Post on 18-Apr-2015
IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS Litopenaeus vannamei
UTILIZANDO MARCADORES MOLECULARES TIPO
MICROSATÉLITES
Ph.Dc Franklin Pérez
Yordan Vivanco Muñoz
1. Utilización de los Microsatélites para la identificación de 32 familias de camarón
2. Análisis financiero de la utilización de la técnica de microsatélites para un sistema de producción comercial
IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS
Utilización de los Microsatélites para la identificación de 32
familias de camarón
INTRODUCCIÓN
ACTUALES PROBLEMAS BIOLÓGICOS EN LA
PRODUCCIÓN DE CAMARÓN
Enfermedades
- Síndrome de Las Gaviotas (1990)
- Síndrome de Taura (1994)
- Síndrome de la Mancha Blanca (1999) Bajo crecimiento Endogamia
MEJORAMIENTO GENÉTICO
Cruzando individuos de diferente procedencia con mejores resultados en el campo se puede obtener variedades más resistentes y con mejor crecimiento
Implementación el uso de marcadores moleculares (o genéticos) para programas de mejoramiento genético
VENTAJAS DE LOS MARCADORES MOLECULARES
Identifican el grado de parentesco entre individuos, evitando el cruce entre hermanos (endogamia)
Su relativa fácil aplicación permite incluir programas de mejoramiento genético en programas de producción
MARCADOR MOLECULAR
Es un segmento de ADN con una ubicación física identificable en un cromosoma y cuya herencia se puede rastrear.
TIPOS DE MARCADORES MOLECULARES
Marcador Dominante
Marcador Codominante
(Microsatélites)
MICROSATÉLITES
Son secuencias de bases repetitivas ej:
….TCCGTGAGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGGAATAT....….AGGCACTCACACACACACACACACACACACCTTATA….
Abundantes en el genoma Presentan alta variabilidad Repeticiones van de 2 a 6 pares de bases con
longitudes de 20 a 100 pb Pueden estar relacionadas con genes importantes
(de resistencia y crecimiento)
VISUALIZACIÓN DE LOS MICROSATÉLITES
5’GCGGCCATCACA3’
...3’ATACACGCCGGTAGTGTCCAGGCCACA5’…
…5’CATCACCTATTGGATGCTATAGCGTGTCAGCCT3’… 3’TACGATATCGCACA5’
3’5’3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’3’
3’
3'3'5’
CICLO 1 CICLO 2
3’ 5’
5’3’
5’ 3’
5’ 3’
CICLO 3
CICLO 4
AISLAMIENTO Y AMPLIFICACIÓN POR PCR DE UN FRAGMENTO DESEADO DE DNA
MATERIALES Y MÉTODOS
OBTENCIÓN DE PRIMERS
Se diseñó a partir de secuencias publicadas en NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) con el programa Genfisher
1ra amplificación: extracción CTAB (DNA purificado) T°: 42 – 45 – 48 – 51 – 54 – 57 – 60 [MgCl2]: 1,0 – 1,5 – 2,0 – 2,5
2da amplificación: extracción CHELEX (DNA no purificado)
OBTENCIÓN DE MUESTRA
32 familias obtenidas por el programa de mejoramiento PROMOGEN. 15 animales por familia
OBTENCIÓN Y DOCUMENTACIÓN DE RESULTADOS
PCR de las muestras Separación de bandas en gen de
Poliacrialmida 6% Visualización por tinción de plata Cámara digital Kodak DC 120 Programa EDAS de Kodak El análisis del tamaño de las bandas corridas
por electroforesis se llevó a cabo con el Programa GeneProfiler
CÁLCULO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA
Análisis de heterocigocidad observada
Análisis de heterocigocidad esperada
Ni
HHo
21 piHe
TIPO DE SEGREGACIÓN ESPERADA EN EL ANÁLISIS DE 2 SEGREG. PARENTAL 1 0,25PARENTAL 2 0,25 0,25 0,25
