Post on 14-Apr-2015
INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO(CROSSLINKING)
Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO(CROSSLINKING)
Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL
RESIDUOS ÁCIDOS (Glu, Asp)
OH
O
N C N RRO
O HN
NR
RNH2R
NH
O
R
O
O
R
OH
O
OH
O
R-OH
BF3.OEt
OH
O
SO3
NO
Et
Reactivo K deWoodward
O
O
OHN
Et
SO3
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MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL
LISINA
NH2
NO2
NO2O2N
SO3
NH
O2N
O2N
NO2TNBS
NH2
O C N K
NHNH2
O
NH2
N
OH
OH
CH3
OP
O
HOHO
N
N
H
CH3
OH
OP
O
HOOH
PLP
HISTIDINA
N NH
O O
O
O
O
EtEt
N NO
O
Et
ARGININA
HN NH2
NH
RR
O
O N N
NH
RR
fenilglioxal, butanodiona
CISTEÍNA
SH
I
O
OR
S
O
OR
N
O
O
Et
SH SN
O
O
Et
SH S
CO2H
O2N
S
CO2H
NO2
S
CO2H
NO2
SDTNB
METIONINA
SCH3
[O]
SCH3
O
SCH3
O
[O][O]
OI
O
OR
S
O
OR
CH3
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MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL
TIROSINA
OHTNM
NO2
NO2NO2
O2N
OH
NO2
SERINA
OH
F P
O
OROR
O P
O
OROR
F P
O
ORR
OH O P
O
ORR
TRIPTÓFANO
HN
NBS
HN
Br
[O]
HN
O
dimerizacíon, ruptura anillo
[O]
luz, O2
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Modificaciones unipuntuales de interésObjetivo: hacer a la enzima insoluble en disoluciones acuosas.Uno de los métodos más tradicionales: UNIÓN COVALENTE DE UN POLÍMERO ANFIPÁTICO.El más habitual: monometoxipolietelienglicol (mPEG)
OMeO O
OOH
nPeso molecular variable. El mas usado: sobre 5 kDa.Dependiendo del grado de modificación, se consigue la total insolubilidad en agua.Este grado debe ser controlado cuidadosamente, pues puede conducir a la pérdida de actividad.La unión se suele hacer sobre lisinas.
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Uno de los más empleados.A través de TCT (cloruro cianúrico)Debe controlarse bien
Copolímero con anh. succínicoEnlace amida estable
A través de un carbamatoSe sigue fácilmente la activación.
Oxidación del mPEGSe activa el grupo ácido con N-hidroxisuccinimda.
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Otra característica interesante de esta metodología:
SE OBTIENEN DERIVADOS SOLUBLES EN CIERTOS DISOLVENTES ORGÁNICOS:
Benceno, tolueno y clorados (cloroformo, 1,1,1-tricloroetano, tricloroetileno)
LA CATÁLISIS SE HACE HOMOGÉNEA.
Inmovilización en disolventes orgánicos?Siempre que se pueda recuperar el derivado.Recuperación:
Añadiendo disolv. muy apolares (hexano, éter de petróleo) se produce la pptación.
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INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO(CROSSLINKING)
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H
O
H
O
Glutaraldehido
NH2
NC
O
NC
O
hexametilenbisisocianato
NH2
N
O
O
N
O
O
N,N-hexametilen-bismaleimidaSH
O On
bis-oxiranos
NH2
OH
n
NH2
MeO
NH2
OMe
bisimidatos
NH2
O
I
HN
NH
I
O
hexametilenbisiodoacetamida
SH
N NNN
SO3
O3S
2,2'-disulfonato de bisdiazobencidina
OH
SO O
divinilsulfonaNH2
SH
F
F
NO2
NO2
NH2
OH
N
N
N
Cl
ClCl
NH2
OH
OH
SS ClCl
O
O O
ONH2
REACTIVOS ENTRECRUZANTESDIFUNCIONALES
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Cross-Linked Enzyme Crystals
Cross-Linked Enzyme Aggregates
Crosslinked Spray-Dried Enzymes
Cross-Linked Enzymes
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Cross Linked Enzymes (CLE)
A comienzos de los años 60 se describe por primera vez que el tratamiento de enzimas con reactivos difuncionales (fundamentalmente glutaraldehído) originaba derivados insolubles con retención de actividad (CLEs)
Al mismo tiempo, se aumentaba la termoestabilidad (sobre todo en enzimas multiméricas), pero se necesitan unas condiciones muy delicadas (cantidad crosslinker, T, pH, fuerza iónica).
