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INFORME TÉCNICO FINAL
PROYECTO SIP 2007 0759
SUSCEPTIBILIDAD ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS DE ARROZ. BIOACTIVOS
PROTEÍNICOS.
DIRECTORA: MC MA. ISABEL CORTÉS VÁZQUEZ.
INVESTIGADORES PARTICIPANTES: MC ROBERTO BRIONES MARTÍNEZ,
ESTUDIANTES PARTICIPANTES: OSCAR JAVIER RAMOS.
Resumen
Se realizó un estudio de la susceptibilidad a la proteólisis de proteínas
obtenidas de arroz Morelos A98 (PA), de sus fracciones proteínicas: albúminas,
globulinas y glutelinas y, comparativamente, de proteínas aisladas de suero
lácteo (PSL). Se analizó el efecto de dos proteasas de diferente especificidad y
origen: tripsina y hemisfericina, ensayando diferentes tiempos de hidrólisis.
Asimismo, con el propósito de conocer las propiedades funcionales de los
productos de reacción generados en la proteólisis se determinaron las
propiedades emulsionante y antioxidante. Los resultados obtenidos mostraron
que las fracciones de proteínas aisladas de arroz presentan diferencias
significativas en su susceptibilidad a la hidrólisis tríptica. Los valores de grado
de hidrólisis para las albúminas, globulinas, glutelinas y del concentrado total de
proteínas del arroz, después de 120 minutos de reacción, fueron 1.9, 11.5, 2.6 y
4.8%, respectivamente. Las globulinas presentaron la más alta susceptibilidad a
la hidrólisis tríptica. Las preparaciones totales PA y PSL, en cambio, resultaron
con bajos de grado de hidrólisis con ambas enzimas (1-2.6%). El análisis de
funcionalidad de los hidrolizados de PSL con hemisfericina mostró la presencia
de péptidos cuya actividad emulsionante (IAE) fue significativamente más alta
que la de los hidrolizados de PA o la de sus fracciones aisladas. Las fracciones
de proteínas del arroz, por otra parte, mostraron muy buenas características de
estabilidad emulsionante. Los niveles de actividad antioxidante (AOX) sobre el
radical 2,2-difenil-1-picril hidracilo (DPPH) generados por los péptidos
contenidos en los hidrolizados con hemisfericina de las PA y de PSL, en
tiempos de reacción cortos (30 min), produjeron un 40% de reducción de la
oxidación; valor que se incrementó hasta 55% para 180 min de proteólisis. Por
otra parte, los productos de los hidrolizados trípticos de las PSL mostraron una
AOX muy baja, 15% aproximadamente. La tripsinólisis de las fracciones
albúminas, globulinas y glutelinas del arroz generó productos de reacción con
buenas características de actividad antioxidante, reduciendo hasta en un 75%
la oxidación del radical DPPH. Mientras que los productos de reacción de los
hidrolizados de proteínas de suero lácteo con la proteasa cisteínica
hemisfericina fueron los que mostraron los mejores niveles de actividad
emulsionante.
Antecedentes.
El arroz que se produce en el Estado de Morelos es ampliamente reconocido
por su alta calidad. Específicamente, su contenido proteínico es de interés
como fuente de péptidos con funcionalidad mejorada: tecnofuncionales y/o
bioactivos, obtenidos por modificación enzimática (proteólisis limitada). La
aplicación de la tecnología enzimática en la hidrólisis de proteínas alimentarias
o de proteínas sub-utilizadas se vuelve una alternativa dentro de la búsqueda
de péptidos funcional cuyas propiedades biológicas, fisicoquímicas, funcionales
y sensoriales puedan ser mejoradas respecto a las de la proteína nativa. Los
estudios de susceptibilidad proteolítica permiten obtener el patrón específico de
los productos de hidrólisis, que constituye una huella de las propiedades
conformacionales de una proteína. Adicionalmente, se plantea la hipótesis de
que, por razones estructurales, resultarán diferentes tanto la susceptibilidad a la
proteólisis como la funcionalidad del contenido proteínico total del arroz y de las
fracciones proteínicas separadas en función de su solubilidad con diferentes
disolventes (globulinas, albúminas, glutelina). Con base en lo anterior, en la
presente propuesta, se realizó un estudio comparativo de la hidrólisis con dos
proteasas de diferente especificidad y origen (tripsina y hemisfericina) a
distintos grados de hidrólisis sobre proteínas obtenidas de arroz. El objetivo de
la presente investigación fue caracterizar la susceptibilidad tríptica y
hemisfericínica, así como la funcionalidad y actividad antioxidante resultante de
la modificación enzimática en las fracciones proteicas aisladas de arroz
variedad Mor-A-98: albúmina, globulina, glutelina.