CASO 1*
CASO 1
1:1*
1:1
1:2:1
1:1:1:1*
1:1:1:1
ANÁLISIS ENTRE FAMILIAS
Análisis de Lineaje de familias: Programa Kinship 1.2
Análisis Cluster (agrupamientos): Programa TFPGA que realiza dendogramas basados en el análisis UPGMA
RESULTADOS
MICROSATÉLITES ESCOGIDOS DE 131 PARES DE PRIMERS
locus Secuencia de los primersT°
(TD)[MgCl2](Mm)
Accesoal NCBI
CN-54 F: TGCTTGTGAAGGTGTGTGAACGTGR: CAAGATGCGTATGCACACATTGCTG 43 1,0 AF360040
CN-67 F: GAAGAGGCAGGGCGGATTTR: GGAAGGGTGGGAACAAGG 51 2,0 AF360007
CN-84 F: GGGTTATGATGACCAAAGR: ATTGGGTCTCGGAGTTTA 59 2,0 AF360114
CN-135 F: ATAATGCGAGCGTGAGR: ATTCCTTAGCGAACCA 43 2,0 AF359979
CN-142 F: TGCTACGCCGACAATGR: GAAGGTGCTTGCGACA 43 2,0 AF360029
CN-148 F: CATCATCGCTAAAATTR: CCTTCTGTTGTGGGTAT 43 2,0 AF360051
CN-159 F: AAGAACGAAGTGGAGGAGR: AAGCACCCAGTGTAGCC 47 2,0 AF360109
PRESENCIA DE ALELOS NULOS
CN-67
CN-46
CN-67
CN-46
Familia 22
Familia 2
HETEROCIGOCIDAD
Proyecto de Familias
Silvestres (Casalla, 2003)
Mic. N. Alelos Rango (pb) He Ho N. Alelos Rango (pb) He Ho
CN-54 17 127 – 187 0,18 0,47 12 126 – 148 0,55 0,36
CN-67 21 213 – 305 0,70 0,71 41 230 – 310 0,91 0,70
CN-84 19 243 – 323 0,89 0,47 20 294 – 332 0,48 0,86
CN-135 4 233 – 263 0,16 0,12 20 232 – 270 0,80 0,81
CN-142 17 295 – 229 0,84 0,65 19 196 – 232 0,78 0,61
CN-148 6 211 – 221 0,70 0,32 11 204 – 224 0,80 0,31
CN-159 14 269 – 195 0,91 0,30 20 148 – 194 0,85 0,31
Promedio 14 0,63 0,43 20,42 0,74 0,57
CN-148, Familia 15
CN-135, Familia 10
CN-135, Familia 4
PARENTALES DESCENDENCIA
CN-142, Familia 16
1
1
SEGREGACIÓN 1:1
CASO 1*
CASO 1
0,50 0,50
SEGREGACIÓN 1:1*
0,50 0,50
PRUEBA DE SEGREGACIÓN MENDELIANA
7 CASOS DE SEGREGACIÓN
PRUEBA DE SEGREGACIÓN MENDELIANA
7 CASOS DE SEGREGACIÓN
CN-67, Familia 8
CN-67, Familia 22
PARENTALES DESCENDENCIA
CN-142, Familia 12
SEGREGACIÓN 1:1:1:1
SEGREGACIÓN 1:2:1
0,25 0,25 0,25 0,25
SEGREGACIÓN 1:1:1:1*
0,25 0,25
0,25 0,25 0,25 0,25
0,25 0,25
CN-84, familia 23
301297
295 295 295 295 295293
289285 285 285 285 285 285 285 285
257 257 257 257 257 257 257 257
PRUEBA DE SEGREGACIÓN MENDELIANA
Familia que no presenta ningún caso de segregación
CN-67, Familia 5
CN-84, Familia 5
CN-142, Familia 5
267259 259 259 259 259 259 259 259 259
251 251 251 251 251 251 251 251233 233 233 233 233 233 233 233 233
297 297 297 297 297291 291 291 291 291 291 291 291 291 291
287 287 287 287 287 287 287 287257
221 221 221 221 221213 213 213 213 213 213 213 213 213 213
205 205 205 205 205 205 205197 197 197 197 197 197 197
PRUEBA DE SEGREGACIÓN MENDELIANA
Individuo que no presenta el perfil del grupo
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 01 - 02 *** - 03 *** *** - 04 *** *** *** - 05 *** *** *** *** - 06 *** *** *** *** *** - 07 *** *** *** *** *** ** - 08 *** *** *** *** *** *** *** - 09 *** *** *** *** *** ** *** *** - 10 *** *** *** *** *** *** *** *** *** - 11 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** - 12 *** *** *** *** *** ** *** *** *** *** *** - 13 *** *** *** *** *** ** *** *** *** *** *** *** - 14 *** *** *** *** *** *** * *** ** ** *** *** ** - 15 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** -
AGRUPAMIENTO FAMILIAR CON EL PROGRAMA KINSHIP
Familia 25
