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IDENTIFICACIÓN DE LOS POSIBLES ACTIVADORES DE LOS GENES fbpA
yIDENTIFICACION DE LOS POSIBLES ACTIVADORES DE LOS GENES fbpA y
fbpC INVOLUCRADOS EN LA RESPUESTA DE
Mycobacterium tuberculosis AL TRATAMIENTO CON ISONIACIDA
IBETH CRISTINA ROMERO CALDERON
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para obtener el título de MAGISTER EN
CIENCIAS BIOLOGICAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
1
IDENTIFICACION DE LOS POSIBLES ACTIVADORES DE LOS GENES fbpA y fbpC
INVOLUCRADOS EN LA RESPUESTA DE
Mycobacterium tuberculosis AL TRATAMIENTO CON ISONIACIDA
____________________________________
____________________________
2
Nota de Aprobación
____________________________ ____________________________
____________________________ ___________________________ Dr. Raúl
Potou Dr. Fredy Gamboa Jurado Jurado
3
NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la resolución No 13 de julio de 1946:
La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos
por sus
alumnos en sus tesis de grado.
4
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. John Walker, Director de este trabajo, quien con su
orientación,
paciencia, dedicación y exigencia constantes, ha contribuido no
sólo al
desarrollo de esté proyecto, sino que ha hecho posible mi
crecimiento
profesional y personal al brindarme la oportunidad de hacer parte
de su
grupo de investigaciones; lo mismo que su valiosa amistad,
motivación y
confianza brindadas. GRACIAS.
A, Rafael Góngora “Don Raffa”, amigo y compañero de trabajo quien
con
sus sabios consejos, su apoyo y asesoría continua, ha contribuido a
la
culminación de éste trabajo, siendo protagonista en su desarrollo.
Gracias
Rafita.
A Carolina Vergel, por la confianza brindada, al permitirme
continuar
desarrollando éste proyecto que nació como una pequeña idea, además
por
su asesoría y ayuda a pesar de la distancia.
A todos mis amigos y compañeros de UB&BM, especialmente LuzDa,
Caro
G., Monic, Leyder y Claris, quienes me han brindado su valiosa
amistad y
me han enseñado el valor que ella tiene; también por su ayuda
durante la
realización del proyecto.
5
Al CIDEIM, por las facilidades y el apoyo brindado lo que
contribuyó al buen
desarrollo y culminación de este trabajo de tesis.
También agradezco al Programa Especial para la Investigación
y
Entrenamiento en Enfermedades Tropicales (TDR) de la
Organización
Mundial de la Salud (WHO), por el soporte financiero [Project
Development
Grant (PDG) Code A40270]; así mismo al Instituto Colombiano para
el
Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología "Francisco José de
Caldas"
(COLCIENCIAS) [Centro Colombiano de Investigación en
Tuberculosis
CCITB, Código No.431].
Al Laboratorio de Investigaciones en Micobacterias de la
Universidad del
Estado de Colorado (CSU, USA), especialmente a los Drs. John
Belisle,
Richard Slayden y Patrick Brennan por proveer el entrenamiento
y
reactivos para los estudios de expresión realizados previos a
esta
investigación los cuales dieron soporte a ésta; así mismo a la Dra.
Karen
Dobbos por las fracciones de proteína citosólicas gentilmente
donados y
facilitar los análisis por espectrometría de masas de algunas de
unas de las
proteínas aisladas.
Functional Genomics Facility, Universidad de Glasgow, U.K.) por
realizar la
gran mayoría de los análisis de espectrometría de masas.
6
DEDICATORIA
y ser la luz que me ha guiado en este
sendero, proporcionándome sabiduría y
mi vida.
comprensión en todos los momentos de mi
vida, quienes con su fé y constante apoyo
me han ayudado a alcanzar la cumbre
siendo los artífices de éste nuevo logro; a
ellos este trabajo como una pequeña
muestra de mi amor y gratitud.
A mi hermanita Martha, mi amiga y
consejera; quien con su cariño, ternura y
apoyo constantes, me ha enseñado que la
perseverancia es el camino que lleva a
escalar las cumbres del éxito. Gracias por
ser mi fortaleza en los momentos más
difíciles de mi vida.
ayuda permanentes contribuyendo no sólo
en mi formación profesional sino personal.
Ibeth Cristina.
P ág.
RESUMEN 13
1 INTRODUCCIÓN 15 2 MARCO TEÓRICO 18 2.1 El Impacto de la
Tuberculosis sobre la salud humana 18 2.2 Biología y Clasificación
del género Mycobacterium 24 2.3 Patogénesis y manifestaciones
clínicas de la enfermedad 26 2.4 Diagnóstico 32 2.4.1 Métodos
convencionales 32 2.4.2 Métodos moleculares 37 2.4.3 Otras técnicas
38 2.5 Inmunología de la Tuberculosis 39 2.6 Fisiología y
metabolismo 41 2.7 Genoma de Mycobacterium tuberculosis 50 2.8
Tratamiento y resistencia a drogas 52 2.8.1 Respuesta al
tratamiento con isoniacida (INH) 58 2.9 Antígeno 85 un posible
blanco de nuevas drogas 61 3 OBJETIVOS 67 3.1 Objetivo General 67
3.2 Objetivos Específicos 67 4 MATERIALES Y METODOS 69 4.1
Materiales 69 4.1.1 Micobacterias 69 4.1.2 Extracto de proteínas
69
4.1.3 Iniciadores para PCR 71 4.2 Métodos 72 4.2.1 Extracción de
ADN de Mycobacterium tuberculosis 73 4.2.2 Ensayos de PCR 74 4.2.3
Análisis del producto de amplificación 74
8
4.2.4 Clonación de los promotores de los genes fbpA y fbpC 75 4.2.5
Ensayos de unión al ADN “pull down asssay” 76 4.2.6 Separación de
proteínas mediante electroforesis en eles de
poliacrilamida 78
4.2.7 Detección de proteínas 80 4.2.8 Identificación de proteínas
utilizando espectrometría de masas
(EM) y bioinformática 80
5 RESULTADOS 83 5.1 Aislamiento y clonación de las regiones
promotoras de los genes
fbpA y fbpC 83
5.2 Ensayos de unión a ADN “pull down assay” 87 6 DISCUSION 106 7
CONCLUSIONES 116 8 PERSPECTIVAS 117 9 ANEXOS 119 10 BIBLIOGRAFIA
145
9
P ág.
ANEXO 1. Geles de Agarosa 119 ANEXO 2. Purificación de bandas de
ADN a partir de geles de agarosa
de bajo punto de fusión, con el Kit Wizard Sv Gel Y “PCR Clean Up
System” de Promega.
122
ANEXO 3. Ligación de productos de PCR a vector pGEM-T EASY de
Promega.
123
ANEXO 4. Transformación de células competentes 124 ANEXO 5.
Extracción de Plásmidos – Miniprep – con el kit Wizard de
Promega. 128
ANEXO 6. PCR-COLONY (confirmación de insertos dentro de las células
transformadas).
131
ANEXO 7. Separación de Proteínas mediante electroforesis en geles
de poliacrilamida.
133
ANEXO 8. Tinción con Plata. 139 ANEXO 9. Secuenciación, región
promotora del gen fbpA. 141 ANEXO 10. Secuenciación región
promotora del gen fbpC. 143 ANEXO 11. Dominio HTH (Hélice giro
Hélice) de unión a ADN de la
proteína hipotética C3 de M. tuberculosis. 144
10
Pág.
Tabla 1. Clasificación de las Micobacterias según Runyon. 27 Tabla
2. Complejos enzimáticos de los sistemas FAS-I y FAS-II. 49 Tabla
3. Clasificación funcional de los genes de Mycobacterium
tuberculosis. 51
Tabla 4. Principales fármacos de uso contra la tuberculosis. 55
Tabla 5. Iniciadores usados para amplificar la región promotora
corriente. 71 arriba de los genes fbpAC.
Tabla 6. Programas de PCR. 75
Tabla 7. Identificación de proteínas con alta afinidad por los
promotores 102 de los genes fbpA (A1-A6) y fbpC (C1-C7) de
Mycobacterium
tuberculosis por espectrometría de masas (EM).
11
LISTA DE FIGURAS P
ág. Figura 1. Incidencia global de tuberculosis 2004. 19 Figura 2.
Tasa total de incidencia de tuberculosis en Colombia 2005. 23
Figura 3. Representación esquemática de la envoltura de M.
tubercuolosis 25 Figura 4. Fotografía del cultivo de micobaterias
en medio Lowenstein Jensen. 26 Figura 5. Mycobacterium tuberculosis
en esputo. Coloración de Ziehl-
Neelsen. 34
35
Figura 7. Representación esquemática de la pared celular de
M.tuberculosis. 45 Figura 8. Esquema de la estructura primaria del
PG bacteriano. 46 Figura 9. Esquema del proceso de acetilación de
la INH. 62 Figura 10. Secuencia de las regiones promotoras de los
genes fbpA y fbpC 72 Figura 11. Esquema del ensayo de unión a ADN
“pull down assay”. 79 Figura 12. Cuantificación de la expresión de
los genes fbpABC e iniBAC 84 Figura 13. Análisis electroforético de
la región promotora de los genes fbpA y
C de M. tuberculosis amplificada por PCR a partir de ADN
genómico.
85
Figura 14. Análisis electroforético de la región promotora de los
genes fbpA y C de M. tuberculosis amplificada por PCR a partir de
ADN plasmídico.
86
Figura 15 Alineamiento múltiple entre las secuencias nucleótidicas
de los clones A1, A2 y el promotor del gen fbpA.
87
Figura 16. Alineamiento múltiple entre las secuencias nucleótidicas
de los clones C1, C2 y el promotor del gen fbpC.
88
Figura 17. Ensayo de proteínas de unión a ADN “pull-down” usando el
extracto citosólico preabsorbido y ADN región promotora del gen
fbpA. SDS-PAGE (gel homogéneo al 10%) teñido con plata.
89
Figura 18. Ensayo de proteínas de unión a ADN usando el extracto
citosólico preabsorbido y ADN región promotora del gen fbpA
90
Figura 19. Ensayo de proteínas de unión a ADN usando el extracto
citosólico preabsorbido y ADN región promotora del gen fbpC.
