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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
IDENTIFICACIÓN ESTRUCTURAL DE COMPUESTOS
MAYORITARIOS EN PLANTAS SILVESTRES DE
Castilleja tenuiflora Benth Y SU ACUMULACIÓN EN
CULTIVOS DE RAÍCES in vitro.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTORADO EN CIENCIAS
EN
DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
PRESENTA
YENNY ADRIANA GÓMEZ AGUIRRE
DIRECTORES
GABRIELA TREJO TAPIA
ALEJANDRO ZAMILPA ALVAREZ
Yautepec, Morelos, México Diciembre 2011
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Células Vegetales del
Departamento de Biotecnología del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del
Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra. Gabriela Trejo Tapia y en el
Centro de Investigación Biomédica del Sur del Instituto Mexicano del Seguro Social,
bajo la dirección del Dr. Alejandro Zamilpa Alvarez.
Para la realización de los estudios se contó con el apoyo económico del Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) (No. becario: 215309) y del Programa
Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) de la Secretaría de investigación
y Posgrado (SIP) del IPN. La investigación fue realizada con el financiamiento
otorgado a los proyectos de la SIP (No. 20090311, 20100308 y 20110153) y del
CONACyT (Proyecto No.100202).
AGRADECIMIENTOS
Expreso sinceros agradecimientos a:
A mis directores:
Dr. Gabriela Trejo Tapia. Investigadora del Departamento de Biotecnología. Centro
de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi) – Instituto Politécnico Nacional (IPN).
Dr. Alejandro Zamilpa Alvarez. Investigador del Centro de Investigación Biomédica
del Sur (CIBIS) - Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS).
Al comité tutorial y revisor:
Dr. Antonio Ruperto Jiménez Aparicio. Investigador del Departamento de
Biotecnología. CeProBi-IPN.
Dra. Kalina Bermúdez Torres. Investigadora del Departamento de Biotecnología.
CeProBi-IPN.
Dr. Federico Castrejón Ayala. Investigador del Departamento de Interacciones
Planta-Insecto. CeProBi-IPN.
Dra. Elsa Ventura Zapata. Investigadora del Departamento de Biotecnología.
CeProBi-IPN.
Dr. Mario Rodríguez Monroy. Investigador del Departamento de Biotecnología.
CeProBi-IPN.
Dr. Manasés González Cortazar. Investigador del CIBIS-MSS.
A mis compañeros y profesores del CeProBi y del CIBIS.
CONTENIDO
Páginas
ÍNDICE DE CUADROS i
ÍNDICE DE FIGURAS iii
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS v
RESUMEN vi
ABSTRACT vii
1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................1
2. ANTECEDENTES..................................................................................................3
2.1. Castilleja tenuiflora y su importancia en la medicina tradicional Mexicana .................... 3
2.2. Estudios de fitoquímica y actividades biológicas del género Castilleja .......................... 6
2.3. Iridoides glucosilados .................................................................................................. 11
2.3.1. Biosíntesis de los iridoides glucosilados ................................................................... 12
2.3.2. Actividad biológica de los iridoides glucosilados....................................................... 16
2.4. Feniletanoides glicosilados ......................................................................................... 17
2.4.1. Biosíntesis de los feniletanoides glicosilados ........................................................... 18
2.4.2. Actividades biológicas de los feniletanoides glicosilados .......................................... 21
2.5. Cultivos in vitro de raíces ............................................................................................ 22
2.6. Cultivos de órganos in vitro como fuente de iridoides glucosilados y feniletanoides
glicosilados ........................................................................................................................... 23
2.7. Antecedentes sobre el cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora .................................. 25
3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................. 26
4. OBJETIVOS ........................................................................................................ 27
4.1. Objetivo general .......................................................................................................... 27
4.2. Objetivos específicos .................................................................................................. 27
5. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 28
5.1. Material vegetal silvestre ............................................................................................. 28
5.2. Evaluación de protocolos de extracción ...................................................................... 29