* Probabilidad de 95,0 % que sean hermanos** Probabilidad de 99,0 % que sean hermanos*** Probabilidad de 99.9 % que sean hermanos
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15
01 -
02 *** -
03 *** *** -
04 N.S. N.S. ** -
05 N.S. N.S. N.S. N.S. -
06 *** N.S. *** * N.S. -
07 *** N.S. *** *** N.S. *** -
08 N.S. * N.S. * N.S. *** * -
09 N.S. N.S. ** *** N.S. *** *** *** -
10 N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. -
11 N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. * N.S. * *** -
12 *** *** *** * N.S. N.S. * ** *** N.S. * -
13 N.S. N.S. N.S. N.S. *** N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. -
14 N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. * N.S. * * * N.S. N.S. -
15 N.S. N.S. N.S. *** N.S. *** *** *** *** N.S. N.S. * N.S. * -
* Probabilidad de 95,0 % que sean hermanos** Probabilidad de 99,0 % que sean hermanos*** Probabilidad de 99.9 % que sean hermanosNS No significativo
AGRUPAMIENTO FAMILIAR CON EL PROGRAMA KINSHIP
Familia 24
AGRUPAMIENTO FAMILIAR CON EL PROGRAMA KINSHIP
F1 77% F2 48% F3 83% F4 79% F5 68% F6 73% F7 76% F8 81% F9 79% F10 94% F11 68% F12 81% F13 94% F14 65% F15 86% F16 98% F17 99% F18 96% F19 91% F20 75% F21 66% F22 89% F23 71% F24 36% F25 100% F26 87% F27 100% F28 41% F29 100% F30 50%
F31 61% F32 100%
AGRUPAMIENTO ENTRE FAMILIAS CON EL PROGRAMA KINSHIP
AGRUPAMIENTO ENTRE FAMILIAS CON EL PROGRAMA KINSHIP
F16 01
F16 02
F16 03
F16 04
F16 05
F17 01
F17 02
F17 03
F17 04
F17 05
F18 01
F18 02
F18 03
F18 04
F18 05
F16 01 -
F16 02 ** -
F16 03 *** *** -
F16 04 ** *** *** -
F16 05 ** *** *** *** -
F17 01 *** *** ** ** *** -
F17 02 *** *** ** *** ** *** -
F17 03 *** *** *** *** *** N.S. *** -
F17 04 *** *** *** ** *** *** ** ** -
F17 05 ** *** *** *** *** ** * ** *** -
F18 01 * *** *** ** *** ** * * * ** -
F18 02 * *** *** *** *** *** ** ** *** *** *** -
F18 03 *** N.S. ** ** ** ** *** * N.S. N.S. *** *** -
F18 04 *** ** *** *** *** ** *** ** N.S. ** *** *** *** -
F18 05 N.S. *** *** ** *** ** N.S. ** ** *** *** *** N.S. *** -
DENDOGRAMA FAMILIAR REALIZADO CON EL PROGRAMA TFPGA
DISCUSIÓN
PRESENCIA DE ALELOS NULOS
No hay correcto plegado de iniciador, por una mutación
Modificación o cambio de primer podría amplificar el alelo nulo
Puede subir la proporción de falsos homocigotos
VARIABILIDAD GENÉTICA
Cuando la Ho es menor que la He se debe a una alta consanguinidad (muchos homocigotos) o incidencia de alelos nulos
Caso los loci CN-84; CN-135; CN-142; CN-148; CN-159
Cuando la Ho es mayor que la He se debe a un exceso de heterocigotos por a las cruzas dirigidas y no al azar
Caso del locus CN-54
VARIABILIDAD GENÉTICA
La población silvestre ecuatoriana (Casalla, 2003) tiene más variabilidad que las familias en estudio por tener:
Mayor número de alelos Mayor Heterocigocidad
Presencia de 21 alelos en las familias que no tiene la población silvestre debido al origen distinto de algunos reproductores (Panamá)
SEGREGACIÓN MENDELIANA Y AGRUPAMIENTO
En la familia 25 encontramos:
Locus Segregación
CN-54 1*
CN-67 1
CN-84 1:2:1
CN-135 1*
CN-142 1:1:1:1
CN-148 1:2:1
CN-159 1:2:1
2da ley de Mendel: cada alelo tiene segregación independiente, no depende de la segregación de
otro alelo.
