoma
• Adquirir datos de metabolómica (MS) y transcriptómica (microarrays).
• Mapear y visualizar los datos expresados diferencialmente del p y ptranscript/metabol-omas en una ruta/s común/es.
• Reextraer los datos de TODOS los metabolitos involucrados en las rutas.
• Identificar las proteínas involucradas en la red y usar soft "Skyline" para• Identificar las proteínas involucradas en la red y usar soft. Skyline para desarrollar MRMs dirigidos.
• Realizar los ensayos dirigidos de proteínas utilizando LC-QQQ y analizar t dí ti t l bi tit ti d l testadísticamente los cambios cuantitativos del proteoma.
Página 27
Portfolio de Instrumentos para Metabolomica: desde zeptomoles hasta exactitudes de masa de 250ppb’sp pp
5975C5975CGC/MSGC/MS
7000B7000BGC/QQQGC/QQQ
GC/MS7000B7000B
GC/QTOFGC/QTOFGC/QTOFGC/QTOFúnico
QQ--TOFTOF6500 series6500 seriesHiHi--DEF QDEF Q--TOFTOF
QqQ-6490
6500 series6500 series6500 series6500 series 6490-QqQ
100 atogramos verapapmil
CECEZeptomoles !! zmol 10-21
CE/MS
QQQQQQ6400 Series6400 Series
TOFTOF6200 series6200 series
Infinity Infinity 1290 1290
UHPLCUHPLC
CE/MS
LC/MS
RMN
Página 28
CromatografíaEjemplo Instrumentación MS: LC/MS-Q-TOF
HPLC: todo tipo analitos GC: analitos volatilizables
CE: analitos iónicos
Para poder ser detectadasen MS las moléculas
necesitan ser ionizadas HPLC MS: QTOF
GCMS
necesitan ser ionizadas HPLC MS: QTOF
JUAN
29Página 29
Posibles Aplicaciones NO Metabolómicas del Análisis Comparativo de MuestrasAnálisis Comparativo de Muestras
Aplicando las mismas estrategias y herramientas analíticas
• Descubrimiento y Validación de Proteínas como Biomarcadores.
• Identificar los compuestos responsables de episodios de contaminación medio ambiental o alimentaria.
• Descubrir compuestos correlacionados con comportamientos• Descubrir compuestos correlacionados con comportamientos anómalos de un lote de productos, con su origen, con tratamientos a que han sido sometidos,……
E t di l i ilit d dif i d i ió t• Estudiar las similitudes y diferencias de composición entre sus productos y otros semejantes en el mercado.
• Estudiar el impacto del tratamiento de un alimento en su composición.
• Optimizar condiciones de procesos de Extracción / Síntesis (temperatura, pH, presión,….) para maximizar su eficiencia
• A partir de muestras de referencia poder clasificar/AUTENTIFICAR• A partir de muestras de referencia, poder clasificar/AUTENTIFICAR muestras desconocidas, materias primas, según su origen, tipo, tratamientos a que han sido sometidas, detectar fraudes,….
Página 30
• ….
Herramientas y Flujos de Trabajo en
Programa:de Trabajo en Metabolómica y Análisis Comparativos
1.- Introducción.- Importancia Metaboloma & Biomarcadores.
2 Flujos de Trabajo en Estudiosp
por Espectrometría de Masas.
2.- Flujos de Trabajo en Estudios Metabolómicos.
3.- Herramientas para Análisis pComparativos de Muestras.
- Cromatografía/ Espectrometría de Masas.
4 C l i4.- Conclusiones.
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Conclusiones
• El estudio de cambios en el metaboloma permite evaluar el impacto sobre un organismo, tanto de factores internos(genoma/proteoma/enfermedades/…) como externos (fármacos/ dieta, medio(genoma/proteoma/enfermedades/…) como externos (fármacos/ dieta, medio ambiente/…).
• El metaboloma es una excelente fuente de biomarcadores para diagnóstico y seguimiento de enfermedades, clasificación de pacientes,….
• La espectrometria de masas acoplada a cromatografía (LC/MS y GC/MS) tit h dí l h i t líti á t t lGC/MS) constituyen hoy en día la herramienta analítica más potente para el análisis del metaboloma proporcionando perfiles de cientos/miles de metabolitos.