91
Figura 20. Ensayo de proteínas de unión a ADNusando el extracto
citosólico preabsorbido y ADN región promotora del gen fbpA.
93
Figura 21. Alineamiento múltiple entre las secuencias patrón del
motivo de unión al ZN familia citidina deaminasa y la secuencia de
la proteína hipotética Rv0828c de M.tuberculosis (C7).
99
Figura 22 Comparación estructural de la proteína hipotética C3 de
M. tuberculosis y la proteína MarR de E. coli (1jGS).
101
12
RESUMEN
uno de los candidatos más promisorios como nuevo blanco de
medicamentos. Este antígeno comprende tres proteínas distintas
(Ag85A,
B, C) codificadas por los genes fbpA,B y C, los cuales están
involucrados no
sólo en la biosíntesis de la pared celular, sino también en la
patogénesis
debido a que poseen un dominio de unión a fibronectina que se une a
los
macrófagos durante la infección; además están implicados en la
respuesta al
tratamiento con isoniacida (INH), un anti-micobacteriano de uso
clínico. El
objetivo del presente trabajo fue identificar las proteínas con
alta afinidad por
la región promotora de los genes fbpA y C, posibles activadores
involucrados
en la sobre-expresión de éstos genes en respuesta al tratamiento
con INH.
La region promotora corriente arriba [ región 5’ no traducida
(UTR)] de los
genes fbpA y C biotinilada fue usada junto con perlas magnéticas
cubiertas
con estreptavidina en los ensayos de unión al ADN para aislar
proteínas
con alta afinidad apartir de extractos citosólicos de M.
tuberculosis tratado
con INH. El análisis por 1-SDS-PAGE de las fracciones aisladas
reveló 6
polipéptidos (A1-A6; Mr 61-28 kDa) con alta afinidad por el
promotor fbpA y 7
más (C1-C7; Mr 97-15 kDa) con especificidad por el promotor fbpC.
La
identificación de todas las proteínas por espectrometría de masas
[LC-ES-
13
medicamentos, respuesta a estres, metabolismo y división celular;
los cuales
incluyen proteínas de choque térmico (como el antígeno groEL2),
proteínas
con unión a ADN (transposasas y represores); oxidoreductasas
(catalasas/peroxidasas), enzimas metabólicas (Malato
deshidrogenasa, y
Enoil-CoA hidratasa) y proteínas conservadas (FtsK/SpoIIIE). De
éstas la
proteína hipotética C3, que pertenece a la familia de represores
MarR
demuestra un mayor potencial como posible regulador de los genes
fbpA y C
y es uno de los principales candidatos para los estudios de
validación
funcional usando sistemas de plásmidos reporteros y de esta
forma
determinar si la proteína tiene algún efecto sobre el promotor de
los genes
fbps; es decir confirmar su función en la regulación de estos y
para futuras
investigaciones dirigidas a la manipulación genética y evaluación
de blancos
terapéuticos.
14
1. INTRODUCCION
Debido al incremento en la incidencia global de la tuberculosis,
así como al
incremento de aislados del agente causante Mycobacterium
tuberculosis
multirresistentes a drogas en uso clínico (Bloom & Murria,
1992), es urgente
encontrar blancos para desarrollar nuevas medicamentos para el
tratamiento
de esta enfermedad que permitan revertir o evitar resistencia a los
fármacos
en uso.
Dentro de los candidatos más promisorios como blancos para
medicamentos
esta el complejo antígeno 85, compuesto por tres proteínas
distintas
(trehalose dimycolyl transferasas) codificadas por los genes fbpA,
fbpB, y
fbpC e involucradas en el último paso de la biosíntesis de la pared
celular,
particularmente en la síntesis de ácidos micólicos (Belisle et al.,
1997).
Adicionalmente, estas enzimas parecen estar jugando un papel
importante
en la patogenicidad de la micobacteria, debido a que poseen un
dominio de
unión a fibronectina, el cual es responsable de la unión a los
macrófagos
humanos durante el inicio de la infección. Estudios de inactivación
génica
han demostrado que estos genes y sus proteínas son importantes para
la
construcción de una pared micobacteriana normal, así como para
el
crecimiento celular (Jackson et al., 1999; Armitige et al., 2000;
Harth et al.,
2002).
15
Por otro lado, estudios de expresión usando microarreglos, al igual
que las
aproximaciones proteómicas han demostrado la sobre-expresión de
los
genes fbpABC en respuesta al tratamiento con Isoniacida (INH)
(Garbe et al.,
1996; Wilson et al., 1999). A pesar de que los genes del antígeno
85 están
bien caracterizados (Content et al, 1991; Ohara et al, 1997), el
mecanismo
por el cual su expresión es regulada aún es desconocido.
Recientemente se demostró que la sobre-expresión del gen fbpC no
puede
explicarse por la presencia de algún tipo de mutación en el
promotor o en el
gen mismo (Ramaswamy et al., 2003). Es así como se plantea entonces
la
existencia de un mecanismo de retroalimentación positiva, en el
cual estos
genes son sobre-expresados como respuesta al descenso en la
síntesis de
ácidos micólicos maduros (Wilson et al., 1999), como un mecanismo
de
compensación esencial para la biosíntesis de la pared y la
integridad celular,
sin el cual la micobacteria no sería viable. Por tanto el
entendimiento del
mecanismo de regulación de estos genes (fbpABC), puede
proveer
información importante para el desarrollo de nuevas medicamentos
anti-
tuberculosis, además de contribuir al entendimiento global de éste
patógeno.
En análisis previos usando PCR en tiempo real (qRT-PCR) e
inmunoblot se
confirmó una diferencia en los niveles de expresión (a nivel mRNA y
nivel
proteíco) de los genes fbpA y fbpC en células tratadas con
concentraciones
16
dos veces mayores a la concentración inhibitoria mínima (CIM) de
INH,
comparada con las células control (no tratadas). Se determinó que
el gen
fbpA tuvo una mayor expresión (5.44 veces) seguido por el gen fbpC
(3.47
veces) en tanto que el fbpB presentó un nivel de expresión similar
al control
sin medicamento. Aunque a nivel proteico las diferencias en
expresión de
fbpA y fbpC no son tan marcadas como a nivel del mRNA, cabe
resaltar que
sí se logra notar un aumento en la cantidad de antígeno 85 presente
en las
células tratadas con 2x CIM de (INH) y una disminución en las
células
tratadas con la mitad del CIM.
Teniendo en cuenta lo anterior, en este trabajo se
caracterizó
molecularmente los promotores de los genes fbpA y fbpC de M.
tuberculosis
los cuales fueron utilizados para aislar e identificar proteínas
con alta afinidad
de unión por esta región promotora, siendo posibles reguladores de
estos
genes y estando involucradas en el mecanismo de retroalimentación
positiva;
las cuales debido a su importancia a nivel celular, pueden ser un
nuevo
blanco de medicamentos contra la tuberculosis.
17
2. MARCO TEORICO
2.1. El impacto de la tuberculosis (TB) sobre la salud
humana.
La tuberculosis (TB) es una enfermedad re-emergente que constituye
uno
de los problemas de salud pública de mayor gravedad a nivel mundial
debido
al constante incremento en las tasas de morbilidad y mortalidad
(Clarck-
Curtiss & Haydee 2003; Garocica et al., 2005). La Organización
Mundial de
la Salud (OMS) estima que alrededor de 9 millones de nuevos casos
de TB
son diagnosticados anualmente. Aunque la probabilidad de
desarrollar la
enfermedad activa es tan sólo de un 5-10% para la mayoría de
infectados;
es de resaltar que de los individuos con TB activa al menos 2
millones de
personas en el mundo mueren cada año por causa de ésta
enfermedad
(Nachega et al., 2003; WHO 2005 y 2006).
Para el año 2004 199 de los 211 países que participan en el
programa de la
OMS sobre vigilancia, planificación y financiación de la lucha
mundial contra
la TB, reportaron casos, en donde el 81% del total de casos nuevos
se
presentaron en Asia y África, el 17% en Latinoamérica y sólo el 2%
en
Norteamérica. A pesar que América Latina se ubica en el tercer
lugar de
incidencia para ésta enfermedad; la tuberculosis constituye un
serio
problema de salud en la región. Cada año se notifican cerca de
250.000 -
18
300.000 nuevos casos de los cuales mueren alrededor de 20.000
(Potter et
al., 2005; WHO 2005); siendo Brasil, Perú y México los países que
tienen
las mayores incidencias (Organización Panamericana de la Salud.,
2004)
(Figura 1).
Se estima que entre 2002 y 2020, cerca de 150 millones de
personas
enfermarán y 36 millones morirán de tuberculosis, si no se
fortalecen las
medidas existentes para el control de la enfermedad (WHO
2005).
Figura 1. Incidencia global de tuberculosis 2004. Tomado y
modificado de: WHO: Global Tuberculosis Control. 2005.
19
Muchos factores han contribuido al resurgimiento y progresión de
la
tuberculosis que se empezó a darse a partir de 1985. En primer
lugar la
pandemia del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), debido
al
incremento en la propagación del Virus de Inmunodeficiencia Humana
(VIH)
el cual afecta el sistema inmune de las personas, que permite tanto
una
reactivación de una antigua infección así como un aumento de
la
susceptibilidad a una nueva. Se ha estimado que cerca de un tercio
de los
aproximadamente 40 millones de casos de VIH en el mundo se
encuentran
co-infectados con ésta micobacteria y que el riesgo de desarrollar
una TB
clínica es del 10% por año para este grupo de individuos (Buitrago
et al.,
1999).
Los cambios sociales que van acompañados de un aumento del índice
de
pobreza, la inmigración de personas desde áreas de alta incidencia,
que
conduce al hacinamiento en las grandes urbes son un segundo
factor
importante. Es claro cómo las tasas más altas de enfermos y
fallecidos se
registran en los países más pobres; en los cuales el riesgo de
desarrollar TB
es 50 veces mayor que en los países desarrollados (Garcia-Garcia et
al.,
2000; Smith 2003). Así mismo la falla en los sistemas de control de
la Salud
Pública y la escasa asignación de recursos para la investigación de
nuevas
medicamentos, nuevos métodos diagnósticos y vacunas en estos
países
contribuyen en gran medida al recrudecimiento de la
enfermedad.
