Inducción de Proteína

Recombinante

Bioquímica Experimental

2020-2

Q.A. Moisés Méndez Ramírez

Dra. Sobeida Sánchez Nieto

Utilidad de la producción de proteínas recombinantes• Amplia variabilidad de aplicaciones científicas y comerciales.

• Creciente investigación en ingeniería genética para mejorar la eficiencia en su producción y obtención en diferentes sistemas.

• Desarrollo de nuevos protocolos y herramientas de manipulación y purificación.

Logros de la ingeniería genética

Impacto de la ingeniería genética en la sociedad

https://elpais.com/noticias/manipulacion-genetica/

Elección del sistema de clonación

Sistema de expresión en bacterias: E. coli

Ventajas:• Fácil manipulación genética.• Secuencia conocida.• Mínimo entrenamiento de manejo.• Tiempo corto de propagación.• Medios de cultivo y procesos de

operación baratos.• Fácil escalamiento y automatización.

Limitantes:• Perdida de funcionalidad o nula expresión de

proteínas de eucariontes y de membrana.• Diferente carácter químico de citoplasma. • Formación inadecuada de enlaces disulfuro.• Niveles altos de proteasas.• Gran diferencia entre chaperonas.• Mínimas modificaciones post-traduccionales.• Baja capacidad de secreción de proteínas solubles.• Proteínas no glicosiladas.

Cepas más empleadas de E. coli

• BL21 (DE3)

• Contiene al gen T7 de RNApolimerasa.

• Útil para plásmidos con promotor T7.

• Alta expresión de proteínas recombinantes.

• Baja actividad de RNAsas.

• Ausencia de proteasas de membrana externa (OmpT), reduce degradación de proteínas heterólogas.

• Inducción por IPTG.

• DH5α

• Alto rendimiento y calidad del DNA.

• Asegura la estabilidad del inserto; previene la recombinación.

• Permite selección de colonias por coloración blanca o azul en X-gal (Blue/White screening).

• Evita degradación por endonucleasa.

• E. coli str. B F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)

F– endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG purB20 φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK–mK+), λ–

Genotipo:Genotipo:

La elección de la cepa dependerá de la aplicación, la eficiencia, el genotipo y fenotipo deseado.

Características básicas de un vector de clonación

• -Marcador de selección.• -Sitio de clonación múltiple.• -Origen de replicación.• -Promotor y terminador para el gen de interés.• No contiene al gen de interés. (Es el vector vacío)

Vector de clonación pET 24 (+)

Vector recombinantepET-TEM-1-ompA-β-Lactamasa

• El vector pET-TEM-1 promueve la sobreexpresión de β-Lactamasa( ̴ 32kDa), unida al péptido señal ompA ( ̴ 1.kDa).

• Confiere resistencia a Kanamicina.

• Posee la secuencia del promotor T7 del bacteriofago T7 y al operador y represor del operón Lac.

Utilidad de las -lactamasas

• β-Lactamasas catalizan la hidrólisisdel enlace de amida en el anillo β-lactámico de penicillinas ycefalosporinas, siendo su producciónun mecanismo de resistencia.

Estructura de los clases A-D de β-Lactamasas

La producción de proteínas puede estar regulada en diferentes niveles

Operón LacUnidad regulatoria que contiene varias regiones diferentes de genes estructurales controlados por un solo promotor:

Promotor, Operador, Genes estructurales, Terminador.

Inducción de la expresión de β-Lactamasa

El IPTG (isopropil-β-galactosidasa) induce la expresión de la proteína de interés al unirse a la proteína represora de LacI, permitiendo la síntesis y unión de la RNApolimerasa T7.

El promotor T7, es un promotor fuerte del bacteriófago T7 que favorecerá la unión de la polimerasa.

Bajo estas condiciones se dará un mayor nivel en la transcripción del gen de interés.

Protocolo Experimental

Protocolo experimental para obtener la curva temporal de expresión de -lactamasa

Ligas de interés

• Science and History of GMOs and Other Food Modification Processes.

https://www.fda.gov/food/agricultural-biotechnology/science-and-history-gmos-and-other-food-modification-processes

• A time line of biotechnology

https://blogs.systweak.com/biotechnology-journey-from-its-origin-till-date-infographic/

• The Evolution of the Revolution. Biotechnology time line.

https://topforeignstocks.com/wp-content/uploads/2018/11/Innovations-in-Biotechnology-A-Timeline-New.png

• Schumann, Wolfgang, & Ferreira, Luis Carlos S.. (2004). Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Genetics and Molecular Biology, 27(3), 442-453.

https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1415-47572004000300022

• Rosano, G. L., & Ceccarelli, E. A. (2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in microbiology, 5, 172. https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00172

• Julian K-C. Ma, Pascal M. W. Drake and Paul Christou. (2003 ) The production of the recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews. Genetics, 4, 794-805.

https://www.nature.com/scitable/content/Genetic-modification-The-production-of-recombinant-pharmaceutical-15030/#

• C. L. Tooke, P. Hinchliffe, E. C. Bragginton, C. K. Colenso, V. H.A. Hirvonen, Y. Takebayashi, J. Spencer. (2019). β-Lactamases and β-Lactamase Inhibitors in the 21st Century. Journal of Molecular Biology, 413 (18), 3472-3500. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2019.04.002.

• Briand, L., Marcion, G., Kriznik, A. et al. A self-inducible heterologous protein expression system in Escherichia coli. Sci Rep 6, 33037 (2016). https://doi.org/10.1038/srep33037