• Hoy es día ya están disponibles comercialmente en el mercado:
– Cromatógrafos, Espectrómetros de Masas y Software para pasar: g p y p pde IONES a RUTAS METABOLICAS.
– Instrumentos y Software bioinformático para abordar con una visión global la “Biologia de los Sistemas”.
Página 32
www.metabolomics-lab.com
33
MuchasMuchas Gracias
www.metabolomics-lab.com
www.proteomics-lab.comwww.proteomics lab.comEstamos a su disposición en:
http://www.chem.agilent.com/escustomercare_spain@agilent.com
Tel. 901.11.6890
Isidro Masana
Mass Spec/tacularIsidro Masana Especialista de Productos LC-CE/MS AGILENT TECHNOLOGIES 901.11.68.90 isidre_masana@agilent.com
Sesión de Preguntas
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Isidro Masana
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INFORMACION• Ejemplos Resultados:
1 Optimización Proceso de ExtracciónINFORMACIONSUPLEMENTARIA (No impartida en Seminario PRBB)
1.- Optimización Proceso de Extracción de Metabolitos de Glóbulos Rojos.2.-Estudio Metabolómico Infección Bacteriana en Arroz: Influencia líneas de Arroz y cepas Bacteriales.3.-Clasificación de Muestras. Autentificación de Vinos4.-Ejemplos Conclusiones de Varios Estudios MetabolómicosEstudios Metabolómicos5.- Ejemplo Control Calidad Anticuerpos Monoclonales:
I f ió V i• Información Varia:1.- Proceso Deconvolución 3D: MFE+AMDIS
2.- Descubrimiento de Biomarcadores en2. Descubrimiento de Biomarcadores en Proteómica.3.-Aspectos Clave en Estudios Metabolómicos :Metabolómicos :
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Ejemplo Aplicación 1º: Optimización Proceso de Extracción de Metabolitos deProceso de Extracción de Metabolitos de Glóbulos Rojos
PARÁMETROS INFLUENCIAN RENDIMIENTO EXTRACCIONES LÍQUIDO/LÍQUIDO:
pH fase acuosa (parámetro estudiado en este ejemplo)
P i f / á iProporciones fase acuosa/orgánica
Adición de sales / modificadores orgánicos fase acuosa
TemperaturaTemperatura
...PREPARACIÓN MUESTRA:
1.- Centrifugar sangre (con citrato como anticoagulante) y eliminación del sobrenadante.
2.- Lavado con PBS (solución salina de tampón fosfato) para eliminar los metabolitos del exterior de los glóbulos.
3.- “Quenching” y lisado de la membrana de los glóbulos para liberar los metabolitos de su interior.
4 Adición modificador fase acuosa (metanol)4.- Adición modificador fase acuosa (metanol).
5.- Adición fase orgánica (cloroformo).
6.- Extracción líquido-líquido a diferentes pH’s fase acuosa.
7.- Evaporación a vacío y reconstitución fase acuosa.
Página 37
Influencia pH en nº Metabolitos ExtraídosDistribución 1211 metabolitos distintos identificadosDistribución 1211 metabolitos distintos identificados en MetLin DB por su masa exacta con <10ppm error
(LC/MS-TOF)
Incluye compuestos no identificados en MetLin DB
+ inf. en nota aplicación: Maximizing Metabolite Extraction for p gComprehensive Metabolomics Studies of Erythrocytes p/n: 5989-7407EN
Página 38
Ejemplo 2º: Estudio Metabolómico Infección Bacteriana en Arroz: Influencia líneas de Arroz y cepas Bacteriales
• TP309: Arroz salvaje susceptible de ser atacado por la bacteria PXO99 salvaje
• TP309-Xa21 arroz transgénico resistente a la
PX099 PX099 RaxST -Bacteria salvaje Bacteria transgénica
TransgenicSalvajeCondition
2 Tipos de Arroz (TP...)
Resistente a la plaga
2 tipos bacterias
TP309 Xa21 arroz transgénico resistente a la bacteria salvaje PXO99, pero NO a la modificada genéticamente: PXO99 (RaxST-).
• PXO99: bacteria salvaje que dispone del gen raxST que codifica una proteína tipo sulfotransferasa
Péptido AvrXa21+6 (C)6 (A)PXo99
g
TP309-Xa21
Salvaje
TP309
Condition
(Class)
ria
(PX
…)
(A) (B) (C) (D)
raxST que codifica una proteína tipo sulfotransferasa capaz de generar el péptido AvrXa21.