5.3. Cromatografía de capa fina (CCF) .............................................................................. 29
5.4. Análisis cromatográfico del extracto metanólico de tallo de C. tenuiflora. .................... 31
5.4.1. Purificación de la fracciones T19 y T22 .................................................................... 33
5.5. Análisis cromatográfico del extracto metanólico de raíces de C. tenuiflora.................. 34
5.5.1. Obtención de la fracción acetónica de raíces ........................................................... 34
5.5.2. Fraccionamiento de la fracción acetónica (F3) de raíces .......................................... 34
5.5.2.1. Purificación de las fracciones C1 obtenidas de la fracción acetónica del extracto metanólico
de raíces silvestre de C. tenuiflora ......................................................................................................... 36
5.5.2.2. Purificación de las fracciones C2 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces
silvestre de C. tenuiflora ......................................................................................................................... 37
5.5.2.3. Purificación de la fracción C3 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces
silvestre de C. tenuiflora ......................................................................................................................... 38
5.5.2.4. Purificación de la fracción C4 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces
silvestre de C. tenuiflora ......................................................................................................................... 39
5.6. Cuantificación de aucubina ......................................................................................... 40
5.7. Cuantificación de verbascósido e isoverbascósido ...................................................... 41
5.8. Cuantificación de apigenina ........................................................................................ 42
5.9. Inducción de raíces adventicias y cultivo in vitro de C. tenuiflora ................................ 43
5.10. Determinación de parámetros cinéticos .................................................................... 44
5.11. Análisis estadístico .................................................................................................... 45
6. RESULTADOS .................................................................................................... 46
6.1. Evaluación de protocolos de extracción ...................................................................... 46
6.2. Identificación de apigenina en tallos silvestres de C. tenuiflora ................................... 48
6.3. Identificación de aucubina y bartsiósido en tallos silvestres de C. tenuiflora ............... 48
6.4. Identificación de feniletanoides glicosilados en raíces silvestres de C. tenuiflora ........ 50
6.5. Cuantificación de aucubina, verbascósido, isoverbascósido y apigenina en plantas
silvestres ............................................................................................................................... 63
6.6. Inducción de raíces adventicias y cultivos in vitro de C. tenuiflora ............................... 64
6.7. Cuantificación de aucubina, verbascósido e isoverbascósido en cultivos in vitro de
raíces adventicias de C. tenuiflora ........................................................................................ 68
7. DISCUSIÓN ......................................................................................................... 71
8. CONCLUSIONES ................................................................................................ 76
9. PERSPECTIVAS ................................................................................................. 77
10. LITERATURA CITADA ....................................................................................... 78
ANEXO 1. Espectro de RMN 1H (400 Hz) del bartsiósido (fracción T19b) 89
ANEXO 2. Espectro de RMN 1H (400 Hz) de la aucubina (fracción T22a) 90
ANEXO 3. Espectro de 1H–1H NOESY (400 Hz) del verbascósido 91
ANEXO 4. Espectro de 1H–13C HSQC (400 Hz) del verbascósido 92
ANEXO 5. Espectro de RMN 1H (300 Hz) de compuestos aislados
de la fracción C4R2 (posible feniletanoide glicosilado) 93
ANEXO 6. Espectro de RMN 1H (300 Hz) de compuestos aislados
de la fracción C4R4 (posible feniletanoide glicosilado) 94
ANEXO 7. Cromatograma de HPLC del extracto metanólico del
tallo de C. tenuiflora 95
ANEXO 8. Artículo publicado con los resultados de la presente tesis 96
i
ÍNDICE DE CUADROS
Páginas
1. Usos y forma de preparación de C. tenuiflora en la medicina
tradicional
5
2. Iridoides glucosilados identificados en el género Castilleja 7
3.
Feniletanoides glicosilados y ácidos fenólicos identificados en el
género Castilleja
10
4.