Metas: a) Identificación de péptidos con propiedades funcionales realzadas,
aislados de fracciones proteínicas sometidas a hidrólisis tríptica y
hemisfericínica. b) Determinar los perfiles de grado de hidrólisis para cada
sistema estudiado de enzima-sustrato. c) Caracterizar mediante electroforesis
los productos de reacción obtenidos a diferentes grados de hidrólisis. d)
Evaluar y comparar las propiedades emulsionante y antioxidante de los
péptidos resultantes durante la hidrólisis enzimática
Materiales y métodos
La muestra de arroz Morelos A-98 de la marca “La Perseverancia de Jojutla” fue
procesada en un molino Tekmar A-10 (Alemania) y tamizada a un tamaño de
partícula de 40 US. La harina ya tamizada fue desengrasada utilizando el
método de Wang et al (1999) con unas modificaciones, en la que se hace uso
de iso-butanol en una relación 1:3 manteniéndolo en agitación durante 30
minutos. Pasado este tiempo se decanta el disolvente y al sedimento se le
añade hexano lo suficiente para cubrirlo y se agita por unos 5 minutos mas, se
vuelve a decantar y el sedimento se deja airear toda la noche. La harina
desengrasada se almacenó a una temperatura de 5ºC.
Extracción de las fracciones peptídicas de arroz. Para la extracción de las
fracciones de proteínas más abundantes (albúmina, globulina y glutelina) se
utilizo el método descrito por Ju et al (2001). Extracción de albúmina (Extracción
acuosa): a la harina ya desengrasada se le adicionó agua destilada a 20ºC en
una proporción de 1:4, y se mantuvo en agitación por 4 horas, fue centrifugadá
a 3000 g x min. (1500 rpm), el sobrenadante obtenido se separó y filtró ya que
ahí se contenía la mayor parte de las fracciones solubles en agua,
principalmente albúmina. Extracción de globulina (Extracción salina): al
sedimento se le añadió una solución de NaCl al 5% (1:4) a 20ºC con agitación
de 4 horas y posteriormente se centrifugó en las mismas condiciones, los
sobrenadantes obtenidos se filtraron. Extracción de glutelina (Extracción
alcalina: de nueva forma al sedimento resultante de la fracción anterior se le
añadió NaOH al 0.02M, 13, (pH 11.0), a 20ºC y solo se agitó por 30 minutos; se
centrifugó y se filtraron su sobrenadantes.
Separación de las proteínas de los extractos Todas las fracciones fueron
precipitadas de los sobrenadantes por el ajuste de pH a valores que
corresponden a sus puntos isoeléctricos (PI). Los valores de pH en que se
obtuvo la precipitación, PIs, fueron determinados tomando muestras de cada
sobrenadante ajustándolas a distintos intervalos de pH (3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5,
6.0, 6.5 y 7.0) los cuales fueron sometidos a centrifugación y se midió la
absorbancia de los sobrenadantes obtenidos a 320 nm. El pH que obtuvo la
menor absorbancia correspondió al PI. El resto del sobrenadante se precipitó al
pH de su punto isoeléctrico y se centrifugó a 10, 000 rpm x minuto y los
sedimentos obtenidos se lavaron con agua destilada dos veces y ajustados a
pH 7.0 y sometidos a congelación. Estos sedimentos se liofilizaron para su
almacenamiento y posterior uso.
Aislamiento de la proteína total de arroz. Para realizar la extracción de las
proteínas de arroz totales se utilizó el método descrito por Sudarat et al (2005),
en el cual se hizo una dilución de harina desengrasada y agua destilada (1:4),
se ajustó el pH a 10.0 agitando constantemente durante 30 minutos a
temperatura ambiente. La mezcla fue centrifugada (HERMLE z 383 k,
Alemania) a 3000 rpm por 30 minutos, se obtuvo el sobrenadante que se
sometió a una precipitación isoeléctrica pH a 5.0 (precipitación isoeléctrica) y se
volvió a centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos. El precipitado fue lavado con
agua (pH 4.5) y se neutralizó para su liofilización.