• PXO99 RaxST- : bacteria modificada genéticamente para eliminar el gen raxST que permite generar el péptido AvrXa21
Blanco control tratado
6
6
6
6
deb
acte
r
Blanco control permite generar el péptido AvrXa21.
• Péptido AvrXa21 (producido a partir del gen raxST) y que genera una respuesta inmune en el arroz modificado genéticamente (TP309-Xa21)
PXo99
RaxST-6 (D)
6
NA(B)
6
2 ti
pos
d control SIN tratar
TP309 TP309-Xa212 tipos arroz (TP…)p ( )
Los replicados de muestras de la población son importantes
LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/muestra (ESI+: 1500 -: 400)
Página 3930-15m
Mass Profiler Professional: ANOVA de 1-vía con Datos de Arroz Filtrados mediante “Tukey Post-hoc Test”. M d I P itiModo Iones Positivos
Azul: estadísticamente equivalentes
----- Arroz Salvaje ------7 Condiciones Biológicas Comparadas
----- Arroz Transgénico ------
. act.
lv
aje
Bac
t.
alva
je
equivalentes
Rojo: estadísticamente diferentes
Bac
t. M
od
if.
Gen
.
Ba
Sal B Sa
lóg
icas
s
ArrocesResisten.
zT
ran
gén
ico
on
es B
iol
mp
arad
asA
rro
z
Bact. Modif. Gen.
Bact. Salvaje Resisten.
7 C
on
dic
ioC
om
Infección
zS
alva
je Arroces
7
Arr
o
Bact. Salvaje Infección
LCMS ESI 1900 t / t ANOVA li d 564 t dí ti t fi blLCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables
Página 40
“Mass Profiler Profesional”: Diagrama de Venn de ANOVA de 1-vía con Datosde Venn de ANOVA de 1 vía con Datos de Arroz Filtrados La comparación mediante ANOVA de 1-
Diagrama de Venn ComparandoArroz Infectado Vs Resistentep
vía se realizó para encontrar “molecular features” (/compuestos) de interés biológico.
Arroz Infectado Vs. Resistente
• Se evaluan 7 condiciones biológicas. De la comparación de resultados se concluye:
– Immunity features: (42) – metabolitos relacionados con la resistancia
– Infected features (22) – metabolitos l i d l i f iórelacionados con la infección
– Bacterial features (25) – metabolitos producidos por las bacterias
– Rice line features (170) – metabolitos relacionados con diferencias en las líneas de arroz
Página 41
“Mass Profiler Profesional”: Ejemplo combinación de Análisis de PCA con ANOVA
Proporciona una mucha j dif i ió
LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta
ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables
mejor diferenciación de clases
7-INF 6-RES
2
3-INF7-INF
6-RES
2
3-INF5
5
3 Ensayos con Arroz salvaje 4 Ensayos con Arroz transgénico1 4
Permitiría evaluar si un tratamiento tiene un claro impacto en la composición de una muestra
12
3-INF
45
6-RES7-INF mod. genet.
“bacteria salvaje”
“control”
“sin tratar”
i f N t d A li ió M t b l i P fili f B t i l L f Bli ht i Ri 5989 6234EN+info: Nota de Aplicación Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice: 5989-6234EN
Página 42
Ejemplo Aplicación 3º: Clasificación de Muestras.Autentificación de Vinos
• 45 Vinos Tintos (para modelizar)
• 3 Variedades: Cabernet Sauvignon (15), Merlot (16), Pinot Noir (14)
• 11 países de origen: República Checa, Eslovaquia, Francia, Italia, Macedonia, Bulgaria, Hungría, Australia, Chile,
Alemania, EE.UU.
• Cosechas: 2004 – 2008
CONJUNTO DE MUESTRAS MUY VARIADO
Página 43 35-10m
Instrumentación Utilizada
?Jet Stream ESI source
?Jet Stream ESI source
Multimode ion source
Software de AnálisisAnálisis
Estadístico Multivariante
Agilent Technologies
/
Agilent Technologies
1200 RRLC
Eclipse Plus C18 (2.1×100, 1.8µm)HILIC Plus C18 (2.1×100, 3.5µm)
Sin preparación previa de muestra, análisis directo (previa microfiltración).Ondrej Lacinaa, Lukas Vaclavika, Jana Hajslovaa, Jerry Zweigenbaumb
6530 Accurate‐Mass Q‐TOF LC/MS1200 RRLC system
a Institute of Chemical Technology Prague, Czech Republic b Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA
Página 44
Procesado de Datos: ejemplo T.I.C.
