Post on 29-Aug-2019
Hondakin koipetsuen ustiapena entzimen bidez
Jakintza-arloa: Biokimika
Egilea: EVA MARIA FERNANDEZ DE LABASTIDA AMURRIO
Urtea: 2006
Zuzendariak: MAILO VIRTO LEKUONA, MERCEDES RENOBALES SCHEIFLER
Unibertsitatea: UPV/EHU
ISBN: 978-84-8438-500-4
Hitzaurrea
Ikerlan honetan erabilitako hondakin koipetsuak bi motatakoak izan ziren. Alde batetik, hiltegietatik jasotako animalia-gantzak, eta bestaldetik, erabilitako landare-olioak. Substratu hauen ezberdintasunik nagusienak euren konposaketa gantz-azidotan (ase-gehiago animalia-gantzetan) eta hasierako hidrolisi-mailak (altuagoa animalia-gantzetan) izan ziren. Koipeen eraldaketa nahiko ikertu bada ere, hondakin koipetsuen ustiapena era entzimatikoan, berriz, ez da hain ohikoa.
Aztertutako tratamenduak bi izan ziren: hidrolisia (gantz-azido askeak eta glizerola lortzeko) eta transesterifikazioa edo esterifikazioa ester metilikoak ekoizteko. Tratamendu hauek gantz eta olio komertzialekin askotan erabili badira ere, hondakinekin, esan bezala, ez hainbeste, eta horrez gain, literaturan lipasa komertzialen arteko alderaketak aurkitzea ez da ohikoa. Hidrolisi erreakzioak burutzeko 6 lipasa aztertu ziren; ester metilikoak ekoizteko, berriz, 3 lipasa immobilizatu. Lipasa hauen guztien ezaugarriak ikertu ziren tratamenduen baldintzarik egokienak zehaztu baino lehen. Lipasa hauen arteko alderaketa bi eratan egin zen. Alde batetik, euren ezaugarri fisiko-kimikoak ikertu ziren. Bestaldetik, euren erabilera tratamenduetan aztertu zen.
Lan hau garatzeko ezinbestekoa izan zen nire tesi-zuzendarien laguntza. Izan ere, nire tesi-zuzendarien aurreko ikerketa-lerro beretik jarraitzen du ikerlan honek. Kasu horretan gantz komertzialen hidrolisi entzimatikoa ikertu bazen ere. Honez gain, INASMET Fundazioari eskertu behar diot hiltegietatik jasotako animalia-gantzen hidrolisia ikertzeko aukera ematea. Bukatzeko, tesi hau ez zatekeen posiblea izango EHUko Euskara Errektoreordetzaren “Euskarazko tesiak sustatzeko beka”-ri gabe. Beka honek izugarrizko bultzada eman zion tesiari eta euskaraz egiteko asmoa buruan banuen ere, ekimen honek tesia euskaraz egitera animatu ninduen.
Eva Fernandez de Labastida2014
HONDAKIN KOIPETSUEN
USTIAPENA
ENTZIMEN BIDEZ
Elikagaien Zientzia eta Teknologian Doktore gradua eskuratzeko
aurkeztutako memoria
Eva Maria Fernandez de Labastida Amurrio
Vitoria-Gasteiz, 2006.
Aurkibidea
i
I. SARRERA 1
1. HONDAKIN KOIPETSUAK 3
1.1. Jatekoak ez diren animalia-gantzak 4
1.2. Erabilitako landare-olioak 5
2. HONDAKIN KOIPETSUEN KUDEAKETA 8
2.1. Araudia 8
3. HONDAKIN KOIPETSUEN BERRERABILERA 12
3.1. Hidrolisia 14
3.2. Biodieselaren ekoizpena 17
4. LIPASAK 22
4.1. Ezaugarri nagusiak 22
4.2. Lipasen erabilera industrialak 27
HELBURUAK 31
II. MATERIAL ETA METODOAK 33
MATERIALAK 35
1. GANTZAK ETA OLIOAK 35
1.1. Hondar-gantzak 35
1.2. Erabilitako landare-olioak 35
1.3. Gantz eta olio komertzialak 36
2. LIPASAK 36
2.1. Hidrolisi-erreakzioak 36
2.2. Esterifikazio-erreakzioak 37
3. ERREAKTIBO ETA DISOLBATZAILEAK 38
Aurkibidea
ii
METODOAK 39
1. GANTZ ETA OLIOEN KARAKTERIZAZIOA 39
1.1. Azidotasun indizea (AI) 39
1.2. Saponifikazio indizea (SI) 39
1.3. Hidrolisi-maila 40
1.4. Konposaketa gantz-azidotan 41
1.5. Hondakin koipetsuen lipidoen determinazioa 42
2. LIPASEN KARAKTERIZAZIOA 42
2.1. Aktibitate lipolitikoaren determinazioa 42
2.2. Esterifikazio aktibitatearen determinazioa 45
3. HIDROLISI ERREAKZIOAK 48
3.1. Laborategiko erreaktoreak (0.5 L) 48
3.2. Bost litroko erreaktorea 49
3.3. Berrogei litroko erreaktorea 50
4. METILAZIO ERREAKZIOAK 51
4.1. Erreakzio etenak 51
4.2. Erreakzio jarraiak 52
5. HIDROLISI ETA ESTERIFIKAZIO PRODUKTUEN
KARAKTERIZAZIOA 53
5.1. Gantz-azido askeak (GAA) 53
5.2. Hidrolisi eta esterifikazio produktuen karakterizazioa gas-
kromatografiaren bidez 53
5.3. Glizerolaren determinazio entzimatikoa 54
III. EMAITZAK 57
GANTZ ETA OLIOEN EZAUGARRIAK 59
1. AZIDOTASUN ETA SAPONIFIKAZIO INDIZEAK. HASIERAKO
HIDROLISI-MAILA 59
2. KOIPEEN LIPIDOAK 60
Aurkibidea
iii
3. KONPOSAKETA GANTZ-AZIDOTAN 60
LIPASEN KARAKTERIZAZIOA 65
1. GANTZ ETA OLIOEN HIDROLISI OSORAKO EGOKIAK DIREN
LIPASEN KARAKTERIZAZIOA 65
1.1. Aktibitate lipolitikoa 66
1.2. pH-ren eragina aktibitate lipolitikoan 68
1.3. Tenperaturaren eragina aktibitate lipolitikoan 71
1.4. pH-ren eragina lipasen egonkortasunean 75
1.5. Tenperaturaren eragina lipasen egonkortasunean 80
1.6. Substratu-ereduen hidrolisia 85
1.6.1. Gantz-azidoen ekoizpena 86
1.6.2. Glizerido partzialen determinazioa 89
2. ESTER METILIKOAK EKOIZTEKO ERABILITAKO LIPASEN
KARAKTERIZAZIOA 94
2.1. Esterifikazio aktibitatea 94
2.2. Tenperaturaren eragina aktibitatean 97
2.3. Substratuen kontzentrazioaren eragina aktibitatean 99
2.4. Tenperaturaren eragina lipasen egonkortasunean 109
2.5. Ester metilikoen eragina egonkortasunean 112
2.6. Metanolaren eragina lipasen egonkortasunean 113
HONDAKIN KOIPETSUEN TRATAMENDUAK 115
1. HONDAR-GANTZEN ETA OLIOEN HIDROLISIA 115
1.1. Animalia-gantzen hidrolisia 116
1.1.1. Gantza:ura proportzioaren eragina 116
1.1.2. Tenperaturaren eragina 118
1.1.3. Gehitutako lipasaren eragina 120
1.1.4. Saio erdi-pilotoa 122
1.1.5. Glizerolaren determinazioa ur-fasean 123
1.2. Erabilitako landare-olioen hidrolisia 124
Aurkibidea
iv
1.2.1. Gehitutako lipasaren eragina 125
1.2.2. Tenperaturaren eragina 127
1.2.3. Saio erdi-pilotoa 129
2. ESTER METILIKOEN SINTESIA 131
2.1. Erreakzio etenak 132
2.1.1. Olioaren transesterifikazioa 133
2.1.1.1. Metanolaren eragina 133
2.1.1.2. Lipasen kontzentrazioaren eragina 135
2.1.2. Esterifikazioa 147
2.1.2.1. Lipasen kontzentrazioaren eragina 149
2.2. Erreakzio jarraiak 152
2.2.1. Transesterifikazioa 153
2.2.2. Esterifikazioa 154
3. EMAITZEN LABURPENA 157
IV. ONDORIOAK 163
V. BIBLIOGRAFIA 167
Laburdurak
LABURDURAK AEB Ameriketako Estatu Batuak AI Azidotasun Indizea ASTM American Society for Testing and Materials (Ameriketako
Saioetarako eta Materialetarako Elkartea) BAUN Batch Acidolysis Unit Novo (Novo Azidolisi unitateak) BOE Boletín Oficial del Estado (Estatuaren Aldizkari Ofiziala) BSA Bovine Serum Albumin (Behi Seroalbumina) BSE Bovine Spongiform Encephalopathy (Behi entzefalopatia
espongiformea) BSTFA N,O-Bis-(trimethylsylyl)-trifluoroacetamide (N,O-Bis-
(trimetilsilil)-trifluoroazetamida) DG Diglizeridoak DOCE Diario Oficial de las Comunidades Europeas (Europako
Batasunaren Aldizkari Ofiziala) Ea Aktibazio energia EB Europar Batasuna EBB European Biodiesel Board (Europako Biodiesel Elkartea) EC European Commission (Europako Batzordea) EHAA/BOPV Euskal Herriko Agintaritzaren Aldizkaria/Boletín Oficial del
País Vasco EM Ester metilikoak FAO Food and Agriculture Organization (Elikagaien eta
Nekazaritza Erakundea) FAOSTAT FAO Statistical Databases (FAO-ren datu-base estatistikoak) GA Gantz-azidoak GAA Gantz-azido Askeak GAT Gantz-azido Totalak
Gantz-azidoak
C4
C12
C14:0
C16:0
C16:1 Δ9
C18:0
cC18:1 Δ9
tC18:1 Δ9
cC18:2 Δ9, 12
cC18:3 Δ9,12, 15
Azido butirikoa
Azido laurikoa
Azido miristikoa
Azido palmitikoa
Azido palmitoleikoa
Azido estearikoa
Azido oleikoa
Azido elaidikoa
Azido linoleikoa
Azido linolenikoa
IUN Interesterification Unit Novo (Novo Interesterifikazio
Laburdurak
Unitateak) K Kelvin graduak K.a. Kristo aurretik K.o. Kristo ondoren ki Inhibizio konstantea MG Monoglizeridoak PLU Propyl Laurate Units (Propil-laurato unitateak) PNRU Plan Nacional de Residuos Urbanos (Hiri hondakinen nazio
plana) RPdH Residuos Peligrosos del Hogar (Etxeetako hondakin
arriskutsuak) rpm Revolutions per minute (Bira minutuko) SI Saponifikazio indizea TG Triglizeridoak U Unitateak UHKPI/PIGRM Udal Hondakinak Kudeatzeko Plan Integrala/Plan Integral
de Gestión de Residuos Municipales USDA United States Department of Agriculture (Estatu Batuetako
Nekazaritza Saila)
I. SARRERA
I. Sarrera
3
Elikagai-industriak sortzen dituen hondakinen kudeaketa oso
garrantzitsua da gaur egun. Mundu osoan hondakin guztien kudeaketa
jasangarriaren aldeko apustua dago, halaber elikagai-industriak sortutako
hondakinena. Hondakinek ingurumenari egindako kalteek eta gero eta
murritzagoak diren ingurumen-legeriek interes handia sortu dute gai honetan.
Hondakinak kudeatzeko hainbat aukera aurki daitezke: hondakinen
murrizketa jatorrian, berrerabilera, berreskurapena eta ezabapena (Bates eta
Phillips, 1999). Aukera hauek ingurumen-legeria berrietan agertzen diren
printzipioekin bat datoz. Administrazioak hondakinen murrizketa sorlekuan
hobesten badu ere, kasu gehienetan hori ez da posible. Horregatik, guztiz
beharrezkoak dira berrerabilerapen- edo berreskurapen-estrategiak sortutako
hondakinak balioztatzeko. Horrela industriek, ingurumen-legeriak betetzeaz
gain, hondakinak tratatzetik etekin ekonomikoa atera daitekeela ikusiko dute.
Hala ere, kontuan hartu behar da berreskurapena nola egingo den,
ingurumenari ahalik eta kalte gutxien egiteko. Hori dela eta, entzimen bidezko
hondakinen tratamendua nabarmentzen ari da (Karam eta Nicell, 1997).
1. HONDAKIN KOIPETSUAK
Azken hamarkadetan gantz eta olioen ekoizpen mundiala izugarri
handitu da. Honen ondorioz, hondakin koipetsuak ere handitu dira eta
etorkizunean are gehiago handituko direla espero daiteke, FAOSTAT-ren
(FAOSTAT, 2005) datuen arabera, 1. irudian ikus daitekeen bezala. Aipatzekoa
da landare-koipeen eta olioen ekoizpenaren igoera, azken 20 urteetan bikoiztu
dena. Gantzen eta olioen kontsumo mundialaren %14 industriagintza
oleokimikoan erabiltzen da (Gunstone, 1999).
I. Sarrera
4
0102030405060708090
100
1961 1970 1980 1990 2000Urtea
Gan
tz e
ta o
lioen
eko
izpe
na
(tona
x10
6 )
1. irudia. Azken hamarkadetan munduan ekoitzitako: animalia-gantz eta landare-koipe eta olioak (FAOSTAT, 2005).
Gantzen eta olioen ekoizpen eta kontsumo handiek azpiproduktu eta
hondakin asko sortzen dituzte. Hondakin hauen artean, almazaretan eta hazi
koipetsuen tratamendu-lantegietan sortutakoak, jatekoak ez diren animalia-
gantzak eta elikagai-industrietan erabilitako landare-olioak aurki daitezke,
ikerlan honetan erabilitakoak aipatutako azken bi mota hauek izanik.
1.1. Jatekoak ez diren animalia-gantzak
Animalia-elikagaiak ekoiztean azpiproduktu ugari sortzen dira,
Ockerman eta Hansen-en (1994) arabera produktuaren hasierako pisutik %50
arte hel daitezkeenak. Izan ere, Europar Batasunean urtean 16 milioi tona
inguru animalia-azpiproduktu sortzen dira (EB, 2004). Azpiproduktu hauek
hainbat motatakoak izan daitezke (proteikoak, koipetsuak,...) eta guztiz
beharrezkoa da haien aprobetxamendua haragi-industriak ekonomikoki
lehiakorrak izateko eta ingurumenaren kutsadura saihesteko. Azpiproduktu
hauek jangarriak edo ez-jangarriak izan daitezke.
I. Sarrera
5
Animalia-azpiproduktu jangarri koipetsuen kasuan, bilgorrak eta
margarinaren ekoizpenean, gozogintzan eta kuzinatzeko erabiltzen diren
hainbat mailatako gantzak ditugu. Jangarriak ez diren gantzak, ezpurutasunak
(odol, hezur edo proteina-hondarrak) dituztenak, hainbat prozesu
industrialetan erabili dira maiz, neumatikoen, labaingarrien eta intsektiziden
ekoizpenean (Ockerman eta Hansen, 1994). Esate baterako, jangarria ez den
bilgorra era industrialean erabili izan da gantz-azido askeen ekoizpenean, gero
beste produktu kimiko eta kosmetiko batzuen ekoizpenerako erabil
daitezkeenak; baita kalitate handiko olio industrialak, xaboiak eta glizerina
ekoizteko ere.
Jangarriak ez direnei dagokienez, orain dela hainbat urte arte, giza-
elikakatean sartzen ez ziren animalia-azpiproduktu ugari animalia-
elikadurarako erabiltzen ziren pentsu eta haragi-irinak ekoitziz. Produktu hauei
gantzak gehitzen zitzaizkien hainbat helburu betetzeko: balio energetikoa
handitzeko, hautsaren ekoizpena saihesteko, kolorea eta testura hobetzeko,
palatabilitatea handitzeko eta granulazioa hobetzeko (Ockerman eta Hansen,
1994). Baina azken urteotan hainbat elikagai-segurtasuneko alarma gertatu eta
gero (Behien Entzefalopatia Espongiformea (BSE), dioxinek eragindako
kutsadura, sukar aftosoa eta txerri-sukarra), animalia-azpiproduktuen erabilera
giza- eta animalia-elikakatetan murriztu da.
1.2. Erabilitako landare-olioak.
Azken urteotan frijitzeko olioen erabilera handitu da, batez ere, etxetik
kanpo gero eta gehiago jaten delako eta “fast food” delako janariaren
kontsumoa ugaldu delako. Frijitutako elikagaiak oso azkar prestatzen dira eta
jaten errazak dira, euren urre-kolorea, testura kurruskaria eta palatabilitate ezin
hobea direla eta (Dobarganes eta lank., 2002). Horregatik, erabilitako landare-
olioaren kantitatea asko handitu da azken denboraldietan. Japonian urtean 400
I. Sarrera
6
tona inguru olio ezabatzen da (Watanabe eta lank., 2001) eta AEBn urtean 3800
milioi litro hondar-olio ekoizten omen dira (Wilson, 2002).
Elikagaiak frijitzean hainbat aldaketa fisiko-kimiko gertatzen dira.
Honen ondorioz, olioaren kalitatea gutxitzen da eta olioaren egitura aldatzen
da. Olioan zerbait frijitzean gertatzen diren erreakzioak 2. irudian laburtzen
dira. Esate baterako, elikagaiak duen hezetasunak olioaren hidrolisia eragiten
du, oxigenoak konposatu oxidatuak sortzen ditu eta tenperatura altuek
eraldaketa termikoa eragiten dute. Prozesu hauek guztiek hainbat eraldaketa
eragiten diete olioei: olioen biskositatea eta dentsitatea handitzen dituzte, pisu-
molekular altuko polimeroak sortzen direlako; kolorea iluntzen da, Maillard
erreakzioak gertatzen direlako; aparra sortzen da, sortutako polimeroen
ondorioz; ultramore absortzioa handitzen da; konposaketa gantz-azidotan
aldatzen da erabili gabeko olioarenarekin alderatuta, gantz-azido intsaturatuen
degradazioaren ondorioz, gantz-azido saturatuen kopurua handitzen delako,
eta azidotasun maila handitzen da, triglizeridoen hidrolisiaren ondorioz
(Dobarganes eta lank., 2002).
Erabilitako landare-olioek arazoak sortzen dituzte udal-sareko ur-
arazketan. Izan ere, oso ohikoa da olioak isurbidetik botatzea, batez ere,
etxekoetatik. Elikagaien industrietan, “catering” enpresatan eta jatetxetan gero
eta ohikoagoa da hondakin hauek biltzea. Enpresa espezializatuek erabilitako
olioak biltzen eta birziklatzen dituzte, araztu ondoren, xaboiak, olio labaingarri
edo jariakin hidraulikoak sortuz (Dorado eta lank., 2002). Honez gain,
ingurumen-arautegi berriak erabilitako olioen bilketaren eta ondorengo
balioztapenaren alde daude. Lehen, hondakin hauek pentsuen ekoizpenerako
eta industria kosmetikorako (xaboiak eta eratorriak sortzeko) erabiltzen ziren.
Orain, berriz, olio hauek aprobetxatzeko bide berriak bilatzen ari dira, adibidez,
biodieselaren sintesia.
I. Sarrera
7
2. irudia. Elikagaiak frijitzean olioan eta janarian gertatzen diren erreakzioen eskema, Quaglia eta lankideek (1998).
I. Sarrera
8
2. HONDAKIN KOIPETSUEN KUDEAKETA
Hondakin koipetsuak bildu eta tratatu ezean, ibaien uretara iristen dira,
ura kutsatuz eta arazo ekologiko larriak sortuz (Canler eta lank., 2001). Ibaietara
iristen den olioak oxigenazioa eta gasen trukaketa ekiditen duen eta uren
arazketa egokia zailtzen duen azaleko geruza fina sortzen du. Honez gain,
olioek eta gantzek hainbat arazo sor dezakete hondar-uren tratamenduetan
(Stoll eta Gupta, 1997):
Olioak eta gantzak likatsuak direnez, estolderia eta hoditeria buxatzeko
joera dute. Halaber, zikinkeria-usainak sortzen dituzte eta hainbat
mikroorganismoren garapena sustatzen dute.
Araztegietara heltzean ur-azalean gelditzen dira geruza moduan eta
hodietara eta hormetara itsasten dira iragazkiak buxatuz. Honez gain, aparrak
sortzen dituzte.
Oxigenoaren transferentzia-koefizientzea murrizten dute.
Lohietan adsorbitutako koipeek lohien materia lehorra gutxitzen dute,
uraren ezabapena zailduz. Honek guztiak lohiaren dekantazioa zailtzen du.
Horregatik guztiagatik, guztiz beharrezkoa da gantzak eta olioak
hondar-uretatik bereiztea, jatorrian biltzea eta tratatzea arazo horiek guztiak
saihesteko.
2.1. Araudia
Indarrean den ingurumen-legeriaren barnean hainbat erregulazio-maila
daude, Europar Batasuneko arautegitik udal-hondakinak kudeatzeko planetara.
Hondakinak kudeatzeko EBko estrategiak hurrengo gaiak nabarmentzen ditu:
Prebentzioa sustatzea (hondakinak sorlekuan gutxitzea).
I. Sarrera
9
Balioztapena sustatzea (birziklapena, berrerabilera eta balioztapen
energetikoa ezartzea).
Ezabapena gutxitzea (esaterako, isurketan behin-betiko ezabapen
optimoa eta kontrol handiagoa sustatzea).
Europar Batasunean ingurumen-legerik garrantzitsuena 156/1991/EB
zuzentaraua, “Hondakinen zuzentaraua”, (DOCE, 1991) da. Bere xedapen
nagusiak honako hauek dira: Definizioak (hondakin etab., 1. artikulua);
hondakin-kudeaketaren printzipioen hierarkia: prebentzioa, balioztapena eta
ezabapen kontrolatua (3. eta 4. artikuluak); behin-betiko ezabatu behar diren
hondakinei aplikatutako hurbiltasun eta autosufizientzia printzipioa eta
hondakinak ezabatzeko instalazioen sare integratuaren sorrera (5. artikulua);
estatuek hondakinen kudeaketa-planak ezarri beharra (7. artikulua); ezabapen
eta balioztapen operazioak egiten dituzten enpresei baimena ematea (9. eta 10.
artikuluak); eta “kutsatzen duenak, ordain dezala” printzipioa (15. artikulua).
Espainian 10/1998 legeak, apirilaren 21ekoak (BOE, 1998), indarrean
ziren testuak batu eta Europako arautegiaren arabera moldatu zituen, gaur
egungo lege-markoa eratuz. Lege honek hondakinen ekoizpena, jabetza eta
kudeaketa zein erregimenera egokitu behar diren ezartzen du. Estatuaren eta
autonomia-erkidegoen arteko eskubimenen banaketa kontuan hartzekoa da.
Izan ere, autonomia-erkidego gehienek euren ingurumen-arautegi propioa
ezarri dute. Euskal Autonomia Erkidegoak 3/1998 legea, otsailaren 27koa,
Euskal Autonomia Erkidegoko ingurugiroa babesten duena (EHAA, 1998),
ezarri zuen. Lege honek hondakinen bilketa selektiboaren sistemen ezarpena
sustatzen du, hondakinen birziklapena edo beste balioztapen modu batzuk, eta
hondakinen balioztatzeko eta berreskuratzeko azpiegituren ezarpena bultzatuz.
Espainiako 10/1998 legetik (BOE, 1998) Ingurumen Ministerioak Hiri-
hondakinen Nazio-plana 2000-2006 (PNRU, Plan Nacional de Residuos
Urbanos, 2000-2006) garatu zuen (Ministerio de Medio Ambiente, 2000). Plan
I. Sarrera
10
honen oinarrizko helburuen barruan hurrengo bi hauek daude: hondakinek
duten materia organikoaren balioztapena (konposta, biometanizazioa, eta beste
energia mota batzuen ekoizpenaren bidez) eta 2006ko abenduaren 31 baino
lehen 1000 biztanle baino gehiago duten herri eta hiri guztietan hondakin
bilketa selektiboa ezartzea. PNRU-k olio eta koipeen bilketa selektiboa
aurreikusten du zenbait baliabideen bidez: edukiontzi espezifikoak jarriz,
sentsibilizazio-kanpainak eginez, eta tratamendu eta birziklapen-enpresekin
akordioak eratuz. Erabilitako olioaren %50 biltzea espero zen 2002 urterako eta
2006rako %80ra iristea aurreikusten da.
PNRU-z gain, 10/1998 legeak udal hondakin-kudeaketa planen garapena
ere aurreikusten zuen. Honen adibidea Gasteizko “Udal hondakinak
kudeatzeko plan integrala” (“Plan Integral de Gestión de Residuos Municipales
de Vitoria-Gasteiz”, PIGRM) dugu. Plan honek lehen aipatu hondakin
balioztapenerako urrats guztiak garatzen ditu eta erabilitako landare-olioak
“Etxeko Hondakin Arriskutsuak (Residuos Peligrosos del Hogar, RPdH)”
multzoaren barruan sailkatzen ditu eta euren bilketa selektiboa ezartzen du.
Hondakin hauen bilketa kamioi baten bidez egiten da, “Puntu Berde
Mugikorra” delakoaren bidez, hain zuzen ere. Kamioi hau hiritik ibiltzen da
etxeko hondakin arriskutsuak bilduz. Hondakin hauek baimendutako
kudeatzaile batek jasotzen ditu. Eredu moduan, 1999n 12.1 tona erabilitako
landare-olio bildu ziren (Vitoria-Gasteizko Udala, 2000: PIGRM, 2000-2006).
Ingurumenari buruzko araudiez gain, elikagaiei buruzko araudiak ere
kontuan hartzekoak dira, batez ere, azpiproduktuei edo hondakinei buruzkoak.
Izan ere, elikagaien segurtasuna bermatzeko hainbat ekimen jarri dira martxan.
Adibidez, “El libro Blanco sobre la Seguridad Alimentaria” (EC, 2000) zeinen
helburua elikagaien arloko Europar Batasunaren araudia berritzeko eta
osatzeko beharrezkoak diren ekintzak deskribatzea baita. Araudia
koherenteagoa, ulergarriagoa eta malguagoa egin nahi da, bere ezartze egokia
bermatzeko eta kontsumitzaileei gardentasun gehiago eskaintzeko, era berean
I. Sarrera
11
elikagaien segurtasun maila handia bermatzeko. Halaber, “Entzefalopatia
espongiforme transmitigarri jakin batzuk prebenitzeko, kontrolatzeko eta
erauzteko xedapenak” 999/2001/EB (DOCE, 2001) eta “Giza-kontsumorako ez
diren animalia-azpiproduktuekiko osasun arauak” 1774/2002/EB (DOCE,
2002) arautegiak onartu dira.
Gaur egun eta 1774/2002/EB (DOCE, 2002) arautegiaren arabera
animalia-azpiproduktuak animalia beraientzako, pertsonentzako edo
ingurumenerako arrisku potentzialen arabera hiru mailatan sailkatzen dira:
1. maila. Hurrengo baldintzetan egon daitezkeen animalia-
azpiproduktuak: Entzefalopatia espongiforme transmitigarriek edo
ikarak jota egon daitezkeenak, debekatutako substantzien hondakinak
izan ditzaketenak (e.b. hazkundearen hormona), edo ingurumenaren
kutsatzaileak izan ditzaketenak (e.b. dioxinak, polifenilo kloratuak).
Hondakin hauek guztiz ezabatu behar dira erraustuz edo lurperatuz,
tratamendu termiko egokia jasan ondoren.
2. maila. Hurrengo baldintzetan egon daitezkeen animalia-
azpiproduktuak: beste animalia-gaixotasun batzuk kutsatuta izan
daitezkeenak, etxaldetan hildako animaliak edota albaitari-hondakinez
kutsatutako edo gaixotasunak prebenitzeko hildako animaliak.
Hondakin hauek hainbat erabileratarako birzikla daitezke (e.b. biogasa,
konposta, produktu oleokimikoak, etab. sortzeko), tratamendu egokia
jasan ondoren.
3. maila. Giza-kontsumorako hildako animalia osasuntsuen
azpiproduktuak. Hondakin hauek pentsuen ekoizpenerako erabil
daitezke onartutako prozesatzeko instalazioetan tratamendu egokia izan
ondoren.
Honen guztiaren arabera, animalia-azpiproduktu koipetsuak industrian
erabili nahi badira, ezin dira 1. mailakoak izan.
I. Sarrera
12
Aipatutako 1774/2002/EB (DOCE, 2002) arautegia, giltza da hildako
animaliak eta giza-elikakatetik baztertutako animalia-materialak ezabatzeko,
baita EBn sortutako animalia-azpiproduktuen prozesatze segururako eta
ezabapenerako ere. Arautegi honen pean, bakarrik albaitarien inspekzioa
gainditu ondoren, giza-kontsumorako egokiak diren animaliak erabil daitezke
pentsuen ekoizpenerako. Honez gain, espezie barneko birziklapena,
kanibalismo delakoa, debekatzen da. Horregatik ere, debekatuta dago frijitzeko
olioak animalia-elikadurarako erabiltzea, animalia-produktuekin kontaktuan
egon zitezkeelako eta ezin denez trazabilitatea bermatu, ezin da ziurtatu
espezie barneko kanibalismoari buruzko araudia beteko denik. Arautegiak oso
argi esaten du baztertutako animalien materialekin zer egin behar eta ahal den,
identifikazio zehatza eta trazabilitate-sistema ezarriz. Esaterako, ezabatuta
izango diren materialak era iraunkorrean markatu behar dira. Horrela
iruzurrak eta desbideratze-arriskuak (baimenduta ez dauden materialak berriro
giza-elikakatera edo pentsuen ekoizpenera sartzea) saihestuko dira. Halaber,
material hauek ezabatzeko metodo alternatibo berriak aurkezten ditu, hala
nola, biogasaren ekoizpena, konposta eta ko-errausketa.
Bestalde, Europako Batzordeak hondakin biologikoei buruzko
zuzentaraua prestatuko duela esan du. Bertan jatetxetan sortutako hondakinak
(“catering”-ekoak) ere arautuko dira. Zuzentarauaren helburua hondakin
hauen erabilera segurua, berreskurapena, birziklapena eta ezabapena, eta gerta
daitekeen kutsaduraren kontrola arautzea da.
3. HONDAKIN KOIPETSUEN BERRERABILERA
Bilgorra antzinatik erabili da larruzko tresnak biguntzeko eta
iragazgaizteko, baita lanparak elikatzeko ere. Honez gain, bilgorraren bidezko
xaboiaren ekoizpena sumeriarren garaikoa da, K.a. 3000n jada xaboi-
I. Sarrera
13
disoluzioak erabiltzen baitzituzten. Hala ere, xaboi solidoa ez zen ezagutu K.o.
800era arte, Italiako Savonan, hain zuzen ere (Salzberg, 1991). Koipeak argia
sortzeko ere erabili izan dira, bai argizari moduan bai kriseiluetan (Ockerman
eta Hansen, 1994).
Gantzen eta olioen erabilera industrialak (teknikoak) ugariak dira,
esaterako, detergente sintetikoak, gomak, margoak eta estaldurak,
elikadurarako gehigarriak, labaingarriak eta metal-babesgarriak ekoizteko
(Uhlig, 1998). Hainbat purutasun-mailatako gantzen eta olioen erabilera
teknikoak xaboien, gantz-azidoen eta glizerolaren ekoizpenean edo industria
kimikorako hainbat esterren sintesian dautza. Gehienetan hurrengo prozesuak
erabiltzen dira: saponifikazioa, hidrolisia eta esterifikazioa.
Betiko produktuez gain, gaur egun hondakin koipetsuetatik produktu
berrien ekoizpena ikertzen ari da, adibidez, biodiesela (aurrerago deskribatuko
den erregai biodegradagarria); ramnolipidoak (Haba eta lank., 2000a), euren
mikrobioen aurkako ezaugarriak aztertu eta frogatu baitira (Haba eta lank.,
2003); eta erabilitako landare-olioak, substratu moduan erabilita jatorri
mikrobianoko lipasa industrialak ekoizteko hartzidura bidez (Haba eta lank.,
2000b).
Halaber, beste prozesu batzuk ikertu dira: hainbat motatako esterren eta
poliesterren sintesia lipasak erabiliz (Linko eta lank., 1998); zetonen sintesi
kimikoa, substratu moduan animalia-gantzen eta koltza-olioaren bidez
ekoitzitako gantz-azidoen esterrak erabiliz (Klimkiewicz eta lank., 2001), edo
polialkoholen esterren ekoizpena animalia- eta landare-koipeak erabiliz
(Gryglewicz eta lank., 2003) labaingarri moduan erabiltzeko. Esterifikatutako
koltza-olioa plastifikatzaile moduan ere erabili izan da plastikoen
prozesamenduan (Wehlmann, 1999). Bestaldetik, Bednarski eta lankideek (1994)
monoglizeridoak ekoitzi zituzten substratu moduan hegazti-gantzak eta
bilgorra eta katalizatzaile moduan Candida lipolytica erabiliz. Honekin lotuta,
I. Sarrera
14
Adamczak eta lankideek (2000) Rhizopus cohnii-ren lipasaren bidez hegazti eta
behi-gantzen hondarren biodegradazioa ikertu zuten GAA lortzeko.
Ikerlan honetan aztertutako bi prozesuak hurrengoak izan ziren: gantzen
eta olioen hidrolisia, gantz-azido askeak eta glizerola lortzeko, eta biodieselaren
sintesia erabilitako landare-olioak erabiliz. Prozesu hauek eta aurrera
eramateko aukerak jarraian deskribatzen dira.
3.1. Hidrolisia
Ohiko metodoa
Gantzen eta olioen hidrolisi osoa, gantz-azido askeak eta glizerola
lortzeko, oso aztertutako prozesua da. Triglizerido gehienak nahiko erraz
hidrolizatzen dira gainberotutako lurruna presiopean, 250 ºC eta 60 bar
(Colgate-Emery metodoa (Gunstone, 1994)), erabiliz. Metodo hau asko
erabiltzen da guztiz optimizatuta dagoelako, ez delako oso garestia eta
hidrolisi-maila altuak (>%98) denboratarte motzetan (ordubete baino gutxiago)
lortzen direlako. Metodo honek dituen desabantailak hurrengoak dira:
Metodo honen bidez lortutako produktuak kalitate baxuko gantz-
azidoak, gantz-azido poliinsaturatuen oxidazioaren ondorioz, eta
glizerolaren ur-disoluzioa dira.
Tenperatura altuek sortutako albo-produktuak ezabatzeko beharrezkoa
da gantz-azido askeen destilazioaren bidezko arazketa.
Honez gain, erreaktore indartuak eta erresistenteak behar dira presio
altuak jasateko, honen ondorioz gastua handitzen da eta energia-kostua
ere altua da.
Energia-kontsumoa eta produktuetan tenperatura altuek eragindako
degradazioa gutxitzeko, azken urteotan lipasek katalizatutako gantzen eta
olioen hidrolisia ikertzen ari da.
I. Sarrera
15
Metodo entzimatikoa
Jada XX. mendearen hasieran akain-belarraren hazien lipasak
katalizatutako olioen hidrolisia ikertu zen (Schmid eta Verger, 1998). Azken
hamarkadetan lipasak erabiliz gantzen eta olioen hidrolisi osoa lor daitekeela
ikusi da. Energia-kontsumoa kontuan hartuz gero, metodo entzimatikoen
garapena bultzatzen da, metodo kimikoek baino energia gutxiago behar baitute
(Ghandi, 1997). Metodo hau ohiko metodoarekin alderatuz gero, hainbat
abantaila aurki daitezke:
Energia-kostu baxuko prozesua da, presio atmosferikoan eta tenperatura
epeletan egin daitekeena (30-50 ºC). Horregatik erreaktoreak ez dira
indartuak izan behar.
Erreakzio-baldintzak direla eta, produktuen kalitate hobea lortzen da.
Honez gain, ez dira albo-produktu kutsakorrik sortzen. Honen ondorioz,
produktuak ez dira araztu behar.
Prozesua abian jartzeko beharrezkoa den hasierako inbertsioa
(erreaktorearen kostua…) askoz txikiagoa da.
Japoniako hainbat enpresak Candida rugosa-ren lipasa erabiltzen dute
liho-hazien olioaren hidrolisirako eta xaboi-hautsa ekoizteko (Kosugi eta lank.,
1988). Hala ere, oraindik badaude trabak industrian egiten diren ohiko prozesu
oleokimikoetan hidrolisi entzimatikoa erabiltzeko. Traba hauetariko batzuk
entzimen prezioa eta erreakzio-denbora luzeak dira. Azken urteotan zelulaz
kanpoko lipasa mikrobianoak ekoizteko aukera sortu da, nahikoa era
ekonomikoan. Honek entzimak industrian erabiltzeko aukera berriak sortu
ditu.
Prozesu entzimatikoa industrian errentagarria izan dadin, hainbat
baldintza bete behar dira:
I. Sarrera
16
Etekin handia lortu behar da, ohiko metodoenarekin alderagarria. Hau
da, hidrolisi-maila handia (%97 inguru) ahalik eta lipasa kantitate
gutxien erabilita.
Lipasak koipea guztiz hidrolizatu behar du. Horretarako glizerolaren
ester-lotura guztiak hidrolizatu behar ditu, hau da, lipasa inespezifikoa
izan behar da.
Lipasaren prezioa arrazoizkoa izan behar da, prozesu osoa ez
garestitzeko.
Hainbat autorek gantz eta olio komertzialen hidrolisi osoa (>%97) lortu
dute Candida rugosa-ren lipasa (Virto eta lank., 1991; de Renobales eta lank.,
1992; Virto eta lank., 1994; Albasi eta lank., 1997), eta C. rugosa-ren eta Mucor
miehei-ren lipasak (Uhlig, 1998) erabiliz. Hala ere, hondar-gantzen eta olioen
hidrolisiari buruzko ikerketa gutxi daude. Bednarski eta lankideek (1994)
hegazti-gantza eta bilgorra substratu moduan erabiliz monoglizeridoak ekoitzi
zituzten Candida lipolítica-ren kultibo baten bidez. Adamczak eta lankideek
(2000) behi eta hegazti-gantzak hidrolizatu zituzten Rhizopus cohnii-ren lipasa
baten bidez.
Hondakin koipetsuen tratamendu entzimatikoak arazoak aurki ditzake,
esaterako, degradazio-produktuek nolabaiteko eragina izan dezakete
erreakzioan. Animalia-gantzen kasuan, oxidazio-erreakzioak gertatzeaz gain,
ehun-hondarrak egon daitezke eta hauek lipasak inhibi edo inaktiba ditzakete,
adibidez, proteasen bidez. Erabilitako landare-olioen kasuan, janaria frijitzean
hainbat degradazio-konposatuak sor daitezke eta hauek entzimen aktibitatean
eragina izan dezakete. Agerbo eta lankideek (1992) arrain-olioen bigarren
mailako auto-oxidazio produktuek glukosa 6-fosfatasa mikrosomialaren
inhibizioa eragiten zutela aurkitu zuten. Hala ere, lipasa pankreatikoak arrain-
olioen polimerizatutako triglizeridoak “in vitro” hidroliza zitzakeela frogatu
zuten, ez-polimerizatutako triglizeridoak baino gutxiago hidrolizatzen bazituen
ere (Henderson eta lank., 1993). Arroyo eta lankideek (1996) lipasa
I. Sarrera
17
pankreatikoak erabilitako landare-olioa hidroliza zezakeela ere ikusi zuten,
nahiz eta olioa frijitzeko behin eta berriro erabili. Horrez gain, Dandik eta
lankideek (1993) usagariaren (Nigella sativa) hazien lipasak katalizatutako
erabilitako olioaren hidrolisia ikertu zuten. Lortutako emaitzen arabera olioaren
degradazio-produktuek ez zutela lipasa inaktibatzen ondorioztatu zen.
3.2. Biodieselaren ekoizpena
ASTM-k (American Society for Testing and Materials) biodiesela era
honetan definitzen du: lehengai koipetsu berriztagarrietatik, animalia-
gantzetatik edo landare-olioetatik, eratorritako kate luzeko gantz-azidoen
monoalkil esterrak. “Bio” aurrizkiak jatorri berriztagarri eta biologikoa
adierazten du, petroliotik ateratako diesel erregaiarekin alderatuta;; “diesela”-k
bere erabilerari, diesel-motorretan, egiten dio erreferentzia. Ordezko erregai
moduan, biodiesela bera bakarrik edo petroliotik eratorritako dieselarekin
nahastuz erabil daiteke (Zhang eta lank., 2003).
Biodieselak, ordezko erregaia den neurrian, abantaila ugari ditu. Erregai
hau herri-barneko baliabide berriztagarrietatik eratorria da. Beraz, petrolio-
erregaien inportazioen menpekotasuna arin zezakeen. Biodiesela
biodegradagarria eta ez-toxikoa da. Petroliotik eratorritako dieselarekin
alderatuz gero, biodieselak errekuntza-isuri profil hobea du, esaterako, karbono
monoxidoaren, gai partikulatuen eta ez-erretako hidrokarburoen isuri baxuak.
Biodiesela erretzean sortutako karbono dioxidoa fotosintesiaren bidez errezikla
daiteke. Modu horretan biodieselaren errekuntzak berotegi-efektuan izan
dezakeen eragina gutxituz (Körbitz, 1999; Agarwal eta Das, 2001). Biodieselak
dieselak baino flash-puntu altuagoa du (150 ºC). Honen ondorioz, ez da hain
hegazkorra eta garraiatzeko edo maneiatzeko seguruagoa da (Krawczyk, 1996).
Honez gain, labaingarria da eta motorren higadura gutxi dezake, motorren
bizia luzatuz (Von Wedel, 1999). Laburbilduz, biodieselaren abantaila hauek
ohiko dieselaren ordezko egokia egiten dute eta bere erabilera bultzatu dute
I. Sarrera
18
lurralde askotan, batez ere, babestu behar diren gunetan, esaterako, AEBko
Yellowstone parke nazionalean (Taberski eta lank., 1999).
Landare-olioak diesel motorretan erregai moduan erabiltzea ez da ideia
berria. Izan ere, diesel motorraren asmatzaileak, Rudolf Diesel-ek, kakahuete-
olioa erabili zuen bere lehen saioetan, 1900ean Paris-eko Mundu-Erakusketan
(Krawczyk, 1996). Hala ere, olioen biskositatea altua dela eta, guztiz
beharrezkoa da olioak eraldatzea erregai moduan erabili ahal izateko. Olioen
biskositatea gutxitzeko hainbat aukera saiatu dira: olioak berotu, gasolioarekin
nahastu, alkoholekin edo esterrekin mikroemultsionatu, alkoholekin
esterifikatu…Aukera hauek guztiek olioen biskositatea gutxitzen badute ere,
landare-olioen ester alkilikoak gasolioarekin alderatuz gero, antzeko
biskositatea dutela ikus daiteke eta honen ondorioz, diesel motorretarako
erregai egokiak izan daitezkeela ondorioztatu da (Ma eta Hanna, 1999).
Biodiesela ekoizteko bide ohikoena transesterifikazioa da, hau da,
koipearen eta alkohol baten arteko erreakzio kimikoa gantz-azidoen ester
alkilikoak (biodiesela) eta glizerola (albo-produktua) emateko. Gehien
erabiltzen den alkohola metanola izaten da, merkeagoa da eta. Oro har,
metanola soberan gehitzen da erreakzioaren oreka esterren ekoizpenerantz
bultzatzeko. Beste alkohol mota batzuk ere erabil daitezke gantz-azidoen
esterrak ekoizteko. Izan ere, ekoitzitako esterren kristalizazio-tenperatura
gutxitzeko eta eguraldi epeleko eta hotzeko gunetan biodieselaren erabilera
bultzatzeko, kate luzera ezberdinak eta adarkadurak dituzten alkoholak erabili
dira esterrak sortzeko (Lee eta lank., 1995; Nelson eta lank., 1996).