20
Otro factor desencadenante ha sido la aparición de cepas del
bacilo
multirresistentes (MDR) a los agentes antimicrobianos utilizados
para
controlar la enfermedad; lo cual ha sido debido en gran parte a
esquemas de
terapia incorrectos e incumplimiento en los tratamientos (Bloom
& Murray
1992; WHO, 2002 y 2005), es así como la OMS en su programa de
vigilancia
mundial en tuberculosis ha reportado una prevalencia de cepas de
M.
tuberculosis con MDR primaria del 1,4% (rango 0-14%) en tanto que
la MDR
secundaria ha sido mucho mayor del 13% (rango 0-54%) (Tobón
2001;
Sharma & Mohan 2004b; Said-Fernández et al., 2005). A pesar de
que la
implementación de medidas de control ha sido baja lo cual predice
niveles de
MDR altos, en Colombia los resultados de las encuestas de
vigilancia
epidemiológica realizadas no corresponden a lo esperado; en la
primera
(1999) se muestra una MDR de tan sólo 0,5% y para la segunda
encuesta
(2000) hubo un ligero aumento 1,5%, éstos reportes previos en el
país hacen
sospechar que existen regiones con una prevalencia e incidencia
de
resistencia a medicamentos superior al promedio nacional como es el
caso
de Buenaventura (Valle del Cauca) en el cual se ha descrito una MDR
inicial
del 6% (Chaparro et al., 2004; Moreira et al., 2004).
En Colombia al igual que en muchos países de América Latina, el
deterioro
de las condiciones socioeconómicas ha favorecido el incremento y
extensión
de los factores de riesgo relacionados con la tuberculosis;
factores entre los
que se encuentran, la migración y desplazamiento de población
afectada por
21
los conflictos armados agudizando los problemas de hacinamiento no
sólo en
las grandes urbes. Adicionalmente, la inestabilidad social, el
acceso
inoportuno ó inadecuado al tratamiento son factores que fomentan
el
desarrollo de precarias condiciones de vida y que favorecen la
diseminación
de los casos.
No obstante, la situación de la tuberculosis en Colombia según el
último
reporte de SIVIGILA (2005) es alentadora; en el 2005 la tasa de
incidencia
presentó una leve disminución de 0.8% en relación a la del año 2004
(19,8 y
19.97 por 100.000 habitantes respectivamente). Lo cual evidencia
la
importancia de incrementar las estrategias de control como son la
búsqueda
activa de sintomáticos respiratorios, el diagnóstico, la
notificación oportuna
de los casos, el tratamiento y un punto muy crítico el
seguimiento
permanente a los casos y a sus contactos y más si se tiene en
cuenta que de
los 9.118 casos nuevos de tuberculosis reportados, 84,1%
correspondían a
tuberculosis pulmonar, 0,5% tuberculosis meníngea y el 15,4%
restante a
otras formas extrapulmonares (Castiblanco & Espinosa
2006,).
Estos reportes permiten dividir el país en 3 zonas principales de
acuerdo al
riesgo de contagio (Figura 2), resaltando que los departamentos
de
Amazonas, Arauca, Casanare, Guainía, Guaviare, Huila, Meta,
Putumayo,
Quindío, Guajira y Valle del Cauca y el distrito de Barranquilla
continúan
22
siendo los de mayor riesgo con incidencias mayores a 30 casos por
cada
100.000 habitantes (Castiblanco & Espinosa 2006).
Figura 2. Tasa total de incidencia de tuberculosis, Colombia, 2005
Tomado de: Sistema de Vigilancia en Salud Pública, SIVIGILA 2006.
Boletín
Epidemiológico Quincenal, Vol. 11 No. 06 Marzo 30 de 2006.
Tuberculosis y lepra año
2005.
23
Las micobacterias pertenecen a la familia Mycobacteriaceae,
género
Mycobacterium y orden Actinomycetae (con forma de hongo) y
son
consideradas formas de transición entre las eubacterias y los
hongos.
El género Mycobacterium está integrado por bacilos largos de 3-5 µm
de
longitud y 0.2-0.6 µm de ancho; con morfología variable
encontrándose
formas cocoides pequeñas así como bacilares largas, no esporulados
ni
flagelados con abundantes gránulos citoplasmáticos. La mayoría
son
aerobios estrictos como Mycobacterium tuberculosis y microaerófilos
como
M. bovis. No producen endotoxinas, exotoxinas, ni enzimas
histolícas
conocidas. (Wayne & Kubica 1986).
La envoltura de las micobacterias es una estructura compleja que
está
compuesta de la cápsula, la membrana plasmática y la pared
celular,
estructuras que proveen protección contra factores múltiples
externos y dan
soporte a la célula; además de poseer mecanismos que permiten
el
transporte de iones y moléculas para el mantenimiento celular
(Figura 3)
(Brennan & Draper 1994; Gorocica et al., 2005).
24
Figura 3. Representación esquemática de la envoltura; 1. Cápsula, 2
y 3.
Pared celular: 2. capa electrón-transparente compuesta por
arabinogalactano y
ac.micólicos, 3. capa electrón densa compuesta de peptidoglicano;
4. Membrana.
Plasmática.
Tomado y modificado de: Brennan P. & Draper P. 1994.
Tuberculosis.
El género Mycobacterium comprende especies patógenas, oportunistas
y
saprofitas. En 1950 Timpe y Runyon propusieron una clasificación
útil de
Mycobacterium en cuatro grupos, la cual ha servido de guía para
la
identificación y el estudio de éste género. Esta clasificación se
basaba en la
velocidad de crecimiento (rápido o lento, según sea superior o
inferior a una
semana), producción de pigmento en presencia o ausencia de
luz
(fotocromógeno, escotocromógeno y no cromógeno) (figura 4) (Casal
&
Casal 2000; Garcia-Garcia et al., 2005).
25
Figura 4. Fotografía del cultivo de Micobacterias crecidas en el
medio Lowenstein Jensen. Lado A se observa M. tuberculosis,
bacteria no cromógena
de crecimiento lento y en el lado B, una bacteria no tuberculosa
fotocromógena el
M. marinum.
Tomado de: Archivo Imágenes de micobacterias, Grupo de TB-
CIDEIM.
En la tabla 1 se presenta una clasificación modificada de la
original de
Runyon, la cual incluye los miembros del género Mycobacterium
de
importancia humana (Casal & Casal 2000).
2.3. Patogénesis y Manifestaciones clínicas de la enfermedad
La TB es una enfermedad crónica y altamente infecciosa
producida
principalmente por Mycobacterium tuberculosis, aunque otras
micobacterias
fenotípica y genéticamente similares como M. bovis, M. africanum y
M.
microtti pueden también causarla.
Tomado y modificado de: Casal & Casal 2000.
Las micobacterias se transmiten a través de pequeñas gotas de
secreciones
respiratorias y saliva aerosolizadas por la tos, el estornudo o el
habla. Una
vez en el exterior las gotas se evaporan y quedan constituidas
solamente por
27
un núcleo pequeñísimo con pocos bacilos tuberculosos viables, que
pueden
permanecer suspendidas en el aire durante períodos prolongados.
(Clarck-
Curtiss & Haydee 2003; Smith 2003; Bonfioli et al.,
2005).
Es importante resaltar que para que se produzca la infección, se
requiere de
la confluencia de varios factores exógenos como la presencia de
bacilos
viables y en alta concentración en la muestra del enfermo, el grado
de
intimidad con el paciente y el ambiente donde se produce el
contacto, pues el
hacinamiento y los ambientes cerrados aumentan el riesgo de
contraer la
enfermedad. (Araujo et al., 2004).
Adicionalmente también existen unos factores endógenos asociados
como la
susceptibilidad genética y la inmunidad celular del hospedero. Ha
sido
reconocido que algunas poblaciones parecen tener un alto grado
de
vulnerabilidad a la TB. Algunos estudios han permitido identificar
que existe
un incremento en el riesgo relativo de transformación de una
infección latente
a una enfermedad activa en hospederos humanos que presentan
polimorfismos en el gen NRAMP1, el cual codifica para un
transportador de
hierro transmembranal localizado en el endosoma tardío.
A nivel del microorganismo uno de los genes cuya implicación en
la
patogénesis de la TB ha sido evaluado es el gen D de la fosfolipasa
C
micobacteriana (plcD); los polimorfismos en éste gen han sido
fuertemente
28
asociados con una variación en la presentación clínica, siendo muy
común la
forma de TB extratorácica (Schluger & Rom 1998; Yew & Leung
2006).
De otra parte, se sabe que las enfermedades que causan alguna
alteración
de la inmunidad celular favorecen el desarrollo de la TB activa o
tienen un
efecto negativo sobre la progresión de la enfermedad. Este es el
caso del
VIH/SIDA; en el cual los pacientes presentan inmunosupresión, lo
que
favorece el desarrollo no sólo de formas pulmonares sino también
extra-
pulmonares cuyas manifestaciones varían según el grado de
compromiso de
la inmunidad celular. Es así como en pacientes parcialmente
comprometidos
(conteos de CD4+ > 200/mm3) (Sharma et al., 2005), la
tuberculosis presenta
el patrón típico de infiltrados en el lóbulo superior con
cavitación, sin
adenopatías importantes; en tanto que en las fases avanzadas de
la
infección por VIH se observa una enfermedad no cavitaria,
extrapulmonar,
difusa, diseminada y rápidamente progresiva que a menudo es mortal
(Lawn
et al., 2002; Bonfioli et al., 2005).
La progresión de la TB en general puede presentar 5 estadios o
fases:
♦ Fase I: El comienzo, luego de que la micobacteria ingresa al
alvéolo,
puede ser destruida por los macrófagos alveolares activados, que
liberan
citoquinas y quimoquinas favoreciendo la formación del
fagolisosoma
(maduración fagosomal) y el desarrollo de la respuesta inmune
innata
29
(Fenton et al., 1996; Macmicking et al., 1997; Clarck-Curtiss &
Haydee
2003; Stenger 2005).