Cultivos de raíces peludas y células en suspensión que producen
verbascósido
24
5. Peso fresco y peso seco de cada órgano de la planta silvestre de C.
tenuiflora
28
6. Fraccionamiento cromatográfico del extracto metanólico de tallos
silvestres de C. tenuiflora
33
7. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción acetónica del extracto
metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora
36
8. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C1 obtenidas de la
fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C.
tenuiflora
37
9. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C2 de la fracción
acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora
38
10. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C3 de la fracción
acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora
39
ii
11. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C4 de la fracción
acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora
40
12. Sistema de elución utilizado en la separación de iridoides
glucosilados por HPLC
41
13. Sistema de elución utilizado en la separación de feniletanoides
glicosilados por HPLC
42
14. Sistema de elución utilizado en la separación de apigenina por HPLC 43
15. Valores de desplazamiento químico del protón (δ, ppm) de aucubina
(CD3OD)
49
16. Valores de desplazamiento químico del protón (δ, ppm) de bartsiósido
(CD3OD)
50
17. Valores de desplazamiento químico del protón y carbón (δ, ppm) de
verbascósido e isoverbascósido (CD3OD)
52
18. Concentración de aucubina, feniletanoides y apigenina en los
diferentes órganos de plantas silvestres de C. tenuiflora
64
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Páginas
1. Castilleja tenuiflora 4
2. Iridoides 12
3.
Propuesta de ruta de biosíntesis de iridoides glucosilados para
Scrophularia umbrosa (a), Buddleya albiflora (b), Antirhinum majus (c)
y Scrophularia racemosa (d)
14
4. Estructura general de los feniletanoides 18
5. Propuesta de ruta de biosíntesis de los feniletanoides glicosilados en
Olea europea (Oleaceae) y Cintasche deserticola (Orobanchaceae)
20
6.
Obtención de la fracción de acetato de etilo de tallo (F2) y aislamiento
de flavonoide (T9) e iridoides glucosilados (T19b y T22a)
32
7.
Resumen del proceso de purificación del extracto metanólico de
raíces de C. tenuiflora
35
8. Cromatografia en capa fina de extractos metanólicos (por 24 h) e
infusiones de C. tenuiflora
46
9. Cromatografía en capa fina de extractos metanólicos de plantas
silvestres de C. tenuiflora
47
10.
Cromatografía en capa fina de compuestos aislados del tallo (Luz UV
365 nm)
48
11. Estructura química de aucubina y bartsiósido aislados de tallos
silvestres de C. tenuiflora
49
12.
Estructuras químicas de los feniletanoides glicosilados: verbascósido
e isoverbascósido aislados de raíces silvestres de C. tenuiflora
51
iv
13.
Espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD) del verbascósido aislado del
extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora
53
14.
Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la
secuencia de espines de la glucosa
57
15. Expansión del espectro COSY junto a la estructura del verbascósido
mostrando la secuencia de espines de la ramnosa
58
16. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la
secuencia de espines de la aglicona
60
17. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la
secuencia de espines del anillo benceno éstos compuestos fenólicos
61
18. Espectro del 13C y expansión del espectro HMBC junto a la estructura
del verbascósido mostrando la unión del carbono C-9 del ácido
cafeico con el hidrogeno H-4 de glucosa
62
19. Expansión del espectro HMBC del verbascósido mostrando la unión
del carbono e hidrogeno de glucosa y ramnosa
63
20. Inducción de raíces adventicias in vitro de C. tenuiflora 65
21. Morfología de las raíces adventicias de C. tenuiflora cultivadas in vitro 66
22. Cinética del cultivo de raíces adventicias de C. tenuiflora en medio
líquido B5 suplementado con 10 M de AIA, ANA ó sin regulador de
crecimiento (control)