AEBko Nekazaritza Saileko txosten baten arabera (USDA, 2003), EBn
azken urteetan olio-hazietatik ekoitzitako biodiesela aintzat hartzekoa da,
koltza-merkatuaren portzentaje garrantzitsua baita. Urtean milioi bat tona
inguru biodiesel ekoitzi ziren 2003n, horretarako 2.7 milioi tona olio-hazi behar
izan zirelarik. Europak ekoizten duen biodieselak gora egin du, 2004n 2 milioi
I. Sarrera
19
tona sortuz (European Biodiesel Board-EBB, 2005). EBko ekoizpen erdia
Alemaniak egiten du, hurrengo ekoizleak Frantzia eta Italia izanik. Hiru
herrialde hauen artean EBko biodieselaren %90 inguru ekoizten dute.
Gantz-azidoen iturri bezala olio eta koipe ugari erabil daitezke (1. taula).
1. taula. Biodiesela ekoizteko erabilitako koipeak.
Substratuak Erreferentziak
Trioleina eta kartamo-olioa Iso eta lank. (2001).
Soja-olioa Kildiran eta lank. (1996); Ban eta lank. (2001, 2002); Kaieda eta lank. (1999, 2001); Matsumoto eta lank. (2001); Samukawa eta lank. (2000).
Koltza-olioa Saucedo (2001).
Soja eta koltza-olioen nahasketak Shimada eta lank. (1999); Watanabe eta lank. (2000).
Ekilore-olioa Antolín eta lank. (2002); Bélafi-Bakó eta lank. (2002); Mittelbach (1990).
Palma-olioaren erdiko frakzioa Basri eta lank. (1997).
Kotoi-olioa Köse eta lank. (2002).
Palma eta koko-olioak (C12) Abigor eta lank. (2000).
Hondar-gantzak
Jantokietatik jasotako erabilitako olioak
Soja-olioa birfintzean sortutako azpiproduktu azidoa
Watanabe eta lank. (2001); Alcántara eta lank. (2000); Leung (2001); Mittelbach eta lank. (1992); Dorado eta lank. (2002); Shimada eta lank. (2002); Zhang eta lank. (2003); Nelson eta lank. (1996); Hsu eta lank. (2001, 2002); Lee eta lank. (2002).
Haas eta lank. (2003).
I. Sarrera
20
Europan, batez ere, koltza-olioa erabiltzen da, AEBn, berriz, soja-olioa
eta ekialdeko lurraldetan bertako olioak erabiltzen dituzte, esaterako, palma-
edo koko-olioak. Biodieselaren ekoizpenak petroliotik ekoitzitako
gasoliorenarekin lehiakorra izateko laguntzak eta zerga-salbuespenak behar
ditu, oso muturreko egoerak izan ezean, hau da, petrolioaren oso prezio altuak
eta landare-olioen oso prezio baxuak. Horregatik oso interesgarria izan daiteke
erabilitako landare-olioen erabilera biodiesela ekoizteko.
Gantz-azidoen ester alkilikoak, biodiesela, sortzeko hainbat aukera
daude: katalizadore azidoak edo basikoak erabiliz, edo lipasak erabiliz. Gaur
egun, industrian aukerarik erabiliena sodio hidroxidoak katalizatutako
transesterifikazio kimikoa da (Ma eta Hanna, 1999).
Metodo kimikoak
Ester metilikoak katalizadore kimikoen bidez sortzeko hainbat aukera
daude (Saucedo, 2001):
a) Olioa metanolarekin transesterifikatzea, katalizadore basikoa (NaOH
o KOH), edo azidoa (H2SO4) erabiliz.
b) Bi urratsetan egindako erreakzioa: Lehenengoa, olioaren hidrolisia,
gantz-azidoak lortuz eta bigarrena, gantz-azidoen esterifikazioa
metanolarekin erreakzio-giro azidoan.
Katalizadore basikoek katalizatutako erreakzioa asko erabiltzen da,
merkea eta azkarra delako, albo-erreakzioak (saponifikazioa) gutxitzen direlako
eta %98ko konbertsioak lortzen direlako. Honez gain, tenperatura ez oso altuak
(30-65 ºC), presio atmosferikoa eta erreakzio-denbora laburrak (ordu batzuk)
erabiltzen dira. Hala ere, erabilitako landare-olioa erabiltzen bada, gantz-azido
askeak eta ura egon daitezke. Kasu hauetan ezin dira katalizadore basikoak
erabili, laginaren saponifikazio partziala gertatzen baita, uraren eta gantz-azido
I. Sarrera
21
askeen ondorioz. Kasu horietarako katalizadore azidoak erabil daitezke, baina
erreakzioa luzeagoa da (Ma eta Hanna, 1999).
Prozesu kimikoen desabantailak hurrengoak dira: glizerola bereiztea
zaila da, erreakzio-produktuak araztu behar dira baita katalizadoren hondarrak
kendu ere (Mittelbach, 1990).
Metodo entzimatikoak
Metodo entzimatikoak metodo kimikoekin alderatuz gero, hainbat
abantaila aurki daitezke:
Erreakzio-baldintzak, erreakzio entzimatiko gehienetan bezala, ez
dira muturrekoak, tenperatura epelak eta presio atmosferikoa
erabili baitaitezke.
Ez dira albo-produkturik sortzen, horregatik glizerolaren
bereizketa askoz errazagoa da (Mittelbach, 1990).
Gastu energetikoa ez da oso altua, erreakzio-baldintzak direla eta.
Katalizadorea erreakzio-girotik bereizteko erraztasuna, batez ere,
lipasa immobilizatuen kasuan
Lipasek katalizatutako biodieselaren sintesia asko ikertu da azken
hamarkadan, lipasarik erabilitakoenak Candida antarctica-ren B lipasa (Shimada
eta lank. 1999; Watanabe eta lank., 2000; Bélafi-Bakó eta lank., 2002; Köse eta
lank., 2002; Du eta lank., 2004), Rhizomucor miehei-ren lipasa (Nelson eta lank.,
1996; Soumanou eta Bornscheuer, 2003 a eta b), Pseudomonas spp.-en lipasak
(Hsu eta lank., 2001 eta 2002; Soumanou eta Bornscheuer, 2003 a eta b) eta
Thermomyces lanuginosa-ren lipasa (Soumanou eta Bornscheuer, 2003 a eta b; Du
eta lank., 2003; Xu eta lank., 2004) izanik. Honez gain, lipasek katalizatutako
biodieselaren sintesia erabilitako landare-olioak erabiliz ere ikertu izan da
(Watanabe eta lank., 2001; Hsu eta lank., 2002; Lee eta lank., 2002), nahiz eta ez
olio komertzialak bezain beste. Horregatik oso interesgarria izan daiteke
I. Sarrera
22
erabilitako landare-olioa erabiltzea biodiesela ekoizteko hainbat lipasa
komertzialak erabiliz eta euren ester metilikoak ekoizteko gaitasuna alderatuz.
4. LIPASAK.
Lipasek (glizerol-ester hidrolasak, EC 3.1.1.3) animalia-, landare- eta
mikrobio-jatorrizko entzima multzoa osatzen dute. Haien funtzio biologiko
nagusia triazilglizerolen hidrolisia katalizatzea da, gantz-azido askeak,
diazilglizerolak, monoazilglizerolak eta glizerola emateko. Erreakzio hau
itzulgarria da, uraren kontzentrazioa oso baxua denean lipasak glizerola eta
gantz-azidoekin triglizeridoen ekoizpena katalizatzen baitu. Lipasen substratu
naturalak azilglizerolak badira ere, beste ester batzuk ere hartzen dituzte
substratu moduan, esaterako, tioesterrak eta amidak (Gandhi, 1997).
4.1. Ezaugarri nagusiak
Lipasak, oro har, 20.000 eta 60.000 Dalton tarteko pisu molekularra duten
glikoproteina azidikoak dira. Lipasa gehienen konposaketaren %2-15
karbohidratoak izan ohi dira, karbohidrato gehiengoduna manosa izanik.
Lipasen aktibitate-espektroa oro har oso zabala da. Bibliografian
aktibitatea garatzeko pH optimoa 4-9 tartean duten lipasak deskribatu dira.
Lipasa mikrobiano gehienen aktibitate optimoa pH 5.6-8.5 tartean ematen da.
Lipasa batzuk aktiboagoak dira erreakzio-giro alkalinoetan (pH > 8) eta
ezaugarri honetaz baliatzen dira enpresak detergenteetan erabiltzeko. Saxena
eta lankideek (2003) Aspergillus carneus-en lipasa alkalinoa araztu eta
karakterizatu zuten. Lipasa honen pH eta T optimoak 9.0 eta 37 ºC izan ziren,
hurrenez hurren. Lipasa egonkorra zen (%85-90eko hondar-aktibitatea) pH 8.0-
10.0 tartean 24 orduz eta 70 ºC-tan 5 minutuz ez zuen aktibitaterik galtzen.
Erreakzio-giro azidoetan aktiboagoak diren lipasak ere aurkitu dira, esaterako
I. Sarrera
23
urdail-lipasa eta lipasa pregastrikoa. Mahadik eta lankideek (2002) Aspergillus
niger NCIM 1207-ren lipasa azidikoa karakterizatu zuten. Lipasa honen
aktibitate maximoa pH 2.5en eta 45 ºC-tan lortzen da eta pH 1.5en ere aktiboa
da (aktibitate maximoaren %75). Honez gain, pH 2.5eko disoluzio indargetzaile
batean 24 orduz eta giro-tenperaturan utzita bere aktibitatearen %70 mantendu
zuen.
Entzima baten tenperatura optimoak bi prozesuen orekarekin dauka
zerikusia: tenperaturak erreakzio-abiadura handitzen du eta era berean
entzimen egitura tridimentsionalaren galera eragiten du (desnaturalizazioa).
Lipasa ugarien tenperatura optimoa 30-40 ºC tartean badago ere, badaude
hainbat lipasa tenperatura altuetan aktiboagoak direnak eta honez gain,
termoegonkorrak direnak, adibidez, Thermomyces lanuginosa-ren lipasa
(Svendsen, 2000).
Triglizeridoak, lipasen substratu naturalak, ez dira uretan disolbagarriak
eta modu naturalean elkartzen dira geruza unimolekularrak, mizelak edo
emultsioak eratzeko urarekin nahasten direnean. Elkarte honen ondorioz,
lipolisia lipido/ura interfasean gertatzen da. Sarda eta Desnuelle-k (1958) esan
zuten bezala, esterasen eta lipasen arteko ezberdintasun nagusia lipasek
garatzen duten interfase-aktibazioa da. Hau da, aktibitate handiagoa dute
substratu emultsionatuekin. Fenomeno honen arrazoia lipasak lipido/ura
interfasean jasaten duen aldaketa konformatzionalean dagoela frogatu da.
Lipasa gehienen gune aktiboa estalki hidrofobiko baten pean dago (Ikus
gezia 3. irudian). Lipolisian aktibazio interfazialak estalkiaren posizio-aldaketa
eragiten du. Honen ondorioz, estalkia irekitzen da eta substratua gune aktibora
hel daiteke. Aktibazio interfaziala lipasen ezaugarria bada ere, badaude
aktibitate lipolitikoa duten entzima batzuk fenomeno hau jasaten ez dutenak,
adibidez, Fusarium solani-ren kutinasa, Pseudomonas aeruginosa-ren lipasa eta
Candida antarctica-ren B lipasa (Villeneuve eta Foglia, 1997). Entzima hauek ez
I. Sarrera
24
dute estalkirik euren egituran eta honen ondorioz ez dute aktibazio
interfazialarik jasaten. Entzima hauek lipasen eta esterasen arteko entzima-
multzo batean egongo lirateke.
3. irudia. Thermomyces lanuginosa-ren (lehen Humicola lanuginosa) lipasaren egitura, Svendsen-en arabera (2000). Geziak gune aktiboaren sarreran dagoen estalkia seinalatzen du.
Lipasen espezifizitatea
Villeneuve eta Foglia-ren (1997) arabera lipasak 5 multzo ezberdinetan
sailka daitezke (2. taula): a) Substratu-espezifizitatea duten lipasak, b) Posizio-
espezifizitatea dutenak (edo regioespezifikoak), c) Espezifizitatea ez dutenak, d)
Gantz-azido espezifizitatea dutenak (edo azilespezifikoak), eta e)
Estereoespezifikoak (edo sn-glizerol-espezifikoak).
I. Sarrera
25
2. taula. Lipasek izan ditzaketen espezifizitateak. Espezifizitatea Lipasa
Substratu-espezifizitatea
Monoglizeridoak Arratoiaren gantz-ehuna
Mono- eta diglizeridoak Penicillium camembertii
Triglizeridoak Penicillium spp.
Regioespezifizitatea
sn-1 eta sn-3
Aspergillus niger
Rhizopus arrhizus
Mucor miehei
sn-2 Candida antarctica A
Ez espezifikoak
Penicillium expansum
Aspergillus spp.
Pseudomonas cepacia
Candida rugosa
GA-ren espezifizitatea
Kate-motzeko gantz-azidoak Penicillium roqueforti
Garai aurreko umeen urdail-lipasa
Hausnarkarien lipasa pregastrikoa
cis-9 intsaturatutako GA Geotrichum candidum
Kate-luzeko intsaturatutako GA Botrytis cinerea
Estereoespezifizitatea
sn-1 Thermomyces lanuginosa
Pseudomonas aeruginosa
sn-3 Fusarium solani-ren kutinasa
Untxiaren urdail-lipasa
Villeneuve eta Foglia (1997).
I. Sarrera
26
a) Substratu-espezifizitatea duten lipasak. Azilglizeridoak lipasen
ohiko substratuak dira. Honen arabera lipasek triglizeridoen ester loturak
hidrolizatzeaz gain, diglizeridoenak, monoglizeridoenak eta fosfolipidoenak
ere hidroliza ditzakete. Substratu-espezifizitatearen definizioa hurrengoa da:
lipasa batek duen gaitasuna bereziki azilglizerol mota bat lehentasunez
hidrolizatzeko. Adibidez, digestioan are-lipasak ez du triglizeridoen hidrolisi
osoa lortzen. Gelditzen diren diglizeridoak monoglizerido bihurtzen dira, baina
monoglizeridoen hidrolisia oso motela da. Triglizeridoak ere landare- eta
mikrobio-lipasa gehienen substratu gustukoenak dira. Hala ere, lipasa gutxi
batzuek glizerido partzialak triglizeridoak baino azkarrago hidrolizatzen
dituzte. Adibidez, Penicillium camembertii–ren lipasa monoglizerido eta
diglizeridoentzat espezifikoa da, triglizeridoekin aktibitate baxua izanik
(Villeneuve eta Foglia, 1997). Zenbait bakterio azido-laktikok ere antzeko
jokabidea erakutsi dute, glizerido partzialak (MG eta DG) triglizeridoak baino
askoz azkarrago hidrolizatuz (Stadhouders eta Veringa, 1973).
b) Posizio-espezifizitatea duten lipasak (edo regioespezifikoak).
Regioselektibitatea lipasek triglizeridoen barruko (ester-lotura sekundarioa) eta
kanpoko (ester-lotura primarioak) posizioak bereizteko duten gaitasuna da.
Triglizeridoen lipolisian, 1,3-regioselektiboak diren lipasek sn-1 eta sn-3 loturak
hidrolizatzen dituzte lehentasunez. Modu horretan, 1,2-DGen eta 2,3-DGen
nahasketa ekimolarra lortzen da eta euren ondorengo hidrolisiak 2-MG ematen
ditu. Txerrien lipasa pankreatikoa 1,3-regioselektiboa da. Espezifizitate mota
hau lipasa batzuetarako deskribatu da, esaterako, Aspergillus niger-ek eta
Rhizopus arrhizus-ek sortutakoak. Benetako sn-2 regioselektibitatea ez da ohikoa,
C. antarctica-ren A lipasa deskribatu da sn-2 espezifikoa den lipasa gutxienetako
bat bezala triglizeridoen hidrolisian (Rogalska eta lank., 1993).
c) Espezifizitatea ez duten lipasak. Lipasa batzuek ez dute ia posizio-
espezifizitaterik eta triglizeridoen ester-lotura guztiak hidrolizatzen dituzte
substratuen gantz-azidoen konposaketa kontuan izan gabe, adibidez,
I. Sarrera
27
Penicillium expansum-en, Candida rugosa-ren eta Aspergillus spp-en hainbat
lipasa.
d) Gantz-azido espezifizitatea duten lipasak (edo azilespezifikoak).
Lipasak gantz-azidoentzat espezifikoak ere izan daitezke, gantz-azido zehatz
batekiko edo sarriago gantz-azido mota batekiko. Lipasa hauek aipatutako
gantz-azido horien esterrak hidrolizatzen dituzte, triazilglizerolean duten
posizioa kontuan izan gabe. Mota honetako lipasarik ikertuena Geotrichum
candidum-ena da. Lipasa hau oso espezifikoa da lehen lotura bikoitza 9-cis
konfigurazioarekin duten gantz-azido intsaturatuekiko. Zenbait jatorritako
lipasa batzuk, Penicillium roqueforti-ren eta hainbat animaliaren urdail-lipasak,
kate motzeko gantz-azidoentzat espezifikoak dira eta oso aktibitate baxua dute
kate luzeko gantz azidoekin.
e) Estereoespezifikoak (edo sn-glizerol-espezifikoak). Espezifizitate
mota hau lipasek triglizeridoen sn-1 eta sn-3 posizioak bereizteko duten
gaitasuna da. Espezifizitate-mota honetako ikerketak nahiko berriak dira eta
giza-mingain lipasek sn-3 estereoespezifizitatea aurkezten dute. Rogalska eta
lankideek (1993) sn-1 esteroespezifizitatea Thermomyces lanuginosa-ren eta
Pseudomonas fluorescens-en lipasetarako eta behi-esnearen lipoprotein-lipasarako
deskribatu dute, eta sn-3 estereoespezifizitatea, berriz, C. antarctica-ren B
lipasarako, txakurren urdail-lipasarako eta F. solani-ren kutinasarako.
Lipasen estereoespezifizitatea konposatu kiralak bereizteko erabiltzen ari
da. Hidrolisi edo sintesi selektiboaren bidez azido edo alkoholen
enantiomeroak bereiz daitezke (Gandhi, 1997).
4.2. Lipasen erabilera industrialak
I. Sarrera
28
Lipasek hainbat erreakzio kataliza ditzakete 4. irudian ikus daitekeenez
eta honen ondorioz erabilera anitz dituzte. Lipasek katalizatutako erreakzioak
bi mailetan sailka daitezke: hidrolisian eta sintesian. Sintesizko erreakzioen
artean esterifikazioa, interesterifikazioa, alkoholisia (honen barruan, industria
oleokimikoan nabarmena den glizerolisia) eta azidolisia, azken hiru erreakzioak
askotan termino bakar baten barruan sailkatzen direnak, transesterifikazioan,
alegia. Era berean, lipasen erabilera industrialak erreakzio hauen arabera sailka
daitezke.
4. irudia. Lipasek kataliza ditzaketen erreakzioak (Vulfson, 1994)
I. Sarrera
29
“Hondakin koipetsuen berrerabilera” atalean (11. orr.) azaldu bezala,
lipasek gantz eta olioen hidrolisia kataliza ditzakete modu industrialean gantz-
azido askeak eta glizerola emateko. Bestaldetik, lipasek ere esterifikazio eta
transesterifikazio erreakzioak kataliza ditzakete ester metilikoak, biodiesela
alegia, ekoizteko. Erabilera hauetaz gain, lipasek ere beste erabilera industrial
batzuk dituzte, aipagarrienak 3. taulan biltzen direnak izanik.
3. taula. Lipasen erabilera industrial nagusiak (Gandhi, 1997).
Prozesua Produktua - erabilera
H
I
D
R
O
L
I
S
I
A
Hidrolisi osoa GAA, glizerola
Detergenteen formulazioetan Orbanak kentzeko
Hondakinen tratamendua Hondakin koipetsuak degradatzeko
Zaporen garapena Gaztak, esnegaina,…
Monoglizeridoen ekoizpena Okintzan, emultsifikatzaileak bai elikagai-gradukoak bai kosmetikoetarako
Erabilera medikoak Digestioa egiten laguntzeko
Hidrolisi selektiboa Nahasketa errazemikoen bereizketa
Gantz-azidoen zatikapena
S
I
N
T
E
S
I
A
Alkoholisia
Lipido estrukturatuak
Biodieselaren ekoizpena
Koipeen ezaugarriak aldatzeko (Interesterifikazioak/Transesterifikazioak)
Zaporeen eta usainen ekoizpena Pisu molekular baxuko esterrak ekoizteko
Esterifikazio selektiboa Nahasketa errazemikoen bereizketa
Gantz-azidoen zatikapena
I. Sarrera
30
Ikerlan honetan taula honetan agertzen diren erabileretatik bi besterik ez
badira ikertu ere, argi dago lipasek erabilera anitz dituztela eta segur aski
etorkizunean ugariago izango direla.
I. Helburuak
31
HELBURUAK
Ikerketa-lan hau INASMET FUNDAZIOAK koordinatutako ENV4-CT98-
0774 proiektu Europarraren barruan kokatzen da eta bere helburua elikagaien
industrietako hondakin koipetsuen entzimen bidezko balioztapena da, batez
ere, hiltegitik jasotako animalia-gantzen eta erabilitako landare-olioen
balioztapena, kontuan izanik indarrean dagoen ingurumen-araudia. Araudi
honek hondakin eta azpiproduktuen ezabapen eta balioztapenaren artean
balioztapena hobesten du.
Tesi honen helburu nagusia elikagaien industrietako hondakin
koipetsuen balioztatzeko proiektuak duen helburu bera da, bereziki hiltegitik
jasotako animalia-gantzen eta erabilitako landare-olioen entzimen bidezko
balioztapena (hidrolisia eta esterifikazioa).
Helburu nagusi hau betetzeko ikerketa-lan honen helburu zehatzak
honako hauek izango dira:
1. Merkatuan dauden zenbait lipasaren aktibitate entzimatikoen aldaketen
azterketa, hidrolisi eta esterifikazio erreakzioen baldintzetan eta lipasa
hauen artean egokienak aukeratzea.
2. Gantz eta olioen hidrolisi maximoa lortzeko erreakzio entzimatikoen
baldintzak ezartzea.
3. Laborategi mailan lortutako hidrolisi emaitzak, maila erdi-pilotoan
egiaztatzea.
4. Gantz-azidoen ester metilikoen ekoizpen maximoa lortzeko, erreakzio
entzimatikoen baldintzak ezartzea.
II. MATERIAL ETA METODOAK
II. Material eta metodoak
35
MATERIALAK
1. GANTZAK ETA OLIOAK
Ikerketa-lan honetan erabilitako hondakin koipetsuak bi motatakoak
izan ziren. Alde batetik, hiltegietatik jasotako animalia-gantzak, eta bestaldetik,
erabilitako landare-olioak. Halaber, gantz eta olio komertzialak substratu-eredu
moduan erabili ziren aktibitate entzimatikoko entseguak egiteko.
1.1. Hondar-gantzak
Lagin guztiak, Frantziako hiltegietatik jasotakoak, Inasmet Fundazioak
(Donostia) bidali zizkigun. Gantzak marroi-ilun kolorekoak eta usain bortitz eta
ezatseginekoak ziren. Giro-tenperaturan solidoak ziren. Hasierako hidrolisi-
erreakzioak tratatu-gabeko gantzarekin, hiltegitik jaso bezala, egin baziren ere,
ondorengo laginak Inasmet Fundazioak azidoekin garbitu ondoren jaso
genituen. Garbiketa hidrolisi-erreakzioetan arazoak sor zitzaketen konposatuak
ezabatzeko egin zen. Garbiketaren ondorioz, jasotako gantzak garbiketaren
hondar-ura (pH 5) zekarren, laginaren %30 (b:p) inguru.
1.2. Erabilitako landare-olioak
Bi jatorri ezberdineko frijitzeko olioak erabili ziren. A olioa elikagai-
industria batekoa zen eta azidoekin garbitu zuten, hondar-gantzen moduan,
Inasmet Fundazioan. Kasu honetan hondar-ur gutxi zegoen eta gainera
ontziaren beheko aldean gelditu zen. Olioa hori-ilun kolorekoa zen eta giro-
tenperaturan ez zen guztiz gardena, baina tenperatura igotzean garden
gelditzen zen. B eta C olioak Arabako Campuseko jantokitik (UPV-EHU,
Vitoria-Gasteiz) jaso ziren. Biak likidoak eta gardenak ziren, anbar kolorekoak.
Olio hauek hondar solidoak kentzeko iragaztea izan ezik, tratamendurik gabe
erabili ziren.
II. Material eta metodoak
36
1.3. Gantz eta olio komertzialak
Oliba-olioa, gehienezko azidotasuna 0.4º, Aceites Coosur, S.A. (Jaén).
Ekilore-olioa, gehienezko azidotasuna 0.2º, Aceites Coosur, S.A. (Jaén).
Birfindutako hazi-olioa azido oleikoz aberastua (Frijiontzietarako
berezia), gehienezko azidotasuna 0.2º, Koipe, S.A. (Jaén).
Txerri iberikoaren gantza, Campofrío, S.A. (Madril).
Koipe hauek guztiak Gasteizko dendetan erosi ziren.
2. LIPASAK
2.1. Hidrolisi-erreakzioak
Ikerketa-lan honetan erabilitako lipasak mikroorganismoek ekoitzitakoak
ziren eta entzima-enpresek hidrolisi-erreakzioetarako gomendatutakoak izan
ziren.
Erabilitako lipasak hauek izan ziren:
1. Candida rugosa-ren, lehen Candida cylindracea-ren, prestakin
entzimatikoak (lipasa inespezifikoa):
Meito Sangyo Co., Ltd.-ren OF® Lipasa (Japonia)
Biocatalysts Ltd.-ren Lipomod 34PTM (Britainia Handia)
2. Thermomyces lanuginosus-en, lehen Humicola lanuginosa-ren, prestakin
komertzialak (triglizeridoen sn-1 eta sn-3 posizioetarako espezifikoak):
Novo Nordisk-en LipolaseTM 100L (Danimarka). Detergenteetan
erabiltzeko diseinatua. Lan egiteko pH-rik egokiena 8 eta 11 tartean
dago. Prestakin likidoa da. (B434 fitxa, Novo Nordisk, 1999a).
II. Material eta metodoak
37
Novo Nordisk-en LipopanTM BG (Danimarka). Okintzan erabilitako
prestakin entzimatikoa (Novozym 677, B986c-GB fitxa, Novo
Nordisk, 1999b).
3. Humicola insolens-en prestakin komertziala (triglizeridoen sn-1 eta sn-3
posizioetarako espezifikoa):
Novo Nordisk-en Novo 398TM (Danimarka). Lan egiteko pH-rik
egokiena 6 eta 11 tartean dauka. Prestakin likidoa da (B 470c-GB fitxa,
Novo Nordisk, 1999c).
4. Candida antarctica-ren A lipasaren prestakin komertziala (ez du posizio
espezifitaterik):
Novo Nordisk-en Novo 868TM (Danimarka), prestakin likidoa da.
2.2. Esterifikazio-erreakzioak
Atal honetan erabilitako lipasak Novozymes-ek bidalitakoak ziren.
Guztiak lipasa immobilizatuak ziren.
Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei). Lipasa honek esterifikazio eta
interesterifikazio erreakzioak katalizatzen ditu. Oso erabilgarria da
triglizeridoen sn-1 eta sn-3 loturen arteko interesterifikazio erreakzioetan.
Jatorrizko lipasa Rhizomucor miehei-rena da eta bere euskarria truke anionikoko
erretxina makroporosoa da. Lan egiteko tenperatura 30-70 ºC tartean dago. Bere
aktibitatea neurtzeko azidolisi entsegua erabiltzen da, azido dekanoikoaren eta
ekilore-olioaren arteko erreakzioa, olioaren sn-1 eta sn-3 posizioetan gehitutako
azido dekanoikoa neurtuz (BAUN, hau da, Batch Acidolysis Units Novo) (347d-
GB fitxa, Novo Nordisk, 2000a).
Lipozyme TL IM (T. lanuginosus). Lipasa hau elikagai-graduko koipe eta
olioen interesterifikazio erreakzioetarako diseinatuta dago, oso erabilgarria
baita triglizeridoen sn-1 eta sn-3 loturen arteko interesterifikazio erreakzioetan.
Jatorrizko lipasa Thermomyces lanuginosus-ena da eta bere euskarria silika
II. Material eta metodoak
38
granulatua da. Lan egiteko tenperaturarik egokiena 55-70 ºC tartean dago. Bere
aktibitatea neurtzeko interesterifikazio entsegua erabiltzen da soja-olioa eta
guztiz hidrogenatutako soja-olioaren arteko interesterifikazio erreakzioa
neurtuz (IUN, hau da, Interesterification Unit Novo) (1276b-GB fitxa, Novo
Nordisk, 2000b).
Novozym 435 (Candida antarctica-ren B lipasa). Lipasa termoegonkor
baten prestakin entzimatikoa da. Esterrak eta amidak ekoizteko erabiltzen da.
Substratu espezifitate zabala dauka, hau da, azido karboxiliko eta alkohol
ugarien arteko erreakzioak katalizatzen ditu. Jatorrizko lipasa Candida
antarctica-ren B lipasa da eta bere euskarria erretxina makroporoso akrilikoa da.
Substratuaren araberako posizio espezifizitatea izan dezake. Aktibitaterik
handiena 70-80 ºC tartean lor dezake, baina inaktibazio termikoa dela eta 40-
60 ºC tartean lan egitea gomendatzen da. Bere aktibitatea neurtzeko azido
laurikoaren eta propanolaren arteko erreakzioa erabiltzen da propil-lauratoren
ekoizpena neurtuz (PLU, hau da, Propyl Laurate Units) (B606d-GB fitxa, Novo
Nordisk, 2000c).
3. ERREAKTIBO ETA DISOLBATZAILEAK
Erabilitako erreaktibo eta disolbatzaile guztiak HPLC kalitatezkoak ziren
eta bestelako arazketarik gabe erabili ziren.
II. Material eta metodoak
39
METODOAK
1. GANTZ ETA OLIOEN KARAKTERIZAZIOA
1.1. Azidotasun indizea (AI)
I.U.P.A.C.-en II.D.1. metodoa (1979) erabili zen.
Gramo batek koipe dituen gantz-azido askeak neutralizatzeko
beharrezkoak diren potasio hidroxidoaren miligramoak dira.
Koipea 115 ºC-tan lehortu zen, 5 0.01 g koipe pisatu, 25 mL isopropanol
eta tanta batzuk fenoftaleina (%1 etanolean, p:b) gehitu eta nahasketa berotu
zen koipea ondo disolbatzeko. Koipea behin disolbatuta, eta artean bero
zegoela, potasio hidroxidoarekin (0.5 N isopropanolean) baloratu zen
adierazlearen kolorea aldatu arte.
Azidotasun indizea formula honen bidez lor daiteke:
mBNAI
1.56
Non, 56.1 potasio hidroxidoaren pisu molekularra baita, B erabilitako
potasio hidroxidoaren mililitroak baitira, N potasio hidroxido disoluzioaren
normalitatea baita, eta m laginaren pisua, gramotan, baita.
1.2. Saponifikazio Indizea (SI)
I.U.P.A.C.-en II.D.2 metodoa (1979) erabili zen.
II. Material eta metodoak
40
Gramo bat koipe saponifikatzeko behar diren potasio hidroxidoaren
miligramoak dira. Koipea potasio hidroxidoarekin saponifikatu eta soberan
gelditzen den potasio hidroxidoa azido batekin baloratuz lortzen da indize hau.
Koipea 115 ºC-tan lehortu zen, 5 0.01 g koipe pisatu eta 25 mL
isopropanol, tanta batzuk fenoftaleina (%1 etanolean, p:b) eta 40 mL potasio
hidroxido (0.5 N isopropanolean) gehitu ziren. Nahasketa 30 minutuz berotu
zen, errefluxupean, eta soberan gelditzen zen potasio hidroxidoa H2SO4 0.5 N
disoluzio batekin baloratu zen adierazlearen kolorea desagertu arte.
Saponifikazio indizea formula honen bidez lor daiteke:
mBBNSI )(1.56 10
Non, 56.1 potasio hidroxidoaren pisu molekularra baita, B0 gehitutako
potasio hidroxido 0.5 N-ren mililitroak baitira, B1 erabilitako azido
sulfurikoaren mililitroak baitira, N azido sulfuriko disoluzioaren normalitatea
baita, eta m laginaren pisua, gramotan, baita.
1.3. Hidrolisi-maila
Aurreko bi indizeak behin neurtuta, lagin baten hidrolisi-maila formula
honen bidez lor daiteke:
100(%) SIAImailaHidrolisi
Non, hidrolisi-maila (%) mol GAA/ 100 mol GAT baita.
II. Material eta metodoak
41
1.4. Konposaketa gantz-azidotan
Gantz eta olioen konposaketa gantz-azidotan aztertzeko gantz-azido
guztiak metil ester bihurtu ziren boro trifluoruroa (BF3) metanolean erabiliz eta
lortutako esterrak gas-kromatografiaren bidez neurtuz, Hamilton eta lankideek
(1992) azaldu bezala.
Tapoi hariduneko hodietan 10 mg gantz edo olio pisatu, 2 mL KOH (%5
metanolean, p:b) gehitu eta harea-bainuan utzi ziren, 90-100 ºC-tan 5-10 minutu,
olio tantak desagertu arte. Hodiak giro tenperaturan utzi, 2mL BF3 metanolean
(%14 p:b, Sigma) gehitu eta berriro harea-bainuan utzi ziren, 90-100 ºC-tan 5
minutu. Hodiak giro tenperaturatan utzi eta 2 mL ur-distilatu gehitu ziren.
Ekoitzitako metil esterrak (ME) 3 mL hexano erabiliz erauzi ziren. Disoluzio
honen mikrolitro bat injektatu zen gas-kromatografoan, Hewlett-Packard (Palo
Alto, Kalifornia, AEB) 5890 Series II. Kromatografo honek sugar-ionizaziozko
detektorea (FID-GC) zuen eta esterrak bereizteko HP-FFAP zutabea (Agilent
Technologies, AEB) erabili zen, elkargurutzatutako polietilenglikolezkoa (25 m
x 0.32 mm b.d.; geruzaren lodiera 0.52 m) gantz-azidoen metil esterrak eta
gantz-azido askeak bereizteko egokia zena. Gas-eramailearen (Helioaren)
fluxua 2 mL/min-koa izan zen, eta labearen tenperatura horrela programatu
zen: 60 ºC-tatik 150 ºC-tara 10 ºC minutuko, 150 ºC-tatik 240 ºC-tara 3 ºC
minutuko, 240 ºC-tan 10 minutu mantenduz. Injektorearen eta detektorearen
tenperaturak 325 ºC eta 275 ºC izan ziren, hurrenez hurren. Erabilitako “split”
1:10 izan zen. Metil esterrak identifikatzeko ezagututako patroien erretentzio
denborak erabili ziren. Kuantifikazioa konposatuen tontorren azaleraren
ehunekoan kalkulatu zen, konposatu guztien azalerak kontuan izanda. Datuak
HP ChemStation (rev 02.04) programarekin analizatu ziren.
1.5. Hondakin koipetsuen lipidoen determinazioa
Lipido-mota ezberdinak (TG, DG, MG, GAA...) geruza-fineko
kromatografiaren bidez banandu ziren Henderson eta Tocher-ek (1992) azaldu
II. Material eta metodoak
42
bezala. Gantza edo olioa 100 L dietil eterrean disolbatu eta kapilare baten
bidez silika-gel plaka batean (Silica gel 60, lodiera 0.5 mm, 20x20 cm, Merck,
Alemania) aplikatu zen. Laginez gain, kolesterolaren, trioleinaren, lezitinaren,
azido oleikoaren eta kolesterol-esterren disoluzio patroiak ere aplikatu ziren.
Plakaren garapena aurrera eramateko plaka fase higikorraz saturatutako kubeta
kromatografiko batean sartu zen. Fase higikorra hexano: dietil eter: azido
formiko (80:20:1; b:b:b) nahasketa zen eta plaka bi aldiz garatu zen. Behin
laginak bananduak, plaka Rodamina G metanolean (%0.05, p:b, Sigma)
disoluzioarekin busti zen eta banandutako lipidoak argi ultramorepean ikusi
ziren. Lipidoak lehen aipatutako patroien Rf-ekin alderatuz identifikatu ziren.
2. LIPASEN KARAKTERIZAZIOA
2.1. Aktibitate lipolitikoaren determinazioa
Aktibitate lipolitikoa neurtzeko entsegu entzimatiko etenak egin ziren
oliba-olioa substratu-emultsifikatu moduan erabiliz. Bi entsegu ezberdin erabili
ziren, emultsio ezberdinak eginez. Ikerketa-lan honen hasieran Virto eta
lankideek (1994) deskribatutako metodoa erabili zen, baina OF lipasaren
aktibitatea egiaztatu nahi izan zenean Meito-Sangyok aitortutako aktibitatea
baino emaitza baxuagoak lortu ziren. Horregatik, Meito-Sangyok bere lantegian
aktibitate lipolitikoa neurtzeko erabiltzen zuen metodoa bidali zigun.
A metodoa
Hau Meito-Sangyo-k bidalitako metodoa eta Naka-k (1987)
deskribatutakoa zen. Substratuaren emultsioa polibinil-alkoholak
emultsifikatzaile moduan erabiliz egin zen. Hirurogeita hamabost mL polibinil-
alkoholen disoluzioa (18.5 g Poval 117 eta 1.5 g Poval 205 (Kuraray Co., Ltd.
(Japonia) litro bat ur-distilatuan) eta 22.9 g oliba-olio nahastu ziren Polytron®
PT-K (PCU-8, Kinematika AG, Suitza) homogeneizagailu batean, 5 minutuko 2
II. Material eta metodoak
43
zikloetan, 11000 rpm-eko abiaduran, tartean 5 minutuko geldialdia eginez.
Horrela egindako emultsioa izotz-bainu batean utzi zen, gutxienez ordubete,
erabili baino lehen.
Entsegu entzimatikoak 50 mL-ko tapoi-esmerilatuzko erlenmeyer
matrazetan egin ziren. Bertan 5 mL oliba-olio emultsio eta 4 mL fosfato 0.1 M
(pH 7.0) disoluzio indargetzaile nahastu eta 10 minutu utzi ziren 37 ºC-tan ur-
bainu batean. Nahasketa honi mililitro bat lipasaren disoluzio (0.01 mg/mL)
gehitu zitzaion, 15 segundu irabiatu eta 37 ºC-tako ur-bainuan sartu zen. Hogei
minutu pasa eta gero, erreakzioa gelditzeko 20 mL azetona-metanol (1:1; b:b)
eta 5 tanta fenoftaleina gehitu ziren pixkanaka. Behin hau eginda askatutako
gantz-azidoak baloratu ziren NaOH 0.05 M-ekin, kontuan harturik erabilitako
mol bat NaOH eta erreakzio-nahasketan zegoen mol bat gantz-azido
baliokideak zirela. Erreakzioaren zurizko saiakuntza egiteko 5 mL oliba-olio
emultsio, 4 mL fosfato 0.1 M (pH 7.0) disoluzio indargetzaile eta 20 mL
azetona:etanol nahastu ziren eta gero mililitro bat disoluzio entzimatiko gehitu
zen. Entsegu bakoitza 3 aldiz egin zen.
B metodoa
Virto eta lankideek (1994) deskribatutako metodoa da eta emultsioa behi-
seroalbumina emultsifikatzaile moduan erabiliz prestatu zen.
Oliba-olioa, potasio fosfato 0.1 M pH 7.0 disoluzio indargetzailea eta
behi-seroalbumina (BSA, %0.01 (p:p) gantz-azido baino gutxiagokoa, Sigma)
25 mg/mL disoluzio indargetzaile berean prestatuta nahastu ziren. Emultsioa
prestatzeko honako proportzioak erabili ziren: oliba-olio: BSA disoluzio:
disoluzio indargetzaile (1:1:2.7; p:b:b). Nahasketa 25 mL-ko prezipitatu-ontzi
batean jarri eta sonikatu zen (MSE Soniprep 150 sonikadorea, SANYO, Japonia)
3 minutuz, 20 segundoko sonikazio zikloekin eta 10 segundoko geldialdiekin.
II. Material eta metodoak
44
Saio-hodi batean mililitro bat substratu emultsio eta 0.9 mL fosfato 0.1 M,
pH 7.0 disoluzio indargetzaile, nahastu ziren. Erreakzio-nahasketa, entzimarik
gabe, 37 ºC-tako ur-bainu batean utzi zen 5 minutu. Erreakzioa hasteko entzima
(0.1 mL disoluzio entzimatiko, 1.0 mg/mL) gehitu zen. Hamar minutu pasa eta
gero, erreakzioa gelditzeko 5 mL geldiera-nahasketa, isopropil alkohol: hexano:
H2SO4 (0.2 M) (40:20:1, b:b:b), gehitu ziren. Erreakzio-produktuak erauzteko 3
mL ur-distilatu eta 3 mL hexano erabili ziren. Nahasketa irabiatu ondoren, fase
organikoaren (goiko fasearen) 2 mL hartu ziren eta potasio hidroxidorekin (0.01
M isopropanolean) baloratu ziren. Erabilitako mol bat KOH eta erreakzio-
nahasketan zegoen mol bat gantz-azido baliokideak zirela kontuan hartu
behar da. Erreakzioaren zurizko saiakuntza egiteko mililitro bat oliba-olio
emultsio, 0.9 mL fosfato disoluzio indargetzaile eta 5 mL geldiera-nahasketa
nahastu ziren eta gero 0.1 mL disoluzio entzimatiko gehitu zen. Entsegu
bakoitza 3 aldiz egin zen.
Aurreko bi kasuetako lipasa-aktibitatea modu berean definitzen da: mol
bat gantz-azido minutuko askatzen duen entzima kantitatea, metodo
bakoitzean adierazten diren baldintzetan.
pH-ren eragina lipasen aktibitatean neurtzeko erabilitako fosfato
disoluzio indargetzailearen pHa aldatu zen (5, 6, 7 eta 8), bestelako baldintzak
era berean utziz.
Tenperaturaren eragina lipasen aktibitatean neurtzeko erreakzioaren
tenperatura aldatu zen, ur-bainuaren tenperatura 25-50 ºC tartean aldatuz, eta
erreakzioaren bestelako baldintzak era berean utziz.
Lipasen egonkortasuna hurrengo baldintzetan aztertu zen:
pH-aren eragina lipasen egonkortasunean aztertzeko lipasen
disoluzioak hainbat pHtako fosfato disoluzio indargetzailetan
II. Material eta metodoak
45
(250 mg/mL inguru, pH 5-7 tartean) mantendu ziren. Disoluzio
bakoitza beratzen utzi zen 37 ºC-tan ur-bainu batean 24 orduz.
Denbora tarte zehatzetan laginak hartu eta gelditzen zen
aktibitatea neurtu zen.
Tenperaturaren eragina lipasen egonkortasunean aztertzeko
lipasen disoluzioak (250 mg/mL inguru, fosfato disoluzio
indargetzailean pH 7.0) beratzen utzi ziren 24 orduz hainbat
tenperaturatan (25-45 ºC-tan) zeuden ur-bainuetan. Denbora tarte
zehatzetan laginak hartu eta gelditzen zen aktibitatea neurtu zen.