♦ Fase II: Conocida también como la fase de simbiosis porque el
bacilo
evade los mecanismos bactericidas se establece en el interior
del
macrófago inactivo sin causarle daño formando el tubérculo
mejor
conocido como complejo de Ghon, 2-8 semanas después de su
ingreso
(Smith 2003).
♦ Fase III: Se da por primera vez la necrosis caseosa, en la cual
se
presenta tanto la lesión tisular (respuesta de hipersensibilidad
retardada
debida a estimulación antigénica crónica) como una activación
de
macrófagos alveolares, destrucción de micobacterias intracelulares
y
liberación de antígenos bacilares presentados a las células T
para
estimular una respuesta inmune celular (Dannenberg & Rook
1994). A
éste punto la enfermedad es leve y frecuentemente asintomática y
la
única evidencia de infección es la positividad de la prueba cutánea
de
hipersensibilidad a la tuberculina.
♦ Fase IV: Es determinante para la progresión de la enfermedad
desde el
punto de vista clínico. En esta fase la respuesta inmune celular
juega un
papel importante, o se logra controlar la progresión de la
infección al
destruir las micobacterias presentes en las lesiones
tuberculosas-
caseosas o granulomas (macrófagos activos) o las micobacterias
siguen
multiplicándose intracelularmente y se diseminan a otras zonas
del
30
de meninges, riñones, ganglios linfáticos, pleura, sistema
osteo-articular y
miliar; con síntomas y signos que dependen del sistema afectado y
del
daño causado en cada uno de ellos. Por otro lado la bacteria
también
puede permanecer dentro del granuloma caseoso en un estado de
latencia por años esperando la oportunidad para volver a
replicarse
activamente; (Casal & Casal 2000; Donald & Schoeman 2004;
Sharma &
Mohan 2004a; Toth et al., 2004; Enberg et al., 2006).
♦ Fase V : Hay formación de cavidades cuando las paredes de
los
bronquios se rompen debido a la carga bacilar en los tubérculos y a
la
respuesta inmune agresiva, lo cual permite la descarga de todo
el
material caseoso con micobacterias vivas y muertas en las vías
aéreas lo
que contribuye a la diseminación del bacilo a otras partes del
cuerpo así
como también al ambiente externo permitiendo transmisión e
infección de
un nuevo huésped por intermedio de la tos, la saliva o el estornudo
del
paciente infectado (Dannenberg & Rook 1994; Smith 2003).
Es importante resaltar que la TB pulmonar afecta el aparato
respiratorio
inferior, donde el flujo aéreo es mayor favoreciendo el depósito de
los
bacilos inhalados y contribuyendo a los signos y síntomas que
durante las
primeras fases de la enfermedad, suelen ser inespecíficos y
consisten
principalmente en fiebre, sudoración nocturna, pérdida de peso,
anorexia,
malestar general y debilidad. Posteriormente se presenta tos
con
31
expectoración purulenta y hemoptisis debido a la ruptura de algunos
vasos
sanguíneos y en algunos casos más críticos se cursa con disnea
(Frieden et
al., 2003; Campbell & Bah-Sow 2006).
2.4. Diagnóstico
Dentro de las estrategias para combatir a la TB, el diagnóstico
subyace como
uno de los pilares más importantes, debido a que permite la
atención e inicio
del tratamiento minimizando los riesgos de contagio y dispersión de
la
enfermedad. El diagnóstico de la TB se ha basado en la historia
clínica y el
análisis radiológico de los pacientes; así como la aplicación del
test de la
tuberculina o PPD y la identificación del M. tuberculosis por
métodos
microbiológicos, citopatológicos o histopatológicos en la muestra
(esputo
fresco, lavado gástrico, orina, líquido pleural, líquido
cefalorraquídeo, líquido
articular, biopsia de tejido, sangre entre otros), proveniente del
paciente
sospechoso de tener la enfermedad.
2.4.1. Métodos convencionales
♣ La baciloscopía: Es la metodología más ampliamente aceptada en
la
investigación microbiológica de tuberculosis. Está basada en la
afinidad
que poseen las micobacterias por ciertos colorantes formando
complejos
32
estables con ellos, reteniendo el colorante aún después de su
exposición
al alcohol ácido o ácidos minerales. La baciloscopía (BK) con la
tinción
microbiológica de Ziehl–Neelsen (ZN) es la prueba de oro para
el
diagnóstico de tuberculosis activa (pacientes bacilíferos); es una
técnica
sencilla, económica y permite observar a los bacilos tuberculosos
de color
rojo sobre un fondo azul (Figura 5). Sin embargo, su sensibilidad
es
variable y es en este sentido en donde se han observado las
mayores
limitaciones, pues este sistema necesita >104 micobacterias para
arrojar
un diagnóstico positivo, además, no permite diferenciar entre las
especies
de micobacterias (Guevara et al., 2003.).
Por otra parte, las tinciones empleando fluorocromos como la
auramina o la
rodamina están siendo cada vez más utilizadas pues además, de la
rapidez
diagnóstica que ofrecen han demostrado la misma eficacia que la de
tinción
de ZN para detectar las micobacterias, que aparecen de color
amarillo o
naranja brillante contra un fondo verdoso al ser observadas en
un
microscopio de luz ultravioleta (Figura 6) (Grosset et al.,
2000).
33
resaltando la condición ácido alcohol resistente de las
micobacterias. M. tuberculosis
aparece como un pequeño filamento rojo sobre un fondo azul
(flecha).
Tomado y modificado de: Archivo Imágenes de micobacterias, Grupo de
TB-CIDEIM.
♣ El cultivo: Es una técnica más sensible que la baciloscopía,
produce
resultados positivos hasta con una concentración de 10 bacilos/ml
de
muestra, pero su gran limitante es el tiempo requerido para obtener
el
resultado, ya que toma en promedio entre 3 y 6 semanas para
ser
informado. Existen diferentes medios de cultivo para el aislamiento
de
micobacterias, que garantizan un buen soporte nutritivo para
su
crecimiento; éstos pueden ser sólidos o líquidos, selectivos y
no
selectivos. El medio Lowenstein-Jensen es históricamente el
más
utilizado en los laboratorios clínicos de diagnóstico, es un medio
sólido
elaborado a base de huevo y contiene verde de malaquita, que inhibe
el
crecimiento de la flora bacteriana asociada (Sierra et al.,
2004).
34
Figura 6. Mycobacterium tuberculosis en pulmón. Muestra directa de
esputo coloreada
con auramina-rodamina. M. tuberculosis aparece como un pequeño
filamento amarillo
fluorescente sobre un fondo verde (flecha).
Tomado y modificado de:
www-medlib.med.utah.edu/STAINS/STAIN020.html. (en
http//images.google.com).
Ante las limitaciones en tiempo que presentan los cultivos
tradicionales, se
han implementado otros sistemas de cultivo líquido automatizado o
semi
automatizado (BACTEC 460TB), en los cuales se emplea ácido
palmítico
marcado con C14 como fuente de carbono. El crecimiento de M.
tuberculosis
se puede manifestar en 10 días al medir la liberación de CO2
radiomarcado
que se desprende una vez se haya metabolizado el sustrato, la
radioactividad es detectada y se traduce en índice de crecimiento.
Sin
embargo una de las limitaciones que presentan éste tipo tecnologías
ha sido
la contaminación al ambiente por la radioactividad que se puede
generar
dado que en la mayoría de laboratorios de diagnóstico no se cuenta
con la
infraestructura necesaria que permita una adecuada disposición
final de los
radioisótopos evitando la contaminación radioactiva (Guevara et
al., 2003).
Basados en lo anterior se han generado nuevos sistemas
no-radiométricos
como el BACTEC9000 (Becton Dickinson), que funciona midiendo
fluorométrica o colorimétricamente, los cambios en la presión de
gas,
producción de CO2 y consumo de O2. En términos generales estos
nuevos
sistemas permiten detectar micobacterias en aproximadamente 14 y 21
días
mediante la aparición de fluorescencia de color naranja al exponer
los tubos
a la luz UV (365nm) (Pfyffer et al., 1997).
Indirectos
♣ Las pruebas inmuno-serológicas: Se basan en la evaluación de
la
respuesta inmune celular (la prueba cutánea de la tuberculina o del
PPD
(derivado proteico purificado) y/o respuesta inmune humoral como en
los
enzimoinmunoensayos (EIE, ELISA) que permiten evidenciar la
presencia
de anticuerpos circulantes dirigidos específicamente contra
antígenos de
la micobacteria indicando una infección activa. Para el diagnóstico
de
una infección latente se han desarrollado pruebas derivadas del
ELISA,
como ELISPOT y QuantiFERON®–TB Test (QFT-G) en las cuales se
mide la cantidad de interferón gama (IFNγ) producido por las
células
sanguíneas totales o por células mononucleares de sangre
periférica
previamente estimuladas con derivados proteicos purificados
de
tuberculosis (PPD) o antígenos más específicos de la micobacteria
como
36
ESAT-6 y CPF-10 (Mazurek et al., 2005; Shams et al., 2005; Nahid et
al.,
2006; Yew & Leung 2006).
2.4.2. Métodos Moleculares
En la actualidad, las técnicas basadas en la amplificación de
ácidos
nucleicos por medio de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR),
parecen ser una de las mejores alternativas para una específica y
rápida
identificación no sólo de M. tuberculosis, sino de otras
especies
micobacterianas, aplicándolas directamente sobre las muestras lo
que facilita
la identificación de aquellos microorganismos de difícil cultivo.
La PCR se
fundamenta en la amplificación de una región blanco de ADN,
utilizando un
par de cebadores que inician la síntesis de las dos hebras del ADN
a partir
del molde. La secuencia blanco comúnmente utilizada en la detección
de M.
tuberculosis, es la secuencia de inserción IS6110 específica para
éste
complejo (M. tuberculosis). Recientemente se han venido empleando
otras
secuencias blanco como el gen hsp65 que codifica una proteína de
choque
térmico de 65 KDa y el gen 16s rARN cuya secuencia es conocida en
las
distintas especies de micobacterias y a pesar de que es
bastante
conservado, tiene regiones variables con secuencias
nucleotídicas
específicas de género y especie (Guevara et al., 2003; Heginbothom
et al.,
2003).