El material obtenido era gelatinoso, y se intentó el entrecruzamiento con otras moléculas para aumentar propiedades mecánicas,
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Centro activo
Enzima nativa
Enzima desplegada(desnaturalizada)
Enzima estabilizada por un entrecruzamiento
intramolecular
ENTRECRUZAMIENTO INTRAMOLECULAR
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Cross Linked Enzyme Crystals (CLECs)
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Proceso de cristalización
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Entrecruzamientosmás habituales
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Ventajas 1. Mayor actividad por unidad de volúmen (partículas uniformes, microporosas,
formadas por sólo moléculas de enzima pura, lo que implica la máxima posible concentración de enzima)
2. Gran actividad específica3. Fácil separación del medio de reacción, lo que facilita su reutilización.4. Buenas propiedades mecánicas y termoestabilidad, así como resistencia a
disolventes orgánicos.5. No producen contaminación medioambiental.6. No requieren soportes muy caros7. Resistentes a la proteolisis
Desventajas
1. Dificultad de cristalización2. Problemas de difusión (debe miminizarse el tamaño del cristal)3. Alto precio
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CLECS
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CLECS
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Cross Linked Enzyme Agreggates (CLEAs)
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POSIBILIDADESPOSIBILIDADES
CLECsCLECs
Enzimas puras y cristalinasEnzimas puras y cristalinas
Necesidad de enzima puraNecesidad de enzima pura
Estabilización de proteinas Estabilización de proteinas multiméricasmultiméricas
CLEAsCLEAs
Enzimas con trazas de impurezasEnzimas con trazas de impurezas
Coagregación de enzimasCoagregación de enzimas
Agregación de enzima y polímeroAgregación de enzima y polímero
Estabilización de enzimasEstabilización de enzimasmultiméricasmultiméricas
Crosslinked Enzyme Crystals Crosslinked Enzyme Aggregates
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CLEAsCLEAs
ESQUEMA DE CLEAsESQUEMA DE CLEAs
entrecruzante
+ + precipitanteprecipitante
PEGPEGSales, disolventesSales, disolventes
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rápido lento
Muy lento
Enzima multiméricaEnzima disociada
(reversible)
Enzima desnaturalizada
(irreversible)
Enzima multimérica entrecruzada
Enzima desnaturalizada entrecruzada(irreversible)
ENTRECRUZAMIENTO INTERMOLECULAR
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INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN
Es el método más sencillo y antíguo (células de acetobacter
adsorbidas sobre palos de madera para obtener vinagre por
fermentación-1815)Se puede emplear tanto para células como para enzimas.Las fuerzas de unión son débiles:
Van der WaalsInteracciones iónicasEnlaces de hidrógeno.
Se producen fácilmente desorciones debido a:variaciones concentración de sustrato.Cambios de pHcambios de Talteración de la fuerza iónica.
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INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN
Soportes típicos:carbón activosílice, alúmina, titania, ...Tierra de diatomeas (Celite)celulosaresinas sintéticasCPG (controlled pore glasses).
La mayoría de las enzimas se unen mejor a soportes polaresLas lipasas se unen mejor a superficies hidrofóbicasMÉTODO MUY RECOMENDADO PARA ENZIMAS EN
DISOLVENTES ORGÁNICOS (NO DESORCIÓN)
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INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN
Unión iónica es bastante habitual.Se usan a nivel industrial resinas intercambiadoras :
catiónicascarboximetilcelulosaamberlite IRA
aniónicasdietilaminoetilcelulosa (DEAE-celulosas)resinas Sephadex
Se precisa un exquisito control del pH de la inmovilización :
Coherencia con la carga neta enzimática como consecuencia del
pKa.
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INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN
Metodologías empleadas:métodos en batch
ayuda de precipitación (ej acetona, isopropanol)métodos en columna
plug flowlecho fluidizado
REGLA DEL DIÁMETRO DE GIRO (spin diameter)
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EHN
O
O
O
HN
(S) (R)
O
O
O
HN
(R) (S)
OH
O
+