Suero lácteo. El suero fue proporcionado por el laboratorio de lácteos del
CBTA #8 de Xoxocotla, Mor., este fue procesado en el Laboratorio de Enzimas
Vegetales (Reyes-Nava y Briones-Martínez) para concentrar la proteína por
medio de precipitación térmica a 85ºC y posterior liofilización para su
conservación y uso posterior. Extracción de proteínas de suero lácteo: para
extraer la proteína se utilizó el método desarrollado por Kika et al (2007) con
unas modificaciones, se hicieron dispersiones al 2% del liofilizado y se
desengrasó por agitación a 4ºC. El contenido de proteína soluble fue
determinado con el método de Bradford (1976). La concentración de hizo por
extracción con carboximetil celulosa (CMC) al 2% (p/v); y eluida con regulador
de fosfatos pH 9.0. Se centrifugó a 5000 rpm por 20 minutos y el precipitado fue
lavado dos veces con agua destilada, y se procedió a filtrar con papel filtro
Whatman de poro medio.
Enzimas. Tripsina (Sigma Chemical Co., EUA). Se preparó una solución al
0.4% (p/v) en regulador de fosfatos (0.05M, pH 7.6) para el concentrado de
proteína de arroz y suero lácteo mientras que se utilizó 0.5% para las fracciones
peptídicas. Hemisfericina. Se empleó una preparación de hemisfericina refinada
obtenida en el Laboratorio de Enzimas Vegetales del CeProBi (Briones-
Martínez, et al). Se preparó una solución al 5% (p/v) en regulador de fosfatos
activada con cisteína (1.6M), para las fracciones no se hace comparación con la
enzima hemisfericina y tripsina.
Hidrolizados. Los hidrolizados se prepararon en experimentos por lote, en un
vaso de reacción de 100 ml con doble pared para el control de la temperatura,
acoplado a un titulador automático pH-stat con registro de consumo de NaOH
(0.1N). Las proteínas fueron hidrolizadas a un pH y temperatura constantes de
7.6 y 45ºC con un volumen de reacción de 50 ml. La concentración de enzima
fue de 1% (v/v) con respecto al volumen del sustrato y 10% (v/v) de solución de
tripsina para las fracciones. Los tiempos de hidrólisis fueron de 15, 60, 180 y
360 minutos para cada sistema E/S y 0, 10, 30, 60 y 120 minutos para las
fracciones, de cada tiempo de hidrólisis se tomo una alícuota de 8µl para su
caracterización electroforética.
Método de Bradford. Este método determina el contenido de proteína soluble
en una solución y consiste en la formación de un compuesto de adsorción de
coloración azul entre los residuos de aminoácidos básicos de las proteínas y el
colorante Azul Coomassie. Absorbe luz a 595 nm, los límites para la
determinación de proteína están entre 1 y 10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4
mg/ml (ensayo estándar) y la intensidad de absorción depende del contenido de
aminoácidos básicos y aromáticos. El reactivo de Bradford es preparado de la
siguiente manera. Primero, se obtiene una solución concentrada que incluye
100 mg de azul de Coomasie G-250 (SIGMA Chemical Co., EUA) con 50 ml de
etanol al 95% y 100 ml de ácido fosfórico al 65% pureza de 85%, se
homogeniza y se afora posteriormente a 1 L con agua desionizada.
El procedimiento consiste en hacer reaccionar 100 µl del sobrenadante de las
dispersiones de las proteínas con 2 ml del reactivo de Bradford, agitar
brevemente en un vortex, dejar reposar durante 5 min y leer a 595 nm, en un
espectrofotómetro (SHIMADZU UV-160) utilizando como blanco 2ml de reactivo
de Bradford mas 100 µl de agua. Los análisis se realizaron por triplicado. Las
absorbancias obtenidas se comparan con una curva tipo para calcular el
contenido de proteína soluble, ésta se preparó utilizando como referencia
albúmina de suero bovino (BSA) en una concentración de 2.5 mg/10 ml de agua
destilada desionizada.