37
Hoy en día se cuenta con una gran variedad de técnicas
moleculares
ampliamente utilizadas y comercializadas (RFLPs [Restricción
Fragment
Length Polymorphism(s)], PCR en tiempo real o “test” de PCR
Amplicor-
Roche) desarrolladas a partir de la tradicional PCR con variaciones
que
incluyen fases de hibridización, secuenciación y restricción, las
cuales han
aumentado significativamente la especificidad en el diagnóstico y
han
eliminado el riesgo de falsos positivos (Pfyffer 1999).
2.4.3. Otras técnicas
Finalmente es importante mencionar que se han desarrollado otras
técnicas
de diagnóstico con diversos fundamentos, como la cromatografía de
gases
en la cual la identificación se basa en el perfil de ácidos grasos
de las
micobacterias y la cromatografía líquida de alta presión (HPLC)
para la
detección de ácidos micólicos en muestras sanguíneas o de orina
(Guevara
et al., 2003).
Los análisis del patrón proteómico de las micobacterias; así como
la
aplicación de herramientas basadas en la tecnología SELDI-TOF-MS
o
Espectrometría de Masas en "Tiempo de Vuelo" mediante
Desabsorción/Ionización por Láser de Superficie Mejorado
(Surface-
Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass
Spectrometry)
tienen un gran potencial en el estudio de la TB, dado que permiten
identificar
38
antígenos o proteínas únicas (biomarcadores) de M. tuberculosis
en
muestras de pacientes. Esta tecnología se ha ensayado con éxito en
la
detección y caracterización de proteínas asociadas con formas
específicas
de cáncer de próstata, ovario y colon, así como en la detección
de
microorganismos patógenos como Mycobacterium tuberculosis (Steyn et
al.,
2002).
2.5. Inmunología de la TB
La tuberculosis es el prototipo de infección en la cual la
respuesta inmune de
tipo celular es esencial para su control; siendo el macrófago
alveolar la
célula clave porque libera enzimas proteolíticas y otros
metabolitos
micobactericidas, produce un patrón característico de mediadores
solubles
(citoquinas) en respuesta a M. tuberculosis, incluyendo
interleuquinas (IL-1,
IL-6, IL-10), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), entre otros.
Estos
factores tienen un potente efecto inmunoregulador y median muchas
de las
manifestaciones clínicas de la TB como por ejemplo la fiebre
inducida por la
IL-1. Los macrófagos también intervienen en el procesamiento
y
presentación de antígenos micobacterianos a los linfocitos T (LT)
CD4+; en
asociación con las moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad
(Barnes et al., 1994; Stenger 2005).
39
Los macrófagos pueden interactuar directamente con las
micobacterias; por
medio de los receptores del macrófago como los toll-like (TLR-2) y
el
receptor de manosa (MR) que reconoce el peptidoglicano y el
lipoarabinomanano (LAM). También pueden interactuar
indirectamente
debido a que al bacilo se unen moléculas del hospedero como
anticuerpos o
factores del complemento (C3b), que son reconocidas por el
macrófago a
través de receptores específicos como CR1 (CD35) molécula presente
en el
macrófago que reconoce el C3b unido a carbohidratos de superficie
de la
micobacteria (Rojas- Espinosa et al., 2004).
En la misma línea de ideas, es importante resaltar el papel que
desempeñan
los LT CD4+ y su diferenciación a los subtipos Th1 y Th2 después de
la
presentación antigénica. Estas poblaciones de células T son
definidas por el
perfil de citoquinas que secretan y es así que el subtipo Th1
produce
principalmente IL-2 e INF-γ, que activa los macrófagos y otras
células para la
destrucción de patógenos intracelulares como M. tuberculosis. En
tanto, el
subtipo Th2 produce IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 que estimulan
principalmente la
inmunidad humoral y se han asociado con inmunidad a infección
por
parásitos extracelulares, enfermedades alérgicas (Barnes et al.,
1994).
Por otro lado es importante resaltar que citoquinas como la IL-10 e
IL-13
antagonizan la acción del IFN-γ e inhiben la activación de los
macrófagos,
40
por lo que el desarrollo excesivo o incontrolado de células Th2 se
puede
asociar a deficiencias en la inmunidad celular contra
microorganismos
intracelulares. Además se ha demostrado que la polarización de la
respuesta
inmune hacia el subtipo Th1 juega un papel muy importante en la
defensa
contra la micobacteria, pues la presencia de éste subtipo celular y
de
moléculas como IL-2 e IFN-γ ha sido asociada con un curso benigno
de la
enfermedad y una mejoría clínica (Barnes et al., 1993; Condos et
al., 1998).
Aunque la infección tuberculosa se asocia con una intensa respuesta
celular
mediada por LT CD4+, la subpoblación citolítica CD8+ también se
encarga de
la defensa contra muchos patógenos intracelulares debido a que
pueden lisar
directamente las células infectadas con el bacilo de una manera
antígeno
específica. Además, cabe destacar que la respuesta celular
está
estrechamente relacionada con la respuesta humoral ya que las
citoquinas
(IL-2, IL-4 e IL-5) intervienen en el crecimiento y diferenciación
de las células
B y por tanto en la producción de anticuerpos que reconocen
específicamente los antígenos de los microorganismos infectantes
(Araujo et
al., 2004; Yew & Leung 2006).
2.6. Fisiología y Metabolismo
El metabolismo de las micobacterias es muy variado. Se puede
encontrar
desde micobacterias de crecimiento rápido y en medios simples, las
de
41
crecimiento lento y que necesitan medios más ricos, hasta M. leprae
el cual
no se ha podido cultivar en medios sin células. En general
estos
microorganismos tienen una velocidad de crecimiento mucho más lenta
que
el resto de las bacterias, con un tiempo de duplicación celular de
14 a 20
horas, requiriéndose de tres a seis semanas para observar los
primeros
indicios de colonias. La temperatura ideal para su crecimiento es
de 32 a
37°C, y su pH óptimo está entre 6.5 y 6.8; además, su crecimiento
es
favorecido con una atmósfera de 5-10% de CO2 (Wayne & Kubica
1986).
Las micobacterias crecen en medios de cultivo sintéticos que
contengan
glicerol como fuente de carbono, lípidos, agentes que inhiban el
crecimiento
de microorganismos contaminantes (como la carbenicilina,
polimixina,
piperacilina, anfotericina B) y sales de amoníaco como fuente de
nitrógeno.
Obtienen su energía mediante la oxidación de compuestos de
carbono;
sintetizan niacina, reducen nitratos, producen urea y catalasa, dan
pruebas
positivas de aril–sulfatasa. El hierro es esencial para su
crecimiento, por lo
que cuenta con un mecanismo único de transporte, el mycobactín
quelante
liposoluble con gran afinidad por el hierro. Además, se sabe que
éstos
microorganismos son capaces de asimilar un amplio rango de
metabolitos
del hospedero (carbohidratos, proteínas y en mayor cantidad
lípidos) los
cuales son utilizados para la síntesis de macromoléculas dentro de
sus vías
metabólicas. Las micobacterias son generalmente resistentes a
agentes
químicos y a la desecación debido a su cápsula, pero son
altamente
42
Ratledge 1994).
En este orden de ideas, la cápsula es uno de los componentes
estructurales
de la envoltura que además, de proteger a la bacteria del ataque de
los
antimicrobianos, también interactúa directamente con elementos de
la
respuesta inmune. La cápsula está compuesta principalmente de
proteínas y
polisacáridos y sólo una pequeña parte son lípidos. Los
polisacáridos
capsulares consisten principalmente en un glucano, un arabinomanano
y un
manano; las proteínas capsulares son una mezcla compleja de
polipéptidos,
algunas de ellas son proteínas secretorias como la superoxido
dismutasa y la
alcohol deshidrogenasa, pero otras son proteínas asociadas a la
pared
celular o las proteínas citoplasmáticas. Los lípidos forman entre
el 2 y 5% de
la cápsula, principalmente fosfolípidos como el
fosfatidilinositolmanósido
(PIM), lipo-oligosacáridos, glicolípidos, ácidos micólicos los
cuales son los
responsables de las características antigénicas de las
micobacterias (Steck
et al., 1978; Brennan 1989; Ortalo-Magné et al., 1995; Gorocica et
al., 2005).
Otro de los componentes estructurales que posee la envoltura es
la
membrana plasmática, que como la de otras bacterias cumple
básicamente
la función de protección osmótica y el transporte de iones y
moléculas a la
célula. Su estructura está constituida por una bicapa lipídica
clásica, a la que
están asociadas proteínas y algunos lipopolisacáridos,
lipoarabinomanano
43
cardiolipinas y fosfatidiletanolaminas (PE) (Brennan & Draper
1994;
Gorocica P. et al., 2005).
La pared celular de la micobacteria, localizada por debajo de la
cápsula y
separada por el espacio periplásmico es una de las más complejas
entre los
microorganismos conocidos. Es dos veces más gruesa y fuerte que la
de las
otras bacterias (Gram positivas y negativas) y constituye una
verdadera
coraza lipídica difícilmente penetrable, la cual es requerida por
la bacteria
para crecer y sobrevivir en el hospedero; además, le otorga a la
micobacteria
no sólo su tamaño y su forma sino también su típica resistencia a
la acción
del alcohol y los ácidos (Brennan & Draper 1994; Gorocica et
al., 2005).
La base estructural de la pared de las micobacterias es el
esqueleto insoluble
(mAGP), formado por la unión covalente entre el peptidoglicano
(PG), el
arabinogalactano (AG) y los ácidos micólicos que son el mayor
constituyente
de la pared confiriéndole un carácter altamente hidrofóbico a ésta
estructura;
además del core o complejo mAGP la pared está compuesta por
moléculas
como el PIM, el LM, el LAM, algunas proteínas y algunos lípidos
libres como
la trehalosa dimicolato (TDM) o formando parte del fthiocerol
dimicocerosato
(DIM) (Figura 7) (Besra & Chatterjee 1994; Gorocica et al.,
2005).