2.2. Esterifikazio aktibitatearen determinazioa
Esterifikazio aktibitatea neurtzeko Novozymes-ek (Madril) bidalitako
SM0342 (Novo Nordisk, 2000d) metodoa egokitu zen. Azido laurikoaren eta 1-
propanolaren arteko erreakzioa erabili zen propil-lauratoren ekoizpena neurtuz
(PLU, hau da, Propyl Laurate Units), jarraian adierazitako baldintzak jarraituz.
Hodi batean substratuak, azido laurikoa (200.3 mg) eta 1-propanola
(75 L), proportzio estekiometrikoetan (1:1, mmol:mmol) eta substratuak
disolbatzeko 4 mL hexano gehitu ziren. Hodiak 30 ºC-tan zegoen eta irabiatze
orbitala zuen ur-bainu batean (Selecta® Unitronic OR) sartu eta 10 minutu utzi
ziren, substratuak ondo nahasteko eta erreakzio-tenperaturara egokitzeko.
Erreakzioa hasteko 10 mg inguru lipasa immobilizatu gehitu ziren. Hogei
minutu pasa eta gero 5 L-ko laginak hartu eta mililitro bat hexanon disolbatu
ziren. Erreakzio-nahasketa gas-kromatografiaren bidez analizatu zen.
Erabilitako gas-kromatografoa eta zutabea lehen (ikus 41. orr.) aipatutakoak
izan ziren. Gas eramailearen (Helioaren) fluxua 2 mL/min izan zen eta labe-
tenperatura 50 ºC-tan 2 minutu izan eta gero, 240 ºC-tara igo zen 25 ºC/min eta
han 10 minutu mantendu zen. Injektore eta detektorearen tenperaturak 325 ºC
eta 275 ºC izan ziren, hurrenez hurren. Propil-lauratoaren kuantifikazioa
II. Material eta metodoak
46
egiteko aurretik kanpo-patroiaren metodoaren bidezko kalibrazioa egin zen,
propil-laurato eta azido laurikoaren kantitate ezberdinak injektatuz eta
tontorren azaleran oinarrituz.
Propil-laurato esterifikazio-aktibitatearen unitatea (PLU) mol bat
propil-laurato minutuko ekoizten duen entzimaren kantitatea da, adierazitako
erreakzio-baldintzetan.
Tenperaturaren eragina esterifikazio-aktibitatean aztertzeko erreakzioak
30-80 ºC-tan zeuden ur-bainutan egin ziren.
Substratu inhibizioa ikertzeko zenbait entsegu egin ziren 1-propanol
erabili ordez metanola eta kate-luzera ezberdineko gantz-azidoak erabiliz. Izan
ere, biodiesela ekoiztean metanola erabili zen eta erabilitako landare-olioen
gantz-azido gehienak kate-luzekoak ziren. Substratuen kontzentrazioaren
eragina ikertzeko substratu baten kontzentrazioa finkoa mantentzen zen
bitartean, bestearena aldatzen zen. Horrela, metanolaren eta gantz-azidoen
arteko erreakzioak egiteko ikertutako kontzentrazioak hauek izan ziren:
Lipasa guztiak erabiliz, metanolaren eragina ikertzeko, C12ren
kontzentrazioa aldatu gabe (250 mM),
o Metanola: 37.5, 75, 125, 187.5, 250, 312.15, 375, 437.5 eta 500
mM
Lipasa guztiak erabiliz, gantz-azidoen eragina ikertzeko,
metanolaren kontzentrazioa aldatu gabe (250 mM),
o Azido butirikoa (C4): 62.5, 125, 250, 375 eta 500 mM
o Azido laurikoa (C12): 6.25, 12.5, 25, 37.5, 75, 125, 187.5, 250,
312.15, 375, 437.5 eta 500 mM
o Azido oleikoa (C18:1) : 62.5, 125, 250, 375 eta 500 mM
Novozym 435 erabilita, metanolaren eta C12ren arteko
erreakzioaren mekanismoa ikertzeko, substratu bien
II. Material eta metodoak
47
kontzentrazioen eragina aztertu zen (37.5, 75, 125, 187.5, 250,
312.15, 375, 437.5 eta 500 mM).
Lipasen egonkortasuna ikertzeko entsegu guztietan lipasek beraiek
katalizatutako erreakzioaren substratu edota produktu izan daitezkeen
likidoetan (olioan, ester metilikoen nahasketa batean eta metanolean) beratzen
utzi ziren hainbat denbora tartetan, gero gelditu zitzaien aktibitatea neurtu
zelarik.
Tenperaturaren eragina egonkortasunean aztertzeko 3 lipasak
aldez aurretik 60 ºC-tan lehortutako eta sodio sulfato anhidroaren
zehar pasatutako ekilore-oliotan beratzen utzi ziren hainbat
tenperaturatan (30, 40, 50 eta 60 ºC) 24 orduz. Laginak denbora
tarte ezberdinetan hartu, n-hexanorekin garbitu eta N2-pean
lehortu ziren giro-tenperaturan. Gelditzen zitzaien aktibitatea
lehen azaldutako esterifikazio metodoaren (PLU/g) bidez neurtu
zen.
Metanolaren eragina lipasen egonkortasunean ikertzeko lipasak
metanolean (0.5 mL) beratzen utzi ziren 30 ºC-tan. denbora tarte
ezberdinetan (15, 30, 60, 120 eta 240 minututan) laginak hartu, n-
hexanorekin garbitu eta N2-pean lehortu ziren giro-tenperaturan.
Gelditzen zitzaien aktibitatea lehen azaldutako esterifikazio
metodoaren (PLU/g) bidez neurtu zen.
Ester metilikoen eragina egonkortasunean aztertzeko lipasak
aldez aurretik 60 ºC-tan lehortutako eta sodio sulfato anhidroaren
zehar pasatutako kate luzeko ester metilikoen nahasketa batean
beratzen utzi ziren 30 ºC-tan. Hainbat denbora tartetan (2, 4, 6 eta
24 ordu) laginak hartu, n-hexanorekin garbitu eta N2-pean lehortu
II. Material eta metodoak
48
ziren giro-tenperaturan. Gelditzen zitzaien aktibitatea lehen
azaldutako esterifikazio metodoaren (PLU/g) bidez neurtu zen.
3. HIDROLISI ERREAKZIOAK
Animalia-gantzak erabili baino lehen zeukaten hondar-ura kendu
zitzaien. Horretarako laginak urtu eta geldi utzi ziren bi fase banandu arte,
goikoa koipetsua eta behekoa urtsua.
Hidrolisi-erreakzio guztietan erabilitako fase urtsua kanilako ura izan
zen.
3.1. Laborategiko erreaktoreak (0.5 L)
Laborategian eginiko hidrolisi-erreakzio arruntak litro bateko ontzietan
egin ziren, 500 mL-ko erreakzio-bolumena erabiliz (5a. irudia). Erreakzio-
nahasketa prestatzeko beharrezkoa zen animalia-gantza (45 ºC-tan urtua) edo
olioa, erreakzio-nahasketan nahi zen koipe proportzioaren arabera (10:90; 25:75;
50:50; 60:40; 75:25, p:b), pisatu eta urarekin nahastu zen 360 rpm-ko abiadura
erabiliz (Heidolph RZR 1 motorrak (Alemania), 5b. irudia), aztertutako
entseguaren tenperaturan (25–40 ºC-tako tartean) emultsioa lortu arte. Orduan
kasu bakoitzean beharrezkoa zen entzimaren kantitatea gehitu zen uretan
disolbatuta irabiaketa mantenduz. Denbora tarte zehatzetan laginak hartu (50
mL inguru) eta 80 ºC-tan zegoen ur-bainu batean sartu ziren, faseak banantzeko
eta entzima inaktibatzeko. Ondoren fase koipetsua (goikoa) hartu zen eta
hidrolisi-maila azidotasun indizea (AI) neurtuz zehaztu zen. Esperimentu
bakoitza bi aldiz egin zen.
II. Material eta metodoak
49
5. irudia: a) Laborategian erabilitako erreaktoreen argazkia, b) Irabiagailuaren xehetasuna.
3.2. Bost litroko erreaktorea
Hidrolisi-erreakzio batzuk bost litroko beirazko termostatizatutako
erreaktore batean (Afora, Espainia) egin ziren (6a. irudia). Erreaktore honetan
erabilitako landare-olioen hidrolisi-erreakzioak egin ziren, erreakzioaren
baldintzak honako hauek izanik: olio:ura proportzioa 50:50 (p:b), OF lipasaren
180 U /g olio, 360 rpm-ko irabiatzea (6b. irudia). Erreakzioak 25 ºC-tan egin
ziren.
Zehaztutako denboratan (1, 3, 5, 7 eta 24 ordu) laginak (50 mL) hartu eta
80 ºC-tan zegoen ur-bainu batean sartu ziren, faseak banantzeko eta entzima
inaktibatzeko. Ondoren fase koipetsua (goikoa) hartu zen eta hidrolisi-maila
azidotasun indizea (AI) neurtuz zehaztu zen.
a) b)
II. Material eta metodoak
50
6. irudia: a) 5 litroko erreaktorea barruan erabilitako olioaren emultsioa duelarik, b) Laborategiko eta bost litroko erreaktoreen irabiagailuen arteko konparaketa.
3.3. Berrogei litroko erreaktorea
Hiltegitik jasotako animalia-gantzen hidrolisirako 40 L-ko
termostatizatutako erreaktorea erabili zen (7a. irudia). Erreakzio-baldintzak:
355 rpm-ko irabiatzea (7b. irudia), 32º C, OF lipasa 180 U/g gantz eta
gantza:ura proportzioa 50:50 (p:b).
Zehaztutako denbora tartetan (3, 7, 21.5, 24, 28 eta 48 ordu) 2 lagin (50
mL) hartu eta 80 ºC-tan zegoen ur-bainu batean sartu ziren, faseak banantzeko
eta entzima inaktibatzeko. Ondoren fase koipetsua (goikoa) hartu eta hidrolisi-
maila azidotasun indizea (AI) neurtuz zehaztu zen.
a)
b)
II. Material eta metodoak
51
7. irudia: a) 40 L-ko erreaktorea, b) Irabiagailuaren xehetasuna.
4. METILAZIO ERREAKZIOAK
4.1. Erreakzio etenak
Erreakzioak 50 mL-ko tapoi esmerilatuzko erlenmeyer matrazetan egin
ziren, bertan olioa (jatorrizkoa edo hidrolisatua) pisatu eta kasu bakoitzean
beharrezkoa zen metanola gehitu zitzaion. Denbora labur batean, (10 minutu
inguru) nahasten utzi ondoren, lipasa gehitzen zen. Erreakzioak 30 ºC-tan eta
irabiaketa orbitala (100 U/min) zuen ur-bainu batean (Selecta® Unitronic OR)
egin ziren. Hainbat denbora tartetan bi lagin (50 L) hartu eta erreakzio-
produktuak gas-kromatografiaren bidez aztertu ziren. Erreakzio bakoitza bi
aldiz egin zen.
a)
b)
II. Material eta metodoak
52
4.2. Erreakzio jarraiak
Termostatizatutako beirazko zutabe bat (XK16, 20 cm-ko luzera eta 16
mm-ko barne-diametroa, Pharmacia, Suedia) 3 gramo Novozym 435-ekin
(C. antarctica, B lipasa) bete eta ohantze finkoko erreaktore moduan erabili zen.
Substratuen nahasketa, 175 mL inguru (olioa edo hidrolisatutako olioa eta
metanolaren kantitate ezberdinak), zutabetik pasarazi zen ponpa baten bidez
(LC Gradient pump, LKB 2249, LKB Produkter AB, Bromma, Suedia), 8. irudian
ikus daitekeen bezala. Produktuak ez ziren erreziklatzen. Erabilitako fluxua
7.2 L/ordu izan zen eta erreakzioa 30 ± 2 ºC-tan egin zen. Ateratzen zen
produktuaren laginak hartu ziren hainbat denbora tartetan eta euren
konposaketa gas-kromatografiaren bidez analizatu zen.
8. irudia. Ohantze finkoko erreaktorearen eskema.
Produktuak: Ester metilikoak
Ura, erreakzio-tenperaturan
Immobilizatutako lipasa
Substratuak: Metanola + olioa edo olio-hidrolisatua
Ura, erreakzio-tenperaturan
II. Material eta metodoak
53
5. HIDROLISI ETA ESTERIFIKAZIO PRODUKTUEN KARAKTERIZAZIOA
5.1. Gantz-azido askeak (GAA)
GAA beste konposatu lipidikoetatik (TG, fosfolipidoak,…) banantzeko
Sep-Pak Vac 3cc (500 mg, Waters, AEB) amilopropilozko trukatze anionikoko
zutabeak erabili ziren Kaluzny eta lankideek (1985) azaldu bezala. Zutabeak
atontzeko 10 mL heptano pasarazi ziren eta ondoren 10 mg lagin dietil
eter:heptano (1:1, b:b) mililitro batean disolbatuta pasarazi zen, barne-patroi
moduan C17 (0.25 mg/mL) gehituta zuelarik. Lipido neutroak kanporatzeko 10
mL kloroformo:isopropanol (2:1, b:b) pasarazi ziren. Ondoren GAA kanporatu
ziren 5 mL azido formiko dietil eterrean (%2, b:b) pasaraziz eta GAA gas-
kromatografiaren bidez analizatu ziren. GAA-en banantzeko lehen (ikus 41.
orr.) deskribatutako gas-kromatografoa eta HP-FFAP zutabe kapilarra erabili
ziren, hurrengo baldintzak erabiliz: Gas eramailearen (Helioaren) fluxua 2
mL/min-koa, eta labearen tenperatura 65 ºC-tatik 240 ºC-tara 10 ºC/min-ko,
240 ºC-tan 20 minutu mantenduz, “split” 1:10. GAA kuantifikatzeko barne-
patroi metodoa erabili zen eta GA bakoitzaren erantzun-faktorea determinatu
zen GA bakoitzaren kantitate ezagunak kromatografoan injektatuz eta
tontorren azaleran oinarrituz.
5.2. Hidrolisi eta esterifikazio produktuen karakterizazioa gas-kromatografiaren bidez.
Erreakzio-nahasketetan zeuden lipido-mota ezberdinak (TG, DG, MG,
GAA eta EM) eratorkin sililatu moduan banandu eta kuantifikatu ziren Plank
eta Lorbeer-ek (1995) eta Nelson eta lankideek (1996) azaldu bezala. Hodi
batean barne-patroia (tricaprina 0.4 mg) zuen 10 mg erreakzio-nahasketa 100 L
tetrahidrofuranon disolbatu zen, 100 L BSTFA (N,O-Bis-(trimetilsilil)-
II. Material eta metodoak
54
trifluoroazetamida, FLUKA) gehitu ziren eta 15 minutuz 95-100 ºC-tan zegoen
harea-bainu batean utzi zen. Hodia giro-tenperaturan utzi eta 7 mL hexano
gehitu zitzaion. Disoluzio honen L bat injektatu zen DB1-ht (%100
dimetilpolisiloxano, 15 m, 0.32 mm-ko barne-diametroa eta 0.1 m fase, J&W
Scientific, AEB) zutabea zuen gas-kromatografoan. Honako baldintzetan: Labe-
tenperatura 50 ºC-tan minutu bat egon eta gero, 180 ºC-tara igo zen 15 ºC/min,
230 ºC-tara 7 ºC/min eta 370 ºC-tara 20 ºC/min, azken tenperaturan 10 minutu
egonik. Konposatuen identifikazioa patroien (azido oleikoa, metiloleatoa,
monooleina, dioleina, trioleina) errententzio-denborekin alderatuz egin zen eta
kuantifikazioa patroien erantzun-faktoreen bidez, tontorren azaleran oinarrituz.
5.3. Glizerolaren determinazio entzimatikoa
Glizerola hidrolisi-erreakzioen fase urtsuan kuantifikatzeko Boehringer
Mannheim-en (Alemania) glizerola neurtzeko kit-a erabili zen. Kit hau
hurrengo erreakzioetan datza:
Glizerola adenosin-5’-trifosfatoarekin (ATP) fosforilatzen da L-glizerol-3-
fosfato sortuz glizerol kinasa-k (GK-k) katalizatutako erreakzioan (1).
Glizerol + ATP --------------> L-glizerol-3-fosfato + ADP (1)
Horrela sortutako ADP-a fosfoenolpirubato-rekin (PEP) erreakzionatzen
du pirubato kinasa-ren (PK) laguntzarekin ATPa eta pirubatoa sortuz (2).
ADP + PEP ------------> ATP + pirubato (2)
L-laktato deshidrogenasa-ren (L-LDH) aurrean pirubatoa L-laktato
bihurtzen da NADH-aren oxidazioaren bidez NAD-a sortuz (3).
Pirubato + NADH + H+ --------------> L-laktato + NAD+ (3)
GK
PK
L-LDH
II. Material eta metodoak
55
Azken erreakzioan oxidatutako NADH-a laginan dagoen glizerolaren
baliokide estekiometrikoa da. NADH-aren desagerpena 340 nm-tan
absorbantziaren bidez neurtzen da.
Laginan dagoen glizerolaren kontzentrazioa (g/L) formula honen bidez
kalkulatzen da:
AxxdxbxBxPMK
1000
Non,
ΔA = 340 nm-tan neurtutako lagina eta zurizkoaren (ur-distilatuaren)
arteko absorbantzien diferentzia,
B = erreakzioaren bolumen osoa (3.020 mL),
b = laginaren bolumena (0.100 mL),
PM = glizerolaren pisu molekularra (92.1 g/mol),
d = kubetaren argi-igarobidea (1 cm) eta
= NADH-aren absortibitate molarraren koefizientea 340 nm-tan (6.3 L x
mmol-1 x cm-1),
baitira.
Beraz, formula horrela gelditzen da:
K = 0.441 x ΔA (g glizerol/L lagin)
III. EMAITZAK
III. Emaitzak
59
GANTZ ETA OLIOEN EZAUGARRIAK
Lehen esan bezala (“Material eta Metodoak” atalaren “Gantzak eta
olioak” azpiatalean, 35. orr.), ikerketa-lan honetan erabilitako hondakin
koipetsuak animalia-gantzak eta erabilitako landare-olioak izan ziren.
Animalia-gantzak hiltegietatik jaso ziren, eta gehienetan behi-gantzak ziren.
Landare-olioak, frijitzeko erabilitako olioak ziren eta euren jatorriaren arabera
ezaugarri ezberdinak zituzten. Landare-olio hauen jatorria “Material eta
Metodoak” atalean azalduta dago eta 3 olio ezberdin erabiltzearen arrazoiak bi
dira. Alde batetik, saio guztiak egiteko olio bakoitzaren kantitate nahikorik ez
zegoen eta beste aldetik, ezaugarri ezberdinak izan zitzaketen olioak aztertzea
interesgarria izan zitekeen. Ezaugarri horiek nolabaiteko eragina izan
baitzezaketen katalizatutako erreakzioetan edota erabilitako entzimetan.
1. AZIDOTASUN ETA SAPONIFIKAZIO INDIZEAK.
HASIERAKO HIDROLISI-MAILA.
Gantzak eta olioak laborategian jasotzen zirenean euren azidotasun- eta
saponifikazio-indizeak eta hasierako hidrolisi-mailak neurtzen ziren. Horrela
ikus zitekeen aldez aurretiko hidrolisia jasan zuten.
4. taula. Hondakin koipetsuen ezaugarriak. Animalia-gantza A olioa B olioa C olioa
Azidotasun indizea (AI)
40.8 ± 0.4 2.0 ± 0.1 1.0 ± 0.2 1.8±0.0
Saponifikazio indizea (SI)
190.3 ± 1.8 197.3 ± 0.9 193.3 ± 0.1 192.2±2.9
Hidrolisi-maila (%)*
21.4 ± 0.8 1.1 ± 0.1 0.5 ± 0.1 0.9±0.3
* Non % mol GAA/ 100 mol GAT baita.
III. Emaitzak
60
Ikus daitekeenez (4. taula), animalia-gantzak hasierako hidrolisi-mailarik
altuena zuen, laborategian jaso zenean %21.4 GAA izanik. Izan ere, animalia-
ehunetan entzima ugari daude eta haien artean gantzen hidrolisia kataliza
dezaketen lipasak (Padley eta lank., 1994). Horrexegatik animalia-gantzak ondo
maneiatzen ez badira, hidrolisi-maila altuak izan ditzakete, kasu honetan
gertatu zen bezala. Erabilitako landare-olioek, berriz, ez zuten hasierako
hidrolisi-maila handirik. Horrek esan zezakeen ez zirela askotan erabili. Janaria
frijitzean elikagaietan dagoen urak eta tenperatura altuek triglizeridoen
hidrolisia eragiten dute, gantz-azido askeen kantitatea handiagoa izanik olioa
behin eta berriro erabiltzen denean (Dobarganes eta lank., 2002; Gertz, 2000;
Tyagi eta Vashishtha, 1996).
1.2. KOIPEEN LIPIDOAK
Lipido mota ezberdinak geruza fineko kromatografiaren bidez aztertu
ziren. Espero bezala, lagin guztien konposatu gehiengodunak triglizeridoak
izan ziren. Animalia-gantzak triglizeridoez gain, gantz-azido askeak eta
glizerido partzialak zituen, hasierako hidrolisi partzialaren ondorioz, eta
kolesterola. Emaitza hauek aurreko atalean azaldutakoarekin bat datoz, batez
ere, aurkitutako gantz-azido askeen kantitatea animalia-gantzan.
1.3. KONPOSAKETA GANTZ-AZIDOTAN
Gantz eta olio guztien (hondakin-koipetsuen eta txerri-gantz eta olioen)
konposaketa gantz-azidotan ikertu zen gas-kromatografiaren bidez. Hondakin-
koipetsuen portzentajezko konposaketa gantz-azidotan (%1ean edo portzentaje
altuagoetan daudenak) 9. irudian biltzen da eta 5. taulan erositako gantz eta
olioen konposaketaz gain bibliografian aurkitutako datu batzuk aurki daitezke.
III. Emaitzak
61
Animalia-gantzaren konposaketa idi-gantzaren antzekoa zen (9. irudia
eta 5. taula). Gantz-azido gehiengoduna azido oleikoa zen (%37), bibliografian
agertzen diren datuekin bat datorrena (%26-50), hurrengoak azido palmitikoa
%27rekin (%17-37) eta estearikoa %22rekin (%6-40) izanik. Tarteak oso zabalak
badira ere, bibliografian aurkitzen diren bilgorraren gantz-azidoen diferentziak
elikadura eta arrazaren araberakoak direla diote adituek (Padley eta lank.,
1994).
0
10
20
30
40
50
60
C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 tC18:1 cC18:1 cC18:2 cC18:3
GA
(%
)
9. irudia. Aztertutako hondakin-koipetsuen konposaketa gantz-azidotan: Animalia-gantza, A olioa, B olioa, ≡ C olioa. (Gantz-azido bakoitzaren portzentajea tontor kromatografikoaren azaleran oinarrituz kalkulatu zen gantz-azido guztiak kontuan izanda).
Gantz-azido gehiengodunez gain, C18:1-ren trans isomeroak ere aurkitu
ziren. Isomero hauek animalia-gantzetan aurkitzea ez da arraroa (Padley eta
lank., 1994), errumeneko bakterioek gantz-azido asegabeak hidrogenatzen
baitituzte.
III. Emaitzak
62
Part
zial
ki
hidr
ogen
atut
ako
soja
-olio
a c
0.1
9.9
4.5
45.3
37.0
2.4
1.2 --
Ant
zar-
gant
za c
0.5 21
2.5
6.5 58
9.5 2 0
Txer
ri-
gant
za b
0.5
– 2.
5
20 –
32
1.7
– 5
5 –
24
35 –
62
3 –
16
< 1.
5
--
Ard
i-ga
ntza
b
2 –
5.5
21 –
25.
8
1.5
– 3
28 –
30.
5
30 –
37
1.4
– 4
0 –
0.2
--
Bilg
orra
b
1.4
– 7.
8
17 -
37
0.7
– 8.
8
6 –
40
26 –
50
0.5
– 5.
0
< 2.
5
--
Haz
i a
olio
a
d.g.
4.38
0.09
4.84
72.2
7
17.7
1
0.18
0.52
Ekilo
re a
olio
a
0.09
6.87
0.15
4.23
30.0
6
58.0
7
0.07
0.45
Olib
a a
olio
a
d.g.
9.63
0.69
3.62
78.4
1
6.25
0.67
0.73
Txer
ri-
gant
za a
1.68
25.2
4
1.88
19.0
9
42.4
6
7.55
0.43
1.67
Gan
tz-
azid
oa
C14
:0
C16
:0
C16
:1
C18
:0
C18
:1
C18
:2
C18
:3
Best
e
batz
uk
5. ta
ula.
Gan
tz et
a ol
io b
atzu
en k
onpo
sake
ta g
antz
-azi
dota
n.
d.g.
Det
ekta
tu g
abea
. a “
Mat
eria
l eta
Met
odoa
k” a
tale
an a
zald
u be
zala
(41.
orr
.).
b Pad
ley
eta
lank
., 19
94.
c Bel
itz &
Gro
sch,
199
9.
III. Emaitzak
63
Erabilitako landare-olioek gure artean erabiltzen diren landare-olioen
ohizko konposaketa zuten, azido oleiko eta linoleikoaren kopuru altua, alegia.
A olioaren gantz-azido gehiengoduna azido oleikoa zen (%44), hurrengoak
linoleikoa (%28) eta palmitikoa (%18) izanik. Portzentaje hauek bibliografian
aurkitzen diren partzialki hidrogenatutako soja-olioaren baloreekin bat etor
daitezke (Belitz eta Grosch, 1999). Olio hau, batez ere, elikagaiak modu
industrialean frijitzeko erabiltzen da. Beste aukera bat A olioa olioen nahasketa
izatea izan zitekeen. Izan ere, frijitzeko erabilitako olioak batzuetan nahasketak
dira eta palma-olioa erabiltzea ez da arraroa, azido palmitikoaren portzentajea
igoz. Dena den, ez da ahaztu behar elikagaien eragina frijitzeko olioan.
Elikagaien lipidoak oliotan barreia baitaitezke olioen konposaketa aldatuz
(Pokorný, 1998). Frijitutako elikagaiaren arabera, esaterako haragia edo arraina,
barreiatutako gantz-azidoak guztiz ezberdinak izan daitezke baita olioaren
bukaerako konposaketa gantz-azidotan ere. Gainera, A olioak C18:1-ren trans
isomeroen kopuru txikia (%1.2) zuen, isomero hauek frijitzean sor daitezke
hidrogenazioaren ondorioz (Tyagi eta Vashishtha, 1996).
B olioa ekilore-olioarekin alderatuz gero, biak oso antzekoak zirela ikus
daiteke. B olioaren gantz-azido gehiengoduna linoleikoa zen (%56), hurrengoak
oleikoa (%28) eta palmitikoa (%8) izanik, balore hauek lan honetan
aurkitutakoekin (5. taula) eta bibliografian dagoen ekilore-olioaren konposaketa
gantz-azidotan bat etorriz (Belitz eta Grosch, 1999, Padley eta lank., 1994).
Bibliografian agertzen diren ezberdintasunak ekoizpen-tokien eta barietateen
araberakoak dira (Padley eta lank., 1994). C olioak B olioaren jatorri bera ba
zuen ere, Arabako Kanpuseko jantokia, bere konposaketa gantz-azidotan ez zen
guztiz antzekoa. Izan ere, gantz-azido gehiengoduna linoleikoa izan zen (%42),
hurrengoak oleikoa (%36) eta palmitikoa (%16) izanik. Bi olio hauetan gantz-
azido gehiengodunak hiru gantz-azido hauek ziren eta orden bera jarraitzen
zuten, baina proportzioak ez ziren mantentzen. Agian, olio bera zen, baina
jasandako baldintzak guztiz ezberdinak izan zitezkeen, hau da, frijitutako
elikagaiak, frijitzeko erabilitako tenperaturak eta zenbat aldiz erabili ziren.
III. Emaitzak
65
LIPASEN KARAKTERIZAZIOA
Bibliografia aztertu eta hainbat entzimen ekoizleri koipeen hidrolisi eta
esterifikaziorako erabiltzen ziren lipasei buruzko informazioa eskatu eta gero,
6. taulan biltzen diren lipasen ezaugarriak aztertzea erabaki zen. Azterketa
hauen helburua hondakin koipetsuen ustiapenerako egokiak izan zitezkeen
lipasak karakterizatzea zen. Ekoizleek lipasa batzuen fitxa teknikoak helarazi
zizkiguten eta bertan lipasen ezaugarri batzuk deskribatzen ziren (Ikusi
“Material eta Metodoak” atala, 36. orr.).
6. taula. Hondakin koipetsuen ustiapenerako aztertutako prestakin entzimatikoak.
Prozesua Lipasa Jatorria Ekoizlea
Hidrolisia
OF Candida rugosa Meito Sangyo
(Japonia)
Lipomod Candida rugosa Biocatalysts
(Britainia Handia)
Lipopan Thermomyces lanuginosus
Novo Nordisk (Danimarka)
Lipolase Thermomyces lanuginosus
Novo 398 Humicola insolens
Novo 868 Candida antarctica
(A lipasa)
Esterifikazioa
Novozym 435 Candida antarctica (B lipasa)
Novozymes (Espainia)
Lipozyme RM IM Rhizomucor miehei
Lipozyme TL IM Thermomyces lanuginosus
1. GANTZ ETA OLIOEN HIDROLISI OSORAKO EGOKIAK DIREN LIPASEN KARAKTERIZAZIOA
Lipasak karakterizatzeko euren aktibitate lipolitikoa neurtu zen.
Aktibitate lipolitikoa neurtzeko oliba-olioa substratu-eredu moduan erabili zen,
bi emultsio ezberdin erabiliz. Honez gain, pH-ren eta tenperaturaren eragina
III. Emaitzak
66
aktibitatean eta lipasen egonkortasunean ikertu zen. Karakterizazioa osatzeko
substratu-ereduen (hazi-olioa eta txerri-gantza) hidrolisi-erreakzioak garatu
ziren. Erreakzio hauetan hidrolisiaren bitartekoak, askatutako gantz-azidoak
eta ekoitzitako glizerido partzialak, neurtu ziren hainbat denbora tartetan.
1.1. Aktibitate lipolitikoa
Aktibitate lipolitikoa neurtzeko “Material eta Metodoak” atalean (42.
orr.) deskribatutako entseguak erabili ziren. Bertan azaldu bezala, bi entsegu
ezberdin erabiltzearen arrazoia hurrengoa da. Gure laborategian erabiltzen zen
entsegua Virto eta lankideena (1994) zen, baina Meito-Sangyo-ren OF lipasaren
aktibitatea egiaztatzen saiatzean lortutako aktibitatea ekoizleak deklaratutakoa
baino txikiagoa zen. Horregatik, Meito-Sangyo-k bidalitako entsegua erabili zen
aktibitate lipolitikoa neurtzeko eta OF lipasaren aktibitatea egiaztatzeko. Lipasa
bakoitzak lortutako aktibitateak 7. taulan biltzen dira.
Erabilitako entseguaren arabera emaitza ezberdinak lortu ziren. A
metodoa erabiliz aktibitate handiagoak lortu ziren, ia magnitude-ordena
batekoak kasu gehienetan. Aktibitate gehien zuten lipasak C. rugosa-renak izan
ziren 300-400 kU/g eta 65-100 kU/g lortuz, A metodoa edo B metodoa erabiliz,
hurrenez hurren. Novo Nordisk-en prestakin komertzialek, Lipolase eta Novo
398, antzeko aktibitatea izan zuten edozein metodo erabilita. Ekoizleak bientzat
aktibitate bera deklaratzen zuen (100 kU/g), baina datu hauek ez datoz bat
ikerlan honetan erabilitako bi metodoekin lortutako emaitzekin: Novo Nordisk-
ek aktibitate lipolitikoa neurtzeko AF95 metodoa, tributirina substratu moduan
duena, erabiltzen baitu (pH-statoz egindako entsegua, hain zuzen ere).
Novo 868-k (C. antarctica-ren A lipasa) oso aktibitate lipolitiko baxua dauka, bi
metodoekin lortutako emaitzak enpresak emandakoak baino txikiagoak izanik.
Lipopan (T. lanuginosus-en lipasa) prestakin entzimatikoak A metodoa erabiliz
aktibitate handiagoa eman zuen, baina ez dago ekoizlearen emaitzekin
alderatzerik, ez baitugu datu hori.
III. Emaitzak
67
7. taula. Erabilitako lipasen aktibitatea metodo ezberdinak erabiliz.
Lipasa Jatorria kU*/g edo mL (A metodoa 1)
kU/g edo mL (B metodoa 2)
Ekoizleak adierazitako aktibitatea
(kU/g)
OF (Meito Sangyo)
C. rugosa 392.1±10.0 97.1±4.6 360.0 1
Lipomod (Biocatalysts)
C. rugosa 319.5±8.9 66.7±3.4 115.0 3
Lipopan
(Novo Nordisk) T. lanuginosus 68.9±4.8 12.5±0.1 --
Lipolase (Novo Nordisk)
T. lanuginosus 28.6±0.3 1.5±0.1 100.0 4
Novo 398 (Novo Nordisk)
H. insolens 29.1±1.5 1.7±0.3 100.0 4
Novo 868 (Novo Nordisk)
C. antarctica
(A Lipasa) 2.0±0.4 0.3±0.0 6.0 4
*U: 1 mol gantz-azido minutuko. 1 A metodoa: Oliba-olioa eta polibinil alkoholaz egindako emultsioa (Naka, 1987). Ikusi “Material eta Metodoak” atala (42. orr.). 2 B metodoa: Oliba-olioa eta behi-seroalbuminaz (BSA) egindako emultsioa (Virto eta lank., 1994). Ikusi “Material eta Metodoak” atala (43. orr.). 3 Oliba-olioa erabiltzen dute substratu moduan, baina ez dute metodoa zehazten (Biocatalysts
Limited, 1999). 4 Novo Nordisk-en AF95 metodoa. Tributirina substratu moduan erabiliz, askatutako gantz-
azidoak pH-stato baten bidez neurtzen dira.
Neurtutako aktibitate lipolitikoaren emaitza ezberdinak lortzea entsegu
ezberdinak erabiliz gauza normala da hainbat autorek adierazi dutenez.
Adibidez, Garou-k (1998), AF95 (tributirina) eta Worthington (oliba-olioa)
metodoak erabili zituen lipasa batzuen aktibitatea neurtzeko, bi metodoekin
emaitza ezberdinak lortuz. Vorderwülbecke eta lankideek (1992) honako hau
frogatu zuten: lipasa gehienen aktibitate hidrolitikoa substratuaren eta
eratutako emultsioaren araberakoa da. Autore hauek, hainbat entsegu erabiliz,
60 lipasen aktibitatea neurtu zuten eta lipasa bakoitzak bere metodo optimoa
zuela aurkitu zuten. Halaber, hainbat lipasa, adibidez Aspergillus niger eta
A. oryzae-ren lipasa batzuk, substratu artifizialak (paranitrofenilpalmitato eta
butiratoa, S,O,O’-tributiril-tioglizerol (TBTG) eta azido 1,2-O-dilauril-rac-
III. Emaitzak
68
glizero-3-glutariko-erresorufinester (DGGR)) erabiliz aktiboagoak zirela aurkitu
zuten.
Eratutako emultsioaren eragina oso garrantzitsua da lipasa gehienen
aktibitate entzimatikoaren neurketetan eta aktibazio interfatzialean. Izan ere,
substratu-emultsioaren partikula-tamaina emultsioaren araberakoa da eta
partikula-tamainak substratuaren eta entzimaren arteko ukipen-azala
baldintzatzen du (Virto eta lank., 1994; Albasi eta lank., 1997; Schmid eta
Verger, 1998; Beisson eta lank., 2000).
Lipasen ezaugarririk nagusienetakoa ura-lipido interfasean katalizatzen
dituzten erreakzioen izaera fisiko-kimiko berezia da, Sarreran aipatu bezala (23.
orr.). Katalisia gertatu baino lehen entzima interfasean adsorbitzen da eta
ondoren katalisia gertatzen da. Katalisiaren izaera heterogeneoak (Benzonana
eta Desnuelle, 1965) interfasean dauden entzimaren eta substratuaren kantitate
zehatzak (lipolisia baldintzatzen dutenak) neurtzea zailtzen du. Substratuak
uretan emultsionatzeko konposatu anfipatikoak, detergenteak edota proteinak,
behar dira. Konposatu hauek aktibitate-lipolitikoaren neurketan eragin handia
izan dezakete (Beisson eta lank., 2000). Adibidez, B metodoan emultsionatzaile
moduan erabilitako seroalbuminak gantz-azido askeekiko afinitate handia
dauka eta baliteke gantz-azido hauen erauzketa osoa ez izatea. A metodoan,
berriz, askatutako gantz-azidoak erreakzio-nahasketan baloratzen dira
zuzenean, horrela erauzketaren arazoak saihestuz. Honek guztiak A
entseguarekin lortutako aktibitate altuagoak azal zitzakeen.
A entseguak aktibitate altuagoak eman zituenez, hortik aurrera erabili zen
entsegua izan zen.
1.2. pH-ren eragina aktibitate lipolitikoan.
Lipasen aktibitate lipolitikoan pH-ren eragina ikertzeko erreakzio-
giroaren pHa aldatu zen 5-8 tartean fosfato 0.1 M disoluzio indargetzailea
III. Emaitzak
69
erabiliz. Lipasa guztien aktibitaterik altuena pH 5-7 tartean aurkitu zen, pH 8n
aktibitatea gutxituz kasu guztietan (10. irudia).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
4 5 6 7 8 9pH
Ak
tib
itat
ea (
%)
10. irudia. Lipasen aktibitate lipolitikoa pHaren arabera (lipasa bakoitzaren aktibitate maximoaren ehunekoak): OF, o Lipomod, ∆ Lipolase, ◊ Novo 398, x Novo 868 eta + Lipopan.
Lipomod eta OF lipasek, Candida rugosa-ren lipasek, aktibitate altuei eutsi
zizkioten pH 5, 6 eta 7n (aktibitate maximoaren %90-100), pH 8n aktibitatea
gutxitu zen, batez ere, Lipomod lipasaren kasuan (%42). Hainbat autorek
Candida rugosa-ren lipasen pH optimoa 7 inguruan dagoela aurkitu dute, oliba-
olioa substratu moduan erabiliz. Adibidez, Montero eta lankideek (1993) OF
lipasaren aktibitate optimoa pH 6.2-7.7 tartean aurkitu zuten eta maximoa 6.8n.
Honek Pereira eta lankideek (2001) aurkitutakoarekin bat dator, aktibitate
maximoa 6.5-7 tartean aurkitu baitzuten eta pH 8n aktibitatea gutxitu zen
aipatutako bi ikerlan hauetan (%80 eta 60, hurrenez hurren), gure emaitzekin
ere bat datorrena. Garou-k (1998) eta Wang eta lankideek (1988) ere ikerlan
honen antzeko aktibitate-profilak lortu zituzten, pH optimoak 5 eta 7 inguruan,
C. rugosa-ren lipasa baterako oliba-olioa substratu moduan erabiliz.
III. Emaitzak
70
Lipolase eta Novo 398 lipasek antzeko portaera izan zuten erreakzio-
giroaren pH aldatzean, aktibitate maximoa pH 7n izanik. Novo Nordisk-ek
bidalitako Novo 398-ren eta Lipolase-ren fitxa teknikoen arabera entzima hauen
aktibitate maximoa pH 11n ematen da (AF 95 metodoa erabiliz), detergenteen
formulazioetan erabiltzekoak dira eta. Novo Nordisk-en AF 95 entseguak
tributirina erabiltzen du substratu moduan, eta ikerlan honetan oliba-olioa
erabili dugu gero ikertuko diren laginen antza handia duelako. Baliteke
entzimek pH-ren eragina aktibitate-profilean ezberdina izatea substratu
ezberdinak erabiltzen direnean. Izan ere, Wang eta lankideek (1988) C. rugosa-
ren lipasa batek pH-ren arabera eta substratuaren arabera aktibitate ezberdina
zuela aurkitu zuten, oliba-olioa eta tributirina erabiliz. Oliba-olioa erabiliz bi
aktibitate-maximo aurkitu zituzten, pH 5 eta 7n, baina tributirina erabiliz, bat
bakarrik pH 7n.
Novo 398 lipasaren karakterizazioa egitean, Garou-k (1998) ia aktibitate
bera aurkitu zuen pH 5-11 tartean (Novo Nordisk-en AF95 metodoa erabiliz).
Hau ez dator bat guk aurkitutakoarekin ezta Novo Nordisk-ek
adierazitakoarekin. Crooks eta lankideek (1995a) Lipolase-ren aktibitatearen
aldaketa p-nitrofenilbutiratoren mikroemultsioetan aztertu zuten pH-aren
arabera eta Novo Nordisk-ek adierazitakoarekin bat datozen emaitzak lortu
zituzten, pH optimoa 9.3-10.4 tartean. Hala ere, emaitza hauek ez datoz bat
ikerlan honetan lortutakoekin oliba-olioa erabilita, lipasaren aktibitate maximoa
pH 7n baitzegoen. Beraz, entzimen ezaugarriak ikertzean, ondoren erabilera
industriala eman nahi bazaie, guztiz beharrezkoa da erabilera industrialean
erabiliko den substratuaren antza handia duen substratua aukeratzea
karakterizaziorako. Askotan, ekoizleek ez dute kontuan hartzen ondorengo
erabilera industriala. Gehienetan metodo errazak eta azkarrak erabiltzen
dituzte loteen arteko aktibitateen ezberdintasunak neurtzeko.
Novo 868 lipasa aktiboagoa izan zen pH 5-6 tartean (%100-96), baina
erreakzioa pH 8n egiten zenean aktibitatea gutxitzen zen maximoaren %26ra
III. Emaitzak
71
iritsi arte. Lipopan lipasak aktibitate maximoa pH 6n zuen (%100), pH 7 eta 8n
era nabarian gutxituz (%53 eta 13, hurrenez hurren).
Aintzat hartzekoa ere bada, lipasen prestakin komertzial gehienak
prestakin gordinak direla eta lipasa bat baino gehiago izan dezaketela
(isozimak), selektibitate ezberdinak izan ditzaketenak, edo pH profil
ezberdinak dituztenak. Kasu hauetan, neurtutako aktibitatea prestakin horretan
dauden aktibitate ezberdinen batez bestekoa litzateke. Ezaguna da C. rugosa-k
lipasaren 7 gene kodeatzaile dituela (Plou eta lank., 1997) eta hauetatik 5 guztiz
karakterizatu direla. Rúa eta lankideek (1993) C. rugosa-ren bi lipasa (A eta B)
araztu eta karakterizatu zituzten. Bien artean substratu espezifizitate
ezberdinak aurkitu zituzten: B lipasak aktibitate lipasa handiagoa zuen, A
lipasak, berriz, aktibitate esterasa handiagoa. Bi lipasek antzeko pH profilak
bazituzten ere, optimoa 7 inguruan izanik, aktibitate jaitsiera pH 8n nabariagoa
zen B lipasaren kasuan.