67
23. Cromatogramas de CLAR (detección a los 330 nm) de extractos
metanólicos de C. tenuiflora
69
24. Producción de feniletanoides glicosilados en raíces adventicias de C.
tenuiflora cultivadas en medio líquido B5 suplementado con AIA, ANA
ó SRC
70
v
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
AIA Ácido indol 3-acético
ANA Ácido -naftalenacético
BF Biomasa fresca
BS Biomasa seca
CCF-FN Cromatografía en capa fina en fase normal
CCF-FR Cromatografía en capa fina en fase reversa
CLAR-FR Cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa
COSY Correlation spectroscopy
δ Desplazamiento químico
d Día
FG Feniletanoides glicosilados
IG Iridoides glucosilados
HMBC Heteronuclear multiple bond correlation
HSQC Heteronuclear single quantum correlation
MS Metabolitos secundarios
NOESY Nuclear overhauser effect spectroscopy
Rf Factor de retención
RMN 1H Resonancia magnética nuclear de protón
RMN 13C Resonancia magnética nuclear del isótopo de carbono
rpm Revoluciones por minutos
TFA Trifluoracetic acid
td Tiempo de duplicación
µ Velocidad específica de crecimiento (días-1)
W/m2 Vatios por metro cuadrado
vi
RESUMEN
En este estudio, por primera vez se identificaron el verbascósido e isoverbascósido
como los principales feniletanoides glicosilados (FG) en plantas silvestres de
Castilleja tenuiflora. Se identificaron dos iridoides glucosilados (IG) aucubina y
bartsiósido, así como el flavonoide apigenina. Se ha demostrado la actividad
biológica de esos compuestos, como anti-inflamatoria, antioxidante y citotóxica, que
pueden estar relacionadas con los usos tradicionales de esta planta. Se desarrolló
una metodología de separación por cromatografía líquida de alta resolución en fase
reversa (CLAR-FR) para analizar FG e IG. Se determinó su concentración en
diferentes tejidos de plantas silvestres. El verbascósido se acumuló principalmente
en raíces e inflorescencias (9.23 y 7.88 mg g-1 de biomasa seca (BS),
respectivamente), mientras que el isoverbascósido se acumuló principalmente en las
raíces (7.13 mg g-1 BS). Se estableció el cultivo de raíces adventicias in vitro, en el
que las raíces se cultivaron en medio B5 con 10 M de ácido indol 3-acético (AIA) ó
10 M de ácido α-naftalenacético (ANA). El mayor rendimiento de biomasa seca fue
con la auxina AIA a los 30 días (30 g L-1), éste valor fue de 1.5 y 2.3 veces más alto
(P <0,05) que lo obtenido en un medio con ANA o sin regulador de crecimiento
(control), respectivamente. Los mayores rendimientos específicos de FG también se
obtuvieron utilizando esta auxina; el máximo nivel de verbascósido fue 14.62 mg g-1
BS (438.6 mg L-1) a los 30 días de la cinética y el máximo rendimiento de
isoverbascósido fue de 37.32 mg g-1 de BS (522.48 mg L-1) a 23 días de la cinética.
El cultivo de raíces adventicias in vitro de C. tenuiflora es un sistema prometedor
para que en futuros estudios se amplíe el conocimiento sobre la biosíntesis de los
feniletanoides glicosilados.
vii
ABSTRACT
In this study, we identified for the first time verbascoside and isoverbascoside as the
major phenylethanoid glycosides (PhGs) in wild plants of C. tenuiflora. These
compounds have proven biological activities, including anti-inflammatory, antioxidant,
and cytotoxic activities, which may be related to the traditional uses of this plant. We
developed a reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC)
procedure to analyze PhGs, and determined their concentrations in various different
tissues of wild plants. Verbascoside accumulated mainly in roots and inflorescences
(9.23 and 7.88 mg g-1 dry biomass, respectively), while isoverbascoside accumulated
mainly in the roots (7.13 mg g-1 dry biomass). To provide an alternative source of
material for production of bioactive compounds, we established in vitro adventitious
root cultures in which roots were grown in B5 medium containing either 10 M indole
3-acetic acid (IAA) or 10 M -naphthaleneacetic acid (NAA). The greatest dry
biomass yield (30 g L-1) was achieved at 30 days after transfer of roots into IAA-
containing medium. The highest specific yields of PhGs were also obtained using this
auxin; the maximum level of verbascoside was 14.62 mg g-1 dry root biomass (438.6
mg L-1) at 30 days after root transfer, and the maximum yield of isoverbascoside was
37.32 mg g-1 dry root biomass (522.48 mg L-1) at 23 days after root transfer.