TIC of wine and LC blank, LC-(ESI+) QTOFMS
?
?? ?
????
?
?
?
??
?
??
??
?? ? ?
???
??
?
???
???
??
?
??
??
?? 6x10
0.7
0.8
0.9
1
1.1
1.2
1.3+ESI Scan (6.248-6.387 min, 13 scans) Frag=125.0V ESI+_PN…
* 210.1133
Los espectros corresponden a
múltiples compuestos ? ?
BLANKWINE
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
493.1350
200 400 600 800 1000
pcoeluyentes
• Datos muy complejos.
• Compuestos minoritarios enmascarados.
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)200 400 600 800 1000
6x10
1.2
1.4
1.6
1.8+ESI Scan (3.888-3.981 min, 9 scans) Frag=125.0V ESI+_PN_…
Se requiere software que extraiga y caracterice todos los compuestos
ionizados.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
358.1719
571.3074
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)200 400 600 800 1000
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Extracción de Datos: “Find By Molecular Feature”
M F E extrae 20 506 “features” delM.F.E. extrae 20.506 “features” del conjunto de todas las muestras (en
las condiciones utilizadas)
Find compound by Molecular Feature Extractor
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Procesado de Datos mediante Agilent Mass Profiler Profesional: Filtración de Entradas por Frecuencia (Incidencia en las Clases)p ( )
Filtro por omisión: la existencia del “feature” en el 100%* de las muestras de al menos en un grupoy 100%* de las muestras de al menos en un grupo.
inte
nsi
tyA
vera
ge
A
663 “features” de 20.506
* Filtrando con el 50%el nº de “features”
En conjuntos de muestras muy variadas, algunos compuestos importantes podrían ser filtrados ...
e de eatu esaumenta de 663 a 3600
co ju tos de uest as uy a adas, a gu os co puestos po ta tes pod a se t ados
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Revelado de la Estructura Interna de los Datos mediante Filtrado por Frecuencia y Análisis de Componentes
PCA de las “Molecular PCA de las “Molecular Features”
Principales (PCA)
Features” iniciales (20506) filtradas por frecuencia ≥50% (3600)
FILTRATION
CABERNET SAUVIGNONMERLOTPINOT NOIR
FILTRATION
PINOT NOIR
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Revelado de la Estructura Interna de los Datos mediante ANOVA y Análisis de Componentes Principales (PCA)
PCA de las “Molecular Features”
filtradas con ANOVA (p≤0.05) & Ratio de cambio (≥2.0): 26
y p p ( )
(p ) ( )
Un adecuadoUn adecuado filtrado de los
datos es esencial para
FILTRACIÓNesencial para
una buena clasificación
CABERNET SAUVIGNONCABERNET SAUVIGNONMERLOTPINOT NOIR
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Validación del Modelo de Predicción de ClasesClases
Número de muestras utilizadas en la validación: 45
• Durante la validación del modelo, 2 MERLOT fueron mal clasificados.
• Todos los Cabernet Sauvignon y Pinot Noir se clasificaron correctamente.correctamente.
• La fiabilidad de predicción del modelo resuelto ser del 95.6%*
El modelo clasificó correctamente las 5 muestras adicionales evaluadas (2 CS, 1M, 2 PN).* ANOVA utilizó para filtrar un p≤0.05.
Página 50 40-5m
Ejemplos Conclusiones de Varios Estudios MetabolómicosMetabolómicos
• LC/MS-TOF: Biomarcadores de bajo peso molecular de Cáncer Pancreático
Poster ASMS: Mayo Proteomics Research Center, …Mayo Clinic
- La fracción de bajo peso molecular del plasma es una fuente viable de potenciales biomarcadores de cáncer pancreático yviable de potenciales biomarcadores de cáncer pancreático y
mediante unos 20 metabolitos permiten discriminarlo en pacientes diabéticos vs. no diabéticos
• LC/MS-QTOF & QqQ: “Changes in phopholipase expression in the CNS of SIV-q g p p p pinfected macaques”.