Neves Petersen eta lankideek (2001) lipasek zergatik zuten pH optimo
ezberdinak ikertu zuten. Esaterako, C. rugosa-ren (6.5-7.5) eta Humicola
lanuginosa-ren (gaur egun, T. lanuginosus, pH 11-12) pH optimoak ikertu
zituzten. Lipasa bien pH optimoen ezberdintasunari azalpena emateko gune-
aktiboaren hondarren balorazio-kurbak erabili zituzten. C. rugosa-ren lipasaren
gune-aktiboaren inguruak negatiboki kargatzen ziren pH 3n (entzimaren
konformazio irekirako eta itxirako), eta T. lanuginosus-enak, berriz, bakarrik 8.5-
9.0 baino pH altuagoetan. Honek azalduko luke zergatik lipasek pH optimo
ezberdinak izan ditzaketen.
1.3. Tenperaturaren eragina aktibitate lipolitikoan.
Entzimek katalizatutako erreakzioetan tenperatura igo ahala bi kontrako
ondorio ikusten dira (Uhlig, 1998): erreakzioaren abiadura tenperatura igo
ahala igotzen da (honen ondorioz aktibitatea handiagoa da), baina tenperatura
III. Emaitzak
72
altuek entzimaren egonkortasuna gutxitzen dute, desnaturalizazio termikoa
dela eta. Honen ondorioz, entzima aktiboaren kopurua gutxitzen da, baita
erreakzioaren abiadura ere. Normalean 30-50 ºC-tako tartean, abiaduraren
igoera desnaturalizazioaren gainetik nagusitzen da eta aktibitate entzimatikoa
tenperatura igo ahala igotzen da, baina 50 ºC gainetik, kasu gehienetan,
desnaturalizazioa nagusitzen da eta aktibitate entzimatikoa gutxitzen da.
Lipasen aktibitate lipolitikoa 25-50 ºC-tako tartean ikertu zen (11a.
irudia). Kasu gehienetan tenperatura optimoa 37-40 ºC tartean egon zen. Soilik
C. antarctica-ren (A lipasa) Novo 868-k eta H. insolens-en Novo 398-k izan zuten
aktibitate maximoa ikertutako tenperaturarik altuenean (50 ºC).
Abiaduraren logaritmoa eta tenperaturaren alderantzizkoa erlazionatzen
duten kurbak irudikatzen badira, Arrhenius irudikapena lortzen da (11b.
irudia). Horrela lortutako zuzenaren maldarekin erreakzioaren aktibazio-
energia (Ea) kalkula daiteke ekuazio honen arabera (Segel, 1976):
ATR
Ev
alog
1
3.2log
OF, Lipomod, Lipolase eta Lipopan lipasek bi zati ezberdin ematen
zituzten Arrhenius irudikapenean, bata malda positiboa duena eta bestea
negatiboa. Novo 398 eta Novo 868 lipasek, berriz, nahiz eta bi zati izan, bi
zatiek malda negatiboa dute. Honen arrazoia, lipasa hauen tenperatura
optimoan egon daiteke. Izan ere, bi lipasa hauen tenperatura maximoa 50 ºC
zen eta agian 25-50 ºC tartea ez da nahikoa desnaturalizazio termikoa ikusteko.
Lehen esan bezala, erabilitako erreakzio-baldintzetan lipasa gehienen
tenperatura optimoa 37-40 ºC tartean zegoen. Hortik aurrera aktibitatea
gutxitzen da eta zuzenaren malda positiboa da. Horrek azaltzen du Arrhenius
irudikapenak bi zati ezberdin izatea. Kalkuluetarako malda negatiboko zatia
erabiliko da.
III. Emaitzak
73
0
20
40
60
80
100
20 25 30 35 40 45 50 55
T (ºC)
Ak
tib
itat
ea (
%)
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
3.0 3.2 3.4
T-1 x103 (K-1)
Lo
g (
v0)
11. irudia. Aktibitate entzimatikoa tenperaturaren arabera a) Aktibitate erlatiboa (Lipasa bakoitzaren aktibitate maximoaren ehunekoak), b) Arrhenius irudikapena: OF, o Lipomod, ∆ Lipolase, + Lipopan, ◊ Novo 398 eta x Novo 868.
Maldaren aldaketa bi arrazoiengatik izan daiteke: entzimaren
inaktibazioa (jaitsiera oso nabarmena denean) edo emultsioaren ezaugarrien
aldaketak tenperatura igotzean (Segel, 1976). Tenperatura igotzean, biskositatea
a)
b)
III. Emaitzak
74
gutxitzen da, baita ura-lipido interfasearen gainazal-tentsioa ere (Al-Zuhair eta
lank., 2003).
Askotan tenperaturaren eragina erreakzio-abiaduran Q10 koefizientearen
bidez adierazten da. Q10 koefizientea tenperatura 10 ºC igotzen denean
erreakzio-abiadura biderkatzen duen faktorea da.
10
log3.2 1012 QTRTEa
Q10 koefizienteen, aktibazio-energien eta tenperatura optimoen emaitzak
8. taulan biltzen dira. Aktibazio-energiaren eta Q10 koefizientearen datuak
zuzenen malda negatiboaren emaitzekin kalkulatu ziren, desnaturalizazio
termikoa nabarmena izan baino lehen. Ikus daitekeenez, Novo 868 lipasak
aktibazio-energiarik altuena zuen ikertutako tenperatura tarte horretan (25-
37 ºC). Honez gain, tenperaturaren eragin nabarmenena jasaten duena ere bada,
ikertutako lipasen artean Q10 koefizienterik altuena duena izanik.
8. taula. Ikertutako lipasen tenperatura optimoak eta Arrhenius irudikapenetik kalkulatutako aktibazio-energia (Ea) eta Q10 koefizientea.
Lipasa T optimoa (ºC) Ea (kJ/mol) Q10
Lipolase 40 12.67 1.18
Lipopan 40 13.05 1.19
OF 37 14.51 1.21
Lipomod 40 15.73 1.23
Novo 398 50 19.51 1.29
Novo 868 50 34.56 1.57
Ea = Aktibazio-energia Q10 = Tenperatura 10 ºC igotzean erreakzio-abiadura biderkatzen duen faktorea.
Zanin eta de Moraes-ek (1998) erreakzio entzimatiko gehienen aktibazio-
energia 105 kJ/mol baino gutxiagokoa dela adierazi zuten. Al-Zuhair eta
lankideen (2003) esanetan lipasen aktibazio-energiak normalean 10-20 kJ/mol
III. Emaitzak
75
tartean daude, ikerlan honen emaitzekin bat datorrena. Montero eta lankideek
(1993) eta Pereira eta lankideek (2001) C. rugosa-ren lipasen aktibazio-energia
kalkulatu zuten 40 kJ/mol-eko emaitzak lortuz, ikerlan honetan OF eta
Lipomod lipasentzat kalkulatutakoa baino 2.5 bider handiagoak. Crooks eta
lankideek (1995b) Lipolase (H. lanuginosa) eta Lipozyme (R. miehei) aztertu
zituzten hainbat erreakzio-tenperatura erabiliz. Lipolase-k katalizatutako
tributirinaren hidrolisian aktibazio-energia 15 kJ/mol zen, hemen lortutakoaren
antzekoa. Dandik eta lankideek (1993) usagariaren (Nigella sativa) hazien
lipasak katalizatutako olioaren hidrolisiaren aktibazio-energia 26.79 kJ/mol
zela aurkitu zuten, erreakzio-baldintza optimoetan (pH 6 eta birrindutako
haziaren %60 pisuan entzima moduan erabiliz).
1.4. pH-ren eragina lipasen egonkortasunean.
Hondakin-koipetsuen hidrolisi-erreakzioak disoluzio indargetzailerik
erabili gabe garatu ziren (Ikusi “Material eta Metodoak” 48. orr.), xaboien
ekoizpena saihesteko eta hondakinen tratamenduen kostua gutxitzeko, gero
erabilera industrial erakargarria izateko. Horregatik fase urtsua udal-saretik
jasotako ura (Vitoria-Gasteiz) izan zen. Uraren pHa 7.4 ingurukoa izan zen eta
erreakzioa garatu ahala fase urtsuaren pHa jaisten joan zen 5.0era heldu arte,
12. irudian ikus daitekeenez.
Entzima fase urtsuan dagoenez, pH-ren eragina lipasen egonkortasunean
ikertzeko pH 5, 6 eta 7ko fosfato disoluzio indargetzaileak erabili ziren, 37 ºC-
tan eta 24 orduz (13. eta 14. irudiak).
OF lipasa (13a. irudia) nahiko egonkorra da, aktibitatearen %60
mantenduz pH 6n eta 7n, eta %50 inguru pH 5en, 24 orduz beratzen utzi
ondoren. Montero eta lankideek (1993) OF lipasak, ordubetez pH 3-7 tarteko
disoluzio indargetzailetan beratzen uzten zenean, bere aktibitatearen %75
mantentzen zuela aurkitu zuten. OF eta Lipomod lipasek, C. rugosa-ren lipasek,
III. Emaitzak
76
oro har, antzeko egonkortasuna mantendu zuten. Hala ere, Lipomod
egonkorragoa zen pH 6n, ia aktibitatearen %80 mantenduz. Lipasa bien arteko
ezberdintasunak gerta daitezke, lehen azaldu bezala eta bibliografian aurki
daitekeen moduan, C. rugosa-k isozima ezberdinak ekoizten dituelako,
substratu-espezifizitate eta pHaren eta tenperaturaren eragin ezberdinekin.
Hainbat autoreren arabera (Rúa eta lank., 1993; Plou eta lank., 1997; Jonzo eta
lank., 2000) A lipasa egonkorragoa da pH eta tenperaturen aldaketen pean.
Beraz, honek entzima horren prestakinek isozimen proportzio ezberdinak eta
izaera ezberdinak izan ditzaketela adieraz zezakeen.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
denbora (ordu)
pH
12. irudia. OF lipasak katalizatutako erreakzioaren fase urtsuaren pHa hidrolisia garatu ahala (48 ordu pasa eta gero %95eko hidrolisi-maila lortu zen).
Novo 868 eta Lipopan lipasek (13c. eta 14c. irudiak) egonkortasun
handiagoa azaldu zuten pH 5en eta 6n (%80 24 ordu ondoren), hurrenez
hurren, pH 7n baino. Novo 868 lipasa ez zen hain egonkorra pH 7n,
aktibitatearen %60 mantendu zuen 24 ordu pasa eta gero.
III. Emaitzak
77
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
13. irudia. Lipasen hondar-aktibitatea, pH-ren arabera: a) OF, b) Lipomod, c) Novo 868. Lipasak beratzen utzi ziren fosfato 0.1 M disoluzio indargetzailean: …o… pH 5, - - - - pH 6, --∆--- pH 7 (37 ºC-tan).
a)
b)
c)
III. Emaitzak
78
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
14. irudia. Lipasen hondar-aktibitatea, pH-ren arabera: a) Novo 398, b) Lipolase, c) Lipopan. Lipasak beratzen utzi ziren fosfato 0.1 M disoluzio indargetzailean: …o… pH 5, - - - - pH 6, --∆--- pH 7 (37 ºC-tan).
a)
b)
c)
III. Emaitzak
79
Disoluzioan lipasarik egonkorrenak Novo 398 eta Lipolase izan ziren, pH
7n euren aktibitateen %97 eta 93 mantenduz, hurrenez hurren (14. irudia).
Lipasa hauen egonkortasuna jaitsi zen disoluzioen pHa jaistean (pH 5 eta 6),
nahiz eta Novo 398-ren kasuan jaitsiera oso txikia izan, 24 orduz pH 5eko
disoluzioan beratzen utzi ondoren aktibitatearen %90 mantendu baitzuen.
Lipolase lipasa ez zen hain egonkorra, pH 5en eta 6n 24 orduz beratzen utzi
ondoren, bere aktibitatearen %80 mantendu baitzuen.
Lipasa bakoitzarekin lortutako egonkortasun-emaitza esperimentalak
eredu matematikoetara egokitu ziren. Modu horretan lortutako ekuazioekin
entzima bakoitzaren erdibizitza lortu zen, hau da, entzimaren aktibitatearen
%50era jaisteko behar den denbora. Kasu guztietan eredu matematikorik
egokiena esponentziala izan zen (“Single exponential decay model” EnzFitter
Biosoft, 1999) 0.9 baino handiagoko erregresio-koefizientearekin kasu guztietan.
Lortutako emaitzak 9. taulan biltzen dira.
9. taula. Ikertutako lipasen erdibizitza (orduak) 37 ºC-tan, hainbat pH-tako disoluzio indargetzailetan beratzen utzi ondoren.
Lipasak
pH OF Lipomod Novo 398 Lipolase Lipopan Novo 868
5 21.2 29.8 207.3 84.2 36.8 93.2
6 33.3 50.2 417.1 80.2 83.5 91.2
7 28.2 24.0 530.1 251.9 39.2 34.8
Kalkulatutako erdibizitzetatik eta 13. eta 14. irudietatik ondoriozta
daitekeenez, Novo 398 lipasa ikertutakoen artean egonkorrena zen eta
egonkortasun gutxien zutenak, berriz, OF eta Lipomod, C. rugosa-ren lipasak.
Lipasa gehienak egonkorragoak izan ziren pH 6n, Novo 868 izan ezik, pH 5en
baitzen egonkorragoa. Novo 398 eta Lipolase lipasen egonkortasuna pHa
handitu ahala handitu zen. Hidrolisi erreakzioetan pH basikoak ematen ez
direnez, ez ziren aztertu, baina litekeena da lipasa hauek pH basikoetan
egonkorrak izatea, izan ere, detergenteetan erabiltzeko egokitu dira.
III. Emaitzak
80
1.5. Tenperaturaren eragina lipasen egonkortasunean
Sarreran (14. orr.) azaldu bezala, lipasek katalizatutako koipeen
hidrolisia tenperatura epeletan egin daiteke, albo-produktuen ekoizpena
saihesteko eta energia-kostua gutxitzeko. Horregatik, tenperaturaren eragina
lipasen egonkortasunean ikertzeko lipasak beratzen utzi ziren pH 7ko disoluzio
indargetzaileetan 25-45 ºC-tan (15. eta 16. irudiak).
Novo 398 (H. insolens) eta Lipolase (T. lanuginosus) lipasak (16. irudia)
izan ziren lipasarik termoegonkorrenak. Izan ere, 45 ºC-tan 24 ordu pasa eta
gero, euren aktibitateen %92 eta 62 mantendu zuten, hurrenez hurren. Bi lipasa
hauek detergenteetan erabiltzen dira eta termoegonkortasuna guztiz
beharrezkoa dute garbiketa-tenperaturak jasateko. Lipasa hauek ingeniaritza
genetikoaren bidez hobetu dira. Zenbait hondar aminoazidiko espezifiko
ordezkatuz, termoegonkorragoak diren lipasen aldaerak lortu dira. Esaterako
T. lanuginosus-en termoegonkortasuna 4 ºC handitu da (Minning eta lank.,
2002). Era berean Svendsen-ek (2000) lipasen ingeniaritza proteikoari buruzko
errebisio batean ikerketa batzuk bildu zituen eta prolina ordezkatuz
T. lanuginosus-en termoegonkortasuna 2 ºC-tan handitu zela azaldu zuen.
OF lipasak (15a. irudia) bere aktibitatearen %60 gordetzen zuen 37 ºC-tan
24 orduz. Tenperatura altuagoetan, 45 ºC-tan, aktibitatea oso azkar jaitsi zen eta
4 orduetarako aktibitatearen %60 galdu zuen, 24 orduetarako bere hondar-
aktibitatea %5 besterik ez izanik. Montero eta lankideek (1993) ere 37 ºC-tan
ordubetez beratzen utzi ondoren OF lipasa guztiz aktiboa zela ikusi zuten,
baina tenperatura altuagoetan aktibitatea gutxitu zen, 40 ºC-tan %50, 45 ºC %20
eta 50 ºC baino gehiagoko tenperaturetan bere aktibitatea guztiz desagertuz.
III. Emaitzak
81
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
15. irudia. Lipasen hondar-aktibitatea tenperaturaren arabera: a) OF, b) Lipomod, c) Novo 868.
Lipasak beratzen utzi ziren pH 7ko fosfato 0.1 M disoluzio indargetzailean: .... 25 ºC, --—
30 ºC, ---- 37 ºC, - -∆ - - 40 ºC, –х-- 45 ºC-tan.
a)
b)
c)
III. Emaitzak
82
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
16. irudia. Lipasen hondar-aktibitatea tenperaturaren arabera: a) Novo 398, b) Lipolase, c)
Lipopan. Lipasak beratzen utzi ziren pH 7ko fosfato 0.1 M disoluzio indargetzailean: .... 25 ºC, ---- 30 ºC, ---- 37 ºC, - -∆ - - 40 ºC, –х-- 45 ºC-tan.
a)
b)
c)
III. Emaitzak
83
C. rugosa-ren bi lipasak alderatuz gero (15a. eta 15b. irudiak), OF lipasak
Lipomod lipasak baino egonkortasun handiagoa gordetzen zuela 37 ºC arte
ikus daiteke, baina 40 ºC-tik aurrera biek antzeko egonkortasuna izan zuten.
Lipomod lipasaren aktibitatea nahiko azkar jaitsi zen 25-37 ºC tartean, baina 24
orduz 40 eta 45 ºC-tan egon ondoren aktibitatearen %42 eta %21 gorde zituen,
hurrenez hurren. OF lipasaren aktibitatea, berriz, azkarrago jaitsi zen 40-45 ºC-
tako tartean. Honez gain, hondar-aktibitate baxuagoak gorde zituen 24 orduz
40 eta 45 ºC-tan egon ondoren, %36 eta %5, hurrenez hurren. Ezberdintasun
hau, lehen azaldu bezala, C. rugosa-k hainbat isozima ekoizten duelako eta
isozimen egonkortasuna ez delako bera, C. rugosa-ren A lipasa egonkorragoa
izanik tenperaturaren aldaketarekiko (Rúa eta lank., 1993).
Novo 868 lipasa (C. antartica-ren A lipasa, 15c. irudia) nahiko egonkor
mantendu zen aztertutako tenperaturetan. Novo 398 eta Lipolase lipasak bezain
egonkorra ez bazen ere, bere aktibitatearen %80 gorde zuen 25 eta 30 ºC-tan eta
tenperatura igotzean 40 eta 45 ºC-taraino, aktibitatearen %50 gorde zuen 24
orduz beratzen utzi ondoren. Lipopan lipasak (16c. irudia) Novo 868 lipasaren
antzeko profila zuen 25 eta 37 ºC-tako tartean, bere aktibitatearen %70 gordez
24 orduz. Beratze-tenperatura igotzean entzimaren egonkortasuna gutxitu zen
%50era 40 eta 45 ºC-tako tartean, nahiz eta aktibitatearen jaitsiera Novo 868
lipasarena baino motelagoa izan.
Lipasa bakoitzarekin lortutako egonkortasun-emaitza esperimentalak
eredu matematikoetara egokitu ziren. Modu horretan lortutako ekuazioekin
entzima bakoitzaren erdibizitza lortu zen (10. taula). Kasu guztietan eredu
matematikorik egokiena esponentziala izan zen (Single exponential decay
model, EnzFitter, Biosoft 1999) 0.9 baino handiagoko erregresio-
koefizientearekin kasu gehienetan. Kontuan hartu behar da erdibizitza
kalkulatzeko aztertutako denbora-tarteak (24 ordu) lipasa batzuentzat oso motz
gelditzen direla, esaterako Novo 398 eta Lipolase lipasen kasuetan.
III. Emaitzak
84
10. taula. Ikertutako lipasen erdibizitza (ordu) hainbat tenperaturatan eta pH 7n beratzen utzitakoak.
Lipasak
T (ºC) OF Lipomod Novo 398 Lipolase Lipopan Novo 868 25 72.9 45.9 223.9 189.3 44.3 54.3
30 39.4 18.0 164.0 155.9 39.4 71.7
37 28.2 24.0 530.1 251.9 39.2 34.8
40 11.0 11.4 763.5 69.6 15.0 34.8
45 3.2 4.7 231.6 40.5 12.9 34.4
Izan ere, Novo 398 eta Lipolase lipasak oso egonkorrak dira eta euren
erdibizitzak luzeegiak dira era horren bidez neurtzeko. Emaitza hauek lipasa
hauen datuekin egokitze onak lortzeko zailtasunak islatzen dituzte, bi lipasa
hauen desaktibazioa oso txikia baita aztertutako baldintzetan eta aldakortasun
esperimentalak aktibitatean aurkitutako jaitsiera baino handiagoak izan
baitaitezke (Zanin eta de Moraes, 1998). Horregatik Novo 398 eta Lipolase
lipasentzat lortutako emaitzak lipasa hauek oso egonkorrak direla egiaztatzeko
besterik ez dira eta esan daitekeen gauza bakarra aztertutako baldintzetan
lipasa horiek oso egonkorrak izan zirela da.
Ikertutako lipasa gehienen erdibizitza, Novo 398rena izan ezik, 37 ºC-
tatik aurrera azkarrago gutxitu zen. Dirudienez, 37 ºC-tatik aurrera lipasak ez
ziren hain egonkorrak eta azkarrago desnaturalizatu ziren, euren aktibitate
entzimatikoa galduz. Pereira eta lankideek (2001) C. rugosa-ren lipasa baten
egonkortasun termikoa ikertu zuten eta 45 ºC-tan 1.33 ordutako erdibizitza
lortu zuten, ikerlan honetan OF eta Lipomod lipasentzat lortutakoen antzekoa,
45 ºC-tan 3.2 eta 4.7 orduko erdibizitzak lortu ziren, hurrenez hurren.
III. Emaitzak
85
1.6. Substratu-ereduen hidrolisia
Ikertutako lipasek katalizatutako erreakzioen ezaugarriak hobeto
aztertzeko eta lipasa horien artean hondakin-koipetsuak tratatzeko egokiena
aukeratzeko, hazi-olioa eta txerri-gantza erabili ziren hondakin-koipetsuen bi
motatako substratu-eredu moduan eta koipe horiek erabiliz hidrolisi-
erreakzioak egin ziren.
Hidrolisiaren baldintzak gero sakonago aztertu baziren ere, hasierako
erreakzioak lipasarik egokiena aukeratzeko jarraian adierazten diren
baldintzetan egin ziren:
Substratuen proportzioa: 50:50 gantz edo olio:ura (pisu:bolumena).
Koipeen proportzio handiegiak hidrolisi-maila baxuagoa eragin
baitzezakeen erreakzio-denbora bera erabiliz.
Erreakzio-tenperatura: 37 ºC, lipasa gehienen tenperatura optimoa baitzen.
Tenperatura honetan lipasa guztiek euren aktibitatearen %60 gorde zuten
24 ordutako egonkortasun azterketetan.
Gehitutako lipasa unitateak: 90 U lipasa/g substratu (A metodoa erabiliz
neurtuta). Virto eta lankideen (1991) eta Albasi eta lankideen (1997; 1999)
arabera, lipasa-unitate hauek hidrolisi-maila altuak lortzeko, %90 inguru
24 ordutan, eta hasierako orduetan erreakzioaren eboluzioa aztertzeko
nahikoak dira.
Erreakzio-bolumena: 500 mL.
Erreakzio-giro indargetu gabea, xaboien ekoizpena saihesteko. Udal-
sareko ura erabiltzea erabaki zen kostuak gutxitzeko. Virto eta lankideen
(1991) arabera udal-sareko uraren erabilerak ez zuen hidrolisi-maila
gutxitu eta antzeko emaitzak lortu ziren ur destilatu edo desionizatua
erabiliz.
Irabiaketa: 360 rpm, nahikoa emultsio egonkor eta homogeneoak
mantentzeko 24 orduz.
III. Emaitzak
86
“Material eta Metodoak” atalean (53. orr.) azaldu bezala, erreakzio-
nahasketaren laginak hartu ziren hainbat denbora tartetan hidrolisiaren
eboluzioa aztertzeko gantz-azido askeen ekoizpena eta hidrolizatu gabe
gelditzen ziren monoglizerido, diglizerido eta triglizeridoak neurtzeko.
1.6.1. Gantz-azidoen ekoizpena
Txerri-gantza eta hazi-olioa substratu moduan erabiliz hidrolisian
askatutako gantz-azidoak gas-kromatografiaren bidez neurtu ziren. Lortutako
datuekin erreakzioaren hasierako abiadura (mol askatutako GA minutuko)
kalkulatu zen hasierako 5 minututako datuekin (11. taula).
11. taula. Hidrolisi-erreakzioen hasierako abiadura (mol GAA/min) substratuen arabera.
Lipasa Hazi-olioa Txerri-gantza
Lipolase 123.05 ± 6.05 159.58 ± 7.98
Lipopan 107.42 ± 5.07 67.64 ± 3.38
OF 85.08 ± 4.25 56.55 ± 2.83
Lipomod 38.64 ± 1.93 41.57 ± 2.79
Novo 398 103.92 ± 5.20 123.10 ± 6.16
Novo 868 91.51 ± 4.58 68.63 ± 3.43
Neurtutako abiaduren arteko ezberdintasunak nabariak ziren, bai
entzimen artekoak bai substratuen artekoak, kasu guztietan lipasa-unitate
kopuru bera gehitu bazen ere (90 U/g koipe). OF, Lipopan eta Novo 868 lipasen
erreakzioaren hasierako bost minututan neurtutako abiadura handiagoa zen
hazi-olioaren hidrolisirako; Lipolase eta Novo 398 lipasen kasuan, berriz,
erreakzio-abiadura handiagoa zen txerri-gantzaren hidrolisirako. Lipomod
lipasak, bestaldetik, erreakzio-abiadura antzekoa izan zuen bi substratuekin.
Ezberdintasunen arrazoiak honako hauek izan daitezke: 1) lipasen aktibitatea
neurtzeko erabilitako entsegua oliba-olioa, polibinil-alkohola emultsifikatzaile
moduan eta pH 7n mantentzeko fosfato disoluzio indargetzailea erabiliz egin
zen, hidrolisi-erreakzioak, berriz, emultsifikatzailerik eta disoluzio
III. Emaitzak
87
indargetzailerik gabe egin ziren. Beraz, emultsioak guztiz ezberdinak ziren; 2)
honez gain, irabiaketa ere ezberdina zen eta honek eragin handia du eratutako
emultsioan. Aktibitate-entseguan irabiaketa orbitala erabili zen, hidrolisi-
erreakzioetan, berriz, helizezko irabiagailua.
OF eta Lipomod lipasen arteko ezberdintasunak hazi-olioaren hidrolisian
aztertzea interesgarria da. Izan ere, OF lipasak Lipomod lipasaren hasierako
erreakzio-abiadura bikoiztu zuen. Honen arrazoia C. rugosa-k sortzen dituen
isozima ezberdinetan egon daiteke. Lipasen prestakin komertzialak isozima
hauen nahasketak izan ditzakete eta honen ondorioz espezifizitate ezberdinak
erakutsi ditzakete. Esaterako, C. rugosa-ren A lipasak esterasa aktibitate
(tributirinarekin) handiagoa dauka; B lipasak, berriz, aktibitate handiagoa
erakusten du trioleinarekin (Rúa eta lank., 1993).
Lipasek nolabaiteko substratu-espezifizitatea zuten ala ez ikusteko,
erreakzioaren hasierako 5 minututan askatutako gantz-azido bakoitzaren
kantitatea neurtu eta une horretan askatutako gantz-azido guztiei zegokien
ehunekoa kalkulatu zen. Gantz-azido bakoitzaren askatutako portzentajea
substratu bakoitzak berez duen gantz-azido portzentajearekin alderatu zen (17.
irudia). Bi substratuak erabiliz gauza bera ikusi zen, lipasa guztiek azido
linoleikoa (C18:2) lehentasunez askatzen zutela, substratuetan baino portzentaje
handiagoan agertzen baitzen. Oro har, gantz-azido asegabeak lehentasunez
askatu ziren, substratuen berezko konposaketari zegokionez.
Txerri-gantzaren gantz-azidoak (C18:1 izan ezik) substratuaren berezko
konposaketari zegokion portzentaje antzekoekin askatzen zituen lipasa bakarra
Novo 868 (C. antarctica-ren A lipasa) izan zen. Aipatzekoa da lipasa honek
gainontzeko lipasek baino gantz-azido aseen proportzio handiagoa askatu
zuela.
III. Emaitzak
88
0
10
20
30
40
50
60
C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2
GA
(%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
C16:0 C18:0 C18:1 C18:2
GA
(%
)
17. irudia. Askatutako gantz-azido nagusien portzentajea (une horretan askatutako gantz-azido guztiei dagokienez) erreakzioaren hasierako 5 minututan: a) txerri-gantza edo b) hazi-olioa substratu moduan (beltzez dagoen zutabea) erabiliz. Ikurrak: substratuaren konposaketa gantz-azidotan; Lipasak: OF; Lipomod; || Lipolase; ≡ Novo 398; Novo 868; \\ Lipopan. Erreakzio-baldintzak: 50:50, koipe:ura proportzioa (pisu:bolumen), lipasa 90 U/g substratu, 37 ºC eta 360 rpm.
a)
b)
III. Emaitzak
89
Candida rugosa-ren (OF eta Lipomod) lipasek gantz-azidoak era berean
askatu zituzten. Lipasa hauek ez dute posizio-espezifizitaterik (Sonnet, 1988),
baina gantz-azido asegabeekiko espezifizitatea azaltzen dute. Novo Nordisk-ek
adierazi zuenez, T. lanuginosus-en lipasek (Lipolase eta Lipopan) sn-1 eta sn-3
posizioetarako espezifikoak dira, baita Novo 398 (H. insolens) ere. Candida
antarctica-ren A lipasa (Novo 868), berriz, sn-2 posizio-espezifizitatea duela
adierazi izan da (Rogalska eta lank., 1993). Lipolase, Lipopan eta Novo 398
lipasek ere era berean askatu zituzten gantz-azidoak eta C. rugosa-ren lipasekin
alderatuz gero, txerri gantzatik azido palmitiko eta palmitoleiko gutxiago
askatu zituztela ikus daiteke; eta oliotik, berriz, azido linoleiko gutxiago.
Azido linoleikoa TGen 3 posizioetan aurkitzen bada ere, landare olioetan
ugariago da sn-2 posizioan eta txerri-gantzan, berriz, sn-1 eta sn-3 posizioetan.
Bestalde, azido palmitikoa eta palmitoleikoa, batez ere, txerri gantzaren sn-2
posizioan aurki daitezke (Padley eta lank., 1994). Hau guztia lortutako
emaitzekin bat dator.
Bestaldetik, lehen esan bezala, Novo 868 lipasak gainontzeko lipasek
baino gantz-azido ase gehiago askatu zituen. Landare-oliotan eta koipetan
gantz-azido aseak kanpoko posizioetan (sn-1 eta sn-3) aurkitzen dira
normalean, Belitz eta Grosch-ek (1999) azaldu bezala. Txerri-gantzan, berriz,
azido palmitikoa, batez ere, sn-2 posizioan aurki daiteke (Padley eta lank.,
1994). Honek guztiak, lehen esan bezala, lipasa hau sn-2 posizio-espezifikoa
izateaz gain, gantz-azido aseekiko espezifizitatea duela pentsarazi dezake.
1.6.2. Glizerido partzialen determinazioa
Hazi-olioaren eta txerri-gantzaren hidrolisian zehar laginak ere hartu
ziren erreakzio-nahasketaren konposaketa karakterizatzeko, hau da, substratu,
bitarteko eta produktuak neurtzeko denboratarte ezberdinetan. Aztertutako
lipasek jokabide ezberdinak izan zituzten hidrolisian zehar 18. eta 19. irudietan
III. Emaitzak
90
ikus daitekeen bezala. Adibidez, 180 minututako erreakzioaren ondoren OF eta
Lipomod lipasak erabiliz, hazi-olioaren hidrolisi-nahasketan gantz-azidoak
%70-80 (pisuan) ziren eta %60-70 txerri-gantzarenak. Gainontzeko lipasek,
berriz, gantz-azidoen %30 edo %40 inguru besterik ez zuten askatu, kasu
guztietan gehitutako lipasa-unitateak berdindu baziren ere.
Erreakzioaren hasierako minututan, OF lipasak gantz-azidoak eta
diglizeridoak era paraleloan sortzen zituen, gero diglizeridoak pixkanaka
gutxitu ziren, monoglizeridoak, berriz, kontzentrazio minimoetan mantendu
ziren. Emaitza hauek bat datoz lipasa honen inespezifizitatearekin (Sonnet,
1988). Antzeko jokabidea Lipomod lipasaren kasuan aurki daiteke. Lipomod
Candida rugosa lipasaren beste prestakin komertziala baita. Bi lipasa hauek
landare-olioetan ugariago diren gantz-azido asegabeekiko nolabaiteko
espezifizitatea izan dezakete, hori dela eta landare-olioaren hidrolisi-
erreakzioak azkarragoak dira (Sonnet, 1988; Virto eta lank., 1994).
Gainontzeko lau lipasek antzeko jokabidea izan zuten: Erreakzioaren
hasierako minututan gantz-azidoak azkar askatu ziren (%20), honekin batera
diglizeridoen ekoizpena handituz (%30-40). Erreakzioaren 30 minututik aurrera
gantz-azido gutxi askatu ziren %35era iritsiz. Triglizeridoen degradazio motela
gertatzen bada ere, gantz-azido eta diglizeridoak sortuz, azken hauek
kontzentrazio finkoan mantentzen dira, pixkanaka hidrolizatzen baitira
monoglizeridoak emateko. Lipolase, Novo 398 eta Lipopan lipasek posizio-
espezifizitate nabaria dutela, baina ez dutela gantz-azido espezifizitate argirik
ematen du, bitartekoen eboluzioa oso antzekoa baita bi substratuak erabiliz.
Emaitza hauek Fu eta lankideek (1995) lortutakoekin bat datoz. Autore hauek
Aspergillus spp. eta Lipolase lipasek katalizatutako gantzen eta olioen hidrolisia
ikertu zuten eta Lipolasek %25eko hidrolisia lortu zuen bitartean, besteak %70
lortu zuen. Autore hauek emaitza hauei eman zioten azalpena T. lanuginosus-en
lipasak (Lipolase) duen sn-1 eta sn-3 posizio-espezifizitatean aurkitzen da.
III. Emaitzak
91
0102030405060708090
100
0 30 60 90 120 150 180
denbora (minutu)
Err
eak
zio
nah
ask
etar
en
ko
np
osa
ket
a (%
)
0102030405060708090
100
0 30 60 90 120 150 180
denbora (minutu)
Err
eak
zio
nah
ask
etar
en
ko
np
osa
ket
a (%
)
0102030405060708090
100
0 30 60 90 120 150 180
denbora (minutu)
Err
eak
zio
nah
ask
etar
en
ko
np
osa
ket
a (%
)
18. irudia. Lipasek katalizatutako erreakzioen substratu (x TG), bitarteko (∆ DG, MG) eta produktuen (◊ GAA) eboluzioa denboran zehar: …….….Hazi-olioa eta ____ txerri-gantza; Erreakzio-baldintzak: 50:50 koipe:ura proportzioa (pisu:bolumen), lipasa 90 U/g, 37 ºC, 360 rpm eta erreakzio-bolumena 500 mL. Lipasak: a) OF, b) Lipomod eta c) Novo 868.
a)
b)
c)
III. Emaitzak
92
0102030405060708090
100
0 30 60 90 120 150 180
denbora (minutu)
Err
eak
zio
nah
ask
etar
en
ko
np
osa
ket
a (%
)
0102030405060708090
100
0 30 60 90 120 150 180
denbora (minutu)
Err
eak
zio
nah
ask
etar
en
ko
np
osa
ket
a (%
)
0102030405060708090
100
0 30 60 90 120 150 180
denbora (minutu)
Err
eak
zio
nah
ask
etar
en
ko
np
osa
ket
a (%
)
20. irudia. Lipasek katalizatutako erreakzioen substratu (x TG), bitarteko (∆ DG, MG) eta produktuen (◊ GAA) eboluzioa denboran zehar: …….….Hazi-olioa eta ____ txerri-gantza; Erreakzio-baldintzak: 50:50 koipe:ura proportzioa (pisu:bolumen), lipasa 90 U/g, 37 ºC, 360 rpm eta erreakzio-bolumena 500 mL. Lipasak: a) Lipolase, b) Novo 398 eta c) Lipopan.
a)
b)
c)
a)
b)
c)
III. Emaitzak
93
Azkenik, produktibitatea kalkulatu zen entzimaren aktibitatea
erdibizitzaz biderkatuz (12. taula). Emaitzak kontuan hartuz gero, oso argi
ikusten da produktibitaterik handiena OF lipasarekin lortutakoa izan zela. Izan
ere, bere erdibizitza txikia izan arren, bere aktibitatea oso altua da eta egin nahi
den prozesua denbora laburrean (gehienez 24 orduetan) egin nahi dela kontuan
hartuta, hondakin koipetsuen hidrolisirako hau aukeratu zen.
12. taula. Ikertutako lipasen produktibitatea 30 ºC-tan.
Lipasak Aktibitatea
(kU/g) Erdibizitza
(ordu)
Produktibitatea
(mol GA/ g entzima)
OF 392 39.4 15444.8
Lipomod 320 18.0 5760.0
Novo 398 29.1 164.0 4772.4
Lipolase 28.6 155.9 4433.0
Lipopan 69 39.4 2718.6
Novo 868 2 71.7 143.4
III. Emaitzak
94
III. Emaitzak
95
2. ESTER METILIKOAK EKOIZTEKO ERABILITAKO LIPASEN KARAKTERIZAZIOA
Esterifikazio erreakzioak katalizatzeko hiru lipasa immobilizatu erabili
ziren. Lipasa hauek Novozymes-ek (Madril) bidali zizkigun gure
esterifikaziorako lipasen eskariari erantzunez: Novozym 435 (Candida
antarctica-ren B lipasa), Lipozyme TL IM (Thermomyces lanuginosus-en lipasa)
eta Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei-ren lipasa). Novozymes-ek lipasekin
batera euren fitxa teknikoak ere bidali zizkigun, bertan ezaugarririk
nabarmenenak eta ohiko erabilerak azaltzen zirelarik (“Material eta Metodoak”,
37. orr.). Lipasa hauek ester metilikoen sintesirako erabili dira, esaterako,
C. antarctica-ren eta R. miehei-ren lipasak (Nelson eta lank., 1996; Shimada eta
lank., 1999) eta T. lanuginosus-en lipasak (Lipozyme TL IM), Xu eta lankideek
(2004) deskribatu zuten bezala.
2.1. Esterifikazio aktibitatea
Bibliografian esterifikazio aktibitatea neurtzeko hainbat metodo egon
arren (13. taula), haien artean ez dago homogeneotasunik eta honen ondorioz
emaitzen alderaketa oso zaila izaten da. Batzuetan hidrolisi entseguak ere
erabili izan dira esterifikazio erreakzioetan erabiliko ziren lipasen aktibitatea
neurtzeko, baina kasu horietan jasotzen den informazioa guztiz ezberdina da ez
baita neurtzen esterifikazio aktibitatea (Domínguez eta lank., 2002). Gainera
hidrolisian esterifikazioan baino aktibitate handiagoa lortu ohi da lipasa bera
erabilita. Esaterako, Vaysse eta lankideek (2002) metanolarekin neurtutako
esterifikazio abiadura hidrolisi abiadura baino txikiagoa zela aurkitu zuten,
beste batzuen artean Candida antarctica eta Rhizomucor miehei-ren lipasak erabili
zutelarik. Ikertzaile hauen esanetan, ezberdintasun horren arrazoia esterifikazio
erreakzioetan gertatzen den uraren eta metanolaren arteko konpetentzian aurki
daiteke (hidrolisian gertatzen ez dena), edota azilo emailearen (gantz-azidoa
III. Emaitzak
96
ester metilikoaren ordez) ezaugarrietan. Ester metilikoen eta gantz-azido
askeen arteko ezberdintasun nabarmen bat disoziatutako gantz-azidoen eta
lipasaren gune aktiboaren karga negatiboen arteko elkarrekintza errepultsiboa
izan daiteke, Neves Petersen eta lankideek (2001) euren katapulta
elektrostatikoaren ereduan proposatu zuten bezala. Honek hidrolisiaren alde
egingo luke, baina esterifikazio erreakzioak oztopatu.
13. taula. Esterifikazio aktibitatea neurtzeko erabili diren hainbat erreakzio.
Erreakzioa Erreferentziak
Esterifikazioa (Azidoa + Alkohola→Esterra + Ura) o C12+propanola→propil-lauratoa o C8+oktanola→oktanil-oktanoatoa
o (Novo Nordisk, 2000c) o Hult eta Holmquist (1997)
Azidolisia (TG + GA→TG’ + GA’) o Ekilore-olioa+C10→TG C10rekin
o (Novo Nordisk, 2000a)
Interesterifikazioa (TG + TG’→TG’’) o Soja-olioa+triestearina→ TG’’
o (Novo Nordisk, 2000b)
Alkoholisia (TG+Alkohola→Esterra + Glizerola) o TriC18:1+metanola→MetilC18:1+glizerola
o Soumanou eta
Bornscheuer (2003a)
Goiko taulan ikus daitekeenez, esterifikazio erreakzioetan aktibitatea
neurtzeko oso metodo ezberdinak erabil daitezke eta lortzen dugun
informazioa erabat desberdina da. Horregatik, lipasa hauek alderatzeko
entsegu bakarra egitea erabaki zen eta zeudenen artean azido laurikoaren eta
propanolaren arteko erreakzioa neurtzen duena aukeratu zen (“Material eta
Metodoak”, 45. orr.). Entsegu horren bidez lortutako emaitzak eta ekoizleak,
Novozymes-ek, adierazitako aktibitateak 14. taulan ikus daitezke. Argi dago
adierazitako aktibitatearen eta neurtutakoaren artean ez dagoela harreman
zuzenik, batez ere, interesterifikazio entseguetan lortutako emaitzekin
alderatuta. Izan ere, enpresatan normalean aktibitatea ez da neurtzen lipasen
III. Emaitzak
97
arteko alderaketak egiteko, baizik eta lipasa bakoitzaren loteen arteko
ezberdintasunak ikusteko.
14. taula. Erabilitako lipasen esterifikazio aktibitatea.
Izen komertziala Jatorrizko
mikroorganismoa
Neurtutako aktibitatea
(PLU/g)a
Novozymes-ek adierazitako aktibitatea
Novozym 435
C. antarctica
(B lipasa)
3033.9±79.7 10000 PLU/ga
Lipozyme TL IM T. lanuginosus 498.3±95.5 75 IUN/gb
Lipozyme RM IM
R. miehei
1593.7±298.1 5-6 BAUN/gc
aPLU: Propil-Laurato Unitateak, “Material eta Metodoak” atalean (45. orr.) azalduta. bIUN: Interesterifikazio Unitateak (%0.01 (pisuan) eraldatutako triestearina/min (hasierako abiadura) hurrengo erreakzio-baldintzetan: substratua (guztiz hidrogenatutako soja-olioa/soja-olioa; 27/73, p:p), 70 ºC. Disolbatzaile organikorik gabe. Entzimaren kopurua: %10 (p:p) (1276b-GB fitxa, Novo Nordisk, 2000b). cBAUN: Batch Acidolysis Units Novo. Substratuak: Azido oleikoan aberastutako ekilore-olioa eta C10. Erreakzio-baldintzak: 70 ºC eta 60 minutuko erreakzio-abiadura olioaren sn-1 eta sn-3 posizioetan gehitutako azido dekanoikoa neurtuz lortzen da (347d-GB fitxa, Novo Nordisk, 2000a).