Adventitious root cultures of C. tenuiflora are a promising system for further studies
on scale-up and phenylethanoid glycosides biosynthesis.
1
1. INTRODUCCIÓN
Castilleja tenuiflora Benth. (Oronbachaceae antes Scrophulariaceae) es una especie
de importancia en la medicina tradicional Mexicana. Se ha descrito su uso para tratar
síntomas asociados con el cáncer, enfermedades respiratorias y trastornos
gastrointestinales. En la actualidad, la Sociedad Farmacéutica de México la indica
como diurético y sialagogo (sustancia que estimula la saliva).
El primer estudio químico de plantas silvestres de C. tenuiflora fue realizado por
Jiménez et al. (1995), quienes identificaron en el extracto butanólico de la parte aérea
los iridoides glucosilados: bartsiósido, aucubina, shanzhisida, ácido geniposídico y el
ácido mussaenosídico. En una investigación reciente, Rosas (2007) demostró que
tanto en la parte aérea como en la raíz hay presencia de iridoides. Entre los cuales
solo identificó aucubina y bartsiósido.
En el género Castilleja, el verbascósido fue identificado por primera vez en Castilleja
integra en 1987 y en 1990 el isoverbascósido sólo se había identificado en Castilleja
linariaefolia. Los iridoides glucosilados (IG) del tipo de la aucubina, así como los
feniletanoides glicosilados (FG) del tipo de verbascósido son compuestos
considerados marcadores taxonómicos y su presencia se encuentra restringida a los
ordenes Lamiales, Scrophulariales, Hippuridales y Oleales. La presencia de estos
compuestos en la planta parece deberse a su interacción con microorganismos y el
ambiente.
La investigación sobre la biología de la raíz se había visto obstaculizada por la
naturaleza de las raíces y la falta de sistemas experimentales adecuados para
estudiar la interacción entre raíz-raíz y raíz-microorganismo. Sin embargo, los
avances recientes en las raíces que crecen de forma aislada de otros elementos de
la rizósfera han facilitado enormemente su estudio, específicamente del metabolismo,
fisiología y genética, contribuyendo a la comprensión de este órgano, así como el
2
potencial de los metabolitos derivados de la raíz en términos de su actividad biológica
y la manipulación humana.
Los cultivos de tejidos vegetales in vitro, por su grado de especialización y
organización celular pueden sintetizar y/o acumular estos metabolitos secundarios,
representando una alternativa a la extracción directa de la planta. Previamente, en
cultivos de raíces in vitro de C. tenuiflora se acumularon iridoides (biomasa y medio
de cultivo), aunque no se elucidaron las estructuras, sólo se identificó aucubina en el
sobrenadante.
En el presente trabajo de investigación, se realizó el estudio químico de las raíces y
tallos de C. tenuiflora con lo que se logró el aislamiento y elucidación estructural de
dos FG: verbascósido e isoverbascósido, los IG: aucubina y bartsiósido y el
flavonoide: apigenina. Adicionalmente, se desarrolló la metodología cromatográfica
para la cuantificación de estos metabolitos secundarios. Se demostró que las
mayores concentraciones de verbascósido e isoverbascósido están en la raíz. Se
estableció el cultivo in vitro de raíces adventicias y se analizó la capacidad de
producir éstos compuestos.
3
2. ANTECEDENTES
2.1. Castilleja tenuiflora y su importancia en la medicina tradicional
Mexicana
El género Castilleja comprende más de 220 especies, son herbáceas anuales o
perennes, que se distribuyen principalmente en el continente Americano. En México,
considerado centro de dispersión del género, crecen alrededor de 43 especies
(Holmgren, 1976). Éste género ha sido recientemente reclasificado de la familia
Scrophulariaceae hacia la Orobanchaceae, en base a los análisis filogenéticos
moleculares y por sus características hemiparásitas (Thorne, 2000; Wesselingh y van
Groenendael, 2005; Egger, 2008; Tank et al., 2009). Éste género ha sido muy
estudiado desde el punto de vista ecológico (Roby y Stermitz, 1984b; Mead et al.,
1992; Mead et al., 1993; Spasojevic y Suding, 2011) pero poco en el uso medicinal
(Moreno-Escobar et al., 2011).