44
Figura 7. Representación esquemática de la pared celular de M.
tuberculosis.
Tomado y modificado de: Gorocica et al. 2005.
El PG, es una estructura macromolecular encontrada en la superficie
de la
membrana citoplasmática de las bacterias, cuya función es la de
preservar la
integridad celular; el PG está íntimamente involucrado en el
crecimiento y la
división celular. Este es un polímero constituido por unidades
repetidas y
alternadas de N-acetilglucosamina (GlcNAc) y el ácido
N-glucolilmurámico
(MurNGly) unidas por enlaces β,1-4 y asociadas a cortas cadenas
peptídicas
(L-alanina-ácidoD-glutámico-ácido mesodiaminopimélico (o
L-Lisina)-D-
alanina) a través del MurNGly o N-acetilmurámico que en
micobacterias
posee ácidos glicólicos en lugar de grupos acetilo como en las
otras
denominándose ácido N-glucolilmurámico (MurNGly) (Figura 8)
(Brennan
2003).
45
Figura 8. Esquema de la estructura primaria del PG bacteriano.
γ-D-
Glu: ácido-D-glutámico; n: número de amino ácidos en el
puente
dependiendo del organismo; (D-Ala): D-alanina. Tomado y modificado
de: (Heijenoort 2001).
Durante la división celular, las bacterias forman su nueva pared;
para ello las
autolisinas, enzimas producidas por la propia bacteria, rompen la
“pared
vieja”, formando brechas o espacios en ésta; a nivel de esas
brechas o
aberturas es donde se agrega el peptidoglicano de la nueva pared
en
formación. En el citoplasma se lleva a cabo el ensamblaje de la
unidad
monomérica (GlcNAc-MurNAc-pentapéptido-pirofosforil decaprenol)
primer
paso en la síntesis del PG a partir de fructosa 6-fosfato; a esta
unidad se une
un transportador lipídico de membrana, el bactoprenol el cual la
transporta a
través de la membrana citoplasmática. Una vez en el espacio
periplásmico,
46
estas unidades son colocadas en las brechas ya formadas. El paso
final y
fundamental para una correcta función de la pared es la unión
los
monómeros de PG entre si, por medio de un enlace peptídico entre la
D-
Alanina de un tetrapéptido y el ácido diaminopimélico (DA) de
otro
adyacente. Este proceso lo catalizan enzimas denominadas
transpeptidasas. Al peptidoglicano se le unen los otros componentes
que
integran la pared como el AG y los ácidos micólicos (Heijenoort
2001a,b).
El arabinogalactano (AG) es otra de las moléculas del complejo mAGP
y
representa el 35% de la pared. Está compuesto exclusivamente de
D-
galactofuranosas y D-arabinofuranosas dos azúcares muy raros en
la
naturaleza; distribuidos en 3 cadenas de arabinano (27
D-arabinofuranosas)
unidas a un núcleo de homogalactano (32 D-galactofuranosas). La
región
galactano del AG se une al GlcNAc del PG, mientras que los
ácidos
micólicos lo hacen al D-arabinofurasil terminal (Besra &
Chatterjee 1994;
Gorocica et al., 2005).
El tercer componente del core, los ácidos micólicos (AM) son
α-alquil β-
hidroxiácidos de alto peso molecular (C70-C90) que se
encuentran
principalmente esterificando al AG, pero también de forma libre
unido a
trehalosas para formar los dimicolatos de trehalosa (TDM) o
los
monomicolatos de trehalosa (MMT). En M. tuberculosis se han
encontrado
47
tres clases estructurales diferentes de éstos ácidos grasos, los
α-micolatos
que no poseen grupos funcionales oxigenados y los ceto y
metoxi-micolatos
los cuales poseen grupos funcionales oxigenados adicionados al
β-
hidroxiácido (Wheeler & Ratledge 1994; Glickman et al., 2000;
Takayama et
al., 2005).
Entre los genes involucrados en la transferencia de ácidos
micólicos están
los que codifican para el complejo del antígeno 85 (Ag85) que
está
constituido por los antígenos 85A, 85B, 85C, codificados por los
genes fbpA,
fbpB y fbpC2, respectivamente. Estos antígenos son proteínas
ligadoras de
fibronectina que catalizan la transferencia de micolatos a
trehalosa, un paso
necesario para la síntesis de la trehalosa 6,6'- dimicolato (TDM) y
el complejo
mAGP (Chacón et al., 2004).
La síntesis de los AM, como la de cualquier ácido graso, ocurre
dentro de
ciclos repetitivos de condensación y elongación bajo el control de
dos
sistemas de sintetasas de ácidos grasos denominados FAS-I,
complejo
presente en eucariontes y procariontes avanzados y el FAS-II
encontrado en
plantas y bacterias. El sistema FAS-I es un polipéptido sencillo
que lleva
acabo la síntesis de “novo” de cadenas cortas (C16-C26) de acil-CoA
ésteres a
partir de acetil-CoA y malonil-CoA; éstos acil-CoA son el punto de
partida del
sistema FAS-II para la producción de los AM (α-metoxi, y
ceto-micolatos). El
48
sistema FAS-II, cataliza el mismo tipo de reacciones que a
diferencia de
FAS-I está compuesto por muchas otras enzimas separadas que
funcionan
como un sistema completo y en micobacterias es incapaz de realizar
síntesis
de novo (Tabla 2) (Barry et al., 1998; Kremer et al., 2002;
Veyron-Churlet et
al., 2004; Takayama et al., 2005).
Finalmente una disrupción en la biosíntesis de alguno de los
componentes
de la pared, especialmente el complejo mAGP puede destruir la
integridad de
la pared celular. De hecho algunos de los medicamentos
anti-tuberculosos
más efectivas, como la Isoniacida y el Etambutol afectan la
biosíntesis de
dos de los componentes principales, los ácidos micólicos y el
AG
respectivamente.
Tabla 2. Complejos enzimáticos de los sistemas FAS-I y FAS-II
49
a Dehidrasa e isomerasa involucradas en la vía de síntesis de
meroácidos, no han sido
identificadas. Tomado y modificado: Takayama et al., 2005.
2.7. Genoma de Mycobacterium tuberculosis
Los estudios de comparación genómica fueron iniciados en la década
de los
70’s usando ensayos de hibridización ADN-ADN con el cromosoma
total.
Estos estudios han permitido determinar que las especies del
género
Mycobacterium presentan un contenido elevado de G+C (61-71%) en
su
ADN; lo cual es compartido por otros géneros relacionados que
también
poseen ácidos micólicos en la pared celular, como Nocardia y
Rhodococcus
(Araujo et al., 2004).
El genoma de M. tuberculosis (cepa de referencia H37Rv), consiste
de 4.4
x106 pares de bases (pb), contiene aproximadamente 4,000 genes
agrupados
en 11 categorías de acuerdo con su función (Tabla 3) y gracias a
los
avances que se han hecho en éste campo, cada vez se conoce más
la
función de muchos de los productos génicos (Smith 2003). Una
característica interesante del genoma de H37Rv es que más de 200
genes
anotados codifican enzimas involucradas en el metabolismo de
lípidos, lo
cual comprende aproximadamente el 6% del total del genoma, pues si
bien
las micobacterias están compuestas de una gran cantidad de
lípidos,
glicolípidos y lipoglicanos en su pared, se había asumido que M.
tuberculosis
adquiere los lípidos por transporte de ellos desde el tejido del
hospedero
50
antes que sintetizarlos (Clarck-Curtiss & Haydee 2003). Esto se
ha
relacionado con la habilidad de éste patógeno de crecer en los
tejidos del
hospedero infectado, en donde los ácidos grasos pueden ser su
mayor
fuente de carbono (Smith 2003).
Tabla 3. Clasificación funcional de los genes de M.
tuberculosis
Tomado y modificado de: Camus et al., 2002.
Una segunda e inusual característica es la presencia de un gran
número de
genes (4% del total) que codifican para los miembros de dos grandes
familias
de proteínas conservadas: las familias PE y PPE (Cole et al.,
1998). La
familia PE que presenta un motivo repetitivo característico
prolina-glutamato,
consiste de 100 proteínas con un dominio N-terminal conservado de
110
amino ácidos y la familia PPE, aunque el dominio N-terminal es
diferente,
presenta un motivo repetitivo, característico
prolina-prolina-glutamato. Las
51
funciones de las proteínas PE y PPE no son conocidas, aunque han
sido
relacionadas con la variación antigénica de M. tuberculosis durante
la
infección (Brennan & Delogu 2002); además, se ha demostrado que
algunas
proteínas PE de la subfamilia PE-PGRS están localizadas en la pared
y la
membrana celular del Mycobacterium (Banu et al., 2002;
Clarck-Curtiss &
Haydee 2003).
La genómica comparativa ha conducido a la identificación de un
número de
inserciones y deleciones en el cromosoma, las cuales en su mayoría
son el
resultado de transposiciones que involucran la secuencia de
inserción
IS6110. Adicionalmente se ha podido estimar que M. tuberculosis
tiene cerca
de 13 factores sigma, proteínas que dan la especificidad
transcripcional a la
RNA polimerasa y otras 22 proteínas reguladoras que se activan
e
intervienen en la transducción de señales ambientales en la célula
(Cole
2002; Smith 2003). Es así como los estudios genómicos han
sido
herramientas que han contribuido al entendimiento de las bases
moleculares
de la patogénesis, la virulencia, la variación entre los diferentes
aislados y en
general de todos los procesos moleculares y la evolución de
las
micobacterias.
52
La TB es una enfermedad transmisible, prevenible y curable. En la
mayoría
de los países el tratamiento sigue los lineamientos de la
Organización
Mundial de la Salud a través de la estrategia DOTS (directly
observed
treatment, short course) implementada en 1995. El ultimo se basa en
la
supervisión de la ingesta del medicamento y su administración
gratuita,
asegurando así el cumplimiento de todo el esquema terapéutico
(WHO,
2006).
