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IDENTIFICACION DE PROTEINAS DE ALTO PESO MOLECULAR HMW EN TRIGO DURO
INTRODUCCION
Los cereales contribuyen un conjunto de plantas de gran impacto para la humanidad ya que son el
alimento que contribuye con numerosos nutrientes, el trigo en particular es una planta gramínea
anual, de la familia del césped, con espiga de cuyo granos molidos se obtiene la harina, su nombre
científico es del Genus triticum, es uno de los cereales mas utilizados en la elaboración de
alimentos, de ahí la necesidad de hacer el análisis de las proteínas especificas que contiene cada
variedad.
El cultivo de grano en México es importante para el desarrollo socioeconómico del país ya que es
una de las fuentes mas importante de nutrientes en la dieta del mexicano sobre todo para las
poblaciones rurales y urbanas de escasos recursos y por que tanto su cultivo como su
procesamiento y consumo genera una derrama económica y un gran numero de empleos en
varios sectores y actividades de la cadena del sistema producto-trigo. (Peña et al .,2008)
La electroforesis representa actualmente una de las herramientas mas complejas empleadas en el
laboratorio analítico moderno, ya que se ha aplicado a la investigación básica o aplicada e incluso
industrialmente, en particular la electroforesis en gel de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida
constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas dado que reúnen
una serie de propiedades idóneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y
compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos. La poliacrilamida se forma por
copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis acrilamida (N,N metilen-bis-acrilamida),
en una reacción iniciada por la Tetrametilendiamina (TEMED) y el per sulfato de amonio.
Entre las diversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE por sus siglas en inglespolyacrylamide gel electrophoresis) probablemente la mas utilizada es la modalidad que se lleva a
cabo en presencia de detergente duodecilsulfato de sodio (SDS).
MATERIALES Y METODOS
Material vegetal
Muestras de trigo duro proporcionadas por la institución
Reactivos
1. 1M TRIS, pH 8.5
2. 1M TRIS, pH 6.8
3. SDS (dodecilsulfato de sodio) 10%
4. Stock de acrilamida
a) Precaución: usar guantes y mascarilla
b) Almacenar en frasco obscuro y mantener en refrigeración
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5. Stock Buffer de muestra (extracción)
6. Stock TRIS- Glicina para buffer de tanque
7. Solución tinción coloración
8. Acido tricloroacetico
NOTA: Todos los reactivos son preparados con anterioridad para ser usados en
determinado momento según lo marca el método propuesto por Peña et al . 2004 y son
proporcionados por la institución.
Metodología
La muestra de trigo de 5 g ,cada una se molió en un molino UDY para obtener harina integral. El
análisis electroforético de proteínas de alto peso molecular se realizo por el método de Peña et al .,
2004 en el laboratorio de Química y Calidad de trigo del Centro Internacional de Mejoramiento de
Maíz y Trigo. La separación de las proteínas se obtuvo de una muestra de 40 mg de harina integral
pesada en una balanza analítica (Sartorius), colocando la muestra en tubos eppendorf de 1.5 ml de
capacidad.
Adicionamos 1.5 ml de propanol al 50% para la separación de proteínas solubles en alcohol,
mezclamos e incubamos a 65° C y centrifugamos a 10 000 rpm usando una Eppendorf micro
centrifuga 5415 C, Brinkmann Instruments N.Y., el sobrenadante es evaporado en su totalidad en
un tubo limpio y el residuo seco es extraído por medio de la solución de extracción con pH 8.0
(Obtención de gliadinas)
El residuo solido es mezclado con una solución DTT (Dithiothreitol) al 2% y posterior mente con
otra solución de Vinil piridina, se agito, se sónico, incubo y se centrifugo hasta obtener un
sobrenadante el cual contiene las proteínas gluteninas, específicamente que son extraídas con la
solución de extracción de pH 6.8.
El corrimiento electroforético se realizo utilizando geles de 15% de 17cm de alto y 1.5 mm de
ancho, ejemplo para dos geles:
y 24.67 ml de TRIS pH 8.5
y 21.14 ml Stock de Acrilamida
y 0.65 ml SDS
y 17.21 ml Agua destilada
La mezcla es desairada con un desgacificador Branson 5510, se filtra y se adiciona 1.3 ml de
persulfato de amonio al 1.5%, posteriormente adicionamos el TEMED justo antes de utilizar la
solución.
El gel de aplicación se utilizo al 4.8% de 3cm aproximadamente por 1.5 mm de ancho, entes de
que este gelifique se coloco un peine con 20 carriles.
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La cámara de electroforesis utilizada fue larga de forma vertical Electrophoresis Protean II xi an XL
Cell con capacidad para 6 geles con 20 carriles cada uno, y la separación electroforética se llevo a
cabo con 9-11 mA por gel durante 15 o16 horas, fue necesario utilizar un aparato enfriador que
mantenga la temperatura a 15 ° C.