Emaitzen arabera erreakzio-baldintza hauetan aktibitaterik altuena izan
zuena C. antarctica-ren prestakin entzimatikoa, Novozym 435, izan zen. Bere
fitxa teknikoak dioenez oso egokia da ester eta amiden sintesirako. Taula-
oinean dauden oharretan ikus daitekeenez, Lipozyme RM IM eta Lipozyme
TL IM interesterifikazio eta azidolisi erreakzioetarako erabili izan dira, koipeen
konposaketa gantz-azidotan aldatzeko. Euren fitxa teknikoen arabera,
Lipozyme RM IM eta Lipozyme TL IM oso erabilgarriak dira triglizeridoen sn-1
eta sn-3 loturen arteko interesterifikazio erreakzioetan, esaterako, lipido
estrukturatuak eta koipe bereziak, kakao-mantekaren ordezkoaren bezalakoak,
ekoizteko (Xu eta lank., 1998; Zhang eta lank., 2001; Kim eta lank., 2002; Torres
eta lank., 2002; Xu eta lank., 2002).
III. Emaitzak
98
2.2. Tenperaturaren eragina aktibitatean
Esterifikazio aktibitatean tenperaturaren eragina neurtzeko
esperimentuak erreakzioaren tenperatura aldatuz, 30 ºC-tatik 80 ºC-tara, egin
ziren (20a. irudia). Kasu guztietan tenperatura handitu ahala aktibitatea
handitu zen, tenperatura jakin batera heldu arte (60-70 ºC). Hortik aurrera
aktibitatea jaitsi zen kasu guztietan, Lipozyme TL IM eta Lipozyme RM IM-ren
kasuetan nabarmenago izanik. Lipasen aktibitaterik altuenak 50-60 ºC tartean
aurki daitezke. Novozym 435-en aktibitaterik altuena, 4000 PLU/g inguru,
60 ºC-tan lortu zen, Lipozyme RM IM-k 2700 PLU/g inguru lortu zituen 50 ºC
eta 60 ºC tartean. Bestalde, Lipozyme TL IM-k bazeukan tenperatura
optimoaren tarte handiagoa, 40-60 ºC tartean lortu baitzuen aktibitaterik
handiena, 700 PLU/g inguru. Kasu guztietan 80 ºC-tan aktibitatea gutxitu zen.
Aktibazio-energia eta Q10 koefizientearen datuak Arrhenius
irudikapenen bidez kalkulatu ziren (15. taula). Horretarako zuzenaren
maldaren tarte negatiboa erabili zen (20b. irudia). Lehen aipatu bezala, 60 ºC-
tatik gora entzima guztien aktibitatea gutxitu zen, Lipozyme TL IM-ren kasuan
nabariago izanik.
Gandhi eta lankideek (1995) eta Yong eta Al-Duri-k (1996) aktibazio-
energia kalkulatu zuten R. miehei-ren lipasek katalizatutako esterifikazio
erreakzioetan 36.25 eta 24.7 kJ/mol lortuz, hurrenez hurren, gure ikerketa-
lanean lortutakoekin bat datozenak. Novozym 435-entzat lortutako Ea izan
ezik, besteak entzima disolbagarriekin katalizatutako erreakzioentzat
lortutakoak baino altuagoak dira.
III. Emaitzak
99
0
25
50
75
100
20 40 60 80
T (ºC)
Ak
tib
itat
ea (
%)
3.5
4.0
4.5
5.0
2.8 3.0 3.2 3.4
T-1 x103 (K-1)
Lo
g (
v0)
20. irudia. Aktibitate entzimatikoa tenperaturaren arabera: a) Aktibitatea eta tenperatura erlazionatzen duen kurba; b) Arrhenius irudikapena. Novozym 435, Lipozyme RM IM eta Δ Lipozyme TL IM.
15. taula. Arrhenius irudikapenaren bidez kalkulatutako aktibazio-energia (Ea) eta Q10 koefizientearen datuak
Lipasa T optimoa (ºC) Ea (kJ/mol) Q10
Novozym 435 60 8.8 1.1
Lipozyme TL IM 60 24.6 1.4
Lipozyme RM IM 70 20.1 1.2
a)
b)
III. Emaitzak
100
2.3. Substratuen kontzentrazioaren eragina aktibitatean
Azken urteotan gantz-azidoen eta alkoholen arteko esterifikazioaren
erreakzio-mekanismoa ikertzeko hainbat azterketa zinetiko egin dira.
Chulalaksananukul eta lankideek (1990) proposatu zuten lehen aldiz Ping Pong
Bi Bi mekanismoan oinarritutako eredua lipasak katalizatutako azido
oleikoaren eta etanolaren arteko esterifikaziorako. Erreakzioa katalizatzeko
R. miehei-ren lipasa immobilizatua (Lipozyme, 200 U/g, Novo Industri) erabili
zuten eta substratuak ondo disolbatzeko n-hexanoa gehitu zuten. Erreakzio
mota honetan (21. irudia), bi substratu eta bi produktu barne dituen Bi Bi
erreakzioan, entzimak lehen substratuarekin (kasu honetan azidoarekin)
erreakzionatzen du era kobalentean eraldatutako entzima sortzeko (azil-
entzima bitartekoa); jarraian ura askatzen da (lehenengo produktua), eta
alkohola (bigarren substratua) entzimarekin batzen da esterra askatuz bigarren
produktu bezala (Ping Pong mekanismoa):
21. irudia. Ping Pong Bi Bi erreakzio-mekanismoaren eskema, bi substratuen inhibizioa agertzen denean. E: entzima, F: eraldatutako entzima (azil-entzima), Segel (1975) moldatuta.
Autore beraiek alkoholak inhibizio konpetitiboa eragiten zuela frogatu
zuten. Azido oleikoak, ordea, ez zuen inhibiziorik eragiten aztertutako
kontzentrazioetan (60 mM arte). Ramamurthi eta McCurdy-k (1994) C. antartica-
E
C12 Ura
F
Metanola
Metanola C12
E-C12 F + ura F-metanola E + metilC12
ki1 ki2
E
MetilC12
E-metanola (inaktiboa) F-C12 (inaktiboa)
III. Emaitzak
101
ren lipasaren prestakin bat (Randozyme SP-435, Novo Industri) erabili zuten
azido oleiko eta metanolaren arteko esterifikazioaren zinetika ikertzeko. Ikerlari
horiek ere metanolak inhibizioa eragiten zuela ikusi zuten, azido oleikoak,
ordea, ez zuen inhibiziorik eragiten. Ikerketa horretan erabilitako
kontzentrazioa (200 mM) Chulalaksananukul eta lankideek (1990) erabilitakoa
(60 mM) baino altuagoa izan arren. Oktanolak ere inhibizioa eragiten zuen
C. antarctica-ren lipasa batek katalizatutako azido oktanoikoaren esterifikazioan
(Martinelle eta Hult, 1994). Hori guztia kontuan izanda, metanolaren eta azido
laurikoaren kontzentrazioen eragina lipasen erreakzio-abiaduran ikertu zen.
Azido laurikoaren, C12-ren, kontzentrazio finkoa mantenduz eta
metanolaren hainbat kontzentrazio (37.5-500 mM) erabiliz erreakzioaren
hasierako abiadura nola aldatzen zen 22. irudian ikus daiteke. Metanolaren
kontzentrazioa igo ahala, hasierako abiadura era proportzionalean igo zen
neurri bateraino. Hortik aurrera, metanolaren kontzentrazioa gehiago igoz
gero, abiadura igo beharrean jaitsi zen. Lipasa guztien hasierako abiadurarik
handienak substratuen gutxi gorabeherako proportzio ekimolarrak erabiliz
lortu ziren. Lineweaver-Burk, erreziproko bikoitzen, irudikapenean kurba
gorantz tolesten zen 1/v ardatzera hurbiltzen zenean. Metanolaren
kontzentrazio altuak erabiltzean kurba oso argi tolesten zen gorantz,
Ramamurthi eta McCurdy-ren (1994) arabera, metanolak eragindako substratu-
inhibizioa erakutsiz. Atal honetako irudietan bi emaitza mota ikus daitezke:
puntuak datu esperimentalak dira; marrak, berriz, Enzfitter programa
informatikoak (Biosoft, 1999) egindako egokitzeak. Azpimarratzekoa da
metanolak antzeko eragina duela 3 lipasengan, lortutako irudiak oso antzekoak
baitira.
III. Emaitzak
102
22. irudia. Lipasek katalizatutako esterifikazio erreakzioaren hasierako abiadura (1) metanolaren kontzentrazioaren arabera, C12ren kontzentrazio finkoa (250 mM) mantenduz, (2) Lineweaver-Burk irudikapena: a) Novozym 435, b) Lipozyme RM IM eta c) Lipozyme TL IM erabilita. Erreakzio-baldintzak: Substratuak 4 mL hexanon disolbatu ziren, 30 ºC-tan, 100 min-1 irabiaketa orbitala eta 10 mg entzima.
a1) a2)
b1) b2)
c1) c2)
III. Emaitzak
103
Azido laurikoaren (C12) kontzentrazioaren eragina, 6.25-500 mM tartean,
esterifikazioaren hasierako abiaduran metanolaren kontzentrazioa finkoa
mantentzen zenean, 23. irudian ikusten da. Azido laurikoak ere inhibizioa
eragiten zuen, metanolak egiten zuen moduan. Azido laurikoaren
kontzentrazioa igo ahala, hasierako abiadura igotzen zen maximo batera heldu
arte, hortik aurrera azido laurikoaren kontzentrazioaren igotzeak ez zuen
abiadura igotzen, jaitsi baizik. Lipasa guztien hasierako abiadurarik handienak
substratuen gutxi gorabeherako proportzio ekimolarrak erabiliz lortu ziren.
Segel-en (1975) esanetan, Ping Pong sistematan substratu biek
eragindako inhibizio konpetitiboa ohikoa da. Hau antzemateko, Lineweaver-
Burk irudikapenak egin ziren, substratu baten kontzentrazioa finkoa
mantenduz eta bestearena aldatuz Novozym 435 lipasa erabiliz (24. irudia).
Ikus daitekeenez, bi irudiak antzekoak dira. Kasu bietan, substratu finkoko
kontzentrazioa handitzearekin, zuzenaren malda ere handitu egiten da. Hau
inhibizio konpetitiboaren adierazle argia da. Gainera, substratu aldagarriaren
kontzentrazioa handitzearekin, zuzenak, 1/v ardatzera hurbiltzen direnean,
gorantz tolesten dira, substratu aldagarriaren inhibizioaren eraginez. Tolestura
edo kurba nabarmenagoa da substratu finkoaren kontzentrazio baxuetan, eta ia
desagertzen da kontzentrazio handienetan, inhibizio konpetitiboa denez, gaindi
daitekeelako. Metanolaren kontzentraziorik egokiena ez zen bera izan
ikertutako kasu guztietan, azido laurikoaren kontzentrazioaren araberakoa
baizik eta alderantziz. Hasierako abiaduraren eta metanolaren edo C12-ren
kontzentrazioaren alderantzizkoen irudikapena eratzen bada (25. irudia),
inhibitzaileak ez diren C12ren eta metanolaren kontzentrazio bakoitzeko
grafiko zuzenak lortzen dira eta metanolaren eta C12-ren kontzentrazio
baxuetan (37.5-125 mM) zuzen hauek paraleloak dira. Honek Ping Pong
erreakzio-mekanismoa egiaztatzen du (Segel, 1975). Metanolaren kontzentrazio
handiagoetan zuzenek bat egiten dute 24. iruditik antzeman daitekeen moduan.
Emaitza hauek erakusten dute Ping Pong Bi Bi erreakzio mekanismoan
III. Emaitzak
104
23. irudia. Lipasek katalizatutako esterifikazio erreakzioaren hasierako abiadura (1) C12-ren kontzentrazioaren arabera, metanolaren kontzentrazio finkoa (250 mM) mantenduz, (2) Lineweaver-Burk irudikapena: a) Novozym 435, b) Lipozyme RM IM eta c) Lipozyme TL IM erabilita. Erreakzio-baldintzak: Substratuak 4 mL hexanon disolbatu ziren, 30 ºC-tan 100 min-1 irabiaketa orbitala eta 10 mg entzima.
a1) a2)
b1) b2)
c1) c2)
III. Emaitzak
105
24. irudia. Novozym 435-ek katalizatutako esterifikazio erreakzioen Lineweaver-Burk irudikapena: a) Metanolaren kontzentrazioaren arabera C12ren hainbat kontzentrazio (mM) eta b) C12ren kontzentrazioaren arabera metanolaren hainbat kontzentrazio (mM) erabiliz: • 37.5, • 75, • 125, 187.5, ♦ 250, • 312.5, • 387.5, 437.5, ♦ 500 mM. Puntuak emaitza esperimentalak dira eta marrak Enzfitter (Biosoft, 1999) programa informatikoak Ping Pong ereduari egindako egokitzeak.
a)
b)
III. Emaitzak
106
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
-250 -200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200 250
[metanol]-1 x104 mM-1
1/
v0
x1
04 (
mo
l m
etil
C1
2*m
in-1
)*g
-1
0
20
40
60
80
100
120
140
-350 -250 -150 -50 50 150 250 350
[C12]-1x104 mM-1
1/
v0
x1
04 (
mo
l m
etil
C1
2*m
in-1
)*g
-1
25. irudia. Esterifikazio erreakzioaren hasierako abiadura Lineweaver Burk-en arabera inhibitzaileak ez diren metanolaren edo C12-ren kontzentrazioetan eta metanolaren (a) edo C12-ren (b) kontzentrazio baxuak erabiliz: o 31.25 mM, x 62.5 mM eta + 125 mM.
alkoholak eta azidoak entzimarekin konplexu inaktibo bat era dezaketela (E-
metanola edo E-azidoa, 21. irudia) (Chulalaksananukul eta lank., 1990;
Bousquet-Dubouch eta lank., 2001).
Inhibizioa dela eta, oso zaila egiten da erreakzio parametroak
kalkulatzea eredu-egokitzeak erabili gabe. Horregatik, Enzfitter (Biosoft, 1999)
a)
b)
III. Emaitzak
107
programa informatikoa erabili zen Novozym 435 lipasaren Vmax, Kmmet, KmC12,
kimet eta kiC12 lortzeko. Horrela lortutako baloreak 6081.12 molxmin-1xg-1,
563.99 mM, 371.47 mM, 238.74 mM y 208.28 mM izan ziren, hurrenez hurren.
kimet-ren balorea bigarren mailako irudikapenen bidez ere lor zitekeen eta
lortutako emaitza antzekoa zen, 206 mM.
Hanes irudikapena eginez gero, ([metanol]/v0 eta [metanol], 26. irudia),
C12ren kontzentrazio baxuak erabiliz, grafikoek bi zati ezberdin zituzten,
erabilitako prestakin entzimatikoan entzima bat baino gehiago egon zitekeela
adieraz zitekeena (Cadenas eta Sols, 1960).
0
1
2
3
4
5
6
7
0 100 200 300 400 500
[metanol] mM
[met
ano
l]/
v0
(
mo
l m
etil
C12
*min
-1)*
g-1
26. irudia. Hanes irudikapena, Novozym 435-ek katalizatutako azido laurikoaren eta metanolaren arteko esterifikaziorako, azido laurikoaren hainbat kontzentrazio (mM) erabilita: o 31.25, x 62.5.
Lehen esan bezala, Chulalaksananukul eta lankideek (1990), Ramamurthi
eta McCurdy-k (1994) eta Yong eta Al-Duri-k (1996) ez zuten ikertutako
kontzentrazioetan (60, 200 eta 20 mM, hurrenez hurren) azido oleikoak
eragindako inhibiziorik aurkitu. Kate-motzeko gantz-azidoek eragiten dute
inhibizioa. Esate baterako, Khrisna eta lankideek (2000) eta Khrisna eta
Karanth-ek (2001) isoamilbutiratoaren sintesia ikertu zuten alkohol
III. Emaitzak
108
isoamilikoak eta azido butirikoak eragindako inhibizioa aurkituz. Güvenç eta
lankideek (2002) lipasa immobilizatuen bidezko (Novozym 435 eta Lipozyme
RM IM) isoamilazetatoren ekoizpena ikertu zuten. Autore hauek bi substratuek
eragindako inhibizioa deskribatu zuten. Stamatis eta lankideek (1993)
Penicillium simplicissimum-en lipasa batek katalizatutako mentol eta C12ren
esterifikazioan C12k eragindako inhibizioa deskribatu zuten. Vázquez Lima eta
lankideek (1995) ere azido laurikoak eragindako inhibizioa aurkitu zuten. Kasu
honetan ikertzen zutena R. miehei-ren lipasa batek katalizatutako C12ren eta
geraniolaren arteko esterifikazioa zen eta C12k inhibizioa eragiten zuen 0.25 M
baino kontzentrazio handiagoan zegoenean. Ghandi eta lankideek (1995),
ordea, ez zuten C12k eragindako inhibiziorik aurkitu R. miehei-ren lipasa batek
katalizatutako C12ren (100-200 mM) eta butanolaren arteko esterifikazioan.
Hau guztia kontuan izanda, kate-luzera ezberdineko gantz-azidoen
kontzentrazioen eragina aztertzea erabaki zen. Horretarako azido laurikoaz
gain, azido butirikoa eta oleikoa erabili ziren. Emaitzak 27. irudian biltzen dira.
Espero zenez, azido butirikoak inhibizioa eragin zuen hiru lipasetan
aztertutako kontzentrazio guztietan (62.5-500 mM). Azido oleikoak, berriz, ez
zuen inhibiziorik eragin ikertutako kontzentrazioetan. Emaitza hauek ikusita
erabilitako gantz-azidoen kate-luzeraren garrantzia nabarmentzen da. Ikusten
denez, esterifikaziorako erabilitako gantz-azidoaren kate-luzera handitu ahala,
eragindako inhibizioa gutxitu edo desagertu egiten da.
III. Emaitzak
109
27. irudia. Lipasek katalizatutako esterifikazio erreakzioaren hasierako abiadura azido butirikoaren (1) eta oleikoaren (2) kontzentrazioen arabera, metanolaren kontzentrazio finkoa (250 mM) mantenduz: a) Novozym 435, b) Lipozyme RM IM eta c) Lipozyme TL IM erabilita. Erreakzio-baldintzak: Substratuak 4 mL hexanon disolbatu ziren, 30 ºC-tan 100 min-1 irabiaketa orbitala eta 10 mg entzima.
a1) a2)
b1) b2)
c1) c2)
III. Emaitzak
110
2.4. Tenperaturaren eragina lipasen egonkortasunean
Lipasen egonkortasuna ikertzeko lipasek beraiek, ester metilikoak
sortzeko, katalizatutako erreakzioen substratu edota produktu izan daitezkeen
likidoetan (oliotan, ester metilikoen nahasketa batean eta metanolean) beratzen
utzi ziren denbora tarte ezberdinetan gelditzen zitzaien aktibitatea neurtzeko.
Tenperaturaren eragina aktibitatearen egonkortasunean aztertzeko 3
lipasak ekilore-oliotan beratzen utzi ziren hainbat tenperaturatan (30, 40, 50 eta
60 ºC) 24 orduz eta zehaztutako denbora tartetan laginak hartu ziren (28.
irudia). Entsegu hauetan lipasek ez zioten ohiko desaktibazio termikoko
ereduari jarraitu. Kasu batzuetan aktibitatea gutxitu ordez, handitu egin zen.
Aztertutako tenperaturarik baxuena, 30 ºC, hartzen badugu aztergai, Novozym
435-en kasuan, aktibitatea lehenengo 4 orduetan jaisten bazen ere, hortik
aurrera aktibitatea igotzen zen, nahiz eta inoiz %100era iritsi ez. Lipozyme
RM IM-ren aktibitatea hasieran igotzen bazen ere (%140), bigarren ordutik
zortzigarren ordura arte %70era jaitsi zen, 24 ordu pasa eta gero berriro %80ra
igotzeko. Benetako aktibitate igoera izan zuena Lipozyme TL IM zen, hasierako
bi orduetan jaitsiera txikia bazuen ere, zortzi ordu pasa eta gero %180ko
aktibitatea zeukan, 24 ordu pasa eta gero %140n gelditzeko.
Hiru lipasen jokabidea guztiz ezberdina izan zen. Novozym 435-en
kasuan hasierako bi orduetan aktibitatea gutxitu zen tenperatura guztietan,
%85 30 ºC-tan eta %45 60 ºC-tan, gero aktibitatea berreskuratzeko. Esaterako,
60 ºC-tan 24 ordu beratzen utzi ondoren aktibitatearen %75 lortzen zen.
Lipozyme RM IM-ren kasuan, berriz, hasieran aktibitatearen igoera nabaritu
zen, 24 orduz beratzen utzi eta gero hondar-aktibitatearen %85-120 lortuz
tenperaturaren arabera. Bestaldetik, Lipozyme TL IM-k aktibitaterik altuena 8
ordu pasa eta gero lortu zuen %140 inguru mantenduz 24 ordu pasa ondoren
eta 30-50 ºC-tako tartean.
III. Emaitzak
111
0
20
40
60
80
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
0
50
100
150
200
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
0
50
100
150
200
250
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
28. irudia. Lipasen egonkortasuna tenperaturaren arabera: a) Novozym 435, b) Lipozyme RM IM eta c) Lipozyme TL IM, ekilore-oliotan beratzen utzita: ◊ 30 ºC, 40 ºC, Δ 50 ºC eta x 60 ºC-tan.
a)
b)
c)
III. Emaitzak
112
Arrazoi ezberdinak egon daitezke jokabide hauetarako. Alde batetik,
azalpena substratuaren barreiapenean egon daiteke. Izan ere, lipasa
immobilizatuak oliotan beratzen uztean, substratuaren barreiapena
euskarriaren barnean erraz daiteke. Samukawa eta lankideek (2000) ester
metilikoak sortzeko ikerlanean aurkitu zuten moduan: Novozym 435 beratzen
uzten zenean hasieran metiloleaton eta gero soja-olioan, guztira 12 ordu, ester
metilikoen ekoizpena %10-20 inguru igotzen zen. Autore hauek ematen zuten
azalpena euskarria metiloleatoz eta soja-olioz blai geratzen zela izan zen.
Chen eta Wu-k (2003) ere %6-8 inguruko igoera lortu zuten ester
metilikoen ekoizpenean, Novozym 435 oliotan eta ester metilikoetan beratzen
utzita 30 ºC-tan, hainbat denbora tartetan. Honekin lotuta, autore beraiek,
ekoizpen handiagoak lortu zituzten lipasa hainbat disolbatzailetan (hexano,
isopropanol, 2-butanol eta tert-butanol) eta soja-oliotan beratzen utzita.
Emaitzarik onenak, %20ko igoera, lipasa tert-butanolen ordubete eta gero soja-
oliotan beste ordubete beratzen utziz lortu ziren. MacKenzie eta Stevenson-ek
(2000) Novozym 435 bilgorrean utzi zuten hainbat egun 60 ºC-tan eta bere
aktibitatea igo zen bilgor-zatikapenean. Ban eta lankideek (2002) Rhizopus
oryzae-ren zelulaz kanpoko lipasa batek ez zuela ia aktibitaterik galtzen soja-
oliotan 96 ordu eta 35 ºC-tan uzten zenean aurkitu zuten.
Beste aldetik, Novozymes-ek (2005) Lipozyme TL IM-ri buruzko
liburuxka batean azaldu bezala, lipasa erabili baino lehen oliotan beratzen utzi
behar da euskarrian dauden aire-burbuilak kentzeko, era horretan lipasak bere
aktibitate osoa erakuts zezakeen.
Jokabide arraro honen ondorioz, ezin izan zen desaktibazioa eredu
matematiko bati egokitu, ezta erdibizitzarik kalkulatu. Dena den, irudietan
ikusten denez lipasak oso egonkorrak ziren.
III. Emaitzak
113
2.5. Ester metilikoen eragina egonkortasunean
Ester metilikoen eragina lipasen egonkortasunean ikertu zen, biodiesela
ekoizteko erreakzio etenetan pilatzen zirelako. Honen eragina aztertzeko
lipasak kate luzeko ester metilikoen nahasketa batean beratzen utzi ziren 30 ºC-
tan. Ikusten den bezala (29. irudia), ester metilikoen eragina ekilore-olioaren
eraginarekin alderatuz gero, hainbat datu interesgarri aurki dezakegu.
Adibidez, Lipozyme TL IM-ren kasuan aktibitatea igotzen zen hasierako 2-4
orduetan (%150) eta gero jaisten zen %100-120n geldituz. Baina, Novozym 435-
ek eta Lipozyme RM IM-k ez zuten inolako aktibitate-igoerarik jasaten. Izan ere,
bi kasu hauetan aktibitatea jaisten zen %75era Lipozyme RM IM-ren kasuan, eta
Novozym 435-enean %50 baino gutxiagora.
0
25
50
75
100
125
150
175
0 6 12 18 24
denbora (ordu)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
29. irudia. Lipasen egonkortasuna ester metilikoen nahasketa batean beratzen utzita 30 ºC-tan: Novozym® 435, Lipozyme® RM IM eta Δ Lipozyme® TL IM.
Baldintza berdinak erabiliz, baina ekilore-oliotan beratzen utzi zirenean
(28. irudia), lipasen 24 orduko hondar-aktibitateak altuagoak ziren: %140
Lipozyme TL IM-rentzat, %90 Lipozyme RM IM-rentzat eta %80 Novozym 435-
entzat. Ping Pong Bi Bi erreakzio-mekanismoa (Chulalaksananukul eta lank.,
1990) kontuan hartuz gero, erreakzio-giroan ester metilikoak daudenean azil-
III. Emaitzak
114
entzima konplexua sor zitekeen metanola askatuz eta honek entzima inaktiba
zezakeen. Entzima oliotan beratzen uzten denean, berriz, azil-entzima
konplexua sor bazitekeen ere, askatutako bitartekoak glizerido partzialak edo
glizerola izango lirateke. Lipozyme TL IM-ren kasuan, silika gelezko euskarria
duena, silika gelak askatutako metanol kopuru txikia adsorbi zezakeen eta
lipasaren aktibitatea mantenduko litzateke. Edo agian aurreko atalean azaldu
bezala, ester metilikoen nahasketa batean beratzean aire-burbuilak askatuko
lirateke eta horrexegatik hasierako orduetan aktibitatearen igoera ikusi zen.
Ban eta lankideek (2002) aurkitu zuten Rhizopus oryzae-ren zelulaz
kanpoko lipasa batek ere metiloleaton beratzean, aktibitatea oso azkar galdu
zuela, hasierako aktibitatearen %60 mantenduz 20 ordu pasata eta %10
mantenduz 96 ordu igaro eta gero.
2.6. Metanolaren eragina lipasen egonkortasunean
Metanolaren eragina lipasetan bi motatakoa izan daiteke: Alde batetik,
erreakzioaren substratua da eta kontzentrazio handietan substratu inhibizioa
gertatzen da. Bestaldetik, erreakzio giroan beste disolbatzailerik egon ezean,
metanola disolbatzaile hidrofilikoa izanik, lipasek behar duten ur-geruza bahi
dezake lipasak inaktibatuz. Metanolaren eragina egonkortasunean ikertzeko
lipasak metanolean beratzen utzi ziren hainbat denbora tartetan 30 ºC-tan.
Metanolak lipasak inaktibatzen zituen 30. irudian ikusten den bezala. Lipozyme
RM IM-k hasieratik galdu zuen bere aktibitate osoa. Lipozyme TL IM-ren
aktibitatea hasierako 30 minututan ia guztiz desagertu bazen ere, %5eko
hondar-aktibitatea gelditu zela ematen du. Novozym 435-en kasuan metanolak
denbora gehiago behar zuen lipasa inaktibatzeko, baina 60 minutu pasa eta
gero aktibitatearen %10 baino ez zen gelditu.
III. Emaitzak
115
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 30 60 90 120 150 180 210 240
denbora (min)
Ho
nd
ar-a
kti
bit
atea
(%
)
30. irudia. Lipasen egonkortasuna metanolean beratzen utzita 30 ºC-tan: Novozym 435, Lipozyme RM IM eta Δ Lipozyme TL IM.
Disolbatzaileak eta orokorrean konposatu likidoen polaritatea neurtzeko
erabiltzen den neurri bat log P partizio koefizientea da, P balorea
konposatuaren 1-oktanolaren eta uraren arteko partizio koefizientea izanik.
Erreakzio giroa soilik substratuek eta produktuek eratzen dutenean, fase
organikoaren log P-a substratuek eta produktuek beraiek ezartzen dute.
Goldberg eta lankideek (1990) eta Pirozzi eta Greco-k (2004) adierazi zutenez,
disolbatzailerik gabeko erreakzio-giroko log P-a substratuen polaritatearen
araberakoa da (e.b. metanola eta triglizeridoena erreakzioaren hasieran eta
bitartekoena erreakzioak aurrera egin ahala). Erreakzioaren konposatu
bakoitzaren polaritateak lipasaren eta fase likidoaren arteko uraren banaketa
alda dezake eta honek entzimaren aktibitatea alda dezake ere. Horregatik, eta
metanolak eragindako substratu-inhibizioagatik, esterifikazio esperimentuak
egitean guztiz garrantzitsua da metanolaren kontzentrazioaren kontrol zehatza
izatea.
III. Emaitzak
117
HONDAKIN KOIPETSUEN TRATAMENDUAK
1. HONDAR-GANTZEN ETA OLIOEN HIDROLISIA
Hidrolisi-erreakzioen hainbat baldintza ikertu ziren bi motatako
hondakin koipetsuen ahalik eta hidrolisi altuena lortzeko. Lehenik animalia-
gantzen hidrolisia ikertu zen eta ondoren erabilitako landare-olioena. Kasu
guztietan gutxienez %95eko hidrolisia lortu nahi zen ahalik eta entzima gutxien
erabilita. Gutxieneko hidrolisi-maila altua lortu behar da, bestela gantz-azido
askeen arazketa beharrezkoa litzateke.
Aurreko ataleko emaitzak eta prozesuaren erabilera industriala izan
daitekeela kontuan harturik, hurrengo hasierako baldintza orokorrak ezarri
ziren abiapuntu bezala:
Erreakzio tenperatura epelak, giro-tenperaturatik gertu eta 40 ºC baino
baxuagoak, kostu energetikoak gutxitzeko eta entzimaren desnaturalizazioa
saihesteko.
Fase urtsua indargetu gabe, udal-sareko ura erabiliz kostuak gutxitzeko.
Erreakzio denbora 48 ordu baino laburragoa, prozesua era industrialean
garatzeko.
Koipe:ura proportzio altua, koipeen kantitaterik handiena tratatu ahal
izateko eta fase urtsuan glizerolaren kontzentrazio altua lortzeko.
Ahalik eta entzima gutxien koipe gramoko, kostuak gutxitzeko. Izan ere,
entzimen prezioa altua izan daiteke.
III. Emaitzak
118
1.1. Animalia-gantzen hidrolisia
Lipasa guztien karakterizazioa egin eta gero, OF lipasa aukeratu zen
ikerlan honen erreakzio-baldintzetarako egokiena izan zitekeelakoan.
Animalia-gantzen hidrolisirako aztertu ziren baldintzak hurrengoak izan ziren:
- Gantza:ura proportzioa (p:b).
- Erreakzio-tenperatura (ºC).
- Gehitutako lipasa (U lipasa/g substratu).
- Erreakzio-denbora.
1.1.1 Gantza:ura proportzioaren eragina
Hau ikertzeko hainbat gantza:ura proportziorekin (10:90, 25:75, 50:50,
60:40, 75:25; p:b) egindako emultsioen hidrolisi-maila neurtu zen, erreakzioen
gainontzeko baldintzak honako hauek izan zirelarik: OF lipasaren 360 U/g
gantz (gure laborategian neurtutako unitateak, Meito Sangyo-k bidalitako
entseguaren araberakoak), 37 ºC eta 360 rpm-ko irabiaketa. Emaitzak 16. taulan
biltzen dira. Ikus daitekeenez, erreakzioaren hasierako orduetan gantza:ura
proportzioa igo ahala hidrolisia igo zen 50:50 proportziora heldu arte, hortik
aurrera hasierako hidrolisia ez zen hain altua izan gainontzeko baldintzak
finkoak mantendu arren. Proportzio hau erabiliz 7 ordutan %90 baino
gehiagoko hidrolisi-maila lor zitekeen eta 24 ordutan %97koa. Proportzio
altuagoekin, 60:40 eta 75:25, lortutako emaitzak ere aipatzekoak izan ziren, 24
ordu pasa ondoren, %96ko eta %94ko hidrolisi-mailak lortu baitziren, hurrenez
hurren. Gantzaren proportzio txikiagoekin (10:90 eta 25:75) hasierako erreakzio-
orduetan hidrolisi-maila baxuagoak lortu arren, %55 inguru, 24 ordu pasa eta
gero, proportzio handiagoekin lortutako emaitzen antzekoak ziren, %95 eta
%97, hurrenez hurren. Honen arrazoia gantzaren proportzio handiagoekin
(>25:75) eratutako emultsioa egonkorragoa zela izan daiteke, emultsio-mota
III. Emaitzak
119
solidoa eratuz eta hain egonkorra izanik, non irabiaketa ez baitzen beharrezkoa.
Erreakzio hauetan erabilitako irabiaketa, 360 rpm, nahikoa zen nahasketa
homogeneoak lortzeko eta mantentzeko gantzaren proportzio guztiekin. Albasi
eta lankideek (1999) ekilore-olioaren hidrolisia ikertu zuten eta irabiaketaren
eragina, 200-600 rpm, aztertu zuten. Irabiaketa-abiadura handitu ahala,
emultsio finagoa, ukipen-azal handiagoa eta hasierako abiadura handiagoa
lortzen zen. Hala ere, erreakzioa gelditu zutenean (150 min) lortutako hidrolisi-
mailak antzekoak izan ziren irabiaketa guztiekin, %80-90 tartean, hain zuzen
ere. Irabiaketa-abiadura 600 rpm baino gehiagokoa zenean, 150 minutu pasa eta
gero lortutako hidrolisi-maila %70 izan zen. Irabiaketa handiak zizaila-efektua
eta zurrunbiloak handi zitzakeen, horren ondorioz entzimaren egonkortasuna
gutxituz.
16. Lortutako hidrolisi-mailak (%*) erabilitako gantza:ura proportzioaren arabera.
Denbora
(ordu)
Gantza:ura (p:b)
10:90 25:75 50:50 60:40 75:25
2 54.89.1 58.32.7 82.70.6 73.11.6 71.61.6
4 -- 68.50.5 88.32.1 -- 83.70.9
7 69.53.9 -- 92.20.6 90.81.6 90.10.0
24 95.12.5 97.20.4 96.70.4 96.00.2 93.80.4
48 --** 97.60.3 97.80.2 96.20.5 93.90.2
Erreakzio-baldintzak: Lipasa OF 360 U/g gantz, 37 ºC, 360 rpm eta bolumen osoa 0.5 L.
* Non %, mol GAA/100 mol GAT baita. ** Datu hau ezin izan zen hartu, 24 orduko erreakzioa eta gero erreakzio-nahasketa ez baitzen homogeneoa, faseak bereizi ziren eta.
Hasierako bi orduetan lortutako hidrolisi-maila gantza:ura proportzioa
igo ahala igo zen 50:50 (p:b) proportziora heldu arte, hortik aurrera gutxitu
zen. Honek interfasearen eta emultsioaren ezaugarrien aldaketaren eragina
edota gantzaren kontzentrazio handiak eragindako substratu inhibizioaren
eragina adieraz zezakeen. Albasi eta lankideek (1997) olio uretan emultsioen
ezaugarriak aztertu zituzten. Autore hauen arabera olioa %60 baino gehiagoko
III. Emaitzak
120
pisu-portzentajean zegoenean fase-inbertsioa gertatzen zen, hau da, olio uretan
emultsioa izatetik ura oliotan emultsioa izatera pasatu zen, C. rugosa-ren
aktibitatea baldintza hauetan gutxituz. Al-Zuhair eta lankideek (2003) ere fase-
inbertsioa kontzeptua aipatu zuten, nahiz eta kasu honetan palma-olioa
erabiliz, fase inbertsioa %43 baino proportzio handiagoekin gertatuz. Autore
hauen arabera, fase-inbertsioa gertatzean entzimaren dispertsioa interfasean
murrizten da, entzima ur-tantatxoetan helduta baitago.
Kontuan hartzeko beste gauza bat gehitutako lipasa-unitateak gantz
gramoko kalkulatzen direla da. Beraz, substratu kontzentrazio baxuko
emultsioetan entzimaren kontzentrazioa fase urtsuan txikiagoa da eta honek
bere kokapena interfasean zail zezakeen. Era berean, fase urtsuaren bolumena
gutxitzeak interfase-azal txikiagoa eta entzima substratura iristeko traba
gehiago sor zitzakeen. Honez gain, gantzaren proportzioa igotzean eta urarena
jaistean, alderantzizko erreakzioa (pilatutako glizerolaren eta gantz-azido
askeen arteko esterifikazioa) eman daiteke (Iwai eta Tsujisaka, 1984), hidrolisi
erreakzioaren etekina jaitsiaraziz.
Gainontzeko erreakzio-baldintzak aztertzeko 50:50 (p:b) proportzio
finkoa erabiltzea erabaki zen, ikerlan honetan hidrolisi-mailarik altuenak
denbora laburrean eman zuelako eta jangarriak ziren zenbait animalia-gantzen
(de Renobales eta lank., 1992; Virto eta lank., 1991 y 1994) eta ekilore-olioaren
(Albasi eta lank., 1997; 1999) hidrolisi-erreakzioen ikerlanetan ere egokitzat
eman zutelako.
1.1.2. Tenperaturaren eragina
OF lipasaren erreakzio-tenperatura optimoa 35-40 ºC tartean dago,
“Lipasen karakterizazioa” atalean (71. orr.) azaldu bezala. Prozesua industrian
erabiltzekotan erreakzio-giroa berotzearen kostua kontuan hartu beharko
litzateke. Horregatik, oso interesgarria da erreakzioak giro-tenperaturan (25 ºC-
III. Emaitzak
121
tan) egiteko aukera izatea. Horregatik, animalia-gantzen hidrolisi-erreakzioak
25 eta 37 ºC-tan egin ziren, tenperatura optimoan eta giro tenperaturan
egindako erreakzioen emaitzak alderatzeko. Erreakzioaren hasieran hidrolisi-
mailak altuagoak ziren 37 ºC-tan, baina lortutako hidrolisi-mailarik altuena
antzekoa zen bi tenperaturatan (%95-97 inguru), 360 U/g gantz erabiliz 24
ordutan eta 180 U/g gantz erabiliz 48 ordutan (31. irudia).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 6 12 18 24 30 36 42 48
denbora (ordu)
Hid
roli
si-m
aila
(%
)
31. irudia. Lortutako hidrolisi-mailak (%*) tenperaturaren arabera: 25 ºC eta 180 U/g gantz, Δ 25 ºC eta 360 U/g gantz, 37 ºC eta 180 U/g gantz, 37 ºC eta 360 U/g gantz; 50:50 gantz:ur
(p:b) eta 360 rpm. * Non %, mol GAA/100 mol GAT baita.
Tenperatura baxuenean (25 ºC-tan) emultsioa solidoa, homogeneoa eta
egonkorra zen eta, behin emultsioa eratu, ez zen irabiaketarik behar. Lortutako
hidrolisi-mailen arabera ez du ematen irabiaketak eragin handirik duenik
bukaerako hidrolisi-mailetan. Hasierako abiaduran, berriz, eragina handia izan
dezake entzimaren, substratuen eta produktuen barreiapen motelagoa ematen
baita erreakzio-nahasketan. De Renobales eta lankideek (1992) animalia-gantz
komertzialen hidrolisia ikertu zuten gantzen fusio-puntua baino baxuagoko
tenperaturetan. Horretarako irabiatuz emultsio solidoak eratu zituzten eta
III. Emaitzak
122
ondoren erreakzio-nahasketa erreakzio-tenperaturan uzten zuten irabiatu gabe.
Autore hauek ikerlan honetan lortutako antzeko emaitzak lortu zituzten, %94ko
hidrolisi-maila idi-bilgorra erabiliz eta %97ko hidrolisi-maila txerri-gantza
erabiliz, OF lipasaren 180 U/g gehituz erreakzioa 30 ºC-tan eginez eta
ura:gantza proportzioa 50:50 (b:p) izanik, 24 orduko erreakzioan.
Ondorengo erreakzioak 37 ºC-tan egitea eta erreakzio-denbora 24
orduetara murriztea erabaki zen.
1.1.3. Gehitutako lipasaren eragina
Animalia-gantzen hidrolisirako gehitutako OF lipasaren kantitateak 90-
720 U/g gantz tartean egon ziren (17. taula). Lipasaren kantitaterik txikiena (90
U/g gantz) erabiliz %80ko hidrolisia baino ez zen lortu, nahiz eta 48 orduz utzi
erreakzionatzen. Substratu hau guztiz hidrolizatzeko behintzat 180 U/g gantz
behar ziren. Izan ere, 24 orduetarako %94ko hidrolisi-maila lortu zen. Lipasaren
kantitate handiagoa erabiltzean antzeko hidrolisi-mailak lor zitezkeen denbora
laburragoetan, adibidez, %95-96ko hidrolisia 6 ordutan, 540 edo 720 U/g gantz
erabiliz.
17. taula. Lortutako hidrolisi-mailak (%*) gehitutako lipasa-unitateen arabera.
Denbora
(ordu)
Gehitutako OF lipasaren unitateak (U/g gantz)
90 180 360 540 720
2 40.1±1.0 50.0±1.2 82.7±0.6 86.8±1.2 90.0±0.3
6 56.8±0.9 79.1±1.3 92.2±0.6 94.9±0.15 96.4±0.2
24 65.2±1.1 94.1±0.3 95.6±0.7 96.7±0.3 97.5±0.4
Erreakzio-baldintzak: gantza:ura proportzioa 50:50 (p:b), 37 ºC, 360 rpm eta bolumen osoa 0.5 L.
* Non %, mol GAA/100 mol GAT baita.
De Renobales eta lankideek (1992) %97 eta 94ko hidrolisi-mailak lortu
zituzten txerri-gantza jangarrirako eta idi-bilgor industrialerako, hurrenez
III. Emaitzak
123
hurren, OF lipasaren 180 U/g gantz erabiliz, 24 orduko erreakzioetan, gantz:
ura proportzioa 50:50 (p:b) eta 30 ºC-tan. Lipasa gehiago gehituta (360 U/g
gantz) hasierako orduetan hidrolisi-maila altuagoak lortu zituzten, baina 24
orduko erreakzioetan antzeko emaitzak lortu zituzten lipasaren bi kantitateak
erabilita. Ikerlan honetan erabilitako hondakin koipetsuak ez zirela hain
araztuak kontuan hartuta, antzeko emaitzen aurrean gaudela pentsa dezakegu.
Aurreneko bi orduetan hidrolisi maila igo egiten da entzimaren
kantitatea igo ahala. Albasi eta lankideek (1997) gehitutako OF lipasaren
eragina ekilore-olioaren hidrolisian ikertu zuten. Autore hauen arabera,
erreakzioaren hasierako abiadura entzimaren kontzentrazioarekin
proportzionala izateak, interfasean adsortzio-egoera egonkorra islatzen du,
asetasunera iritsi gabe. Kontzentrazio altuetan, aldiz, oreka lortzen da,
interfasea asetu egiten da, fase urtsuan dagoen gehiegizko entzima ezin da
interfasean kokatu eta ezin du erreakzioa katalizatu. Beraz, gehiegizko entzima
horrek ez du hidrolisi-maila handituko. Autore hauek asetasun-
kontzentrazioak kalkulatu zituzten hainbat olio-frakziotarako. Hala nola, %20,
35 eta 50 frakzioetarako 1000, 750 eta 500 U/g, hurrenez hurren. Dirudienez,
fase urtsu gehiago egotean entzima gehiago adsorbi daiteke. Gure kasuan eta
nahiz eta erreakzioen hasierako abiadura neurtu ez, gehitutako 360 U/g-tara
arte aurreneko bi orduetan hidrolisi-maila handitzen zela ikus daiteke. Hortik
aurrera, nahiz eta lipasa-unitate gehiago erabili, handitze hori ez da hain
nabarmena. Beraz, OF lipasaren 360 U/g baino gehiago gehitzeak ez zuen
hidrolisi-maila era nabarian hobetzen erreakzioaren lehenengo bi orduetan.
