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IDENTIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS
Técnicas de hibridación
Southern blot
Northern blot
UNIVERSIDAD NACINAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
Dr. Juan C. Tantaleán V.
AMPLIFICACION DE ADN:
Reacción en cadena de la polimerasa
PCR
HIBRIDACION
• Apareamiento complementario de bases entre dos ácidosnucleicos de hebra simple producto de hebra doble.
RNA
DNA
DNA/DNA
RNA/RNA
DNA/RNA
IDENTIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS
1. DESNATURALIZACION DEL DNA:
Separación de las 2 hebras.
• pH > 13
• 90 - 100 ºC
2. RENATURALIZACION O HIBRIDACION DEL DNA
Recuperación del estado de 2 hebras.
• 55 - 65 ºC
A < temperatura < especificidad de renaturalización
Doble hebra
Factor
desnaturalizante
Doble hebraHebra simple
Condición de
renaturalización
Unión de secuencias
complementarias
FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS
Porcentaje de pares GC v/s pares AT Grado de complementariedad entre hebras Largo de las hebras de polinucleótidos Concentración de sal en la solución de hibridación Temperatura de reacción Concentración de formamida en la solución de hibridación
Efecto del porcentaje de GC en la desnaturalización del ADN
Temperatura de “melting” (Tm): o de desnaturalización
HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS CON SONDAS
Sondas: hebras simples de DNA o RNA de 5 a más de 1000 nucleótidos, complementarias a secuencias específicas en el genoma.
Para su diseño se requiere conocer la secuencia nucleotídica a la cual debe unirse.
La sonda pequeña molécula de DNA o RNA, marcada, complementaria de la región específica que pretendemos detectar
Aplicación del uso hibridación con sondas
Identificación de secuencias de ADN Identificación de ADN viral
TECNICAS QUE SE BASAN EN LA
HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS
SOUTHERN BLOT: Hibridación de ADN
NORTHERN BLOT: Hibridación de ARN
SOUTHERN BLOT: Hibridación de DNA
• Identificar una secuencia de ADN.
• Ubicación de genes.
• Identificación de organismos.
• Caracterización molecular.
Procedimiento.
Corte del ADN genómico con enzimas de restricción
Separación electroforética de fragmentos de ADN en gel de agarosa.
Transferencia del ADN del gel hacia una membrana de nitrocelulosa o nylon.
Hibridación mediante una sonda específica con marca radiactiva (RNA, cDNA, oligonucleótido).
Autoradiografía.
Electroforesis de ADN
en gel de agarosa
Transferencia hacia
membrana de nitrocelulosa
o nylon
Southern blot: identificación de ADN
Esquema de Southern Blot
Esquema de Southern Blot
NORTHERN BLOT: Hibridación de RNA
• Permite detectar la presencia de un transcrito (ARN). Primer nivel de
expresión.
• Proporciona información de su tamaño y procesamiento.
Procedimiento
Extracción de ARN (total o mensajero), purificar.
Separación de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa.
Transferencia del ARN del gel hacia una membrana de
nitrocelulosa o nylon.
Hibridación mediante una sonda específica con marca radiactiva
(RNA, cDNA, oligonucleótido).
Autoradiografía.
Esquema de Northern blot
AMPLIFICACION DE ADN
La reacción en cadena de la polimerasa
( PCR )
PCR: Polimerase chain reaction
1. Kary Mullis (1985) ..... Premio nobel de química en 1993
2. Base: Amplificación in vitro de secuencias específicas de DNA.
PCR
amplificación
DNA
(molécula sencilla)
Muchas
moléculas
El proceso, se controla con la temperatura
Si se repite el ciclo, se obtienen cuatro copias
Desnaturalización
95 C
Hibridización
50-60ºC
Extensión de
la cadena
72ºC
Primer Ciclo
2do Ciclo
95ºC
50 - 60ºC
72ºC
Los múltiples ciclos generan un incremento exponencial en el número de copias de ADN
AMPLIFICACIÓN DE UN SEGMENTO DE ADN
Componentes esenciales en el proceso standard de PCR
• ADN polimerasa termoestable• Oligonucleotidos iniciadores (“primers”)• Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs)• Cationes divalentes (Mg++)• Buffer (para mantener el pH)• ADN molde (Templado)
Reacción:
• DNA templado
• Partidores o Primers
• Nucleótidos dNTP: (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
• Buffer o tampón, Mg++
• Taq Polimerasa (termoestable)
Aceite mineral
Temp.