Electroforesis en gel de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes
(SDS). La electroforesis en poliacrilamida es un método sensible, rápido y
económico para evaluar el patrón de proteínas contenido en una muestra, el
número de especies proteínicas, sus pesos moleculares y la concentración. Se
requieren cantidades pequeñas de muestra del orden de microgramos de
proteína. Se colocan alícuotas de 8 microlitros de muestra en 8 microlitros de
regulador (1M tampón Tris-HCl pH 0.6, glicerol al 50% (v/v), SDS 10% (p/v),
azul de bromofenol y agua destilada). Previamente las soluciones de proteínas,
se someten a temperaturas de ebullición durante dos minutos, y las muestras
así tratadas se aplican a geles verticales de poliacrilamida (13 al 15%
dependiendo de los tamaños moleculares ensayados), siguiendo el método
descrito por Laemmli (1970). La electroforesis se llevo a cabo en una cámara
Mini PROTEAN 3 Cell (BIO-RAD Lab. Inc., EUA). Se utilizo como referencia de
pesos moleculares, el marcador BenchMark Prestained (Invitrogen, EUA). Los
geles se tiñeron durante 15 minutos a temperatura ambiente en solución
fijadora constituida por ácido acético al 10% (v/v), azul de Coomassie R-250
(SIGMA Chemical Co., EUA), metanol al 40% (v/v) y agua destilada. El exceso
de colorante se retiró con una solución desteñidora a base de agua, ácido
acético al 10% (v/v) y metanol al 40% (v/v); haciendo varios cambios de esta
solución hasta que pueden definirse las bandas de los geles.
La distancia recorrida por las bandas proteínicas del marcador de pesos
moleculares conocidos se utiliza como referencia para la elaboración de la
curva de pesos moleculares con la que se determina (por medio de regresión
lineal) el peso correspondiente a las especies que se separan
electroforéticamente.
Propidades funcionales
Indice de Actividad Emulsionante (IAE). Las propiedades emulsionantes de
los hidrolizados se determinaron mediante el método de Pearce y Kinsella
(1978), con ciertas modificaciones. Las muestras se prepararon con aceite de
maíz puro (La Gloria, CORFUERTE; México) en una relación 1:3
(aceite/muestra). La mezcla fue dispersada en una batidora de uso casero
(Princess 2052, China) a velocidad 1 durante 1 minuto. Inmediatamente
después de la homogeneización se tomaron cuidadosamente del fondo del
recipiente, alícuotas de 0.25 ml y se diluyeron con 5 ml de una solución de
dodecil sulfato de sodio (SDS) al 2% en regulador de fosfatos pH 7.6 0.05 M.
Finalmente se midió la absorbancia de las emulsiones diluidas contra un blanco
de regulador a 500 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu 250). Las
lecturas de absorbancia fueron utilizadas para calcular el índice de Actividad
Emulsionante utilizando la fórmula definida por Pearce y Kinsella. Los análisis
fueron realizados por triplicado. El índice de Actividad Emulsionante (IAE) se
determina por la siguiente formula:
Donde:
A500= es la absorbancia a 500 nm; Φ= volumen de la fracción de la fase
oleosa.; l= paso de luz.; C= peso de la proteína por unidad de volumen de la
fase acuosa antes de la emulsión.
Estabilidad emulsionante (EE).
La estabilidad relativa de las emulsiones preparadas en este estudio se siguió
en emulsiones preparadas mediante el método de Pearce y Kinsella, de las
cuales se tomaron alícuotas de 0.25 ml a tiempos de 0, 1, 3, 5 y 10 minutos
después de la homogeneización, se diluyeron en 5 ml de dodecil sulfato de
sodio (SDS) 2% y se leyeron las absorbancias a 500 nm. Los análisis fueron
realizados por triplicado.