Emaitzak kontuan izanda eta erreakzio-denbora 48 ordu baino
laburragoa izan behar zela kontuan hartuta, lipasaren kantitaterik egokiena
gutxienez %95eko hidrolisi-maila lortzeko 180 U/g gantz izan zitekeela erabaki
zen.
III. Emaitzak
124
1.1.4. Saio erdi-pilotoa.
Aurreko ataletan lortutako emaitzak kontuan harturik, eskala
handiagoko hidrolisia aurrera eramateko hurrengo baldintzak egokiak izan
zitezkeela pentsatu zen: gantza:ura proportzioa 50:50 (p:b), OF lipasaren
180 U/g gantz, 25-37 ºC tarteko tenperatura eta emultsioa mantentzeko nahikoa
zen irabiaketa.
Gantzaren hidrolisia Inasmet Fundazioak duen 40 L-ko, palazko
irabiagailua zuen tanga-erreaktore batean egin zen. Azkenean bertan
erreakziorako aukeratutako baldintzak honako hauek izan ziren: 32 ºC, OF
lipasaren 180 U/g gantz, gantza:ura proportzioa 50:50 (p:b) eta 355 rpm-ko
irabiaketa, nahikoa zena emultsio homogeneoa mantentzeko. Kontuan hartu
behar da irabiaketa ez zela laborategiko erreaktoreen guztiz bezalakoa. Palazko
irabiagailua zuen 40 L-ko erreaktoreak eta laborategikoek, berriz, helizezkoak,
“Material eta Metodoak” atalean (48. eta 50. orr.) agertzen diren argazkietan
ikus daitekeen bezala. Hori dela eta, eratutako emultsioaren ezaugarriak ere
ezberdinak izan zitezkeen.
Ikus daitekeenez (18. taula), lortutako emaitzak laborategian lortutakoen
antza handia dute eta hobetu ere egin zituzten. Izan ere, laborategian 37 ºC-tan
eta 180 U/g gantz erabiliz %94 eta 95eko hidrolisia lortu zen 24 eta 48 ordutan,
hurrenez hurren. Berrogei litroko erreaktorean, aldiz, 7 ordutarako %94 eta 21.5
ordutarako %97ko hidrolisia lortu zen. Honen arrazoia irabiaketa-mota izan
daiteke. Izan ere, 40 L-ko erreaktorearen irabiagailuak emultsio finagoa sor
zezakeen, interfasean azalera handiagoa sortuz eta lipasak hobeto helduz
substratuari eta substratuaren eta entzimaren elkartrukatzea erraztuz. Honen
guztiaren ondorioz erreakzio-abiadura handiagoa litzateke.
III. Emaitzak
125
18. taula. Lortutako hidrolisi-mailak (%*) 40 L-ko erreaktorea erabiliz.
Denbora (ordu) Hidrolisi-maila (%)
0 24.90.2
3 86.80.2
7 93.80.1
21.5 96.90.1
24 96.90.1
28 96.80.0
48 97.20.1
Erreakzio-baldintzak: OF lipasaren 180 U/g gantz eta gantz:ura proportzioa 50:50 (p:b), irabiaketa 355 rpm, 32º C. Erreaktorearen lau gune ezberdinetatik hartutako
laginak denbora bakoitzeko. * Non %, mol GAA/100
mol GAT baita.
De Renobales eta lankideek (1992) 30 L-ko erreaktore batean egindako
erreakzioetan %98ko hidrolisia lortu zuten 24 ordutan txerri-gantza substratu
moduan erabiliz 30 ºC-tan OF lipasaren 180 U/g gantz gehituz, ikerlan honetan
lortutakoarekin bat datorrena. Albasi eta lankideek (1999) ekilore-olioaren
hidrolisia ikertzen zutelarik, erreakzioa eskala handiagoan errepikatzean
erreaktorearen geometria mantenduz gero, lortutako hidrolisi-mailak
mantenduko liratekeelako hipotesia eratu zuten.
1.1.5. Glizerolaren determinazioa ur-fasean
Glizerola oso interes handiko produktua da industria kimikoan (Young
eta lank., 1994) eta bere berreskurapena oso garrantzitsua da erreakzioaren
ikuspuntu ekonomikotik. Oro har, glizerolaren disoluzioak %95-98 inguruko
kontzentrazioa lortu arte kontzentratzen dira. Gantzaren hidrolisi
entzimatikoak Colgate-Emery metodoak baino albo-produktu gutxiago sortzen
duenez, hidrolisi entzimatikoa eginez glizerolaren berreskurapena errazagoa
III. Emaitzak
126
eta merkeagoa da. Honez gain, glizerolaren disoluzioa nahiko gardena zen,
nahiz eta animalia-gantza marroi-iluna zen, Colgate-Emery metodoak, berriz,
disoluzio ilun koloreduna sortzen du.
Lipasen bidezko hidrolisian sortutako glizerola neurtu zen %97ko
hidrolisirako glizerolaren kontzentrazioa fase urtsuan %12 ingurukoa
(120±4.5 g/L) izan zen. Emaitza hauek kalkulu teorikoekin bat datoz, formula
estekiometrikotik kalkula daitekeen moduan. Erreakzioa 250 g gantz edo olio
eta 250 mL ur nahastuz eginez gero, 0.29 mol TG (gantz) izango genuke.
Gantzaren %97 hidrolizatzen bada, 0.2853 mol glizerol lortuko lirateke, hau da,
26.25 g glizerol fase urtsuan (250 mL) disolbatuta egongo zirenak. Beraz,
glizerolaren kontzentrazioa 104.99 g/L litzateke. Glizerola neurtzeko metodo
entzimatikoak hainbat motatako laginen (ardoak, xaboiak…) glizerolaren
kontzentrazio baxuak neur dezake. Kasu honetan, fase urtsuko glizerola nahiko
kontzentratuta zegoen (>100 g/L) eta lagina diluitu behar izan zen (1/1000)
bere kuantifikaziorako (Boehringer-Mannheim, 1999), espero zenaren eta
emaitzaren arteko aldea azal zezakeena.
1.2. Erabilitako landare-olioen hidrolisia
Erabilitako landare-olioen hidrolisi-erreakzioak egiteko 50:50 (p:b)
olio:ura proportzioa erabili zen, animalia-gantzen hidrolisian emaitzarik
onenak lortu baitziren. Honez gain, hainbat autorek %40-60ko olio-
kontzentrazioen emultsioetan fase-inbertsioa aurkitu zuten (Albasi eta lank.,
1997; Al-Zuhair eta lank., 2003). Hau da, olio uretan emultsioa izatetik, ura
oliotan izatera pasatzen da. Egoera honetan, entzima ur-tantatxoetan helduta
dago eta lipasen aktibitatea gutxitu egiten da. Beraz, ikertu beharreko
baldintzak gehitutako OF lipasaren kantitatea eta erreakzio-tenperatura izan
ziren.
III. Emaitzak
127
1.2.1. Gehitutako lipasaren eragina
A olioaren hidrolisirako OF lipasaren 72-360 U/g olio erabili ziren.
Lipasaren kantitate txikienarekin lortutako hidrolisi-maila nabarmen gutxitu
zen (32a. irudia). B olioaren hidrolisirako gehitutako lipasaren kantitatea 36
U/g olio arte gutxitu zen, 24 ordutan %94ko hidrolisi-maila lortuz. Lipasaren 72
U/g olio erabiliz, berriz, %96ko hidrolisi-maila lortu zen. Beraz, A olioarekin
lortutako hidrolisi-mailekin alderatuz gero, B olioa erabiliz hidrolisi-maila
altuagoak lortzen zirela lipasa gutxiago gehituz ikus daiteke (32b. irudia).
Emaitza hauetan olioen ezaugarrien eragina nabari daiteke, hala nola,
konposaketa gantz-azidotan (A olioak B olioak baino gantz-azido aseen
kantitate bikoitza baitzuen), gutxiengo konposatuen eragina (konposatu
polarrak eta), eta abar. Erabilitako landare-olioen hidrolisia animalia-gantzen
hidrolisiarekin alderatuz gero, argi dago hidrolisi-maila berdinak lortzeko
lipasa gutxiago behar dela (17. taula, 122. orr.). Honen arrazoia OF lipasak
gantz-azido asegabeak, gantz-azido aseak baino errazago askatzen dituelako
izan daiteke (Ikusi “Lipasen karakterizazioa”, 86. orr.). Emaitza hauek
substratu-ereduen (txerri-gantza eta hazi-olioa) hidrolisian aurkitutakoekin bat
datoz. Hainbat autorek C. rugosa-ren lipasak azido oleikoarekiko eta cis-9 lotura
bikoitza duten beste gantz-azido batzuekiko nolabaiteko espezifizitatea duela
aurkitu dute (Sonnet, 1988; Virto eta lank., 1994), oliba-olioa entzima
honetarako substraturik egokiena izanik.
Honez gain, A olioaren hidrolisiaren erreakzioa eten eta gero, behin fase
urtsua eta fase koipetsua bereiztuta, hidrolizatutako laginak solidoak ziren
giro-tenperaturan. Erreakzioan zehar ere, biskositatearen gehikuntza nabaritu
zen hidrolisi-maila handitu ahala (%80ko hidrolisi-maila gainditu eta gero
agertzen zen fenomeno hau). Hoshino eta lankideek (1990) ere laginen
solidifikazioa nabaritu zuten kontzentratutako PUFA lortzeko Aspergillus niger-
en lipasa batek katalizatutako bakailao-gibelaren olioaren hidrolisian, hidrolisi-
maila %60 ingurura iristen zenean. Autore hauek fenomeno honi eman zioten
III. Emaitzak
128
0102030405060708090
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Hid
roli
si-m
aila
(%
)
0102030405060708090
100
0 4 8 12 16 20 24
denbora (ordu)
Hid
roli
si-m
aila
(%
)
32. irudia. Lortutako hidrolisi-mailak (%*) A (a) eta B (b) erabilitako landare-olioen hidrolisian gehitutako OF lipasaren unitateen (U/g olio) arabera: ∆ 36, 54, ◊ 72, 90, x 180, o 360 eta
720; 50:50 (p:b) olio:ura, 25 ºC eta 360 rpm. * Non %, mol GAA/100 mol GAT baita.
azalpena askatutako gantz-azido aseen lehentasunezko kristalizazioa gertatzen
zela izan zen. Izan ere, bakailao-gibelaren olioaren konposaketa gantz-azidotan
nahiko berezia da eta konposaketa gehiengoduna gantz-azido monoasegabe eta
poliasegabeek osatzen badute ere, gantz-azido aseen portzentaje aipagarriak ere
izan dezake, %21 inguru, Padley eta lankideen (1994) arabera. Honez gain,
hidrolisian zehar erreakzio-produktuen nahasketa (GAA; MG; DG; TG)
a)
b)
III. Emaitzak
129
portzentaje ezberdinetan sor zitekeen, fase eta fusio-puntu ezberdinetako
nahasketak sortuz (Larsson eta Quinn, 1994).
Erreakzioaren lehen orduan lortutako hidrolisi-maila eta bi olioei
gehitutako lipasaren kantitatea aztertuz gero, lipasaren kantitatea handitu ahala
hidrolisi-maila era berean handitzen zela ikus daiteke 100 U/g olio gehitu arte,
hortik aurrera gantz-azido askeen gehikuntza ez zen gehitutako lipasa-
unitatekiko proportzionala. Honek, lehen animalia-gantzen hidrolisian azaldu
bezala, interfasea entzimaz asetuta zegoela adieraz zezakeen. Honen ondorioz,
100 U/g olio baino gehiagoko entzima gehiegizkoa izango litzateke, ezin izango
lukeelako hidrolisi-maila era proportzionalean handitu, ez lukeelako
interfasean kokatzerik izango (Albasi eta lank., 1997). Kasu honetan interfasea
animalia-gantzen kasuan baino entzima gutxiagorekin asetuko litzateke. Yan
eta lankideek (2001) ere antzeko egoera bat aurkitu zuten OF lipasak
katalizatutako tuna-olioaren hidrolisian. Autore hauek OF lipasaren 360 U/g
olio baino gehiago gehitzean hidrolisi-maila ez zela handitu aurkitu zuten,
orekara iritsi baizik. Autore hauetaz gain, Noor eta lankideek (2003) SP 398
lipasak katalizatutako palma-olioaren hidrolisian eta Al-Zuhair eta lankideek
(2003) C. rugosa-ren lipasa batek katalizatutako palma-olioaren hidrolisian
gauza bera aurkitu zuten.
Olioak hidrolizatzeko animalia-gantzak hidrolizatzeko baino lipasa
gutxiago behar zela kontuan izanik, tenperaturaren eragina aztertzeko
lipasaren 90 U/g olio erabiltzea erabaki zen, bi olioen hidrolisirako egokia
baitzen 24 ordu edo gutxiago erabili behar izanik.
1.2.2. Tenperaturaren eragina
Tenperaturaren eragina aztertzeko hurrengo tenperaturak erabili ziren:
25, 30, 35 eta 40 ºC, A olioaren hidrolisia tenperatura guztietan aztertu zelarik
eta B olioa bakarrik 25 eta 30 ºC-tan. Hidrolisi-mailarik altuenak tenperatura
III. Emaitzak
130
baxuetan lortu ziren (25 eta 30 ºC, 19. taula), tenperatura horietan emultsioak
egonkorragoak zirelako segur aski. Tenperatura altuagoetan (>30 ºC) lan
egiteko, irabiaketa handitu behar zen (420 rpm) emultsioa homogeneoa
mantentzeko. Honez gain, lehen azaldu bezala, A olioaren emultsioa, behin
%80 inguruko hidrolisi-maila lortuta, partzialki solidifikatzen zen eta irabiaketa
arazoak agertzen ziren.
19. taula. Lortutako hidrolisi-mailak (%*) tenperaturaren arabera A eta B olioak erabilita.
Denbora (ordu) Olioa
T
(ºC) 1 2 3 5 8 24 48
25 43.1±1.8 -- 70.6±1.9 81.8±1.8 -- 94.8±1.9 95.1±1.6
30 46.4±2.5 -- 74.7±0.6 83.7±0.3 -- 92.7±0.6 91.2±2.5
35 46.3±0.9 -- 74.1±0.5 82.6±1.0 -- 90.3±1.0 87.3±1.2 A
40 49.4±2.5 -- 73.3±0.2 80.2±0.4 -- 87.4±0.4 80.9±0.9
25 -- 33.9±3.5 -- -- 78.5±0.5 94.4±0.6 93.8±0.4 B
30 -- 51.7±3.1 -- -- 88.3±0.3 94.2±0.6 91.6±2.4
Erreakzio-baldintzak: A olioaren hidrolisirako: OF lipasaren 90 U/ g olio, 50:50 (p:b) olio:ur eta 360 rpm-ko irabiaketa, 30 eta 40 ºC erabilita 420 rpm-ko irabiaketa; B olioaren hidrolisirako: OF lipasaren
54 U/ g olio, 50:50 (p:b) olio:ur eta 360 rpm-ko irabiaketa. * Non %, mol GAA/100 mol GAT baita.
Lehen esan bezala, A olioa hidrolizatzeko OF lipasaren 90 U/g olio
erabili ziren, B olioa hidrolizatzeko, berriz, 54 U/g olio besterik ez ziren erabili.
Bi olioen hidrolisiaren hasierako hidrolisi-maila altuagoa zen 30 ºC 25 ºC-tan
baino. Baina, erreakzio-denbora luzatzean erreakzioa moteldu zen eta honen
ondorioz, antzeko emaitzak lortu ziren 24 orduko erreakzioetan. Tenperatura
altuagoetan (>35 ºC) A olioaren hidrolisiaren errebertsioa ikus daiteke, 48
ordutan 24 ordutan baino hidrolisi-maila txikiagoak lortuz. Honen arrazoia
gantz-azido askeen kontzentrazioa handitzean alderantzizko erreakzioa,
esterifikazioa, alegia, hobestu zelako izan daiteke (Iwai eta Tsujisaka, 1984)
prestakin entzimatikoan isozima bat baino gehiago egon daitezkeenez (Rúa eta
lank., 1993), horietariko bat esterifikaziorako espezifikoagoa izan daitekeelako.
III. Emaitzak
131
1.2.3. Saio erdi-pilotoa
Erabilitako olioen hidrolisirako egokiak izan zitezkeen baldintzak behin
aztertuta, olioak aingurazko irabiagailua duen 5 L-ko tanga-erreaktorean
hidrolizatzea erabaki zen (6. irudia, 50. orr.). Erreakzioak A eta B olioekin egin
ziren, 25 ºC-tan, olio:ura 50:50 (p:b) proportzioa erabilita eta OF lipasaren
90 U/g olio gehituta. Emaitzak 33. irudian ikus daitezke. Erreaktore
txikiagoetan (500 mL-ko erreaktoretan) lortutako emaitzak lortu ziren, 24
ordutan %95eko hidrolisia lortuz. Hala ere, bi olioen hidrolisi-maila lehenengo
orduetan antzekoa bazen ere, A olioa hidrolizatu ahala erreakzio nahasketen
biskositatea handitu zen eta honek irabiatzeko arazoak sortu zituen. Honen
ondorioz, A olioaren hidrolisi-maila B olioarena baino txikiagoa izan zen
denboran zehar 0.5 L-ko erreakzioetan gertatu bezala.
0102030405060708090
100
0 3 6 9 12 15 18 21 24
denbora (ordu)
Hid
roli
si-m
aila
(%
)
33. irudia. Lortutako hidrolisi-maila (%*) 5 L-ko tanga-erreaktorea eta A eta ∆ B olioak erabiliz. Erreakzio-baldintzak: OF lipasaren 90 U/g olio, 25 º C, 50:50 (p:b) olio:ur, irabiaketa
360 rpm. * Non %, mol GAA/100 mol GAT baita.
Beraz, baldintzarik egokienak erabilitako olioen hidrolisirako honako
hauek izan zitezkeen: 50:50 (p:b) olio:ura proportzioa, 25 ºC, OF lipasaren
III. Emaitzak
132
90 U/g olio eta 360 rpm-ko irabiaketa, nahiz eta olio batzuekin, euren
ezaugarrien arabera, gehitutako lipasaren kantitatea jaitsi daitekeen, B
olioarekin gertatu bezala.
III. Emaitzak
133
2. ESTER METILIKOEN SINTESIA
Sarreran esan bezala, erabilitako landare-olioak biodieselaren
ekoizpenerako erabiltzeak interes handia sortu du, batez ere ingurumenarekin
lotutako onurak direla eta. Horrez gain, biodiesela entzimen bidez sortzeko
aukera are interesgarriagoa izan daiteke, lehen (“Sarrera” atalean, 17. orr.)
aipatutako ingurumenarekiko abantailak direla eta. Ester metilikoak
(biodiesela) sortzeko hainbat bide egon daitezke, ikerlan honetan erabilitakoak
34. irudian biltzen direnak izanik:
34. irudia. Ester metilikoak lipasen bidez ekoizteko erabilitako erreakzioak: a) Olioaren transesterifikazioa, b) Olio hidrolisatuaren (gantz-azido askeen) esterifikazioa. R’=CH3, R=gantz-azido hondarrak.
Erreakzioak disolbatzaile organikoak erabili gabe egin ziren, gero
prozesua industrian erabiltzeko aukera balego, ez bailitzateke gomendagarria
izango euren erabilera. Izan ere, disolbatzaile organikoak desabantaila ugari
dituzte: garestiak eta sukoiak izateaz gain, segurtasun neurriak betetzeak eta
bukaerako produktutik desagerrarazteak prozesua garestitzen baitute (Linko
eta lank., 1995; Dossat eta lank., 2002).
III. Emaitzak
134
2.1. Erreakzio etenak
Etenean egindako erreakzioak nola egin ziren “Material eta Metodoak”
atalean (51. orr.) azaltzen da. Erabilitako lipasek aktibitaterik handiena 50-
60 ºC–tako tartean bazuten ere (Ikusi “Lipasen karakterizazioa”, 98. orr.),
erreakzioak 30º C-tan egin ziren metanolaren lurrunketa saihesteko eta energia
gastua gutxitzeko.
Erreakzio bakoitzean prestakin entzimatiko bakoitzaren erabilitako
lipasa-unitateak berdindu nahi ziren, lipasen arteko emaitzak alderatu ahal
izateko, eta kasu bakoitzean gehitu behar zen entzimen kantitatea kalkulatzeko
euren esterifikazio aktibitateaz (PLU/g-z) baliatu ginen. Gehitutako lipasa-
unitateen eta gehitutako lipasa kantitateen (g lipasa/100 g olio) arteko
harremana 20. taulan ikus daiteke. Argi gelditzen denez, oso ezberdinak dira
gehitu behar diren lipasa bakoitzaren kantitateak, oso ezberdinak baitira
lipasen aktibitateak (PLU/g).
20. taula. Gehitutako lipasa-unitateen eta lipasa-kantitateen (g lipasa/100 g olio) arteko harremana.
Gehitutako lipasa (%, g lipasa/100 g olio)
Gehitutako lipasa-unitateak*
Novozym 435 Lipozyme RM IM Lipozyme TL IM
120 0.4 0.75 2.40
300 1 1.88 6.02
600 2 3.76 12.04
900** 3 5.65 18.06
1200 4 7.53 24.08
* Prestakin entzimatikoen batez besteko aktibitatea (PLU/g): Novozym 435 3033.9±79.7; Lipozyme RM IM 1593.7±298.1; Lipozyme TL IM 498.3±95.5 (“Lipasen karakterizazioa” 95. orr.). ** Esterifikazio erreakzioetarako bakarrik.
Bibliografian agertzen diren erreferentzietan gehitutako lipasen
kantitateak pisuaren ehunekoetan eman ohi dira. Hori dela eta, emaitzak beste
autore batzuen emaitzekin alderatzeko eta eztabaidatzeko aurreko taulan
agertzen diren lipasen ehunekoak erabiliko dira.
III. Emaitzak
135
2.1.1. Olioaren transesterifikazioa
Lipasek katalizatutako olioaren transesterifikazioa aztertzeko
erreakzioan eragina duten bi baldintza ikertu ziren: Alde batetik, metanola
gehitzeko eraren eragina eta beste aldetik, gehitutako lipasa-unitateen eragina.
2.1.1.1. Metanola gehitzeko eraren eragina
Transesterifikazio erreakzioaren estekiometria 1:3 (mol olio:mol metanol)
da. Metanolak lipasek katalizatutako esterifikazio erreakzioetan eragindako
substratu inhibizioa egiaztatu zenez (Ikus “Substratu kontzentrazioaren
eragina” atala (100. orr.)), metanolaren eragina ikertzeko 1, 2 edo 3 mol-
baliokide metanol gehitu ziren C oliora eta 24 ordu pasa eta gero, beharrezkoa
zenean, erreakzioa osatzeko falta zen metanola gehitu zen.
Erreakzioak katalizatzeko lipasa bakoitzaren 1200 PLU erabili ziren.
Erreakzioa osatzeko beharrezkoa den metanol guztia (3 mol-baliokide) batera
gehituz gero (35. irudia), soilik Lipozyme TL IM-k sor zitzakeen ester
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 3 6 9 12 15 18 21 24
denbora (ordu)
EM
(%
)
35. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (Erreakzio nahasketaren % pisuan) lipasa bakoitzaren 1200 PLU gehituta eta C olioaren eta metanolaren arteko proportzio estekiometrikoa (1:3; mol:mol) erabilita, 10 g olio, 100 oszilazio/min-ko irabiaketa eta 30 ºC. Erabilitako lipasak: Novozym 435, Lipozyme RM IM eta Δ Lipozyme TL IM.
III. Emaitzak
136
metilikoen kantitate handiak ikertutako baldintzetan (%96 EM 7 ordutan eta
%98 EM 24 ordutan). Novozym 435-ekin eta Lipozyme RM IM-rekin, berriz, 24
ordutan %31 eta %20 EM baino ez ziren lortu, hurrenez hurren.
Mol-baliokide bat metanol gehituta 3 lipasek %33 EM ekoitzi zuten,
baina denbora tarte ezberdinetan (36a. irudia). Lipozyme TL IM-k eta Lipozyme
RM IM-k hasierako orduetatik ekoitz zitezkeen ester metiliko guztiak ekoitzi
zituzten. Novozym 435-k, berriz, 6-24 ordu behar izan zuen erreakzioa
osatzeko. Honez gain, 24 ordu pasa ondoren gehitutako metanolak (beste 2
mol-baliokide) eragin ezberdina izan zuen 3 lipasengan. Lipozyme TL IM-k
%95 EM ekoitzi zuen metanola gehitu eta 5 ordutara, Novozym 435-k, berriz,
%80 EM ekoitzi zuen 24 ordu pasa eta gero. Lipozyme RM IM-k emaitzarik
baxuena eman zuen. Izan ere, bigarren aldiz gehitutako metanolak lipasa
inhibitu edo inaktibatu zuela ematen du, ester metilikoen ekoizpena %49n
geldituz.
Metanola gehitzeko era aldatuz gero, hasieran 2 mol-baliokide gehituz
(36b. irudia), bakarrik Lipozyme TL IM-k eta Novozym 435-k ekoitzi zituzten
%66 EM, 3 eta 24 ordutan, hurrenez hurren. Lipozyme RM IM-k, berriz,
inhibituta zegoela ematen du, %20 EM baino ez zuen ekoitzi eta. Erreakzioa
osatzeko falta zen metanola gehitzean (beste mol-baliokide bat metanol)
Lipozyme TL IM-k eta Novozym 435-k %90 baino gehiagoko ekoizpena eman
zuten, %95 eta %91, metanola gehitu eta ordubetera eta 24 ordutara, hurrenez
hurren.
III. Emaitzak
137
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 6 12 18 24 30 36 42 48
denbora (ordu)
EM
(%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 6 12 18 24 30 36 42 48
denbora (ordu)
EM
(%
)
36. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (Erreakzio nahasketaren % pisuan) metanola zatika gehitu zenean a) 1+2 mol-baliokide metanol eta b) 2+1 mol-baliokide metanol; 10 g C olio, 30 ºC, 100 oszilazio/min. Lipasak (1200 PLU): Novozym 435, Lipozyme RM IM eta Δ Lipozyme TL IM. Geziek falta zen metanola noiz gehitu zen adierazten dute.
2.1.1.2. Gehitutako lipasa-unitateen eragina
Aurreko atalean lortutako emaitzek metanola gehitzeko erak eragin
handia duela ekoitzitako ester metilikoetan egiaztatzen dute. Horrexegatik
gehitutako lipasa-unitateen eragina aztertzeko metanola kantitate txikiagotan,
mol-baliokide bat metanol 24 orduro, gehitzea eta erreakzioa hainbat lipasa-
a)
b)
III. Emaitzak
138
unitate (120, 300 eta 600 PLU) erabilita egitea erabaki zen, 37. irudian ikus
daitekeen bezala. Aztertutako lipasen 120 PLU-k ez ziren nahikoak erreakzioak
osatzeko, %30, 35 eta 55 ester metiliko besterik ez baitziren ekoitzi, Novozym
435, Lipozyme RM IM eta Lipozyme TL IM erabilita, hurrenez hurren. Lipasen
unitateak 300 PLU-tara igoz gero, ester metilikoen ekoizpena hobetu zen %45,
%50 eta 85era iritsi zirelarik, Novozym 435, Lipozyme RM IM eta Lipozyme TL
IM erabilita, hurrenez hurren. Hala ere, ez ziren %95era iritsi. Ester metilikoen
%95eko ekoizpenak edo handiagoak lortzeko gutxienez 600 PLU behar ziren.
Lipasa-unitate horiek erabilita, Lipozyme TL IM-k %98, Novozym 435-ek %90
eta Lipozyme RM IM-k %75 EM ekoitzi zuten.
Novozym 435-en kasuan, nahiz eta erreakzioaren hasierako unetan
edozein kantitate erabilita ezberdintasun handirik egon ez, 300 eta 600 PLU
gehituta %33 lortu zen, baina 120 PLU gehituta %30 besterik ez zen lortu. Gero
erreakzioa osatzeko falta zen metanola (mol-baliokide bat 24 orduro) gehitzean,
120 eta 300 PLU erabilita ez zen hobekuntza handirik lortu, bakarrik %30 eta 40
EM ekoitzi baitziren, hurrenez hurren. Unitate gehiago, 600 PLU, gehituta %90
EM lortu ziren.
Lipozyme RM IM-ren kasuan, 120 PLU erabilita %35eko ekoizpena
besterik ez zen lortu eta erreakzioa bertan gelditu zen, aldaketarik izan gabe
metanol gehiago gehitu arren. Lipasa-unitate gehiago gehituta mol-baliokide
bat metanol guztiz agortu zen ekoizpen osoa lortuz, baina bigarren mol-
baliokidea gehitu eta gero 300 PLU erabilita ez zen %66ra iritsi, %50ean gelditu
zen eta azken mol-baliokidea gehitu ondoren ez zen aldaketarik ikusi. Lipasa-
unitate gehiago erabilita, 600 PLU erabilita, alegia, bigarren mol-baliokidea
gehitu ondoren ekoizpen osoa (%66) lortu zen 24 ordutan, baina azken mol-
baliokidea gehitzean erreakzioa gelditu zen, ester metiliko gehiago ekoitzi gabe.
III. Emaitzak
139
0102030405060708090
100
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
denbora (ordu)
EM
(%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
denbora (ordu)
EM
(%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
denbora (ordu)
EM
(%
)
37. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (Erreakzio-nahasketaren % pisuan) gehitutako lipasa-unitateen arabera. Erreakzio-baldintzak: mol-baliokide bat metanol 24 orduro gehituta, 10 g C olio, 30 ºC eta 100 oszilazio/min. Lipasak: Novozym 435, Lipozyme RM IM eta Δ Lipozyme TL IM: a) 120, b) 300 eta c) 600 PLU. Geziek falta zen metanola noiz gehitu zen adierazten dute.
a)
b)
c)
III. Emaitzak
140
Lipozyme TL IM-ren hiru kantitateak erabilita lehenengo mol-baliokidea
gehituta ahal ziren EM guztiak ekoitzi ziren (%33 inguru) 6 ordu igaro baino
lehen. Bigarren mol-baliokidea gehituta soilik 300 eta 600 PLU erabilita lortu
zen ekoizpen osoa (%66), 120 PLU erabilita %50 besterik ez zen lortu eta.
Bigarren mol-baliokidea gehitu eta gero erreakzio-abiadura moteldu zen, 300
PLU erabilita 24 ordu behar ziren erreakzioa osatzeko eta 600 PLU erabilita 3-6
ordu. Hirugarren mol-baliokidea gehituta 600 PLU behar ziren ekoizpen osoa
lortzeko, %95 3-6 orduko erreakzioan eta %98 24 orduko erreakzioan.
Emaitza hauetatik ondoriozta daitekeenez metanola gehitzeko erak
eragin handia du lortutako emaitzetan. Novozym 435 erabilita, metanola
gehitzeko erak badu eragina ekoitzitako ester metilikoetan: %90 lortu ziren 600
PLU erabilita (metanola 1+1+1 gehituta) eta %95 1200 PLU erabilita (metanola
2+1), 72 eta 48 ordutan, hurrenez hurren. Emaitza hauek zenbait autoreren
emaitzekin bat datoz. Shimada eta lankideek (1999) eta Watanabe eta lankideek
(2000) Novozym 435 (%4, g/100 g substratu) erabili zuten soja eta koltza-olioen
metanolisia katalizatzeko eta metanola 3 zatitan gehituta %95eko konbertsioa
lortu zuten. Shimada eta lankideek (1999) erabilitako Novozym 435-en
kantitatea gutxitu zuten (%2) eta antzeko emaitzak lortu zituzten, nahiz eta
erreakzioa osatzeko denbora luzatu 6 ordutatik (%4 lipasa erabilita) 24
ordutara. Autore beraiek lipasaren inaktibazioa ikusi zuten metanolaren 1.5
mol-baliokide baino gehiago batera gehitzen zirenean. Watanabe eta lankideek
(2001) antzeko emaitzak lortu zituzten erabilitako olioaren metanolisian
Novozym 435-en %4 erabiliz eta metanola hiru unetan gehituz (0, 10, eta 24
ordu), %90.4 EM lortu zutelarik.
Lipozyme RM IM-rentzat metanola gehitzeko erak izugarrizko eragina
du eta oso baliagarria izan daiteke mol-baliokide bat metanol hainbat orduro
gehitzea ester metilikoen ekoizpena hobetzeko lipasa kantitate gutxiago
erabilita. Bibliografian agertzen diren Lipozyme RM IM-ren bidez
katalizatutako metanolisi gehienetan gutxienez prestakin entzimatiko honen
III. Emaitzak
141
%10 (g lipasa/100 g substratu) erabili izan da (Nelson eta lank., 1996;
Soumanou eta Bornscheuer, 2003 a/b). Bakarrik Stevenson eta lankideek (1994)
erabili zituzten entzima honen kantitate askoz txikiagoak (%1.25) bilgorraren
metanolisia ikertzean, metanola 10 zatitan gehitzen zutelarik eta %91eko
konbertsioa lortuz. Hala ere, ikerketa-lan horretan erreakzio-girora silika-gel
gehitu zen ekoitzitako glizerola euskarriari ez itsasteko, eta era horretan
substratu eta produktuen barreiapen arazoak ekiditeko.
Lipozyme TL IM-k berriz, 1200 edo 600 PLU erabiliz emaitza bera lortu
zuen (>%95 EM), metanola gehitzeko erak eragina bakarrik zuela erreakzio-
denboran. Soumanou eta Bornscheuer (2003 a/b) Lipozyme TL IM-ren %10
erabili zuten ekilore-olioaren (a) eta kotoi-olioaren (b) metanolisian, mol-
baliokide bat metanol gehituta 5 orduro, %60ko konbertsioa lortuz 30 orduko
erreakzioetan, ikerketa-lan honetan lortutako emaitzak baino askoz baxuagoak.
Xu eta lankideek (2004), berriz, soja-olioaren metanolisia Lipozyme TL IM-ren
bidez katalizatu zuten, metanola 3 zatitan gehituz eta lipasaren %4
(g lipasa/100 g substratu) erabiliz. Lehenengo bi erreakzioak guztiz osatzen
baziren ere, azken mol-baliokide metanol gehitu ondoren ester metilikoen
%98ra iristeko lipasaren %10 behar zen, gure emaitzekin bat datorrena.
Ikerlan honetan gehitutako lipasa-unitateak berdindu baziren ere,
gehitutako lipasa bakoitzaren kantitatea (ikusi 20. taula) oso ezberdina zen eta
honek transesterifikazio-erreakzioetan ikusitako ezberdintasunak azal ditzake
neurri batean. Honekin lotuta ez litzateke ahaztu behar euskarriaren eragina,
oso gutxi ikertu bada ere. Rosevear eta lankideen (1987) arabera euskarriaren
ezaugarriek erreaktiboen faseen arteko zatikatzea baldintza dezakete.
Euskarriak eta erreaktiboren bat antzeko karga izanez gero, errepultsioa gerta
daiteke eta erreaktibo horren kontzentrazioa baxuagoa izango da euskarriaren
alboan, eta alderantziz.
III. Emaitzak
142
Adlercreutz-en (1996) arabera euskarri ezberdinak erabiliz aurkitutako
aktibitate ezberdinak masa-transferentzia arazoei edo ura, substratu edo
produktuen zatikapen eraginei egotzi ahal zaizkie. Honez gain, Rosevear eta
lankideekin (1987) bat datozen ondorioak aurkitu zuen, hala nola, substratua
eta euskarria hidrofobikoak badira, substratua euskarrian kontzentratuko da.
Honek aktibitatea handi dezake edo gutxitu substratu inhibizioa gertatuz gero.
Halaber, Du eta lankideek (2005) euskarriaren eragina frogatu dute soja-
olioaren transesterifikazioan, Lipozyme TL IM lipasa erabiliz eta metanola 3
unetan gehituz. Autore hauen arabera, prestakin entzimatiko honen kantitatea
handitu ahala, lortutako EM handitu ziren. Izan ere, lipasaren %2-10 bitarteko
kantitateak erabili zituzten lortutako emaitzak hurrengoak izanik: %50 EM, %60
EM, %75 EM, >%90, lipasaren %2, %4, %6, eta %8 edo 10 erabiliz. Euskarriaren
eragina aztertzeko %6 silika gel gehitu zen erreakzio girora bertan lipasaren %4
egonik. Erreakzioaren abiadura hobetzeaz gain, lortutako emaitzak lipasaren
%10ekin lortutakoen bezain altuak izan ziren (>%90). Honek guztiak, erreakzio
girora gehitutako euskarriaren eragina nabarmentzen du. Beraz, gure
ikerlanean, nahiz eta gehitutako lipasa unitateak berdindu, lipasa bakoitzaren
gehitutako kantitate (% pisuan) ezberdinek lortutako emaitzen arteko
ezberdintasun hau azal dezakete, neurri batean.
Erreakzioen eboluzioa ikusteko eta emaitzei azalpena emateko DG eta
TG-en eboluzioa erreakzioan zehar aztertu zen. Aztertutako erreakzioak lipasa
bakoitzaren 1200 PLU erabilita eta metanola 3 eratan gehituta eta 600 PLU
erabilita eta mol-baliokide bat metanol 24 orduro gehituta egin ziren. Emaitzak
38, 39 eta 40. irudietan biltzen dira Novozym 435, Lipozyme RM IM eta TL IM-
rentzat, hurrenez hurren.
Novozym 435-ek katalizatutako erreakzioetan (38. irudia) hasierako
unetan ia gauza bera gertatu zen aztertutako 4 egoeratan: TG erdiraino jaitsi
ziren (600 mol/g olio ingurura) eta 400 mol/g olio inguru DG ekoitzi ziren.
Erreakzioa aurrera joan ahala ezberdintasunak agertu ziren. Esaterako, 3 mol-
III. Emaitzak
143
baliokide metanol batera gehitzean TGen degradazioa eten egin zen, baita
DGena ere. Dirudienez, entzima inaktibatu egin zen metanolaren eraginez.
Metanola zatika gehitzean TG degradatu ziren erreakzio osoan zehar, hasierako
degradazio azkarraren ondoren degradazio mantsoagoa eman zelarik. DGen
kasuan antzeko egoera ikus daiteke. Ekoitzitako DG poliki poliki degradatu
ziren EM sortuz eta erreakzio guztietan oso MG gutxi ekoitziz (<%3).
Lipozyme RM IM-k katalizatutako erreakzioetan (39. irudia)
ezberdintasun ugari ikus daitezke metanola gehitzeko eraren arabera:
Erreakzioen hasierako unetan ia TG guztiak oso azkar degradatu ziren mol-
baliokide metanol bakarra gehitzean, baina 2 edo 3 mol-baliokide metanol
gehituz gero, TGen erdia baino ez zen degradatu eta honez gain, erreakzioa
aurrera joan ahala TG gehiago sortu ziren (agian interesterifikazioak eraginda)
eta erreakzioa eten egin zela ematen du. Mol-baliokide bakarra metanol
gehitzean DG pilatu ziren (600 mol/g olio inguru) falta zen metanola gehitu
arte. Dena den, azken kasu honetan 600 PLU ez ziren nahikoak erreakzioa
erabat osatzeko. Bi edo hiru mol-baliokide metanol gehituz gero, DGen
ekoizpena txikiagoa izan zen eta pilatu egin ziren, erreakzioa gelditu zelarik.
Lipozyme RM IM-k DGez gain MG ere ekoitzi zituen.
Lipozyme TL IM-k katalizatutako erreakzioetan (40. irudia) TG ia guztiz
degradatu ziren hasierako unetatik aztertutako lau egoeretan. Kasu guztietan
DG pilatu ziren erreakzio giroan, nahiz eta hauek ere guztiz degradatu
erreakzioa joan ahala eta kasu bakoitzean falta zen metanola gehitu ahala.
DGez gain MG ere pilatu ziren erreakzioaren hasieran gero guztiz
degradatzeko.
III. Emaitzak
144
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
denbora (ordu)
DG
(
mo
l/g
oli
o)
0
200
400
600
800
1000
1200
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
denbora (ordu)
TG
(
mo
l/g
oli
o)
38. irudia. Novozym 435-ek katalizatutako erreakzioen a) DG-en eta b) TG-en eboluzioa denboran zehar. Erreakzio-baldintzak: 10 g C olio, 30 ºC, 100 oszilazio/min. Erabilitako lipasa-unitateak eta gehitutako metanola: 1200 PLU erabilita: mol-baliokide bat metanol eta 24 ordu ondoren beste 2, bi mol-baliokide metanol eta 24 ordu ondoren beste bat, Δ 3 mol-baliokide metanol batera, x 600 PLU erabiliz mol-baliokide bat metanol 24 orduro. Geziek erreakzioa osatzeko falta zen metanola noiz gehitu zen adierazten dute.
a)
b)
III. Emaitzak
145
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
denbora (ordu)
DG
(
mo
l/g
oli
o)
0
200
400
600
800
1000
1200
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
denbora (ordu)
TG
(
mo
l/g
oli
o)
39. irudia. Lipozyme RM IM-k katalizatutako erreakzioen a) DG-en eta b) TG-en eboluzioa denboran zehar. Erreakzio-baldintzak: 10 g C olio, 30 ºC, 100 oszilazio/min. Erabilitako lipasa-unitateak eta gehitutako metanola: 1200 PLU erabilita: mol-baliokide bat metanol eta 24 ordu ondoren beste 2, bi mol-baliokide metanol eta 24 ordu ondoren beste bat, Δ 3 mol-baliokide metanol batera, x 600 PLU erabiliz mol-baliokide bat metanol 24 orduro. Geziek erreakzioa osatzeko falta zen metanola noiz gehitu zen adierazten dute.
a)
b)
III. Emaitzak
146
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
denbora (ordu)
DG
(
mo
l/g
oli
o)
0
200
400
600
800
1000
1200
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
denbora (ordu)
TG
(
mo
l/g
oli
o)
40. irudia. Lipozyme TL IM-k katalizatutako erreakzioen a) DG-en eta b) TG-en eboluzioa denboran zehar. Erreakzio-baldintzak: 10 g C olio, 30 ºC, 100 oszilazio/min. Erabilitako lipasa-unitateak eta gehitutako metanola: 1200 PLU erabilita: mol-baliokide bat metanol eta 24 ordu ondoren beste 2, bi mol-baliokide metanol eta 24 ordu ondoren beste bat, Δ 3 mol-baliokide metanol batera, x 600 PLU erabiliz mol-baliokide bat metanol 24 orduro. Geziek erreakzioa osatzeko falta zen metanola noiz gehitu zen adierazten dute.
a)
b)
III. Emaitzak
147
Emaitza hauetatik guztietatik Lipozyme RM IM eta Lipozyme TL IM
lipasa posizio-espezifikoak direla ondoriozta daiteke, TGen kanpo loturak
degradatzen dituzte eta honen ondorioz DG eta MG pilatzen dira erreakzio
giroan. Novozym 435-k, berriz, TGen lotura guztiak degradatzen ditu eta
horregatik TG guztiak ez dira degradatzen erreakzioaren hasieran eta nahiz eta
erreakzio giroan DG egon, ez dira aurreko bi kasuetan beste pilatzen eta ez dira
ia MGrik sortzen.