Castilleja tenuiflora se conoce como calzón de indio, cola de borrego, castilleja,
coneja, copete de grulla, culano, flor de hielo, garañona, garayona, hierba del cáncer,
hierba del golpe, mirto, plumero, saca miel, tetlatlatzo, yerba de la epístola (Argueta
et al., 1994; Mondragón y Vibrans, 2005) en dialecto náhuatl "Atzoyatl” (Béjar et al.,
2000), en tarahumara “Rosábochi” (Olivas, 1999) y en inglés como "Indian
paintbrush". Las sinonimias son Castilleja canescens (se conoce como garañona) y
Castilleja angustifolia (Nesom, 1992).
Se distribuye en las zonas montañosas del sur de Estados Unidos y en México,
donde se ha registrado principalmente en la zona centro y sur (Nesom, 1992). C.
tenuiflora tiene crecimiento herbáceo o subarbustivo, crece abundantemente arriba
de los 2000 metros de altitud; en el valle de México se encuentra hasta los 3300
m.s.n.m. Su hábitat son bordes de cultivo y orillas de caminos, junto a coníferas y
árboles de encino, en matorrales y pastizales (Figura 1-A).
4
La planta crece de 30 cm hasta 1 m aprox. de alto. El tallo es erecto, muy ramificado,
con pelos largos y tiesos o rígidos, que llegan a ser blancos a blanco-grisáceo. Las
hojas son sésiles y al menos levemente auriculadas (con forma de oreja) en la base,
son lineares-lanceoladas, de 1 a 4.5 cm de largo, el ápice es agudo u obtuso, con
tricomas suaves ó tiesos y largos, algunas veces glanduloso-pubescentes. La
inflorescencia es racemosa, con numerosas flores, pedicelos de 3 a 5 mm de largo,
las brácteas son lanceoladas de 1.2 a 4 cm de largo, con ápice agudo, en ocasiones
teñido de rojo. Las flores tienen forma de corola de 3 a 4.5 cm de largo, de color
anaranjado, ocasionalmente amarilla, gálea verdosa, con pelos simples y muy cortos,
de 1.5 a 2 cm de largo; las anteras son de 2 a 3 mm de largo; el estilo es de 3 a 4 cm
de largo, estigma bilobulado; cáliz de 2 a 3 cm de largo, lóbulos dentados con pelos
largos y tiesos, con el ápice teñido de rojo (Figura 1-B). Los frutos son cápsulas
ovoides de 9 a 14 mm de largo (Figura 1-C) y las semillas son elipsoides de 1.8 mm
aprox. de largo y de color café (Nesom, 1992). Actualmente no hay reportes sobre la
morfología de las raíces de esta especie. En la figura 1-D, se muestra una fotografía
de las raíces de C. tenuiflora recolectadas en el estado de Amecameca.
Figura 1. Castilleja tenuiflora. A. Hábitat de C. tenuiflora (flecha señalando plantas en estado
de floración). Amecameca, Estado de México. 3500 m.s.n.m. B. Inflorescencia. C. Corte
transversal del fruto. D. Raíces. Fotografías (A, B y D) tomadas en Noviembre de 2008 por
Gómez-Aguirre, Y. A. y (C) tomada en un estereomicroscopio por Sánchez, J. A.