El tratamiento de tuberculosis presenta dos características: La
primera es
que se basa en un régimen terapéutico múltiple, el cual asocia
diferentes
fármacos con el fin de asegurar su eficacia al actuar sobre las
distintas
poblaciones de bacilos presentes en el organismo infectado: bacilos
en
división activa (en cavidades pulmonares) y en crecimiento lento
(en
macrófagos), además evita la progresiva aparición de resistencia a
los
distintos fármacos del grupo. La segunda característica es
garantizar la
erradicación de los bacilos de crecimiento lento, para lo que se
recomienda
tratamientos prolongados de hasta seis meses tras la negativización
del
esputo (Gillespie 2002; Coll 2003).
Como las micobacterias presentan una resistencia natural a
numerosos
antibacterianos por el hecho de poseer una pared tan compleja,
muy
hidrófoba con una permeabilidad reducida para un gran número
de
compuestos, el tratamiento se realiza con antimicrobianos
específicos (con
53
actividad antituberculosa), los cuales se dividen en dos grupos.
Los
antimicrobianos de primera línea con propiedad bactericida incluyen
los
agentes más efectivos, menos tóxicos y de menor costo como;
isoniacida
(INH), rifampicina (RIF), pirazinamida (PZA), estreptomicina (ST) y
etambutol
(EMB), el cual aunque es bacteriostático tiene la propiedad de
prevenir la
resistencia a los otros fármacos de primera línea (Tabla 4). Los
agentes de
segunda línea comprende medicamentos de menor acción
antituberculosa y
de mayor toxicidad, como etionamina (ETA) y protionamida,
morfozinamida
(un derivado de la pirazinamida), cicloserina y terizidona,
kanamicina,
capreomicina y ácido paraaminosalicílico (PAS), quinolonas
(ofloxacina y
ciprofloxacina), rifamicinas, clofazamina, thioacetazona, imipenem
y
ampicilina/ clavulanato (Zhang & Amzel 2002; Coll 2003; Del
Olmo
Fernández et al., 2005; Nahid et al., 2006).
La aparición de resistencia constituye el problema principal del
tratamiento;
se ha sugerido que las bacterias usualmente la adquieren
mediante
diferentes mecanismos como son la modificación del blanco debido a
una
mutación en la secuencia del gen que lo codifica; sobre-expresión
del blanco,
la inactivación del fármaco, el aumento del eflujo y la activación
de vías de
detoxificación (Zhang & Amzel 2002).
Clínicamente la resistencia se divide en primaria y adquirida. La
resistencia
primaria se presenta al menos a un medicamento de primera
línea
54
(monoresistencia) en pacientes que nunca han recibido tratamiento
previo,
al ser infectados con una cepa resistente; cuando la resistencia es
al menos
a dos de los medicamentos más efectivas en la terapia
antimicobacteriana
(RIF y INH) en ausencia o presencia de resistencia a otras
medicamentos se
conoce como multiresistencia (MDR).
Tabla 4. Principales fármacos de uso contra la tuberculosis, su
modo de acción y mecanismos de resistencia por parte de M.
tuberculosis.
55
KasA b-cetoacil ACP sintasa
Rifampicina (RIF) Inhibe transcripción RNA pol rpoB RNA pol
(derivado Rifamicinas) (síntesis de mRNA) subunidad b subunidad
b
Pirazinamida (PZA) desconocido FAS-I? pncA * enzima pirazinamidasa
(derivado sintético de fas I ? nicotinamida) Etambutol (EMB) Inhibe
síntesis Arabinosil embCAB Arabinosil transferasa (derivado de
etilendia- de AG y LAM de transferasa mina) pared celular
Estreptomicina (ST) Inhibe síntesis 16S rRNA rrs 16S rRNA
(aminoglucósido) de proteínas Proteína RpsL Proteína ribosomal
S12
ribosomal S12 Etionamida (ETA) Inhibe síntesis enoil ACP InhA enoil
ACP reductasa (derivado del ácido de ácidos micólicos reductasa
etaA * monooxigenasa isonicotínico) Fluoroquinolonas Inhibe
síntesis ADN girasa girA y girB ADN girasa (FQs) de ADN
(Topoisomerasa II) Cicloserina Inhibe síntesis D-alanina: alrA
D-alanina: (Análogo de D-alanina) de PG alanina sintasa dadB
alanina sintasa
(D-Ala-D-Ala) Acido paraamino Inhibe síntesis Desconocido
Desconocido Desconocido salicílico (PAS) Acido fólico
Amikacina/ Inhibe síntesis de 16S rRNA rrs 16S rRNA Kanamicina/
proteínas Capreomicina
Fármaco Mecanismo
KasA b-cetoacil ACP sintasa
Rifampicina (RIF) Inhibe transcripción RNA pol rpoB RNA pol
(derivado Rifamicinas) (síntesis de mRNA) subunidad b subunidad
b
Pirazinamida (PZA) desconocido FAS-I? pncA * enzima pirazinamidasa
(derivado sintético de fas I ? nicotinamida) Etambutol (EMB) Inhibe
síntesis Arabinosil embCAB Arabinosil transferasa (derivado de
etilendia- de AG y LAM de transferasa mina) pared celular
Estreptomicina (ST) Inhibe síntesis 16S rRNA rrs 16S rRNA
(aminoglucósido) de proteínas Proteína RpsL Proteína ribosomal
S12
ribosomal S12 Etionamida (ETA) Inhibe síntesis enoil ACP InhA enoil
ACP reductasa (derivado del ácido de ácidos micólicos reductasa
etaA * monooxigenasa isonicotínico) Fluoroquinolonas Inhibe
síntesis ADN girasa girA y girB ADN girasa (FQs) de ADN
(Topoisomerasa II) Cicloserina Inhibe síntesis D-alanina: alrA
D-alanina: (Análogo de D-alanina) de PG alanina sintasa dadB
alanina sintasa
(D-Ala-D-Ala) Acido paraamino Inhibe síntesis Desconocido
Desconocido Desconocido salicílico (PAS) Acido fólico
Amikacina/ Inhibe síntesis de 16S rRNA rrs 16S rRNA Kanamicina/
proteínas Capreomicina
*KatG, PncA y etaA no son blancos, están involucrados en la
activación de las prodrogas
INH, PZA y ETA respectivamente. Tomado y modificado de: Zhang &
Amzel 2002.
Información adicional integrada de referencias 20,31,46, 47 y
59.
La resistencia secundaria o adquirida, es aquella que se desarrolla
en
pacientes que han recibido quimioterapia antituberculosa, debido a
la
selección de cepas mutantes resistentes, en la mayoría de los
casos
motivado a un tratamiento inadecuado o incumplimiento de la
terapia
(Nachega & Chaisson 2003; Sharma & Mohan 2004b).
Estudios genéticos han demostrado que la resistencia a
medicamentos
antituberculosos se debe predominantemente a mutaciones
cromosómicas
espontáneas en los genes que codifican los blancos o enzimas
implicadas en
la activación del fármaco. A diferencia de otras bacterias no se
han
reportado mecanismos de adquisición de genes de resistencia vía
plásmidos
o transposones y es importante resaltar que no se conoce alguna
alteración
genética que por sí misma, dé lugar al fenotipo MDR; éste se da por
la
acumulación de mutaciones individuales en varios genes, cada uno de
los
cuales es responsable de la resistencia a un antibiótico particular
(Gillespie
2002; Coll 2003); sin embargo estudios recientes han sugerido que
las
mutaciones en el gen katG codón 315 están fuertemente asociadas con
el
fenotipo MDR (Hazbón et al., 2006).
56
Se han descrito mutaciones puntuales, deleciones o
inserciones
responsables de resistencia a fármacos de primera línea y a algunos
de
segunda línea; existen dos tipos de mutaciones bien conocidos: las
que
ocurren en los genes que codifican las enzimas encargadas de
convertir el
pro-fármaco a su forma activa (ejemplo katG/INH) originando
productos
inactivos y las mutaciones en los blancos bioquímicos del
medicamento, lo
que conlleva a una reducción en la unión del fármaco con el blanco
(ejemplo
girasa/FQs) (Musser 1995; Zhang & Amzel 2002; Coll 2003;
Said-Fernández
et al., 2005), así por ejemplo:
♣ Isoniacida (INH): En el 42-58% de las cepas resistentes se
encuentran
mutaciones en el gen katG, el cual codifica para una
catalasa-peroxidasa
que convierte la INH en la forma activa, siendo más frecuente
la
sustitución de la serina 315 por treonina (S315T) (Tabla 4; ver
sección
2.8.1).
♣ Rifampicina (RIF): Un 95% a 98% de las cepas resistentes
presenta
mutaciones en el gen rpoB, el cual codifica para la enzima blanco
RNA
polimerasa subunidad b, generalmente localizadas en un corto
segmento
de aproximadamente 81 pb, que incluye los codones 507 a 533 del
gen
rpoB. Las mutaciones más frecuentes están en codones para
asparagina
516, histidina 526 y serina 531.
♣ Pirazinamida (PZA): Entre el 72-97% de las cepas resistentes
poseen
mutaciones dispersas en el gen estructural pncA o en el promotor de
la
piracinamidasa que convierte la PZA en ácido piracinoico la forma
activa.
57
♣ Fluoroquinolonas (FQ) Entre el 75-94% de los aislados resistentes
han
presentado mutaciones en los genes girA y girB (que codifican para
las
subunidades de la enzima girasa, la cual es el blanco de los FQs).
En
cepas resistentes a ofloxacina, se han descrito mutaciones en
los
codones 89 (Asp-His), 90 (Ala-Val) y 94 (Asp-Gly) del gen
girA.
2.8.1. Respuesta al tratamiento con isoniacida (INH)
La isoniacida (INH) o ácido isonicotínico de hidracida introducido
en 1952,
es un agente bactericida sintético de primera línea, debido a que
demuestra
actividad específica contra M. tuberculosis y baja actividad contra
otras
micobacterias. Este fármaco presenta bajos costos por dosis,
baja
hepatotoxicidad y una muy buena bio-disponibilidad una vez que
entra a la
micobacteria vía difusión pasiva a través de la envoltura
bacteriana (Slayden
& Barry 2000; Whitney & Wainberg 2002).