Lehen esan bezala, koipe eta olioen metanolisia osatzeko 3 mol-baliokide
metanol behar dira. Hala ere, ikerketa-lan ugarik (21. taula), baita lan honek ere,
erakutsi dute koipeen metanolisia aurrera eramateko behar den metanol guztia
batera gehitzen denean, lortutako EM teorian ekoitz zitezkeenak baino askoz
gutxiago direla kasu gehienetan. Taulan ikus daitekeen bezala EM-en ekoizpen
handiak lortzeko (>%80) lipasa kantitate handiak erabili dira (>%10, g lipasa/g
substratu), Köse eta lankideek (2002) eta Du eta lankideek (2003) egin zuten
bezala Novozym 435-en %30 erabiliz kotoi-olioaren metanolisia katalizatzeko
eta Lipozyme TL IM-ren %30 erabiliz soja-olioa metanolizatzeko, hurrenez
hurren. Halaber, ekoizpen handiak lortu ziren Pseudomonas-en lipasak erabilita.
Hsu eta lankideek (2001, 2002) eta Kaieda eta lankideek (2001) P. cepacia-ren
lipasak, edo Soumanou eta Bornscheuer-ek (2003a, b) P. fluorescens-en lipasa
erabiliz egin zuten moduan. Dirudienez, Pseudomonas-en andui batzuek
metanola jasaten dute (Heipieper eta lank., 1994). Gainera, Hsu eta lankideek
(2001) ziotenez, P. cepacia-ren PS-30 lipasa filosilikatoen sol-gel matrize batean
immobilizatzeak bere aktibitatea eta egonkortasuna hobetzen zituen.
III. Emaitzak
148
21. taula. Lipasa immobilizatuen bidez lortutako gantz eta olioen EM (%) 3 mol-baliokide metanol batera gehitzen zirenean eta disolbatzaile organikorik gabeko erreakzio-giroa erabilita.
Lipasa
(%, g lipasa/g olio)
Olioa/gantza Denbora (ordu)
EM (%)
Erreferentzia
R. miehei (%1.25) Bilgorra 48 <1 Stevenson eta lank. (1994) c
R. miehei (%10) Bilgorra 8 19.4 Nelson eta lank. (1996) b
C. antarctica (%4) Soja eta koltza-olioa
24 <10 Shimada eta lank. (1999)eta Watanabe eta lank. (2000)
C. antarctica (%4) Soja-olioa 4 <10 Samukawa eta lank. (2000)
P. cepacia (%5.75) Bilgorra/ erabilitako gantza
24 92/94 Hsu eta lank. (2001) c, d
C. antarctica (%6) Ekilore-olioa 12 <20 Bélafi-Bakó eta lank. (2002) c, d
C. antarctica
(%10-30) Kotoi-olioa 7 70.5-84 Köse eta lank. (2002) a, e
C. antarctica,
T. lanuginosus,
P. cepacia (%10)
Jantokietatik jasotako gantza
48
75
4
98
Hsu eta lank. (2002) a, d
C. antarctica (%10) Bilgorra 24 2.7 Lee eta lank. (2002)
T. lanuginosus (%30) Soja-olioa 12 85 Du eta lank. (2003)
P. fluorescens
R. miehei
T. lanuginosus (%10)
Ekilore-/Kotoi-olioa
24
55
40/30
35/10
Soumanou eta Bornscheuer (2003 a/b) a
C. antarctica (%4) Soja-olioa 10 <5 Du eta lank. (2004) a
T. lanuginosus (%4) Soja-olioa 24 <5 Xu eta lank. (2004) a
Beste lekuren batean adierazi ezean, erreakzio baldintzak honako hauek izan ziren: 30 ºC, TG:metanol (1:3; mol:mol) eta irabiaketa orbitala 100 eta 200 rpm tartean. a) 40 ºC; b) 45 ºC; c) 50 ºC d) TG:metanol (1:4; mol:mol) e) Irabiaketa magnetikoa 700 rpm
III. Emaitzak
149
Alkoholisi erreakzioetan ikusitako substratu inhibizioaz gain (metanolak
eraginda Samukawa eta lankideek (2000) ikusi zuten bezala eta ikerlan honetan
frogatu bezala; butanolak eraginda Dossat eta lankideek (2002) aurkitu bezala),
autore batzuek metanola eta olioak, metanolisia aurrera eramateko behar diren
mol-proportzioetan, ez direla guztiz nahaskorrak ikusi dute (Stevenson eta
lank., 1994; Nelson eta lank., 1996; Shimada eta lank., 1999; Watanabe eta lank.,
2000; Iso eta lank., 2001; Chen eta Wu, 2003). Honen inguruan badago hipotesi
bat. Hipotesi honen arabera erreakzio-giroan ondo nahasten ez diren metanol-
tantak gelditzen dira, eta tanta hauek lipasak inaktibatzen dituzte. Shimada eta
lankideen (1999) eta Watanabe eta lankideen (2000) arabera, 1:1.5 (TG:metanol;
mol:mol) baino handiagoko proportzioa erabiltzen zenean Novozym 435
inaktibatzen zen.
Chen eta Wu-k (2003) metanola eta etanola soja-olioarekin gaizki
nahasten zirela ikusi zuten. Olioari alkoholaren mol teorikoen 1/9 baino
gehiago gehitzen zitzaionean, nahasketa emultsio bihurtzen zen. Alkohol
tantatxoak ikusten ziren eta entzima desaktibatzen zen. Entzima
immobilizatzeko erabilitako materiala erretxina akrilikoa zen eta metanol eta
etanol bezalako konposatu polarrak adsorbi zitzakeen. Nahasketan kate-
motzeko alkoholen kontzentrazioa altua zenean, alkoholek tantatxoak eratzen
zituzten eta hauek erretxina partikulei eransten zitzaizkien. Alkohola
immobilizatutako entziman adsorbatzen zenez, triglizeridoen sarrera
eragozten zen eta honen ondorioz erreakzioa gelditzen zen.
Metanolisi erreakzioak aurrera eramateko eta aipatutako arazoak
ekiditeko hainbat konponbide deskribatu dira. Alde batetik, disolbatzaile
organikoak erabili daitezke substratuak hobeto nahasteko eta lipasen
inaktibazioa gutxitzeko, horrela %95 EM lortuz (Nelson eta lank., 1996;
Soumanou eta Bornscheuer, 2003 a/b). CO2 superkritikoa ere erabili da
substratuak disolbatzeko (Jackson eta King, 1996). Bestaldetik, metanol guztia
batera gehitu beharrean, kantitate txikiagotan gehitzen bada denboran zehar,
III. Emaitzak
150
ekoitzitako ester metilikoek, metanol eta olioaren arteko nahaskortasuna
hobetzen dute eta lipasa ez da inaktibatzen (Watanabe eta lank., 2000). Argi
dago guztiz beharrezkoa dela metanolaren kontzentrazioa kontrolatua izatea
erreakzio-giroan.
Azken aukera hori, ikerlan honetan erabilitakoa izan da eta ikusi denez
EM-en ekoizpena hobetzen da, %95 EM inguru lortuz Novozym 435 eta
Lipozyme TL IM erabiliz. Emaitza hauek 21. taulan dauden autore batzuen
emaitzekin bat datoz metanola zatika gehituta %90 EM baino gehiago ekoitzi
zirelarik (Stevenson eta lank., 1994; Shimada eta lank., 1999; Watanabe eta lank.,
2000; Bélafi-Bakó eta lank., 2002; Xu eta lank., 2004).
Ikerlan gutxi batzuetan biodiesela ekoizteko lipasa batzuk erabili dira
entzimen arteko alderaketak egiteko. Deng eta lankideek (2005) 6 lipasa
komertzial immobilizatu erabili zituzten ekilore-olioaren alkoholisirako.
Lipasez gain alhokol ezberdinen eragina ikertu zuten. Metanolaren kasuan
(kantitate estekiometrikoa 4 unetan gehituta) eta lipasa bakoitzaren %10
(g lipasa/100 g olio) erabiliz, 24 ordutan %92, 90, 68, 59, 28 eta 8 EM ekoitzi
zuten, Novozym 435, Lipozyme TL IM, LA201 lipasa (T. lanuginosa-ren lipasa
polipropilenozko euskarrian immobilizatua), Lipozyme RM IM, PS-C lipasa
(Pseudomonas cepacia-ren lipasa zeramikazko partikuletan immobilizatua) eta
AK-C lipasa (P. fluorescens-en zeramikazko partikuletan immobilizatua)
erabilita, hurrenez hurren. Ikus daitekeenez, gure emaitzen antza handia dute,
baina lipasa gehiago erabilita. Aipatzekoa da T. lanuginosa-ren bi lipasek
lortutako transesterifikazioak. Izan ere, euskarri ezberdina erabiltzeak
immobilizaziorako eragin handia izan dezake lipasak erakutsitako aktibitatean.
Honez gain, Wu eta lankideek (2003) ikerlan honetan aztertutako 3
lipasak erabili zituzten erabilitako olioa eta metanola transesterifikatzeko.
Lipasa guztiek (%10, g lipasa/100 g olio) mol-baliokide metanol bat gehituta
katalizatu zuten erreakzioa arazorik gabe. Lipozyme TL IM merkeena zenez,
III. Emaitzak
151
erreakzio osoa garatu eta erreakzioaren baldintzak ikertzeko aukeratu zuten.
Metanola lau zatitan gehitu zuten eta %90.2 EM lortu zuten. Gure emaitzekin
alderatuz, errendimendu txikiagoa lortu zuten, agian olioaren ezaugarriek
eraginda.
2.1.2. Esterifikazioa
Lehen, “Lipasen karakterizazioa” atal barruan “Substratuen
kontzentrazioaren eragina aktibitatean” atalean (100. orr.), azaldu bezala,
metanol eta hainbat kate-luzerako gantz-azidoen (C4, C12 eta C18:1) arteko
esterifikazio-erreakzioetan, hexanoa disolbatzaile moduan erabilita, metanolak
substratu inhibizioa eragiten zuen, metanol eta gantz-azidoen arteko
proportzioa 1:1 (GA:metanol; mol:mol) baino handiagoa zenean. Azido
oleikoak, ordea, ez zuen inhibiziorik eragin ikertutako kontzentrazioetan (62.5-
500 mM). Erabilitako olioen gantz-azido gehiengodunak C18:1 eta C18:2 ziren.
Hasierako erreakzioak Novozym 435 (1200 PLU) erabilita egin ziren azido
lauriko eta propanolaren arteko esterifikazioan emaitzarik altuenak lortu zituen
eta. Metanolaren hainbat proportzio gehitu ziren, karakterizazio erreakzioetan
lortutako emaitzekin bat zetozen ikusteko. Entsegu hauek Araba Campuseko
jantokian bildutako olioarekin (B olioa) egin ziren. Olioa jaso ondoren hondakin
solidoak kentzeko iragazi eta hidrolizatu egin zen OF lipasak katalizatutako
erreakzioan (“Material eta Metodoak” atalean, 48. orr.).
Erreakzio-girora metanolaren hainbat proportzio (1:0.3-1.5; mol GA:mol
metanol) gehituz gero, erreakzioaren hasierako 5 orduetan ester metilikoen
ekoizpena metanolaren kontzentrazioa igo ahala igo zen 1:1.25 proportziora
arte (41. irudia). Erreakzioaren lehenengo orduan eta 1:0.3 proportzioa erabilita,
ekoitz zitezkeen ester metiliko guztiak ekoitzi ziren (%33 EM), eta gauza bera
gertatu zen 1:0.6 proportzioa erabiliz (%66 EM). Emaitzarik onenak proportzio
III. Emaitzak
152
estekiometrikoa baino pixka bat altuagoak diren proportzioak erabiliz (1:1.25;
mol GA:mol metanol) lortu ziren, lehenengo erreakzio orduan %95 EM lortuz.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 3 5 24
denbora (ordu)
EM
(%
)
41. irudia. Novozym 435-ek (%4 pisuan=1200 PLU) katalizatutako hidrolisatutako olioaren metanolisian ester metilikoen ekoizpena (% pisuan) gehitutako metanolaren arabera. 10 g hidrolisatutako B olio, 30 ºC, irabiaketa orbitala 100 oszilazio/min eta gantz-azido aske:metanol
hainbat proportzio erabiliz: 0.3, 0.6, 1.0, 1.25 eta 1.5.
2.1.2.1. Gehitutako lipasa-unitateen eragina
Entsegu hauek Araba Campuseko jantokian bildutako olioarekin
(C olioa) egin ziren. Olioa jaso ondoren hondakin solidoak kentzeko iragazi eta
hidrolizatu egin zen OF lipasak katalizatutako erreakzioan (“Material eta
Metodoak” atalean, 48. orr.). Entseguak lipasa bakoitzaren hainbat lipasa-
unitate (120-1200 PLU) eta gantz-azido:metanol (1:1.25 mol:mol) proportzioa,
lehengo atalean egokia aurkitu zena, erabiliz egin ziren.
Novozym 435 erabilita (42a. irudia), espero zenez, gehitutako lipasa-
unitateak igo ahala ester metilikoen ekoizpena handitu zen erreakzioaren
hasierako unetan, gero erreakzioaren bukaeran (180 minututan) orekara
heltzeko. Kasu guztietan %90 baino gehiagoko ekoizpena lortu zen 300 PLU
baino gehiago erabiltzean.
III. Emaitzak
153
Bestaldetik, Lipozyme RM IM-ren kasuan (42b. irudia) gehitutako
lipasaren kopurua igo ahala ester metilikoen ekoizpena handitu bazen ere,
%90eko ekoizpena ez zen inolako kasuan lortu, ekoizpenik altuena %80koa
izanik. Dirudienez, kasu guztietan erreakzioa 60-90 minutu pasa eta gero
gelditu zen.
Honekin lotuta, Lipozyme TL IM-k (42.c irudia) ere jokabide berezia izan
zuen. Erreakzioaren hasierako unetan (15 minututan) lipasa kopuru guztiek
ekoizpen bera lortu baitzuten, esterifikazio-abiadura Novozym 435-ena eta
Lipozyme RM IM-rena baino txikiagoa izanik. Erreakzioen bukaeran bakarrik
900 eta 1200 PLU erabilita lortu ziren %30eko baino handiagoko ekoizpenak.
900 PLU erabilita %50eko ekoizpena lortu zen 180 minututan eta 1200 PLU
gehituta %95 EM lortu zen 90 minututan.
Gehitutako lipasa-unitateen eragina alderatuz gero, honako hau aurki
daiteke: 120 PLU gehituta bakarrik Novozym 435-ek lor zezakeen %90eko baino
gehiagoko ekoizpena aztertutako erreakzioaren gehienezko denboran (180
min). Lipozyme RM IM-k %50 besterik ez zuen lortu eta 90 minutu igarota
bertan gelditu zen. Lipozyme TL IM-k %20 baino ez zuen lortu eta gainera
ekoizpen hori hasierako unetatik lortua zuen. Era berean 300 PLU gehituta
bakarrik Novozym 435-ek lortu zuen %95 EM, Lipozyme RM IM-k %50ean eta
Lipozyme TL IM-k %20n geldituz. 600 PLU edota PLU gehiago gehituz gero,
Novozym 435-ek %95eko ekoizpena lortu zuen 90 minututan kasu guztietan, 60
minututan jada emaitza berdinak emanik.
Watanabe eta lankideek (2002) tuna-oliotik C22:6 lortzeko sortutako
gantz-azido askeak metanolarekin (GAA:metanol, 1:2 mol:mol) esterifikatu
zituzten Novozym 435 erabilita. Autore hauen arabera, %0.5 (g lipasa/100 g
GAA) baino gehiago erabilita %95 EM ekoitzi zitezkeen 24 orduetan. Lipasaren
kantitatea igo ahala, erreakzio denbora murriz zitekeen eta %1-2 (g lipasa/100 g
GAA) nahikoa zen 3 orduetan %95 inguru lortzeko.
III. Emaitzak
154
0102030405060708090
100
0 30 60 90 120 150 180
denbora (minutu)
EM
(%
)
0102030405060708090
100
0 30 60 90 120 150 180
denbora (minutu)
EM
(%
)
0102030405060708090
100
0 30 60 90 120 150 180
denbora (minutu)
EM
(%
)
42. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (% pisuan) gehitutako lipasa-unitateen arabera hidrolisatutako C olioaren metanolisian, 10g olio hidrolisatua, gantz-azido:metanol (1:1.25; mol:mol), 30 ºC eta 100 oszilazio/min: a) Novozym 435, b) Lipozyme RM IM, c) Lipozyme TL IM; ◊ 120, 300, Δ 600, x 900, 1200 PLU.
a)
b)
c)
III. Emaitzak
155
Honez gain, Lai eta lankideek (2005) eta Watanabe eta lankideek (2005)
Novozym 435 erabilita olio azidoen metanolisia katalizatu zuten. Lai eta
lankideek (2005) arrozaren zahiaren olioa birfintzean sortutako GAA
esterifikatu zituzten %98 EM lortuz ordubetean eta lipasaren %5 (g lipasa/100 g
GAA) gehituz. Olioaren, transesterifikaziorako, berriz, 6 ordu behar izan
zituzten. Watanabe eta lankideek olio azido baten eredua sortu zuten TG eta
GAA proportzio ezberdinak erabiliz. Esterifikaziorako nahikoa zen lipasaren
%0.5 (g lipasa/100 g substratu), transesterifikaziorako, aldiz, %6 behar izan
zuten 10 orduetan %90 EM baino gehiago ekoizteko.
Gehitutako lipasa-unitateen eraginez gain, badago azpimarratzekoa den
beste gai bat. Izan ere, bi olio hidrolisatuekin lortutako emaitzak alderatuz gero
(43. irudia), ezberdintasun nabarmenak ikus daitezke.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 30 60 90 120 150 180
denbora (min)
EM
(%
)
43. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (% pisuan) erabilitako olioaren arabera. Ikur hutsak hidrolisatutako B olioa adierazten dute, ikur beteak, berriz, hidrolisatutako C olioa. Emaitzak alderatu ahal izateko bi olioak esterifikatzeko erabilitako lipasa bakoitzaren unitateak berdindu ziren: Novozym 435 (1200 PLU), Lipozyme RM IM (600 PLU) eta Δ Lipozyme TL IM (300 PLU).
Novozym 435-ek eta Lipozyme RM IM-k emaitza hobeak lortu zituzten B
olio hidrolisatuaren metanolisian. Novozym 435-en kasuan erreakzioa askoz
III. Emaitzak
156
azkarragoa zen, 15 minututan jada %95 EM lortu zuelarik eta Lipozyme RM IM
erabilita ere, antzeko kantitatea lortzeko 180 minutu behar baziren ere, %95 EM
lor zitekeen. Bestaldetik, Lipozyme TL IM-ren kasuan C olio hidrolisatua
erabiliz %20 EM lortzen zen, B olioa erabilita baino pixka handiagoa. Hala ere,
erreakzioaren profila antzekoa zen, erreakzioa gelditu baitzen hasierako
ekoizpena lortu eta gero. Ezberdintasunen arrazoia olioen konposaketa gantz-
azidotan izan daiteke. Izan ere, C olioak B olioak baino C16:0 gantz-azidoaren
kantitate bikoitza zuen, guztira gantz-azido saturatuen %21 eta 12 izanik,
hurrenez hurren. Gainera, hidrolisatutako C olioa giro-tenperaturan solidoa
zen. Beste arrazoi bat frijitzeko olioetan agertzen diren degradazio
konposatuetan egon daiteke. Izan ere, Lipozyme RM IM fitxa teknikoaren
arabera (Novo Nordisk, 2000a) koipetan ager daitezkeen oxidazio produktuek
entzimaren aktibitatea gutxi dezakete. Honen ondorioz, entzimaren
produktibitatea substratuen ezaugarriekin eta kalitatearekin lotuta egon
daiteke. Honez gain, Lipozyme RM IM-ren euskarria ioi-trukaketa erretxina
denez, konposatu polarrak bertan adsorbi daitezke substratuen barreiapena
zailduz (Rosevear eta lank., 1987).
2.2. Erreakzio jarraiak
Erreakzio jarraiak garatzeko Novozym 435 erabili zen, prestakin
entzimatiko honek bi substratuen, olioaren eta olio hidrolisatuaren, metanolisia
lipasa kantitate txikienekin katalizatzen zuelako.
Erreakzio jarraiak egiteko termostatizatutako beirazko zutabea (XK16,
Pharmacia, Suedia) erabili zen. Erreakzio substratuak, aldez aurretik nahastuta
eta erreakzio-tenperaturan zeudela, zutabetik pasarazteko ponpa peristaltikoa
erabili zen eta elikatzea behetik gora egin zen. Behetik egindako elikatzearen
abantailak honako hauek dira: entzima eta jariakinaren arteko kontaktu ona
sortzen da eta erreaktorean barruko presio-jaitsierak gutxitzen dira (Xu, 2000).
III. Emaitzak
157
Zutabea paketatzeko, ohantze finkoa sortzeko, alegia, entzima substratu-
nahasketari gehitu eta lortutako nahasketa zutabean sartu zen goiko aldetik.
Entzima pixkanaka beheko aldean jalkitzen joan zen, bitartean beirazko
hagaxka baten bidez pixka bat irabiatu zen aire-burbuilak kentzeko. Entzima
beheko aldean jalki zenean eta ohantzea sortua zegoenean soberan zeuden
substratuak pipeta baten bidez kendu ziren. Paketatzeko metodo hau hautatu
zen lehen egindako entseguetan trabatze arazoak sortu zirelako entzima lehorra
sartu zenean eta erreakzio-nahasketak entzima bustitzen zuenean. Traba hauek
metanol eta olioaren arteko nahasketaren biskositate altuari egotzi zitzaizkion.
2.2.1. Transesterifikazioa
Etenean egindako erreakzioetan metanolak, proportzio
estekiometrikoetan, batera gehituta lipasa inaktiba zezakeenez, metanola zatika
gehitzea erabaki zen, transesterifikazio esperimentuak egiteko bi urrats eman
zirelarik. Lehena, olio:metanol 1:1 (mol:mol) proportzioa erabiliz egin zen.
Horrela, erreakzio-nahasketa hau zutabetik pasa eta gero, produktua (%30 ester
metiliko inguru) mugitu gabe utzi zen gau osoa faseen bereizketa gertatzen zen
ikusteko eta horrela glizerola kentzeko. Kasu honetan ez zen horrela gertatu eta
ez zen faseen bereizketa ikusi. Hurrengo goizean erreakzioa osatzeko behar zen
metanola (2 mol-baliokide) gehitu zitzaion erreakzio-nahasketari eta zutabetik
pasatzen utzi zen. Lortutako ester metilikoak %67 izan ziren. Emaitza baxu
hauen arrazoia glizerolak eragiten duen inhibizioan aurki daiteke. Izan ere,
glizerola ez zen bereiztu eta zutabearen beheko aldean pilatzeko joera izan
dezake (Dossat eta lank., 1999 eta Watanabe eta lank., 2000). Dirudienez,
glizerolak euskarriari itsasten zaion geruza sortzen du. Honen ondorioz,
erreakzio-girotik entzimarako substratu hidrofobikoaren barreiapena ekiditen
da (Dossat eta lank., 1999). Etenean egindako erreakzioetan irabiaketak arazo
hau saihesten laguntzen du.
III. Emaitzak
158
Lehen esan bezala, gure entseguetan ez zen posible izan glizerola
bereiztea. Shimada eta lankideek (1999) eta Watanabe eta lankideek (2000),
ordea, erreakzio-nahasketa uzten zuten irabiaketarik gabe eta bi fase bereizten
ziren, goikoa ester metilikoen eta lipidoen fasea eta behekoa fase urtsua
glizerolarekin nahastuta. Gure kasuan glizerola erreakzio-nahasketan gelditzen
zen eta ziurrenez, honen ondorioz entzimaren euskarrian pilatu zen.
2.2.2. Esterifikazioa
Olioa erabiliz ez bezala, gantz-azido askeen esterifikazioa urrats bakar
batean egin daiteke, ester metilikoen ekoizpen altuak lortuz erreakzio etenetan
frogatu den bezala. Era honetan inhibizio arazoak ekidin zitezkeen, bai
metanolak bai glizerolak sortuak. Prozesua askoz errazagoa da, nahasketaren
(gantz-azidoen eta metanolaren) biskositatea txikiagoa delako, zutabe barruko
presioa txikiagoa izanik. Lortutako emaitzak 44. irudian ikus daitezke. Bertan B
olio hidrolisatuaren eta metanolaren arteko esterifikazioa (1:1; mol:mol) ikertu
zen lipasa berria eta lipasa berrerabilia erabilita.
Ikus daitekeenez, lipasa berria erabiliz hasieran ekoizpena igo zen %93
ester metiliko lortu arte 3 ordutan, gero ekoizpena jaitsi zen %89ra ekoitzitako
uraren ondorioz. Erreakzioan ura sortzen zenez, euskarriak ura adsorbi
zezakeen eta honen ondorioz hidrolisia eragin. Urak hidrolisia eragiteaz gain,
konposatu hidrofilikoa izanik substratu hidrofobikoen, GAA-en barreiapena
zail zezakeen (Dossat eta lank., 1999). Ekoitzitako ura zutabearen beheko aldean
pilatu zen. Hori dela eta erreakzioa bukatu eta gero, erreaktorea hustu eta
lipasa hexanoarekin garbitu eta iragazi zen. Zutabea berriro bete eta erreaktorea
martxan jarri zen. Bigarren erabileraren emaitzak pixka baxuagoak ziren,
ekoizpenik altuena %88 izanik eta 24 ordutan %85 mantenduz. Watanabe eta
lankideek (2001) ziotenez, nahiz eta hasieran ur kantitate txikia egon erreakzio-
giroan, lipasa bera erabilita substratu berriarekin ura desagerraraz zezakeen
(euskarritik kanporarazi) eta aktibitatea hobetu.
III. Emaitzak
159
0102030405060708090
100
0 3 6 9 12 15 18 21 24
denbora (ordu)
EM
(%
)
44. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (% pisuan) ohantze finkoko erreaktorean. Erreakzio baldintzak: 30 ºC, gantz-azido:metanol (1:1; mol:mol). Fluxua 7.2 mL/ordukoa izan zen. Novozym 435 lipasaren lehen erabilera , Δ Novozym 435 lipasa berrerabilia.
Horrexegatik, lipasa bera erabili zen ohantze finkoko erreaktorean
metanolaren proportzioa igo zen (1:1.25, mol GA:mol metanol), erreakzio
etenetan emaitzarik onenak eman zituelako eta gainera metanola soberan
gehituta erreakzioa esterifikaziorantz zuzentzen duelako. Erreakzioaren
garapena 45. irudian ikus daiteke.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
EM GAA MG DG TG
Err
eak
zio
nah
ask
etar
en
ko
np
osa
ket
a (%
)
45. irudia. Ester metilikoen ekoizpena (% pisuan) ohantze finkoko erreaktorean Novozym 435 lipasa erabilita. 30 ºC-tan eta gantz-azido:metanol proportzioa (1:1.25; mol:mol). Fluxua 7.2
mL/ordukoa izan zen. Denbora tarte ezberdinetan (ordu) hartutako laginak: 1, 3, 5, 7 eta 24.
III. Emaitzak
160
Kasu honetan ekoizpena %95era igo zen hasierako 5 orduetan, gero
%90era jaitsiz 24 orduetan, ekoitzitako uraren ondorioz. Arazo teknikoak zirela
eta ez ziren bestelako entsegurik egin gainontzeko entzimekin.
Emaitza hauek guztiek frogatzen dute EM sor daitezkeela zenbait lipasa
immobilizatu erabiliz (Novozym 435 eta Lipozyme TL IM, batez ere) bai era
etenean bai jarrian.
III. Emaitzak
161
EMAITZEN LABURPENA
Ikerlan honetan erabilitako hondakin koipetsuak bi motatakoak izan ziren.
Alde batetik, hiltegietatik jasotako animalia-gantzak, eta bestaldetik, erabilitako
landare-olioak. Substratu hauen ezberdintasunik nagusienak euren
konposaketa gantz-azidotan (saturatu gehiago animalia-gantzetan) eta
hasierako hidrolisi-mailak (altuagoa animalia-gantzetan) ziren. Koipeen
eraldaketa nahiko ikertu bada ere, hondakin koipetsuen berrerabilera era
entzimatikoan, berriz, ez da hain ohikoa eta jarraian aipatutako lanak besterik
ez dira aurkitu, animalia-gantzen eta erabilitako landare-olioetarako. Autore
batzuek hidrolisia erabili zuten (Adamzack eta lank., 2000; Dandik eta lank.,
1993), beste batzuek, berriz, ester metilikoen sintesia ikertu zuten (Hsu eta
lank., 2001 eta 2002; Lee eta lank., 2002; Watanabe eta lank., 2001, 2002 eta 2005;
Wu eta lank., 2003).
Koipe hauek erabiliz aztertutako tratamenduak bi izan ziren: hidrolisia
(gantz-azido askeak eta glizerola lortzeko) eta ester metilikoak ekoizteko
transesterifikazioa edo esterifikazioa. Tratamendu hauek gantz eta olio
komertzialekin askotan erabili badira ere, hondakinekin ez hainbeste, esan
bezala, eta honez gain, ez da ohikoa lipasa komertzialen arteko alderaketak
aurkitzea. Hidrolisi erreakzioak egiteko 6 lipasa aztertu ziren eta ester
metilikoak ekoizteko, 3 lipasa immobilizatu. Lipasa hauen guztien ezaugarriak
ikertu ziren tratamenduen baldintza egokienak zehaztu baino lehen. Lipasa
hauen arteko alderaketa bi eratan egin zen. Alde batetik, euren ezaugarri fisiko-
kimikoak ikertu ziren. Beste aldetik, euren erabilera tratamenduetan ikertu zen.
Hidrolisirako lipasarik egokiena aukeratzeko irizpide nagusienak
aktibitate altua edukitzea eta erreakzio-denboran zehar (gehienez 24 orduz)
egonkorra izatea izan ziren. Candida rugosa-ren OF eta Lipomod lipasek
aktibitaterik altuena izan zuten oliba-olioa substratu moduan erabilita,
hidrolisi-aktibitatea neurtzeko erabilitako bi metodoekin. Bi lipasa hauen
III. Emaitzak
162
ondoren Lipopan (Thermomyces lanuginosus), Novo 398 (Humicola insolens) eta
Lipolase (Thermomyces lanuginosus) lipasak zeuden, aktibitate gutxien zuen
lipasa Novo 868 (Candida antarctica-ren A lipasa) izan zelarik. Aztertutako
lipasa guztiek pH 5-7 tartean izan zuten aktibitaterik altuena eta aktibitate
gutxiago pH 8n. Aztertutako entzima gehienek aktibitate optimoa 37 eta 40 ºC
tartean izan zuten, Novo 398 eta Novo 868 izan ezik, euren aktibitaterik altuena
ikertutako tenperaturarik altuenean izan zutelarik (50 ºC).
Prestakin entzimatikorik egonkorrenak, bai pH-ren bai tenperaturaren
eraginpean, Novo 398 eta Lipolase lipasak izan ziren. OF eta Lipomod lipasak
egonkorragoak izan ziren pH 6n eta 37 ºC-tan utzita, baldintza hauetan 24
ordutan bere aktibitatearen %60 baino gehiago mantendu zutelarik. Aktibitate
balioak eta egonkortasuna kontutan hartuta lipasen produktibitatea kalkulatu
zen. Candida rugosa-ren prestakinek eman zuten produktibitaterik altuena. Izan
ere, bere egonkortasuna oso altua ez izan arren, gainontzeko entzimak baino
aktibitate askoz altuagoa dute.
Substratu-ereduen, txerri-gantza eta hazi-olioa, hidrolisian bi jokabide
ezberdin aurkitu ziren. C. rugosa-ren prestakin entzimatikoek (OF eta Lipomod)
eman zuten koipeen hidrolisi mailarik altuena (>%60 substratuaren arabera 3
ordutan), segur aski ez dutelako posizio-espezifizitaterik. Gainontzeko
entzimak mota ezberdineko espezifizitatea azaldu zuten : Lipolase, Novo 398
eta Lipopan lipasek sn-1 eta sn-3 posizio-espezifizitate nabaria azaldu zuten;
Novo 868 lipasa, berriz, sn-2 posizio-espezifikoa izateaz gain, gantz-azido
saturatuekiko espezifizitatea duela ematen du; eta eman zuten hidrolisi altuena
%30 ingurukoa izan zen.
Emaitza hauek guztiak kontuan harturik, koipeen hidrolisi osorako
C. rugosa-ren lipasak aukeratzea erabaki zen, aktibitaterik altuena eta hiru
orduetan hidrolisi-mailarik altuenak eman zituztenak izan zirelako. Bien artean,
OF lipasak erreakzio-baldintzetan ezaugarri egokienak aurkeztu zituen. Hala
III. Emaitzak
163
nola, hidrolisi-maila altuak denbora laburretan (%70-80, 3 orduetan eta 90 U/g
koipe erabilita); aktibitate entzimatiko altua (390 U/mg); ez zen lipasarik
egonkorrena, baina %60ko aktibitatea gorde zuen 37 ºC-tan 24 orduz.
Horregatik guztiagatik, hondakin koipetsuen hidrolisirako erabiliko zena izan
zen.
Behin hidrolisirako lipasarik egokiena aukeratuta, hidrolisi-
erreakzioaren baldintzak ikertu ziren bi substratu erabilita, animalia-gantza eta
erabilitako landare-olioak. Animalia-gantzen hidrolisirako baldintza egokiak
honako hauek izan ziren: 50:50 (p:b) gantza:ura proportzioa, OF lipasaren
180 U/g gantz, 25-37 ºC tarteko tenperatura eta emultsioa mantentzeko nahikoa
zen irabiaketa, 360 rpm. Baldintza hauek erabiliz %95 baino gehiagoko
hidrolisia lortu zen 24 ordutan 0.5 L-ko erreaktorean. Halaber, 40 L-ko
erreaktorean emaitzak errepikatu ziren. Erabilitako olioen hidrolisirako
baldintzarik egokienak honako hauek izan ziren: 50:50 (p:b) olio:ura
proportzioa, 25 ºC, OF lipasaren 36 U/g olio eta 360 rpm-ko irabiaketa.
Baldintza hauekin, 24 ordutan B olioaren %95eko hidrolisia lortu zen. Hala ere,
zenbait kasutan entzima kantitate handiagoak erabili behar dira olioen
ezaugarrien arabera, edota tarte laburragoetan antzeko hidrolisi-mailak lortu
nahi baldin badira. Eskala handiagoan ere, 5 L-ko erreaktorean, emaitzak
errepikatu ziren. Adamzack eta lankideek (2000) %72ko hidrolisi-maila besterik
ez zuten lortu Rhizopus cohnii-ren lipasaren 360 U/g erabiliz hegazti-gantzen
hidrolisian. Bestaldetik, Dandik eta lankideek (1993) usagariaren (Nigella sativa)
hazien lipasak katalizatutako erabilitako olioaren hidrolisian %94ko hidrolisi-
maila lortzeko %60 hazi (p:p) erabili behar izan zuten.
Hidrolisiaz gain, ester metilikoen ekoizpena ere ikertu zen. Ester
metilikoak sortzeko erabilitako lipasen kasuan, Novozym 435 lipasak
aktibitaterik altuena izan zuen ikerlan honetan erabilitako entseguarekin,
3000 PLU/g inguru lortuz, Lipozyme RM IM-k 1500 PLU/g eta Lipozyme
III. Emaitzak
164
TL IM-k 500 PLU/g lortu zutelarik. Lipasen tenperatura optimoa 60 ºC
inguruan zegoen, hortik aurrera aktibitatea jaitsi zen kasu guztietan.
Substratuen kontzentrazioaren eragina lipasen aktibitatean nabaria zen.
Erreakzioaren mekanismoa Ping Pong Bi Bi dela frogatu zen, substratu bien
(alkohola eta azidoa) inhibizio konpetitiboarekin. Gantz-azidoen kasuan, azido
butiriko, lauriko eta oleikoa ikertu ziren substratu bezala, kate-luzerak
inhibizioan duen garrantzia argi ikusi zelarik. Izan ere, azido butirikoak
inhibizioa eragin zuen ikertutako kontzentrazio guztietan (62.5-500 mM). Azido
laurikoak, berriz, inhibizioa eragin zuen kontzentrazio altuagoetan (>250 mM)
eta azido oleikoak, aldiz, ez zuen inhibiziorik eragin aztertutako
kontzentrazioetan.
Bestalde, metanolaren eragina ikertutako lipasetan bi motatakoa izan
zitekeela ikusi zen: 1) substratu moduan, kontzentrazio altuetan (>200 mM)
inhibitzailea zen; 2) konposatu hidrofilikoa izanik, entzimek duten ur-geruza
bahi dezake entzima desnaturalizatuz eta aktibitatea galduz.
Lipasen egonkortasunari dagokionez, oso emaitza ezberdinak lortu
ziren. Tenperaturaren eragina aztertzeko, lipasak oliotan beratzen uztean
substratuaren barreiapen aldaketak edo eragin ziren eta honen ondorioz ezin
izan zen tenperaturaren eragina egonkortasunean ongi aztertu. Dena den,
lipasa immobilizatuak zirenez, gutxienez bere aktibitatearen %80 mantendu
zuten 24 ordutan beratzen utzi ondoren. Metanolaren eragina egonkortasunean
ikertzeko lipasak metanolean beratzen utzi ziren. Metanolak lipasak
inaktibatzen zituen. Novozym 435 lipasa egonkorrena izan zen eta metanolak
denbora gehiago behar zuen lipasa inaktibatzeko, baina 60 minutu pasa eta
gero aktibitatearen %10 baino ez zuen mantendu.
Lortutako emaitzen arabera ez zegoen ester metilikoak ekoizteko
lipasarik egokiena zein zen erabakitzerik. Horregatik ester metilikoak ekoizteko
III. Emaitzak
165
hiru lipasak erabili ziren. Biodieselaren sintesirako lipasek katalizatutako bi
erreakzio ezberdin burutu ziren: transesterifikazioa eta esterifikazioa.
Transesterifikazio prozesurako substratuak hondakin koipetsuak eta metanola
izan ziren. Esterifikaziorako, berriz, hondakin koipetsuen hidrolisien ondorio
diren gantz azido askeak eta metanola erabili ziren.
Transesterifikazio erreakzioetan metanola gehitzeko erak garrantzi
berezia izan dezakeela, entzimaren arabera, frogatu zen. Hala nola,
erreakzioaren estekiometriaren arabera gehitu behar zen metanola (3 mol-
baliokide) batera gehituz gero, soilik Lipozyme TL IM-k sor zitzakeen ester
metilikoen kantitate handiak ikertutako baldintzetan (%96 EM 7 ordutan eta
%98 EM 24 ordutan). Beste bi entzimak erabiliz metanolak lipasak inaktiba
zitzakeenez, metanola zatika gehitu behar izan zen. Novozym 435-en kasuan
emaitza onak (>%80 EM) lortu ziren metanola bi zatitan gehituz gero (%80 eta
%90, 1+2 edo 2+1 mol-baliokide gehituz, hurrenez hurren), baina
Lipozyme RM IM-ren kasuan emaitza erlatiboki onak lortzeko (%75 EM),
metanola beti hiru zatitan gehitu behar zen (1+1+1mol-baliokide).
Honez gain, lipasa bakoitzaren gehitutako unitateen eragina ikertu zen
metanola 3 zatitan gehituta. Ester metilikoen %95eko edo handiagoko
ekoizpenak lortzeko gutxienez 600 PLU behar ziren. Lipasa unitate horiek
erabilita, Lipozyme TL IM-k %98, Novozym 435-ek %90 eta Lipozyme RM IM-k
%75 EM ekoitzi zuten. Gehitutako lipasa-unitateak berdindu baziren ere,
gehitutako lipasa bakoitzaren euskarri kantitatea oso ezberdina zen eta honek
transesterifikazio erreakzioetan ikusitako ezberdintasunak azal zitzakeen neurri
batean. Euskarriak erreakzioaren emaitzetan izan dezakeen eraginari buruzko
aipamen gutxi aurkitu da bibliografian. Du eta lankideek (2005) euskarriaren
eragina aztertzeko %6 silika gel gehitu zioten erreakzio girora bertan Lipozyme
TL IM-ren %4 egonik. Erreakzioaren abiadura hobetzeaz gain, lortutako
emaitzak lipasaren %10ekin lortutakoen bezain handiak izan ziren (>%90).
III. Emaitzak
166
Bestalde, esterifikazio erreakzioetan, esan bezala, erabilitako olioen
hidrolisian lortutako gantz-azidoak erabili ziren substratu gisa prozesua
ikertzeko. Kasu honetan metanola eragin dezakeen inaktibazioa saihesten zen,
prozesuaren estekiometria 1:1 delako eta gantz azidoen solugarritasuna
metanolean triglizeridoena baino hobea delako, erreakzioa urrats bakar eta
azkar batean burutzen delarik.
Honela, gehitutako lipasa-unitateen eragina alderatu zen. Novozym 435
erabilita gehitutako lipasa-unitateak igo ahala, ester metilikoen ekoizpena
handitu zen erreakzioaren hasierako unetan. Kasu guztietan %95eko ekoizpena
lortu zen 300 PLU baino gehiago erabiltzean. Bestaldetik, Lipozyme RM IM-ren
kasuan gehitutako lipasaren kopurua igo ahala ester metilikoen ekoizpena
handitu bazen ere, lortutako ekoizpenik altuena %80koa izan zen. Lipozyme
TL IM-k jokabide berezia izan zuen. Izan ere, erreakzioaren hasierako unetan
(15 minututan) lipasa kopuru guztiek ekoizpen bera lortu zuten, baina denbora
luzeagotan bakarrik 900 eta 1200 PLU erabilita lortu ziren %30eko baino
handiagoko ekoizpenak. Hortik aurrera, 900 PLU erabilita %50eko ekoizpena
lortu zen 180 minututan eta 1200 PLU gehituta %95 EM lortu zen 90 minututan.
Beraz, Lipozyme TL IM transesterifikazio erreakzioa urrats bakar batean
eta denbora laburrean katalizatzeko gai den entzima bakarra da, ikertutakoen
artean, ester metilikoen %95 baino gehiago emanez. Badirudi prestakin
entzimatikoaren izaeraren menpean dagoela emaitza, euskarriaren kantitateak
bere gain eragin garrantzitsua izan dezakeelarik. Dena den, honek guztiak
ikerkuntza sakonagoa eskatzen du.
Halaber, esterifikazio erreakziorako emaitzarik onenak ematen duen
prestakin entzimatikoa Novozyme 435 da, entzima kantitate baxuenekin,
denbora laburrenean ester metilikoen %95 ematen baitzuen.
III. Emaitzak
167
Transesterifikazio eta esterifikazio emaitzak ikusita Novozym 435 lipasa
aukeratu zen erreakzio jarraiak aztertzeko. Izan ere, lipasa honek EM-en
ekoizpen altuak eman zituen bai olio bai gantz-azido askeak substratu moduan
erabilita. Erreakzioak ohantze finkoko erreaktore batean egin ziren.
Transesterifikazioan %66 EM baino ez ziren lortu, ziurrenik glizerola
euskarriari itsasten zitzaiolako. Azkenik, esterifikazio saioetan %95 EM baino
gehiago lor zitezkeen oso denbora laburrean.
Beraz, hondar koipetsuen ustiapena bi urrats xinpleetan burutua izan
zitekeen: 1) hidrolisia, ur-fasean glizerolaren berreskuratzea ahal egingo
lukeena, eta 2) gantz-azido askeen esterifikazioa, jarraian, era honetan
metanolak eragin zitzakeen arazoak ekidinez.