Actividad antioxidante. La propiedad con implicaciones e actividad biológica o
bioctividad que se midió fue la de actividad antioxidante (AOX) del radical
DPPH. Se utilizó el método descrito por Von Gadow et al (1997) con algunas
modificaciones. Se preparó una solución metanólca de DPPH (2,2- difenil- 6-
picrilhidrazilo). Este es un método colorimétrico que se basa en que el DPPH
tiene apariencia en su forma oxidativa que es de color púrpura, pero al ser
reducido en presencia de un antioxidante cambia a un color amarillo (Figura 4 y
5). Para este método se preparo una solución 0.1 mM de DPPH (SIGMA
Chemical Co., EUA) en metanol al 100%. La reacción se efectuó agregando la
solución de DPPH a las muestras de los hidrolizados en una relación 1:1, la
mezcla fue agitada vigorosamente en un vortex (Genie 2, EUA) y
posteriormente se mantuvo en reposo durante 30 minutos en la oscuridad, al
finalizar este tiempo se leyó el sobrenadante a 517 nm. Se utilizo metanol como
blanco y la solución de DPPH al tiempo cero como testigo. Los análisis se
realizaron por triplicado.
Resultados y discusión
Aislamiento de la proteína total de arroz Mor A-98.- Efecto del pH.
(Sudarat,2005). Previa extracción de lípidos, las preparaciones proteínicas
obtenidas se sometieron a varios lavados en medio alcalino, a pH 10.0, en el
cual se obtuvo una primera preparación, en una segunda etapa se precipitó
por su punto isoeléctrico a las fracciones de interés con base en el mejor
rendimiento, el cual se obtuvo a pH de 5.0 como se observa en la figura 1.
Figura 1. Patrón electroforético de los precipitados isoeléctricos de proteína obtenidos del arroz Variedad Morelos A-98. M, marcador (M), valores de pH .
Caracterización electroforética de las proteínas de arroz en diferente etapas
de su aislamiento. En la figura 2, se muestra el patrón electroforético de las
proteínas totales de la variedad de arroz A-98, con y sin tratamiento (columnas
5 y 6), entre las que se encuentra una mayor proporción de especies de peso
molecular menor a 15 kD, en segundo lugar aparecen proteínas de peso
molecular de 20 y 60 kD. Se puede observar en las columnas 2 y 4 que los
sobrenadantes que resultan de la precipitación isoeléctrica presentan una
buena cantidad de proteína de 15 kD.
Figura 2. Caracterización electroforética de las proteínas de arroz. M marcador, 1 extracción alcalina, 2 precipitación isoeléctrica, 3 segunda extracción alcalina, 4 segunda precipitación isoeléctrica, 5 y 6 primero y segundo concentrado de proteínas respectivamente.
Grado de hidrólisis (GH) tríptica. La acción catalítica de la tripsina se observó
en mayor medida sobre la fracción de globulinas, lo que indica una mayor
susceptibilidad de su estructura al efecto de esta enzima de origen animal. Se
observaron grados de hidrólisis (GH) de 1.95, 11.47, 2.63 y 4.81 para albúmina,
globulina, glutelina y concentrado de proteína de arroz, respectivamente
(Figura. 3)
Figura 3. Hidrólisis tríptica de las proteínas de la variedad de arroz Morelos A-98: concentrado (CPA) y fracciones albúmina, globulina y glutelina. Comparativo de los perfiles de grado de hidrólisis (GH).
Identificación por electroforesis de los péptidos resultantes de las proteínas de arroz sometidas a hidrólisis tríptica y hemisfericínica. En los patrones electroforéticos (Figura 4) se observa la ausencia de los
péptidos de 25 kD (testigos, 1,3,5,7 y 9 ) con la aparición de bandas de péptidos
de bajo peso molecular en los carriles 8 y 6, correspondientes a los tiempos de
hidrólisis más largos, 180 y 360 minutos respectivamente. La desaparición de
las fracciones es un primer indicador de la susceptibilidad enzimática de las
proteínas de arroz a la acción de la hemisfericina, a diferencia de las fracciones
obtenidas en los sistemas hemisfericina/lactosuero, tripsina/lactosuero y
tripsina/arroz que se muestran como comparativo.
Figura 4. Electroforesis en gel de poliacrilamida (14%) de los hidrolizados de proteínas de arroz y de suero lácteo. A: proteínas de suero lácteo- tripsina, B: proteínas de suero lácteo- hemisfericína, C: proteínas de arroz- tripsina y D: proteínas de arroz- hemisfericína. M representa la línea de marcadores moleculares; 1: la muestra sin hidrolizar; 2: 15 min de hidrólisis; 3: testigo 15 min; 4: 60 min de hidrólisis; 5: testigo 60 min; 6: a 180 min de hidrólisis; 7: testigo de 80 min; 8: 360 min de hidrólisis; y 9: testigo de 360 min.