• Gary Siuzdak & others. The Journal of Clinical Investigation http://www.jci.org Volume 118 Number 7 July 2008
• CE/MS-TOF: “Ophthalmic Acid as an Oxidative Stress Biomarker Indicating Hepatic Glutathione Consumption”
• Tomoyoshi Soga & others. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 24, pp. 16768–16776, June 16, 2006, , pp , ,
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Típicos Análisis de Metabolopatías mediante MS
• Típicos compuestos a seguir
- Aminoácidos
- Acyl carnitinas
Á- Ácidos orgánicos
- Ácidos grasos
- ……
F il t i (PKU) t l l l ió d PHE / T d d
LC/MS-QQQ
• Fenilcetonuria (PKU): se controla con la relación de PHE / Tyr, donde Tirosina es el producto natural del metabolismo de la fenilalanina. Niveles elevados de Phe en relación con Tyr indica problemas en la conversión natural de este metabolito. PKU es una enfermedad que se puede tratar (sólo por el control de la dieta) y es importante tratarla lo antes posible, ya que puede conducir a daño cerebral y retraso mental.q p y
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Ejemplo Control Calidad Anticuerpos Monoclonales: Using Mass Profiler Pro to Analyze Large Batch of SamplesMass Profiler Pro to Analyze Large Batch of Samples PCA plot of different mAb’s oxidation conditions
•Principal component analysis Controles
(PCA) is a clustering tool often applied to reduce the dimensionality of complex data sets
Controles
sets.
•The result for the oxidation samples demonstrates correct
Tratadas con >0.3% t-BHP
grouping of the technical replicates and clear separation between different concentrations of t‐BHP treatedconcentrations of t BHP treated mAbs.
•It is clearly observed that Tratadas con
control (cyan) and 0.1% (red) are well separated as compared with other oxidized samples.
Tratadas con 0.1% t-BHP
Deconvolución 3-D con AMDIS (GC/MS) y Mass HunterMolecular Feature Extractor”(LC/MS)
TICPicos deconvolucionados y espectrosTIC & Espectro
En muestras complejas 1 pico (TIC) suele estar formado por varios compuestos no resueltos y algunos del propio fondo
TIC (suma de los 3)
Componente 1
y p
Componente 1TIC & Espectro
[M+H]+
Componente 2
Componente 3 Componente 2
[M+Na]+
“Deconvolución”
p[M+H]+
[M+Na]+ [2M+H]+
E.C.C.: Suma de intensidades de sus
iones específicos
Componente 3
[M Na]
[M+H]+
Ejemplo con espectros de LC/MS
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jAPI-LC/MS apenas produce fragmentación
Descubrimiento de Biomarcadores en Proteómica: Flujo de Trabajo “Metabolómico”
Identificación de Proteínas con estrategia “Metabolómica” & MFE: considerará TODOS los péptidos ionizados, incluso cuando coeluyen con
otros mucho más concentrados.
Selected Peptides by MFE & GS-MSTOF o QTOF
en modo MS
Targeted MS/MS by TRAP or QTOF
Identificar Proteínas por “DB MS/MS search”
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Aspectos Clave en Estudios Metabolómicos
• Buen diseño experimental • Adecuada selección de las distintos individuos que componen cada una
de las poblaciones sujetas a estudio.• Adecuada valoración del impacto de la diversidad dentro de cada una de las
poblaciones (sexo, raza, actividad física y estilo de vida, dieta, factores ambientales,…).
• Adecuado nº de individuos dentro de cada población para valorar la variabilidad natural dentro de cada grupo (~20-30 en descubrimiento // cientos-miles para validación).
• …
• Adecuada Extracción y Conservación de la muestra:• La muestra extraída (biofluidos, tejidos, cultivos celulares,…) debe ser representativa del objeto
del estudio.• Extraer los compuestos de interés con una elevada y reproducible recuperación (o en
d f t tili b t i t d f i )su defecto utilizar buenos patrones internos de referencia).• …..
• Adecuados Instrumentos y Procesos Analíticos• Potentes Herramientas de Análisis Estadístico Multivariante
• Deben permitir correlacionar cambios multivariantes en el perfil masivo del metaboloma (sin hipótesis previas – aproximación holística) con las diferencias entre las distintas
bl i dpoblaciones comparadas.
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