INH es un pro fármaco que requiere la activación celular para
producir un
derivado potente capaz de oxidar o acilar enzimas del bacilo y
ejercer su
actividad antimicobacterial. Todo esto ocurre en un proceso en el
cual el
medicamento es oxidado por una hemoproteína de 80 kDa conocida
como
hidroxiperoxidasa I, que pertenece a la familia de enzimas con
actividad
catalasa/peroxidasa (CP) y está codificada por el gen katG. Una vez
activa
la INH puede inhibir la síntesis de ácidos micólicos dado que sus
blancos
58
principales son la 2-trans-enoil ACP reductasa (InhA) y la
β-cetoacil-ACP-
sintasa (KasA), enzimas que hacen parte del sistema FAS-II y
catalizan la
síntesis de ácidos micólicos al participar en la elongación de los
precursores
de cadena corta como el ácido hexacosanoico (C26:0) para generar
los α-
alquil β-hidroxiácidos de cadena larga (Nagy et al., 1997; Slayden
& Barry
2000; Vilcheze et al., 2000; Takayama et al., 2005 ).
La resistencia a INH en M. tuberculosis ha sido asociada
principalmente a
mutaciones puntuales en el gen katG que conducen a una alteración
de la
actividad catalasa/peroxidasa indispensable para la activación del
fármaco.
Una mutación puntual (AGC-ACC) en el codon 315 de katG que conlleva
a
un cambio en la hidroxiperoxidasa I de una serina por una
treonina
(Ser315Thr) es la alteración más comúnmente asociada a
resistencia,
aunque se han descrito otras mutaciones más en éste gen
originando
sustituciones de aminoácidos (a.a.) importantes en la proteína
(Arg463Leu,
Thr275Pro, Leu587Met, Met1Ala, Asp63Glu, His108Gln,
Ala350Ser,
Gli629Ser). Por otro lado polimorfismos en los genes que codifican
los
blancos del fármaco también juegan un papel importante como
mecanismo
de resistencia, en el gen inhA que codifica para 2-trans-enoil ACP
reductasa
(InhA) se ha reportado una mutación puntual en el nucleótido 280
(T-G) que
genera la sustitución Ser94Ala, además de posibles polimorfismos en
su
región reguladora que originan una sobre-expresión de gen. En el
gen kasA,
59
(Asp66Asn, Gli269Ser, Gli312Ser, Fen413Leu, Arg121Lis,
Gli387Asp)
también han sido descritas (Musser 1995; Slayden & Barry 2000;
Whitney &
Wainberg 2002; Coll 2003; Cohen et al., 2004).
Es importante resaltar que M. tuberculosis ha desarrollado otro
mecanismo
de defensa en respuesta al tratamiento con INH, generando cambios
en los
patrones de expresión de proteínas involucradas o relacionadas con
las vías
metabólicas que el medicamento afecta y de ésta forma compensar el
daño,
al sintetizar los productos inhibidos. Es así que mediante el uso
de la
hibridación con microarreglos, marcaje metabólico y proteómica se
ha
demostrado la sobre-expresión de un grupo de genes que codifican
para
componentes del sistema Fas-II (acpM, kasA, kasB, fabD, accD6),
además
de proteínas secretadas por el bacilo como el complejo antígeno
85,
compuesto por tres trehalosas dimycolyl transferasas (fbpA, B y
C)
involucradas en la transferencia de ácidos micólicos (AM) a partir
de una
trehalosa 6-monomicolato (TMM) a otra (TMM) y al arabinogalactano
(AG)
para formar la trehalosa 6,6’-dimicolato (TDM) y el complejo mAGP.
Estos
procesos forman parte de los últimos pasos en la producción de
ácidos
micólicos y construcción de la pared celular, como mecanismos
de
retroalimentación positiva que se presentan cuando la bacteria
censa una
depleción de los AM maduros, por acción de la INH. Lo anterior pone
en
peligro la integridad de la micobacteria y es por eso que estas
enzimas son
indispensables para el buen funcionamiento y estructuramiento de la
pared
60
celular y por tanto son esenciales para la sobrevivencia
micobacteriana
(Garbe et al., 1996; Belisle et al., 1997; Wilson et al., 1999;
Takayama et al.,
2005).
Muchos otros genes son inducidos por la exposición a INH, el ahpC
cuyo
producto una alquil-hidroxiperoxido reductasa reduce peróxidos
orgánicos a
sus correspondientes alcoholes, jugando un papel importante en
la
respuesta de estrés a peróxidos; su sobre-expresión se da para
compensar
la pérdida de la actividad catalasa/peroxidasa como consecuencia de
los
polimorfismos que se presentan en el gen katG (Zhang et al., 1996;
Wilson et
al., 1999; Slayden & Barry 2000; Whitney & Wainberg
2002).
Recientemente se ha descrito que la sobre expresión de la enzima
arilamida
N-acetiltransferasa (NAT) de M. tuberculosis y en M smegmatis
incrementa la
resistencia a INH; ésta enzima puede acetilar el fármaco
transfiriendo un
grupo acetilo a partir del acetil CoA dentro de la región
nitrógeno-terminal de
la INH que en su forma acetilada es inactiva; probablemente NAT
compita
con KatG por el fármaco (Figura 9) (Sandy et al., 2005).
2.9. Antígeno 85 un posible blanco de nuevos fármacos
El complejo antígeno 85, está compuesto por tres proteínas Ag85A
(fbpA),
Ag85B (fbpB) y Ag85C (fbpC), codificadas por los genes fbpA, fbpB,
y fbpC ,
61
los cuales están localizados en loci separados dentro del genoma de
M.
tuberculosis y han sido bien caracterizados no sólo en éste bacilo
sino
también en otras especies de micobacterias (Content et al., 1991;
Belisle et
al., 1997; Kremer et al., 2002). Este grupo de proteínas comparten
la misma
función, aunque existen algunas diferencias en la especificidad de
Ag85A y
Ag85C en relación a Ag85B (Artimige et al., 2000), además
están
cercanamente relacionadas compartiendo del 68 – 80% de identidad en
su
secuencia de amino ácidos (Jackson et al., 1999; Takayama et al.,
2005).
Figura 9. Esquema del proceso de acetilación de la INH. A. Proceso
de
activación del fármaco por la catalasa/peroxidasa (producto del
KatG). El
asterisco en el N terminal denota una especie oxidada. B. La
enzima
arilamida N-acetiltransferasa (NAT), transfiere un grupo acetilo a
la INH,
generando un fármaco inactivo. Tomado y modificado de: Sandy et
al.,
2005.
62
Este complejo proteico es catalogado como un muy atractivo blanco
para
diseño de nuevos fármacos antituberculosos debido a las
características
particulares que presenta:
♣ El complejo antígeno 85 hace parte de la familia de proteínas de
unión a
fibronectina que están consideradas como potenciales factores
de
virulencia (Ratliff et al., 1998, Abou-Zeid et al., 1998) pues
en
Mycobacterium tuberculosis al igual que en otros microorganismos
la
habilidad de unión a la fibronectina y a otras proteínas de la
matriz
extracelular aumenta la virulencia de organismos patógenos (Patti
et al.,
1994). Esta propiedad sugiere que el complejo antígeno 85 juega un
rol
importante en la interacción de la micobacteria con los macrófagos
y su
sobrevivencia dentro del hospedero; particularmente el Ag85B
cuyos
niveles de mRNA se incrementan durante las primeras 24h de
infección,
cuando la micobacteria entra al fagocito mononuclear-macrófago,
además
de inducir la liberación de TNF-α al formar complejo con la
fibronectina de
las células del hospedero (Wilkinson et al., 2001; Islam et al.,
2004).
♣ Está involucrado en una de las vías metabólicas esenciales para
el
bacilo como es la síntesis de los ácidos micólicos, necesaria
para
mantener la integridad de la pared celular y el crecimiento de la
bacteria.
Los estudios de inactivación de los genes que codifican para las
proteínas
del complejo antígeno 85 sugieren que la inhibición de los tres
genes
63
puede afectar profundamente el crecimiento micobacteriano; por
ejemplo
la disrupción del gen fbpA, conlleva a una diferencia significativa
en el
crecimiento con respecto a la cepa control en el medio sintético
sauton y
en cultivo de macrófagos humanos, igualmente, la interrupción del
gen
fbpC afecta el contenido total de micolatos en la pared celular en
un 40%
en comparación a la cepa silvestre, lo que lleva a un aumento en la
toma
o difusión de algunas sustancias por la micobacteria, afectando
entonces
la permeabilidad de la pared celular (Jackson et al., 1999,
Armitige et al.,
2000; Harth et al., 2002 ; Nguyen et al., 2005).
♣ La dilucidación de la estructura de cada una de estas proteínas
por
cristalografía, no sólo ha revelado los residuos (altamente
conservados
en las tres proteínas) en los cuales se encuentra el sitio activo y
de unión
con los sustratos (trehalosas monomicolatos y ácidos micólicos)
sino
también ha ilustrado el modo de interacción con su sustrato
respectivo.
Este información permite la posibilidad de diseñar potentes
inhibidores
de su actividad micoliltransferasa (anti-TB). Por otro lado la
identificación
de la región N-terminal como la responsable de la interacción
con
fibronectina, sugiere otra estrategia por medio de la cual se
inhiba ésta
interacción como lo es diseñando péptidos (anti-TB vacunas) contra
ésta
región que bloqueen la unión del antígeno 85 con la fibronectina
del
macrófago y de ésta forma la adhesión y fagocitosis de la
micobacteria,
eliminando una de los principales modos de entrada usada por
64
(Zhang & Amzel 2002; Ronning et al., 2004).
♣ Estudios proteómicos y de expresión usando microarreglos,
han
demostrado que los genes fbpABC contribuyen con el fenotipo
resistente
pues se sobre-expresan en respuesta al tratamiento con Isoniacida
(INH)
(Garbe et al., 1996; Wilson et al., 1999; Ramaswamy et al.,
2003);
aunque el mecanismo p