Indice de actividad emulsionante y estabilidad de la emulsión.
Se determinó la capacidad emulsionante de los hidrolizados hemisfericínicos
obtenidos con las proteínas totales de arroz y con sus diferentes fracciones,
albúmina, glutelina y globulina, medida como el Indice de actividad
emulsionante IAE (Figura 5-A). La estabilidad de las emulsiones ensayadas
(EE) se analizó de forma comparativa para los hidrolizados de arroz /
hemisfericina y las fracciones de proteínas del arroz, los valores de IAE más
altos correspondieron al hidrolizado de globulina; los hidrolizados de albúmina,
no obstante presentar valores de IAE menores, tuvieron una buena estabilidad
en el mismo tiempo probado (Figura 5B).
Figura 5-A. Índice de actividad emulsionante de los hidrolizados enzimáticos. A: arroz, S: suero, T: tripsina, H: hemisfericina; 15, 30, 60, 120, 180 y 360: tiempo de hidrólisis (min).
Figura 5B. Estabilidad emulsionante de los hidrolizados con hemisfericina de proteína total de arroz y de sus fracciones proteínicas albúmina, globulina y glutelina. A: arroz; H: hemisfericina; 15, 60, 180 y 360: tiempo de hidrólisis (min).
Los hidrolizados trípticos de proteínas de arroz presentaron un comportamiento
similar. En la figura 6 se resumen los valores de capacidad y estabilidad
emulsificante,como resultado de la acción de la hemisfericina y de tripsina sobre
los diferentes aislados de arroz; se observó que la hemisfericina modificó en
mayor medida esta propiedad funcional, que la tripsina.
Figura 6. Estabilidad emulsionante de los hidrolizados enzimáticos de arroz con tripsina y hemisfericina. A: arroz; T: tripsina; H: hemisfericina; 15, 60, 180 y 360: tiempo de hidrólisis (min)
Actividad antioxidante (AOX). Se utilizó el aditivo antioxidante comercial ácido
ascórbico como referencia (100%), se observó que los hidrolizados de albúmina
de arroz presentaron un mayor porcentaje de efecto antioxidante sobre DPPH.
Con un 80% de AOX, los hidrolizados hemisfericínicos de las albúminas de
arroz mostraron el mejor efecto antioxidante a un tiempo de reacción de 120
minutos. Los hidrolizados de las proteínas totales de arroz mostraron una AOX
menor al 50%, con un porcentaje mayor para los obtenidos con hemisfericina a
un tiempo de hidrólisis de 180 minutos que para los hidrolizados trípticos ( 30
%) al mismo tiempo de reacción. (Figura 8)
Figura 8. Actividad antioxidante de los hidrolizados de proteínas de suero lácteo y de las fracciones albúmina, globulina y glutelina de arroz. Ac. Asc.: ácido ascórbico.
Los datos informados confirman el cumplimiento de las metas propuestas con la
separación de tres fracciones de arroz variedad A-98, albúminas, glutelinas y
globulinas. Se comprobó que el modo de acción de la tripsina y la hemisfericina
es diferente dependiendo del sustrato utilizado: la susceptibilidad enzimática de
cada tipo de fracción proteica está relacionado con la modificación estructural
que se refleja en las propiedades funcionales analizadas. Los hidrolizados con
hemisfericina tuvieron una buena estabilidad emulsionante en comparación con
los hidrolizados trípticos. La actividad antioxidante de los hidrolizados
generados por hemisfericina fue mejor para los hidrolizados de albúmina con un
80% de AOX.
El impacto de los resultados es en el avance acerca del conocimiento de la
susceptibilidad a la proteólisis de las diferentes fracciones de proteínas que
contiene el arroz, como preparación total y como especies independientes, y en
cuanto a que dichos conocimientos son la base tecnológica de una estrategia
para producir péptidos a partir de proteínas de arroz con propiedades
funcionales de interés práctico.
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