Después de este tiempo es retirado de los cristales y colocado en una solución para colorear lasbandas por alrededor de 4 horas en agitación suave, el gel es retirado y colocado en agua para
empezar la decoloración.
La fotografía del gel se consigue colocando los geles en un recipiente de cristal o acrílico y
exponerlo a la luz, sin embargo se utilizo un escáner GS-710 Calibrated Imaging Densitometer para
la mejor apreciación de los geles.
RESULTADOS
Las proteínas de alto peso molecular se definen en tres locus Glu-A1, Glu-B1y Glu-D1, en la Figura
1 se observan las áreas donde se localizan cada uno de los alelos correspondientes a cada locus.
Figura 1. Locus Glu-A1, Glu-B1,
Glu-D1 y Gli-B1 de proteína en
geles de poliacrilamida.
Glu-A1
Glu-B1
Glu-D1
Gli-B1
LMW
HMW
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7
8
12*
17
18
75
10
2
12
G-APM
9
713
16
6
19?
A
7
8
7
8
12*
17
18
75
10
2
12
G-APM
9
713
16
6
19?
A
En la figura 2 se observa los diferentes perfiles de bandas de proteína de alto peso molecular y en
el cuadro 1 su identificación completa.
No.Muestra
HMWGlu-A1
HMWGlu-B1
HMWGlu-D1
1 2* 17+18 5+10
2 1 17+18 2+12
3 2* 7+8 5+10
4 2* 7+9 5+10
5 1 13+16 2+12
6 2* 7 5+10
Figura 2. Subunidades de proteínas
de alto peso molecular (HMW) en
geles de poliacrilamida
Cuadro 1. Bandeo correspondiente
a las proteínas de alto peso
molecular (HMW)
No. Muestra 1 2 3 4 5 6
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Las proteínas solubles en alcohol también llamadas gliadinas se pueden observar en la Figura 3,
correspondiente al locus Gli-B1.
La T observada en la figura 3 se refiere a la traslocación que consiste en el remplazo del brazo
corto del cromosoma 1B del trigo por el brazo corto 1R del centeno. Dicha traslocación se
encuentra asociados a genotipos de amplia adaptación y alto rendimiento (Rajaram y Braun 2008);
sin embargo desfavorece la calidad del gluten (Liu et al ., 2005).
Figura 3. Subunidades de proteína (gliadinas) en geles de poliacrilamida, T=
traslocación 1B/1R
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Las gliadinas identificadas en el locus Gli-B1 se encuentran ligadas a las gluteninas de bajo peso
molecular aunque estas proteínas no son nuestro objeto de estudio es importante saber que el
perfil del locus Gli-B1 permite confirmar los alelos del locus Glu-B3. En el cuadro 2 se observa
dicha relación.
Las bandas (locus Glu-A1, locus Glu-B1, locus Glu-D1 y locus Gli-B1) se identificaron en base a lo
nomenclatura propuesta por Payne y Lawrence (1983), Jackson et al . (1996) y Branlard et al .
(2003) para las subunidades pertenecientes a las gliadinas.
Glu-B3 b G C´ h d i j
Gli-B1 b F i d h k lCuadro 2. Correspondencia alelica
entre Gli-B1 y Glu-B3
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LITERATURA CITADA
y Branlard, G., M. Dardevet, N. Amiour, and G. Igrejas. 2003. Allelic diversity of HMW
and LMW glutenin subunits and omega-gliadins in French bread wheat (T riticum
aestivum L.). Gen. Res. Crop Evol. 50: 669679.
y He, Z. H., L. Liu, X.C. Xia, J. J. Liu, and R. J. Peña. 2005. Composition of HMW and
LMW glutenin subunits and their effects on dough properties, pan bread, and
noodle quality of chinese bread wheats. Cereal Chem. 82:345350.
y Jackson, E. A., M. H. Morel, T. Sontag-Strohm, G. Branlard, E. V. Metakovsky, and R.
Redaelli. 1996. Proposal for combining the classification systems of alleles of Gli-1
and Glu-3 loci in bread wheat (T riticum aestivum L.). J. Genet. Breed. 50:321-336.
y Payne, P. I., E. A. Jackson, and L. M. Holt. 1984. The association between K-gliadin
45 and gluten strength in durum wheat varieties: a direct causal effect or the result
of genetic linkage? J. Cereal Sci. 2:73-81
.
y Peña, B. R. J., H. González S., and F. Cervantes. 2004. Relationship between Glu-
D1/GluB-3 allelic combinations and breadmaking quality-related parameters
commonly used in wheat breeding. In: Masci, S. and D. Lafiandra (eds. Proceedings
of the 8th
International Gluten Workshop.. Viterbo, Italy. pp: 156-157.
y Rajaram, S. R. and H. J. Braun. 2008. Wheat yield potential. In: Reynolds, M. P. J.
Pietragalla, and H. J. Braun (eds). International Symposium on Wheat Yield
Potential: Challenges to International Wheat Breeding. CIMMYT. México, D. F. pp:
103-107.