IV. ONDORIOAK
IV. Ondorioak
169
1. Animalia- eta landare-hondakin koipetsuen birziklapen entzimatikoa
hidrolisiaren bidez GAA eta glizerola emateko eta transesterifikazio edo
esterifikazioaren bidez EM (biodiesela) emateko posible da. Aipatutako
tratamenduen bidez %95eko edo gehiagoko errendimendua lortuz.
2. Hidrolisi-erreakzioetarako 6 lipasa komertzial aztertu dira, Meito Sangyo-k
komertzializatutako Candida rugosa-ren OF lipasa egokiena izanik hurrengo
arrazoiengatik:
Aktibitaterik (392.1±10.0 kU/g) eta produktibitaterik (15000
mol GA/g entzima) altuena zuen.
Txerri-gantza eta hazi-olioa substratu-eredu moduan erabiliz %70-
80ko hidrolisi-mailak lortu ziren 90 U/g koipe erabiliz 3 ordutan.
3. Hondakin koipetsuen %95eko hidrolisia lortu da. Erreakzio-baldintza
orokorrak honako hauek izanik, gantza:ura proportzioa 50:50 (p/b),
erreakzioaren tenperatura 25 edo 37 ºC eta erreakzio denbora 24 ordu.
Baldintza garrantzitsuena gehitutako lipasaren kantitatea izan zen.
Animalia-gantzen hidrolisian %95eko hidrolisi-maila lortzeko lehen
aipatutako erreakzio-baldintzetan OF lipasaren 180 U/g gantz erabili ziren.
Erabilitako landare-olioen hidrolisirako, berriz, OF lipasaren 90 U/g olio
edo gutxiago nahikoak ziren olioaren kalitatearen arabera.
4. Aipatutako baldintzak erreaktore semi-pilotoan egiaztatu ziren emaitzak
errepikatuz.
5. Esterifikazio erreakzioaren mekanismoa Ping Pong Bi Bi dela frogatu da,
substratu bien (alkohola eta azidoa) inhibizio konpetitiboarekin, kate labur
eta ertaineko gantz-azidoak inhibitzaileak izan daitezkeelarik, baina kate
luzekoak ez.
6. Ester metilikoen ekoizpenerako 3 lipasa komertzial immobilizatu aztertu
dira. Horietatik, hondar olioen transesterifikazio erreakzioetan, soilik
Lipozyme TL IM prestakin entzimatikoak ematen du, urrats bakar batean
IV. Ondorioak
170
eta denbora laburrean, ester metilikoen %95 baino gehiagoko ekoizpena.
Novozym 435 eta Lipozyme RM IM prestakin entzimatikoek metanola
zenbait urratsetan gehitzea behar dute %90 eta 75 baino ekoizpen altuagoak
emateko, hurrenez hurren.
7. Transesterifikazio erreakzioetan lortutako emaitzek adierazten dute entzima
immobilizatzeko erabiltzen den euskarriaren izaerak edota kantitateak
nolabaiteko eragina duela substratuen barreiapenean eta entzimak azaltzen
duen aktibitate katalitikoan.
8. Gantz-azido askeen eta metanolaren arteko esterifikazio erreakzioetan
prestakin egokiena Novozym 435 da, %95eko edo gehiagoko
errendimenduak ematen baitu lipasa kantitate gutxien erabilita.
9. Esterifikazio emaitza berdinak lortzen dira prozesua era jarraian, ohantze
finkoko erreaktore batean, burutuz gero. Honela, hondar koipetsuen
ustiapena bi urrats xinpleetan burutua izan daiteke:
1) hidrolisia, ur-fasean glizerolaren berreskuratzea ahal egingo lukeena, eta
2) gantz-azido askeen esterifikazioa, jarraian, era honetan metanolak eragin
zitzakeen arazoak ekidinez.
V. BIBLIOGRAFIA
V. Bibliografia
175
ABIGOR, R.D., UADIA, P.O., FOGLIA, T.A., HAAS, M.J., JONES, K.C., OKPEFA, E., OBIBUZOR, J.U., BAFOR, M.E. (2000) “Lipase-catalysed production of biodiesel fuel from some Nigerian lauric oils” Biochemical Society Transactions 28 (6), 979-981 ADAMCZAK, M., BEDNARSKI, W., SAWICKA-ZUKOWSKA, R., KRAKOWIAK, A., JEDRYCHOWSKA, B. (2000) “The application of lipase preparation from Rhizopus cohnii to animal waste fat biodegradation” Mededelingen- Faculteit Landbouwkundige en toegepaste Biologische Wetenschappen (Universiteit Gent) 65 (3b), 623-626. ADLERCREUTZ, P. (1996) “Modes of using enzymes in organic media” Enzymatic reactions in organic media. A.M.P. Koskinen & A.M. Klibanov eds. Blackie Academic and Professional-Chapman and Hall. Glasgow. AGARWAL, A.K., DAS, L.M. (2001) “Biodiesel development and characterization for use as a fuel in compression ignition engines” Transactions of the American Society of Mechanical Engineers 123, 440-447. AGERBO, P., JØRGENSEN, B.M., JENSEN, B., BØRRESEN, T., GUNHILD, H. (1992) “Enzyme inhibition by secondary lipid autoxidation products from fish oil” Journal of Nutritional Biochemistry 3, 549-553. ALBASI, C., BERTRAND, N., RIBA, J.P. (1999) “Enzymatic hydrolysis of sunflower oil in a standardized agitated tank reactor” Bioprocess Engineering 20, 77-81. ALBASI, C., RIBA, J.P., SOKOLOVSKA, I., BALES, V. (1997) “Enzymatic Hydrolysis of Sunflower Oil: Characterisation of Interface” Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 69, 329-336. ALCANTARA, R., AMORES, J., CANOIRA, L., FIDALGO, E., FRANCO, M.J., NAVARRO, A. (2000) “Catalytic production of biodiesel from soy-bean oil, used frying oil and tallow” Biomass and Bioenergy 18, 515-527. AL-ZUHAIR, S., HASAN, M., RAMACHANDRAN, K.B. (2003) “Kinetics of the enzymatic hydrolysis of palm oil by lipase” Process Biochemistry 38, 1155-1163. ANTOLIN, G., TINAUT, F.V., BRICEÑO, Y., CASTAÑO, V., PÉREZ, C., RAMÍREZ, A.I. (2002) “Optimisation of biodiesel production by sunflower oil transesterification” Bioresource Technology 83, 111-114. ARROYO, R., SÁNCHEZ-MUNIZ, F.J., CUESTA, C., BURGUILLO, F.J., SÁNCHEZ-MONTERO, J.M. (1996) “Hydrolysis of used frying palm olein and sunflower oil catalyzed by porcine pancreatic lipase” Lipids 31 (11), 1133-1139.
V. Bibliografia
176
BAN, K., HAMA, S., NISHIZUKA, K., KAIEDA, M., MATSUMOTO, T., KONDO, A., NODA, H., FUKUDA, H. (2002) “Repeated use of whole-cell biocatalysts immobilized within biomass support particles for biodiesel fuel production” Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 17, 157-165. BAN, K., KAIEDA, M., MATSUMOTO, T., KONDO, A., FUKUDA, H. (2001) “Whole cell biocatalyst for biodiesel fuel production utilizing Rhizopus oryzae cells immobilized within biomass support particles” Biochemical Engineering Journal 8, 39-43. BASRI, M., HENG, A.C., RAZAK, C.N.A., WAN YUNUS, W.M.Z., AHMAD, M., RAHMAN, R.N.A., AMPON, K., SALLEH, A.B. (1997) “Alcoholysis of palm oil mid-fraction by lipase from Rhizopus rhizopodiformis” Journal of the American Oil Chemists’ Society 74 (2), 113-116. BATES, M.P., PHILLIPS, P.S. (1999) “Sustainable waste management in the food and drink industry” British Food Journal 101 (8), 580-589 BEDNARSKI, W., ADAMCZAK, M., KOWALEWSKA-PIONTAS, J., ZADERNOWSKI, R. (1994) “Biotechnological methods for the up-grading and modification of animal waste fats” Acta Biotechnologica 14 (4), 387-393 BEISSON, F., TISS, A., RIVIÈRE, C., VERGER, R. (2000) “Methods for lipase detection and assay: a critical review” European Journal of Lipid Science and Technology 102, 133-153. BÉLAFI-BAKÓ, K., KOVÁCS, F., GUBICZA, L., HANCSÓK, J. (2002) “Enzymatic biodiesel production from sunflower oil by Candida antarctica lipase in a solvent-free system” Biocatalysis and Biotransformation 20 (6), 437-439. BELITZ, H.D., GROSCH, W. (1999) “Food Chemistry” 2nd edition. Springer-Verlag, Alemania. BENZONANA, G., DESNUELLE, P. (1965) “Kinetic study of the action of pancreatic lipase on triglycerides in emulsion. Enzymic action in a heterogeneous medium” Biochimica et Biophysica Acta 105 (1), 121-136. BIOCATALYSTS LIMITED (1999) “LipomodTM 34P – L034P-ren fitxa teknikoa” Pontypridd, Wales, UK. BIOSOFT (1999) “EnzFitter”, Biosoft, Britainia Handia. BOEHRINGER-MANNHEIM (1999) “UV method for the determination of glycerol in foodstuffs and other materials” Cat. No. 148270, Biopharm GmbH Darmstadt, Germany. BOLETIN OFICIAL DEL ESTADO (BOE) (1998) nº 96, de 22 de abril de 1998,
V. Bibliografia
177
Ley 10/1998, de 21 de abril, de residuos. BOUSQUET-DUBOUCH, M.P., GRABER, M., SOUSA, N., LAMARE, S., LEGOY, M.D. (2001) “Alcoholysis catalyzed by Candida antarctica lipase B in a gas/solid system obeys a Ping Pong Bi Bi mechanism with competitive inhibition by the alcohol substrate and water” Biochimica et Biophysica Acta 1550, 90-99. CADENAS, E., SOLS, A. (1960) “Ketokinase activity of the intestinal mucosa” Biochimica et Biophysica Acta 42, 490-498. CANLER, J.P., ROYER, C., DUCHÈNE, PH. (2001) “Aerobic biological treatment of grease from urban wastewater treatment plants” Water Science and Technology 44 (2-3), 219-226. CHEN, J-W., WU, W-T. (2003) “Regeneration of immobilized Candida antarctica lipase for transesterification” Journal of Bioscience and Bioengineering 95 (5), 466-469. CHULALAKSANANUKUL W., CONDORET, J.S., DELORME, P., WILLEMOT, R.M. (1990) “Kinetic study of esterification by immobilized lipase in n-hexane” FEBS Letters 276 (1-2), 181-184 CROOKS, G.E., REES, G.D., ROBINSON, B.H., SVENSSON, M., STEPHENSON, G.R. (1995a) “Comparison of Hydrolysis and Esterification Behavior of Humicola lanuginosa and Rhizomucor miehei Lipases in AOT-Stabilized Water-in-Oil Microemulsions: 1. Effect of pH and Water Content on Reaction Kinetics” Biotechnology and Bioengineering 48, 78-88. CROOKS, G.E., REES, G.D., ROBINSON, B.H., SVENSSON, M., STEPHENSON, G.R. (1995b) “Comparison of Hydrolysis and Esterification Behavior of Humicola lanuginosa and Rhizomucor miehei Lipases in AOT-Stabilized Water-in-Oil Microemulsions: 2. Effect of Temperature on Reaction Kinetics and General Considerations of Stability and Productivity” Biotechnology and Bioengineering 48, 190-196. DANDIK, L., ARIOGLU, G., AKSOY, H.A. (1993) “The Enzymatic Hydrolysis of Used Frying Oil by Native Lipase” Applied Biochemistry and Biotechnology 42, 119-126. DE RENOBALES, M., AGUD, I., LASCARAY, J.M., MÚGICA, J.C., LANDETA, L.C., SOLOZABAL, R. (1992) “Hydrolysis of animal fats by lipase at temperatures below their melting points” Biotechnology Letters 14 (8), 683-688. DENG, L., XU, X., HARALDSSON, G.G., TAN, T., WANG, F. (2005) “Enzymatic production of alkyl esters through alcoholysis: A critical evaluation of lipases and alcohols” Journal of the American Oil Chemists’ Society 82 (5), 341-
V. Bibliografia
178
347. DOBARGANES, M.C., VELASCO, J., MÁRQUEZ-RUIZ, G. (2002) “La calidad de los aceites y grasas de fritura” Alimentación, Nutrición y Salud 9 (4), 109-118. DOCE (1991) L nº 078 2613/1991. Directiva 91/156/CEE del Consejo de 18 de marzo de 1991 por la que se modifica la Directiva 75/442/CEE relativa a los residuos. DOCE (2001) L nº 147 de 31/5/2001. Reglamento (CE) nº 999/2001 del Parlamento Europeo y del Consejo de 22 de mayo de 2001 por el que se establecen disposiciones para la prevención, el control y la erradicación de determinadas encefalopatías espongiformes transmisibles. DOCE (2002) L nº 273 de 10/10/2002. Reglamento (CE) nº 1774/2002 del Parlamento Europeo y del Consejo de 3 de octubre de 2002 por el que se establecen las normas sanitarias aplicables a los subproductos animales no destinados al consumo humano. DOMÍNGUEZ DE MARÍA, P., MARTÍNEZ-ALZAMORA, F., PÉREZ MORENO, S., VALERO, F., RÚA, M.L., SÁNCHEZ-MORENO, J.M., SINISTERRA, J.V., ALCÁNTARA, A.R. (2002) “Heptyl oleate synthesis as useful tool to discriminate between lipases, proteases and other hydrolases in crude preparations” Enzyme and Microbial Technology 31, 283-288. DORADO, M.P., BALLESTEROS, E., DE ALMEIDA, J.A., SCHELLERT, C., LÖHRLEIN, H.P., KRAUSE, R. (2002) “An alkaly-catalyzed transesterification process for high free fatty acid waste oils” Transactions of the American Society of Agricultural Engineers 45 (3), 525-529. DOSSAT, V., COMBES, D., MARTY, A. (1999) “Continuous transesterification of high oleic sunflower oil in a packed bed reactor: influence of the glycerol production” Enzyme and Microbial Technology 25, 194-200. DOSSAT, V., COMBES, D., MARTY, A. (2002) “Efficient lipase catalysed production of a lubricant and surfactant formulation using a continous solvent-free process” Journal of Biotechnology 97, 117-124. DU, W., XU, Y., LIU, D., LI, Z. (2005) “Study on acyl migration in immobilized Lipozyme TL catalyzed transesterification of soybean oil for biodiesel production” Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 37, 68-71. DU, W., XU, Y., LIU, D. (2003) “Lipase-catalysed transesterification of soya bean oil for biodiesel production during continuous batch operation” Biotechnology and Applied Biochemistry 38, 103-106. DU, W., XU, Y., LIU, D., ZENG, J. (2004) “Comparative study on lipase-
V. Bibliografia
179
catalyzed transformation of soybean oil for biodiesel production with different acyl acceptors” Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 30, 125-129. EHAA/BOPV (1998) 3/1998 LEGEA, otsailaren 27koa, Euskal Herriko ingurugiroa babesteko lege orokorra. EUROPEAN BIODIESEL BOARD (EBB) (2005) “Statistics: The EU biodiesel industry” http://www.ebb-eu.org/stats.php [2005eko urrian kontsultatuta]. EUROPEAN COMMISSION (EC) (2000) “Libro Blanco de la Seguridad Alimentaria”. EUROPEAN COMMISSION (EC) (2004) DG Health and Consumer Protection “Food and Feed Safety-BSE-Animal By-Products” http://europa.eu.int/comm/food/food/biosafety/bse/byproducts_en.htm [2004ko ekainean kontsultatuta].
FAOSTAT (2005) Agricultural Data “Agricultural Production” htpp://apps.fao.org/page/collections?subset=agriculture&language=ES [2005eko urtarrilean kontsultatuta].
FU, X., ZHU, X., GAO, K., DUAN, J. (1995) “Oil and fat hydrolysis with lipase from Aspergillus sp.” Journal of the American Oil Chemists’ Society 72 (5), 527-531. GANDHI, N.N. (1997) “Applications of Lipase” Journal of the American Oil Chemists’ Society 74 (6), 621-634. GANDHI, N.N., SAWANT, S.B., JOSHI, J.B. (1995) “Studies on the Lipozyme-catalyzed synthesis of butyl laurate” Biotechnology and Bioengineering 46, 1-12. GAROU, D. (1998) “Immobilisation de lipases sur supports synthétiques et application à l’hydrolyse de l’huile d’olive en réacteur de laboratoire. Traitement enzymatique des effluents gras industriels par des lipases en solution” Thèse présentée pour l’obtention du grade de Docteur ès Sciences de l’Université de Technologie de Compiègne.. GERTZ, C. (2000) “Chemical and physical parameters as quality indicators of used frying fats” European Journal of Lipid Science and Technology 102, 566-572. GOLDBERG, M., THOMAS, D., LEGOY, M-D. (1990) “The control of lipase-catalysed transesterification and esterification reaction rates: Effect of substrate polarity, water activity and water molecules on enzyme activity” European Journal of Biochemistry 190, 603-609. GRYGLEWICZ, S., PIECHOCKI, W., GRYGLEWICZ, G. (2003) “Preparation of polyol esters based on vegetable and animal fats” Bioresource Technology 87, 35-39.
V. Bibliografia
180
GUNSTONE, F. D. (1999) “Enzymes as biocatalysts in the modification of natural lipids” Journal of the Science of Food and Agriculture 79, 1535-1549. GUNSTONE, F.D. (1994) “Fatty acid structure” The Lipid Handbook, 2nd ed. Gunstone, F.D., Harwood, J.L., & Padley, F.B. Chapman & Hall. London. GÜVENÇ, A., KAPUCU, N., MEHMETOGLU, Ü. (2002) “The production of isoamyl acetate using immobilized lipases in a solvent-free system” Process Biochemistry 38, 379-386. HAAS, M.J., MICHALSKI, P.J., RUNYON, S., NUNEZ, A., SCOTT, K.M. (2003) “Production of FAME from acid oil, a by-product of vegetable oil refining” Journal of the American Oil Chemists’ Society 80 (1), 97-102. HABA, E., BRESCO, O., FERRER, C., MARQUÉS, A., BUSQUETS, M., MANRESA, A. (2000a) “Isolation of lipase-secreting bacteria by deploying used frying oil as selective substrate” Enzyme and Microbial Technology 26, 40-44. HABA, E., ESPUNY, M.J., BUSQUETS, M., MANRESA, A. (2000b) “Screening and production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCIB 40044 from waste frying oils” Journal of Applied Microbiology 88, 379-387. HABA, E., PINAZO, A, JAUREGUI, O., ESPUNY, M.J., INFANTE, M.R., MANRESA, A. (2003) “Physicochemical characterization and antimicrobial properties of rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCBIM 40044” Biotechnology and Bioengineering 81 (3), 316-322. HAMILTON, S., HAMILTON, R.J., SEWELL, P.A. (1992) “Extraction of lipids and derivative formation” Lipid Analysis: A Practical Approach. R.J. Hamilton & S. Hamilton. IRL Press. Oxford. HEIPIEPER, H.J., WEBER, F.J., SIKKEMA, J., KEWELOH, H., DE BONT, J.A.M. (1994) “Mechanisms of resistance of whole cells to toxic organic solvents” TIBTECH 12, 409-415. HENDERSON, R.J., BURKOW, I.C., MILLAR R.M. (1993) “Hydrolysis of fish oils containing polymers of triacylglicerols by pancreatic lipase in vitro” Lipids 28 (4), 313-319. HENDERSON, R.J., TOCHER, D.R. (1992) “Thin-Layer Chromatography” Lipid Analysis: A Practical Approach. R.J. Hamilton & S. Hamilton. IRL Press. Oxford. HOSHINO, T., YAMANE, T., SHIMIZU, S. (1990) “Selective hydrolysis of fish oil by lipase to concentrate n-3 polyunsaturated fatty acids” Agricultural and Biological Chemistry 54 (6), 1459-1467.
V. Bibliografia
181
HSU, A.F., JONES, K., FOGLIA, T.A., MARMER, W.N. (2002) “Immobilized lipase-catalysed production of alkyl esters of restaurant grease as biodiesel” Biotechnology and Applied Biochemistry 36, 181-186. HSU, A.F., JONES, K., MARMER, W.N., FOGLIA, T.A. (2001) “Production of alkyl esters from tallow and grease using lipase immobilized in a phyllosilicate sol-gel” Journal of the American Oil Chemists’ Society 78 (6), 585-588. HULT K., HOLMQUIST M. (1997) “Kinetics, molecular modeling, and synthetic applications with microbial lipases” Methods in Enzymology. Vol. 286. Lipases. Part B. Enzyme characterization and utilization. Edited by Byron Rubin and Edgard A. Dennos. ISO, M., CHEN, B., EGUCHI, M., KUDO, T., SHRESTHA, S. (2001) “Production of biodiesel fuel from triglycerides and alcohol using immobilized lipase” Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 16, 53-58. IUPAC (1979) Método II.D.1. “Standard Methods for the Analysis of Oils, Fats and Derivatives”. 6th Edition. Pergamon Press. Oxford. IUPAC (1979) Método II.D.2. “Standard Methods for the Analysis of Oils, Fats and Derivatives”. 6th Edition. Pergamon Press. Oxford. IWAI, M., TSUJISAKA, Y. (1984) “Fungal lipase” Lipases. B. Borgström & H.L. Brockman. Elsevier, Amsterdam. JACKSON, M.A., KING, J.W. (1996) “Methanolysis of seed oils in flowing supercritical carbon dioxide” Journal of the American Oil Chemists’ Society 73 (3), 353-356. JONZO, M.D., HIOL, A., ZAGOL, I., DRUET, D., COMEAU, L-C. (2000) “Concentrates of DHA from fish oil by selective esterification of cholesterol by immobilized isoforms of lipase from Candida rugosa” Enzyme and Microbial Technology 27, 443-450. KAIEDA, M., SAMUKAWA, T., KONDO, A., FUKUDA, H. (2001) “Effect of methanol and water contents on production of biodiesel fuel from plant oil catalyzed by various lipases in a solvent-free system” Journal of Bioscience and Bioengineering 91 (1), 12-15. KAIEDA, M., SAMUKAWA, T., MATSUMOTO, T., BAN, K., KONDO, A., SHIMADA, Y., NODA, H., NOMOTO, F., OHTSUKA, K., IZUMOTO, E., FUKUDA, H. (1999) “Biodiesel fuel production from plant oil catalyzed by Rhizopus oryzae lipase in a water-containing system without an organic solvent” Journal of Bioscience and Bioengineering 88 (6), 627-631. KALUZNY, M.A., DUNCAN, L.A., MERRITT, M.U., EPPS, D.E. (1985) “Rapid
V. Bibliografia
182
separation of lipid classes in high yield and purity using bonded phase columns” Journal of Lipid Research 26, 135-140. KARAM, J., NICELL, J.A. (1997) “Potential applications of enzymes in waste treatment” Journal of Chemical Technology and Biotechnology 69, 141-153. KILDIRAN, G., YÜCEL, S.O., TÜRKAY, S. (1996) “In-situ alcoholysis of soybean oil” Journal of the American Oil Chemists’ Society 73 (2), 225-228. KIM, I-H., KIM, H., LEE, K-T., CHUNG, S-H., KO, S-N. (2002) “Lipase-catalyzed acidolysis of perilla oil with caprylic acid to produce structured lipids” Journal of the American Oil Chemists’ Society 79 (4), 363-367. KLIMKIEWICZ, R., FABISZ, E., MORAWSKI, I., GRABOWSKA, H., SYPER, L. (2001) “Ketonization of long chain esters from transesterification of technical waste fats” Journal of Chemical Technology and Biotechnology 76, 35-38. KÖRBITZ, W. (1999) “Biodiesel production in Europe and North America, an encouraging prospect” Renewable Energy 16, 1078-1083. KÖSE, O., TÜTER, M., AKSOY H.A. (2002) “Immobilized Candida antarctica lipase-catalyzed alcoholysis of cotton seed oil in a solvent free medium” Bioresource Technology 83, 125-129. KOSUGI, Y., SUZUKI, H., FUNADA, T. (1988) “Hydrolysis of beef tallow by lipase from Pseudomonas sp.“ Biotechnology and Bioengineering 31 (4), 349-56. KRAWCZYK, T. (1996) “Biodiesel. Alternative fuel makes inroads but hurdles remain” INFORM 7 (8), 800-815. KRISHNA, S.H., KARANTH, N.G. (2001) “Lipase-catalyzed synthesis of isoamyl butyrate: A kinetic study” Biochimica et Biophysica Acta 1547, 262-267. KRISHNA, S.H., PRAPULLA, S.G., KARANTH, N.G. (2000) “Enzymatic synthesis of isoamyl butyrate using immobilized Rhizomucor miehei lipase in non-aqueous media” Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 25, 147-154. LAI, C.C., SITI, Z., VALI, S.R., JU, Y.H. (2005) “Lipase-catalyzed production of biodiesel from rice bran oil” Journal of Chemical Technology and Biotechnology 80, 331-337. LARSSON, K., QUINN, P.J. (1994) “Physical properties: structural and physical characteristics” The Lipid Handbook, 2nd ed. Gunstone, F.D., Harwood, J.L., & Padley, F.B. Chapman & Hall. London. LEE, I., JOHNSON, L.A., HAMMOND, E.G. (1995) “Use of branched-chain
V. Bibliografia
183
esters to reduce the crystallization temperature of biodiesel” Journal of the American Oil Chemists’ Society 72 (10), 1155-1160. LEE, K.T., FOGLIA, T.A., CHANG, K.S. (2002) “Production of alkyl ester as biodiesel from fractionated lard and restaurant grease” Journal of the American Oil Chemists’ Society 79 (2), 191-195. LEUNG, D.Y.C. (2001) “Development of a clean biodiesel fuel in Hong Kong using recycled oil” Water, Air and Soil Pollution 130, 277-282. LINKO, Y-Y., LÄMSÄ, M., HUHTALA, A., RANTANEN, O. (1995) “Lipase biocatalysis in the production of esters” Journal of the American Oil Chemists’ Society 72 (11), 1293-1299. LINKO, Y-Y., LÄMSÄ, M., WU, X., UOSUKAINEN, E., SEPPÄLÄ, J., LINKO, P. (1998) “Biodegradable products by lipase biocatalysis” Journal of Biotechnology 66, 41-50. MA, F., HANNA, M.A. (1999) “Biodiesel production: a review” Bioresource Technology 70, 1-15. MACKENZIE, A.D., STEVENSON, D.E. (2000) “Production of high-oleic acid tallow fractions using lipase-catalyzed directed interesterification, using both batch and continuous processing” Enzyme and Microbial Technology 27, 302-311. MAHADIK, N.D., PUNTAMBEKAR, U.S., BASTAWDE, K.B., KHIRE, J.M., GOKHALE, D.V. (2002) “Production of acidic lipase by Aspergillus niger in solid state fermentation” Process Biochemistry 38 (5), 715-721. MARTINELLE M., HULT K. (1994) "Kinetics of triglyceride lipases" Lipases: Their structure, biochemistry and application. Paul Wolley & Steffen B. Petersen. Cambridge University Press. MATSUMOTO, T., TAKAHASHI, S., KAIEDA, M., UEDA, M., TANAKA, A., FUKUDA, H., KONDO, A. (2001) “Yeast whole-cell biocatalyst constructed by intracellular overproduction of Rhizopus oryzae lipase is applicable to biodiesel fuel production” Applied Microbiology and Biotechnology 57, 515-520. MINISTERIO DE MEDIO AMBIENTE (2000) “Plan Nacional de Residuos Urbanos (2000-2006)”. MINNING, S., VIND, J., SCHROEDER GLAD, S. O., DANIELSEN, S., BORCH, K. (2002) “Lipolytic enzyme variant” WO02055679 patent. MITTELBACH, M. (1990) “Lipase catalyzed alcoholysis of sunflower oil” Journal of the American Oil Chemists’ Society 67 (3), 168-70.
V. Bibliografia
184
MITTELBACH, M., POKITS, B., SILBERHOLZ, A. (1992) “Production and fuel properties of fatty acid methyl esters from used frying oil” Liquid Fuels and Renewable Resources. Proceedings of the Alternative Energies Conference 74-8. MONTERO, S., BLANCO, VIRTO, M. D., LANDETA, L.C., AGUD, I., A., SOLOZABAL, R., LASCARAY J.M., DE RENOBALES, M., LLAMA, M.J., SERRA, J.L. (1993) “Immobilization of Candida rugosa lipase and some properties of the immobilized enzyme” Enzyme and Microbial Technology 15, 239-247. NAKA, Y. (1987) “Study on the assay of lipase with emulsified substrate” Yukagaku 36 (10), 821-825. NELSON, L.A., FOGLIA, T.A., MARMER, W.N. (1996) “Lipase-catalyzed production of biodiesel” Journal of the American Oil Chemists’ Society 73 (8), 1191-1195. NEVES PETERSEN, M.T., FOJAN, P., PETERSEN, S.B. (2001) “How do lipases and esterases work: the electrostatic contribution” Journal of Biotechnology 85, 115-147. NOOR, I.M., HASAN, M., RAMACHANDRAN, K.B. (2003) “Effect of operating variables on the hydrolysis rate of palm oil by lipase” Process Biochemistry 39, 13-20. NOVO NORDISK (1999a) LipolaseTM-ren fitxa teknikoa (B434-GB). Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVO NORDISK (1999b) LipopanTM BG-ren fitxa teknikoa. Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVO NORDISK (1999c) Novozym SP 398-ren fitxa teknikoa (B 470c-GB). Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVO NORDISK (2000a) Lipozyme® RM IM-ren fitxa teknikoa (B 347d-GB). Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVO NORDISK (2000b) Lipozyme® TL IM-ren fitxa teknikoa (B 1276b-GB). Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVO NORDISK (2000c) Novozym 435®-ren fitxa teknikoa (B 606d-GB). Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVO NORDISK (2000d) Lipase Activity. PLU assay. Determination by capillary-GC (B 1322a-GB). Novo Industri A/S. Novo Alle, Danimarka. NOVOZYMES (2005) “Enzymatic interesterification using Lipozyme TL IM in laboratory scale batch reactors” 030206 Cookbook for enzymatic interesterification.
V. Bibliografia
185
OCKERMAN, H.W., HANSEN, C.L. (1994) Industrialización de subproductos de origen animal. Ed. ACRIBIA, S.A. Zaragoza. PADLEY, F.B., GUNSTONE, F.D., HARWOOD, J.L. (1994) “Ocurrence and characteristics of oils and fats” The Lipid Handbook, 2nd ed. Gunstone, F.D., Harwood, J.L., & Padley, F.B. Chapman & Hall. London. PEREIRA, E.B., DE CASTRO, H.F., DE MORAES, F.F., ZANIN, G.M. (2001) “Kinetic studies of lipase from Candida rugosa” Applied Biochemistry and Biotechnology 91-93, 739-752. PIROZZI, D., GRECO G. Jr. (2004) “Activity and stability of lipases in the síntesis of butyl lactate” Enzyme and Microbial Technology 34, 94-100. PLANK, C., LORBEER, E. (1995) “Simultaneous determination of glycerol, and mono-, di- and triglycerides in vegetable oil methyl esters by capillary gas chromatography” Journal of Chromatography A 697, 461-468. PLOU, F.J., SOGO, P., CALVO, M.V., BURGUILLO, F.J., BALLESTEROS, A. (1997) “Kinetic and enantioselective behaviour of isoenzymes A and B from Candida rugosa lipase in the hydrolysis of lipids and esters” Biocatalysis and Biotransformation 15, 75-89. POKORNÝ, J. (1998) “Substrate influence on the frying process” Grasas y Aceites 49 (3-4), 265-270. QUAGLIA, G., COMENDADOR, J., FINOTTI, E. (1998) “Optimization of frying process in food safety” Grasas y Aceites 49 (3-4), 275-281. RAMAMURTHI, K., McCURDY, A.R. (1994) “Lipase-catalyzed esterification of oleic acid and methanol in hexane-A kinetic study” Journal of the American Oil Chemists’ Society 71 (9), 927-930. ROGALSKA, E., CUDREY, C., FERRATO, F., VERGER, R. (1993) “Stereoselective hydrolysis of triglycerides by animal and microbial lipases” Chirality 5 (1), 24-30. ROSEVEAR, A., KENNEDY, J.F., CABRAL, J.M.S. (1987) Immobilised enzymes and cells. Adam Hilger ed. Bristol. RÚA, M.L., DÍAZ-MAURIÑO, T., FERNÁNDEZ, V.M., OTERO, C., BALLESTEROS, A. (1993) “Purification and characterization of two distinct lipases from Candida cylindracea” Biochimica et Biophysica Acta 1156, 181-189. SALZBERG, H.W. (1991) From Caveman to Chemist: Circumstances and Achievements. American Chemical Society, Washington, D.C.
V. Bibliografia
186
SAMUKAWA, T, KAIEDA, M., MATSUMOTO, T., BAN, K., KONDO, A., SHIMADA, Y., NODA, H., FUKUDA, H. (2000) “Pretreatment of immobilized Candida antarctica lipase for biodiesel fuel production from plant oil” Journal of Bioscience and Bioengineering 90 (2), 180-183. SARDA, L., DESNUELLE, P. (1958) “Action de la lipase pancréatique sur les esters en émulsion” Biochimica et Biophysica Acta 30 (3), 513-521. SAUCEDO, E. (2001) “El biodiesel” Ingenieria Química 20, 19-29. SAXENA, R.K., DAVIDSON, W.S., SHEORAN, A., GIRI, B. (2003) “Purification and characterization of an alkaline thermostable lipase from Aspergillus carneus” Process Biochemistry 39 (2), 239-247. SCHMID, R.D., VERGER, R. (1998) “Lipases: Interfacial enzymes with attractive applications” Angewandte Chemie International Edition 37, 1608-1633. SEGEL, I.H. (1975) Enzyme kinetics: Behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme-systems. Wiley Interscience, New York. SEGEL, I.H. (1976) Biochemical Calculations: How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry. 2nd Ed. Wiley Interscience, New York. SHIMADA, Y., WATANABE, Y., SAMUKAWA, T., SUGIHARA, A., NODA, H., FUKUDA, H., TOMINAGA, Y. (1999) “Conversion of vegetable oil to biodiesel using immobilized Candida antarctica lipase” Journal of the American Oil Chemists’ Society 76 (7), 789-793. SHIMADA, Y., WATANABE, Y., SUGIHARA, A., TOMINAGA, Y. (2002) “Enzymatic alcoholysis for biodiesel fuel production and application of the reaction to oil processing” Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 17, 133-142. SONNET, P.E. (1988) “Lipase selectivities” Journal of the American Oil Chemists’ Society 65 (6), 10-14. SOUMANOU, M.M., BORNSCHEUER, U.T. (2003a) “Improvement in lipase-catalyzed synthesis of fatty acid methyl esters from sunflower oil” Enzyme and Microbial Technology 33, 97-103. SOUMANOU, M.M., BORNSCHEUER, U.T. (2003b) “Lipase-catalyzed alcoholysis of vegetable oils” European Journal of Lipid Science and Technology 105, 656-660. STADHOUDERS, J., VERINGA, H.A. (1973) “Fat hydrolysis by lactic acid bacteria in cheese” Netherlands Milk Dairy Journal 27, 77-91. STAMATIS, H., XENAKIS, A., MENGE, U., KOLISIS, F.N. (1993) “Kinetic
V. Bibliografia
187
study of lipase catalyzed esterification reactions in water-in-oil microemulsions” Biotechnology and Bioengineering 42, 931-937. STEVENSON, D.E., ROGER, A.S., FURNEAUX, R.H. (1994) “Near-quantitative production of fatty acid alkyl esters by lipase-catalyzed alcoholysis of fats and oils with adsorption of glycerol by silica gel” Enzyme and Microbial Technology 16, 478-483. STOLL, U., GUPTA, H. (1997) “Management strategies for oil and grease residues” Waste Management & Research 15, 23-32. SVENDSEN, A. (2000) “Lipase protein engineering” Biochimica et Biophysica Acta 1543, 223-238. TABERSKI, J.S., PETERSON, C.L., THOMPSON, J., HAINES, H. (1999) “Using biodiesel in Yellowstone National Park – Final report of the “Truck in the Park” project” Society of Automotive Engineers Technical Paper Series 1999-01-2798. TORRES, C.F., MUNIR, F., BLANCO, R.M., OTERO, C., HILL Jr., C.G. (2002) “Catalytic tranesterification of corn oil and tristearin using immobilized lipases from Thermomyces lanuginosa” Journal of the American Oil Chemists’ Society 79 (8), 775-781. TYAGI, V.K., VASISHTHA, A.K. (1996) “Changes in the characteristics and composition of oils during deep-fat frying” Journal of the American Oil Chemists’ Society 73 (4), 499-506. UHLIG, H. (1998) Industrial enzymes and their applications. John Wiley and Sons, Inc., Nueva York. USDA (2003) Foreign Agricultural Service “Production Estimates and Crop Assessment Division” http://www.fas.usda.gov/pecad/highlights/2003/09/biodiesel3/index.htm [2003ko irailean kontsultatuta].
VAYSSE, L., LY, A., MOULIN, G., DUBREUCQ, E. (2002) “Chain-length selectivity of various lipases during hydrolysis, esterification and alcoholysis in biphasic aqueous medium” Enzyme and Microbial Technology 31, 648-655. VÁZQUEZ-LIMA, F., PYLE, D.L., ASENJO, J.A. (1995) “Factors affecting the esterification of lauric acid using an immobilized biocatalysts: Enzyme characterization and studies in a well-mixed reactor” Biotechnology and Bioengineering 46, 69-79. VILLENEUVE, P., FOGLIA, T.A. (1997) “Lipase specificities: Potential application in lipid bioconversions” INFORM 8 (6), 640-650.
V. Bibliografia
188
VIRTO, M. D., AGUD, I., MONTERO, S., BLANCO, A., SOLOZABAL, R., LASCARAY, J.M., LLAMA, M.J., SERRA, J.L., LANDETA, L.C., DE RENOBALES, M. (1994) “Hydrolysis of animal fats by immobilized Candida rugosa lipase” Enzyme and Microbial Technology 16, 61-65. VIRTO, M.D., LASCARAY, J.M., SOLOZABAL, R., DE RENOBALES, M. (1991) “Enzymic hydrolysis of animal fats in organic solvents at temperatures below their melting points” Journal of the American Oil Chemists’ Society 68 (5), 324-327. VITORIA-GASTEIZko UDALA (2000) “Udal Hondakinak Kudeatzeko Plan Integrala (UHKPI, 2000-2006) - Plan Integral de Gestión de Residuos Municipales de Vitoria-Gasteiz (PIGRM, 2000-2006)”. VON WEDEL, R. (1999) Technical handbook for marine biodiesel in recreational boats. Prepared for National Renewable Energy Laboratory, US Department of Energy. VORDERWÜLBECKE, T., KIESLICH, K., ERDMANN, H. (1992) “Comparison of lipases by different assays” Enzyme and Microbial Technology 14, 631-639. VULFSON, E.N. (1994) “Industrial applications of lipases” Lipases: their structure, biochemistry & application. Paul Wolley & Stephen B. Petersen. Cambridge University Press. 271-288. WANG, Y.J., SHEU, J.Y., WANG, F.F., SHAW, J.F. (1988) “Lipase-catalyzed oil hydrolysis in the absence of added emulsifier” Biotechnology and Bioengineering 31, 628-633. WATANABE, Y, SHIMADA, Y., SUGIHARA, A., NODA, H., FUKUDA, H., TOMINAGA, Y. (2000) “Continuous production of biodiesel fuel from vegetable oil using immobilized Candida antarctica lipase” Journal of the American Oil Chemists’ Society 77 (4), 355-360. WATANABE, Y, SHIMADA, Y., SUGIHARA, A., TOMINAGA, Y. (2001) “Enzymatic conversion of waste edible oil to biodiesel fuel in a fixed-bed bioreactor” Journal of the American Oil Chemists’ Society 78 (7), 703-707. WATANABE, Y., PINSIRODOM, P., NAGAO, T., KOBAYASHI, T., NISHIDA, Y., TAKAGI, Y., SHIMADA, Y. (2005) “Production of FAME from acid oil model using immobilized Candida antarctica lipase” Journal of the American Oil Chemists’ Society 82 (11), 825-831. WATANABE, Y., SHIMADA, Y., BABA, T., OHYAGI, N., MORIYAMA, S., TERAI, T., TOMINAGA, Y., SUGIHARA, A. (2002) “Methyl esterification of waste fatty acids with immobilized Candida antartica lipase” Journal of Oleo Science 51 (10), 655-661.
V. Bibliografia
189
WEHLMANN, J. (1999) “Use of esterified rapeseed oil as plasticizer in plastics processing” Fett/Lipid 101 (7), 249-256. WILSON, E.K. (2002) “Biodiesel revs up” Chemical and Engineering News 27, 46-49. WU, H., ZONG, M.I., LUO, Q., WU, H. (2003) “Enzymatic conversion of waste oil to biodiesel in a solvent-free system” Preparation Paper-American Chemistry Society. Division Fuel Chemistry 48 (2), 533-534. XU, X. (2000) “Production of specific-structured triacylglycerols by lipase-catalyzed reactions: a review” European Journal of Lipid Science and Technology 287-303. XU, X., BALCHEN, S., HØY, C-E., ADLER-NISSEN, J. (1998) “Production of specific-structured lipids by enzymatic interesterification in a pilot continuous enzyme bed reactor” Journal of the American Oil Chemists’ Society 75 (11), 1573-1579. XU, X., PORSGAARD, T., ZHANG, H., ADLER-NISSEN, J., HØY, C-E. (2002) “Production of structured lipids in a packed-bed reactor with Thermomyces lanuginosa lipase” Journal of the American Oil Chemists’ Society 79 (6), 561-565. XU, Y., DU, W., ZENG, J., LIU, D. (2004) “Conversion of soybean oil to biodiesel fuel using Lipozyme TL IM in a solvent-free medium” Biocatalysis and Biotransformation 22 (1), 45-48. YAN, H., NORITOMI, H., NAGAHAMA, K. (2001) “Concentration of DHA in tuna oil using lipase catalysed hydrolysis” 6th World Congress of Chemical Engineering Melbourne, Australia 23-27 September 2001. YONG, Y.P., AL-DURI, B. (1996) “Kinetic studies on immobilised lipase esterification of oleic acid and octanol” Journal of Chemical Technology and Biotechnology 65, 239-248. YOUNG, F.V.K., POOT, C., BIERNOTH, E., KROG, N., DAVIDSON, N.G.J., GUNSTONE, F.D. (1994) “Processing of oils and fats” The Lipid Handbook, 2nd ed. Gunstone, F.D., Harwood, J.L., & Padley, F.B. Chapman & Hall. London. ZANIN, G.M., DE MORAES, F.F. (1998) “Thermal stability and energy of deactivation of free and immobilized amyloglucosidase in the saccharification of liquefied Cassava starch” Applied Biochemistry and Biotechnology 70-72, 383-394. ZHANG, H., XU, X., NILSSON, J., MU, H., ADLER-NISSEN, J., HØY, C-E. (2001) “Production of margarine fats by enzymatic interesterification with silica-granulated Thermomyces lanuginosa lipase in a large-scale study” Journal of the American Oil Chemists’ Society 78 (1), 57-64.
V. Bibliografia
190
ZHANG, Y., DUBÉ, M.A., McLEAN, D.D., KATES, M. (2003) “Biodiesel production from waste cooking oil: 1. Process design and technological assessment” Bioresource Technology 89, 1-16.