SEGREGACIÓN MENDELIANA Y AGRUPAMIENTO
Se encotraron 2 grupos de familias, donde cada grupo presentó los mismos perfiles: F7 y F8 F16, F17 y F18
Hecho que supone la división de un desove en algunos tanques
SEGREGACIÓN MENDELIANA Y AGRUPAMIENTO
20 individuos específicos (distribuidos en las familias) no pertenecieron al perfil familiar
El individuo F5 12 no perteneció a los perfiles de la familia F5; pero fue agrupado (por el programa Kinship) en la familia 23 indicando el origen de la muestra
SEGREGACIÓN MENDELIANA Y AGRUPAMIENTO
Errores y discordancia en la segregación mendeliana se deben principalmente a 3 razones:
Error durante la manipulación de la muestra Mal manejo de familias Por mutación (alelos nulos o alelos diferentes)
ANÁLISIS FINANCIERO
Análisis financiero de la utilización de la técnica de
microsatélites para un sistema de producción
comercial
MÉTODO DE MARCAJ E FAMILIAR
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7
49 Desoves: 7 7 7 7 7 7 7
LARVICULTURA
49 Recipientes de 50 L por 21 días (un recipiente por desove)
49 Tanques de 2 m3 por 15 días
(2000 animales por tanque)
Crecimiento a 1 g y Marcaje
CRECIMIENTO DE REPRODUCTORES
F1 F2 F49 F3
F1 F49 F2
7.000 m2
1.000 1.000 1.000
SISTEMA DE MEJORAMIENTO GENÉTICO DE
SELECCIÓN FAMILIAR
M É T O D O D E “ W A L K B A C K S E L E C T I O N ” ( G E N O T I P E A D O )
G E N O T I P E A D O D E P A R E N T A L E S
L A R V I C U L T U R A
T A N Q U E S C O N V E N C I O N A L E S , F A M I L I A S M E Z C L A D A S
P R O D U C C I Ó N E N C A M A R O N E R A C O N V E N C I O N A L
M E J O R E S E J E M P L A R E S L L E V A D O S A R E P R O D U C T O R E S
SISTEMA DE MEJORAMIENTO GENÉTICO DE
WALK BACK SELECTION
Proyecto Método de Mejoramiento Genético
Característica del Proyecto.
A SELECCIÓN FAMILIAR
Maduración y larvicultura:
Compra de terreno y equipos, construcción de infraestructura.
Camaronera: Compra de camaronera con maquinarias y bombas incluidas.
B SELECCIÓN FAMILIAR Maduración,
Larvicultura y Camaronera: Alquiler
C WALK BACK SELECTION
Maduración y larvicultura:
Compra de terreno y equipos, construcción de infraestructura.
Camaronera: Compra de camaronera con maquinarias y bombas incluidas.
D WALK BACK SELECTION Maduración,
Larvicultura y Camaronera: Alquiler
DIMENSIONAMIENTO DE LOS PROYECTOS A y B
Maduración: 1 Galpón de maduración de 132 m2; 8 tanques, producción de
3’200.000 nauplios diarios durante 9 meses al año
Larvicultura: 2 Tanques de 13 m3 c/u; 6’200.000 larvas anual (3 ciclos) 1 Galpón para 50 recipientes de 50 L c/u 49 Tanques plásticos exteriores de 2 m3
Camaronera: 20 Has, 95.466 libras al año (3 ciclos) Están incluidos 1 Ha, selección de reproductores 0,5 Ha, crecimiento de reproductores; 9.900 reproductores al año
CONSTRUCCIÓN DE INFRAESTRUCTURA
MADURACIÓN Y LARVICULTURA
MADURACIÓN COMERCIAL
CAMARONERA
LEVANTAMIENTO DE LARVA A J UVENIL PARA MARCAJ E
PISCINAS DE EVALUACIÓN DE REPRODUCTORES
PISCINA DE CRECIMIENTO DE REPRODUCTORES
0 1 2 3
PROYECTO A. 5 AÑOS CON CICLOS DE 4 MECES
4 5
ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO AProyecto A: 5 años con ciclos de 4 meses
MADURACIÓN Y LARVICULTURA
MADURACIÓN COMERCIAL
CAMARONERA
LEVANTAMIENTO DE LARVA A J UVENIL PARA MARCAJ E
PISCINAS DE EVALUACIÓN DE REPRODUCTORES
PISCINA DE CRECIMIENTO DE REPRODUCTORES
0 1 2 3 4 5
PROYECTO B. 5 AÑOS CON CICLOS DE 4 MECES
ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO B
Proyecto B: 5 años con ciclos de 4 meses
FINANCIAMIENTO DE LOS PROYECTOS A Y B