ºC
Tiempo (min)
1
2
3
1: desnaturalización; 2: annealing; 3: extensión
95
72
60
El ciclo de PCR Desnaturalización – 94 - 95°C por 45 segundos si G+C < 55%
Hibridización (Annealing) – calculada para cada par de primers
demasiado alta = poco o nada de producto
demasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos
Extensión - a temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada
ej.: 72°C para Taq
Taq : 2000 pb/min
A partir del 3r ciclo se produce ADN de longitud deseada ( producto principal).
• Número de ciclos -
- >25 ciclos para amplificar un gen de copia única a partir de ADN genómico DNA.
- algunos componentes limitantes > 30 ciclos (si inicio = 105 moléculas)
ADN molde (templado)
• Puede ser DNA de hebra simple o doble.
• ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal
• Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej:
1 µg de humano
10 ng de levadura
1 ng de bacteriano
1 pg of plasmídico
• Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas
ADN polimerasas termoestables
• Sintetizan ADN dependiente del ADN templado.• Estabilidad: Taq: 9 min at 97°C, Pwo >2 hr a 100°C• Fidelidad: Taq: baja, Pfu: alta• Actividad transferasa terminal: en el extremo 3´, ej.
Taq agrega una A al exremo 3´, si en el extremo hay una CPwo y Tli generan extremos romos.
• Cantidad usada = 5 x 1012 moleculas (1.5 unidades)• La más común = Taq ADN polimerasa
Taq : Thermus aquaticus,Pwo : Pyrococcus woesei, Pfu : Pyrococcus furiosus, Tli : Thermococcus littoralis
Oligonucleótidos iniciadores (primers)
• Se conoce su secuencia• Es el factor más importante para la eficiencia y la
especificidad del proceso• Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 ciclos, 1 kb)• Requieren de un diseño cuidadoso• Reglas de diseño:
(a) longitud = 18-25
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
(c) Evitar las secuencias repetidas
5´5´
3´3´
5´5´3´
3´
Dímero de primer
PCR
3´ repetido
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’
5’-NNNNNNNNTATA-3’
3’-ATATNNNNNNNN-5’
5´5´
3´3´
no hay extensión
PCR
5´ repetido
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNN-3´
3´-NNNNNNNNATAT-5´
5´5´
3´3´
5´
5´
3´
3´
Productos de PCR no deseados
PCR
Formación de horquillas
5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
5’-NNNNNNNNNNNGCA
3’-CGT
5´3´
Variantes de la PCR
• Colony PCR: uso de colonias como fuente de DNA• Multiplex PCR: uso de varios partidores• Nested PCR: PCR en 2 etapas• RT- PCR: obtención de cDNA
IS TIME FOR TAKE A BRAKE…
SEE YOU IN TEN MINUTES…
PRACTICA
Discusión de las técnicas
Southern Blot y Northern Blot
SEPARACION
ELECTROFORETICA
DE FRAGMENTOS
DE ADN
TRANSFERENCIA
HACIA UNA
MEMBRANA DE
NYLON
AUTORADIOGRAFIA
IDENTIFICACION
DE DNA
SOUTHERN BLOT
NORTHERN BLOT: Identificación de RNA
4. Generación de una sonda marcada
pGEM-T
dATP
dGTPdTTP
dCTP
1. Extracción del RNA
2. Electroforesis del RNA
3. Transferencia a membrana
5. Hibridación
6. Autoradiografía
APLICACIONES
Diagnóstico y detección de patógenos
Clonamiento molecular
Mutagénesis.
Caracterización molecular.
Identificación de mutaciones.
Medicina forense.
Otros
PCR
St 1 2
1200 pb
Kb
23
4
2,2
1,3
1,1
0,6
Amplificación de genes mediante PCR
CLONACION DE GENES EN VECTORES T-A
3’-A
A-3’
T-3'
3'-TA
A
Ligamiento con extremo adhesivo de 1 base = 50 veces mejor
que ligamiento con extremos romos
ligamiento
Producto de PCR
usando TaqVector con cola-T
T-3'
3'-T
Mutaciones en iscS: deleciones por PCR del extremo 3’
Aa
399
369
349
329
Pb
1200
1107
1047
987
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
NH2 COOH
NH2
NH2
NH2
COOH
COOH
COOH
St 1 2 3 4 5 St
St: estandar; 1. pET21b; 2, pET1200;
3, pET1200-90; 4, pET1200-150; 5, pET1200-210
Digestiones NdeI/HindIII de plasmidos recombinantes
MUTAGENESIS POR DELECION
Dos 1ros
PCRs
separadas
Primer F Primer mutagénico directo (forward)
primer mutagénico inverso (reverse) Primer R
X
x
x
x
remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar
2do PCR
Mutagenesis con PCR- extension solapada
PCR: Amplificados para la generación de mutantes puntuales
Kb
1300
11001000
800600
400
St 1 2 3 4 5
iscS (1217 pb)
667 pb
592 pb
THANKS!