Proyecto A Proyecto B
Inversiones $ 219.240,94 $ 72.505,06
Capital de Trabajo $ 92.675,89 $ 160.216,49
TOTAL $ 311.916,83 $ 232.721,55
Capital Propio 30% del Total
$ 93.575,05 $ 69.816,46
Crédito 70% del Total
$ 218.341,78 $ 162.905,08
VENTAS DE LOS PROYECTOS A Y B
Proyecto A Proyecto B
Concepto 1er año 2do año en adelante
1er año en adelante
Nauplios $ 56.320,00 $ 86.400,00 $ 84.480,00
Lb. de camarón
$ 82.737,04 $ 124.105,56 $ 124.105,56
Reproductores $ 4.500,00 $ 9.000,00 $ 9.000,00
TOTAL $ 143.557,04 $ 217.585,56 $ 217.585,56
DIMENSIONAMIENTO DE LOS PROYECTOS C y D
Maduración: 1 Galpón de maduración de 132 m2; 8 tanques, producción de
3’200.000 nauplios diarios durante 9 meses al año
Larvicultura: 2 Tanques 13 m3 c/u; 7’050.000 larvas anual (3 ciclos)
Camaronera: 20 Has, 109.104 libras al año (3 ciclos) Incluiye: 0,5 Ha, crecimiento de reproductores; 7.200 reproductores al año
ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO C
CONSTRUCCIÓN DE INFRAESTRUCTURA
MADURACIÓN Y LARVICULTURA
MADURACIÓN COMERCIAL
CAMARONERA
PISCINA DE CRECIMIENTO DE REPRODUCTORES
1 2 3
PROYECTO C. 5 AÑOS CON CICLOS DE 4 MECES
4 50
Proyecto C: 5 años con ciclos de 4 meses
ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO D
MADURACIÓN Y LARVICULTURA
MADURACIÓN COMERCIAL
CAMARONERA
PISCINA DE CRECIMIENTO DE REPRODUCTORES
0 1 2 3 4 5
PROYECTO D. 5 AÑOS CON CICLOS DE 4 MECESProyecto D: 5 años con ciclos de 4 meses
FINANCIAMIENTO DE LOS PROYECTOS C Y D
Proyecto C Proyecto D
Inversiones $ 218.887.11 $ 71.010.64
Capital de Trabajo $ 77.476.07 $ 137.364.19
TOTAL $ 296.363.18 $ 208.374.83
Capital Propio 30% del Total
$ 88.908.95 $ 62.512.45
Crédito 70% del Total
$ 207.454.22 $ 145.862.38
VENTAS DE LOS PROYECTOS C Y D
Proyecto C Proyecto D
Concepto 1er año 2do año en adelante
1er año en adelante
Nauplios $ 56.320,00 $ 84.480,00 $ 84.480,00 Lb. de
camarón $ 94.556,62 $ 141.834,93 $ 141.834,93
Reproductores $ 2.250,00 $ 4.500,00 $ 4.500,00
TOTAL $ 153.126,6 $ 230.814,93 $ 230.814,93
DISCUSIÓN:COMPARACIÓN DE LOS 4 PROYECTOS
Concepto A B C D
Capital Propio de Inversión
$ 93.575,05 $ 69.816,46 $ 88.908,95 $ 62.512,45
VAN (14,8%) $-23.938,65 $-19.276,99 $ 52.174,68 $ 61.649,71
TIR 8,52% 8,07 % 29,73 % 41,64%
B/ C 0,71 0,68 1,67 2,13
P. Recuperación 4,69 años 4,74 años 4,10 años 3,32 años
CONCLUSIONES
CONCLUCIONES DE LA IDENTIFICACIÓN FAMILIAR
CONCLUCIONES FINANCIERAS
CONCLUSION DE LA IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS
Se puede utilizar microsatélites específicos para Litopenaeus vannamei para la determinación de familias y parentesco
Se comprobó la utilidad de la técnica de marcadores microsatélites para el control de programas de mejoramiento genético en camarón
RECOMENDACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS
Es preferible tener la información del genotipo de los padres, para conocer el genotipos de la descendencia y determinar si hubo mala manipulación al encontrar individuos introducidos.
Un estudio con mayor número de loci microsatélites, los resultados son más exactos, debido a la presencia de alelos nulos
CONCLUSIONES DE LA COMPARACIÓN DE LOS 4
PROYECTOS Es mejor implementar el sistema de Walk
Back Selection por su menor necesidad de inversión y tener los mejores índices, la mejor opción: alquilar las instalaciones (D)
Mientras mayor sea la cantidad de hectáreas en producción, el proyecto será más estable ante las variaciones de precios de venta y costo de insumos ya que es la venta que produce mayor ganancia.
GRACIAS