D
A B C
5
En el siglo XVI, el médico y naturalista español Francisco Hernández (1517?-1587)
investigó sobre las plantas medicinales en México. Una de las especies que describió
fue C. tenuiflora y relató los siguientes usos: antiespasmódico, diurético (sustancia
que al ser ingerida provoca eliminación de agua y sodio), enfermedades del
estómago, eupéptico (sustancia que facilita la digestión), purifica la sangre y
sialagogo (Béjar et al., 2000). En el siglo XX, otros autores también registraron sus
usos en la herbolaria mexicana para curar cólicos hepáticos (Martínez, 1969), tratar
la anemia, cálculos de la vesícula, colecistitis (inflamación de la pared de la vesícula
biliar) y dispepsia (alteración funcional asociada al aparato digestivo) (Cabrera,
1958). También se recomienda para curar tumores (Graham et al., 2000), tratar la
esterilidad, problemas gastrointestinales y la cirrosis (Béjar et al., 2000). La Sociedad
Farmacéutica de México la indica como diurético y sialagogo (Morales, 1952). En el
cuadro 1, se resumen los usos de C. tenuiflora, así como su forma de preparación.
Cuadro 1. Usos y forma de preparación de C. tenuiflora en la medicina tradicional.
Uso medicinal Parte Vía de administración Preparación
Fertilidad y purificación de
la sangre
N.I. Oral Cocción
Lavados vaginales Hojas Local Cocción
Lavado de heridas Planta Local Cocción
Heridas internas Planta Oral Cocción
Tos Inflorescencia y hojas Oral Cocción
Disentería
Nervios
Vómitos
Hojas con
flores de nochebuena
(Euphorbia pulcherrima),
hojas de altísima
(Tanacetum parthenium)
y Chocolate pinolillo
Oral Cocción
Retraso ó adelanto
menstrual
Esterilidad femenina
Flores Oral Cocción
Afecciones del hígado
Problemas del riñón
Ramas Oral Cocción
Caída del cabello Ramas Local Cocción
N.I.: No identificado.
Referencia: (http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php?l=3&t=Gara%C3%
B1ona_o_cola_de_borrego&id=7964).
6
2.2. Estudios de fitoquímica y actividades biológicas del género Castilleja
El género Castilleja ha sido objeto de diversos estudios químicos con los que se ha
logrado el aislamiento y elucidación estructural de iridoides glucosilados (IG) y el
feniletanoide glicoslidado (FG) verbascósido, principalmente. Por ejemplo, en C.
integra se han identificado IG como catalpol y macfadienósido (5-hidroxicatalpol)
(Mead et al., 1993) y el FG verbascósido (Gardner et al., 1987). Mientras que en C.
miniata aff. rhexifolia se detectó aucubina, catalpol y bartsiósido, principalmente. En
C. linariaefolia se identificaron verbascósido e isoverbascósido (Gardner et al., 1987;
Pettit et al., 1990). Hasta el momento sólo se ha identificado el ácido fenólico
salidrósido en C. chromosa (Stermitz et al., 1991). Otros compuestos aislados de
diversas especies del género Castilleja son presentados en los cuadro 2 y 3.
Las investigaciones sobre C. tenuiflora son pocas; abarcan aspectos fitoquímicos,
farmacológicos y biotecnológicos. Uno de los primeros estudios químicos fue
realizado por Jiménez et al. (1995), quienes identificaron en un extracto n-butanólico
de las partes aéreas, los siguientes iridoides poliacetilados: bartsiósido penta-
acetilado, aucubina hexa-acetilada, éster metílico del ácido geniposídico penta-
acetilado, éster metílico del ácido mussaenosídico tetra-acetilado y éster metílico de
la shanzhisida penta-acetilada (Cuadro 2). Posteriormente, Rosas (2007), demostró
mediante cromatografía en capa fina, cromatografía líquida de alta resolución (CLAR)
y resonancia magnética nuclear (RMN) de 13C e 1H, que en extractos de acetato de
etilo de la parte aérea se acumulan iridoides glucosilados, de los cuales sólo se
identificó la aucubina y el bartsiósido.
7
Cuadro 2. Iridoides glucosilados identificados en el género Castilleja.
Especie Iridoides glucosilados Referencia
C. rhexifolia
O
HO
HO Oglc
Aucubina
O
HO
HO Oglc
O
Catalpol
O
HO
Oglc
COOMe
Dihidrocornina
O
HO
Oglc
COOMe
Penstemonósido
Roby y Stermitz (1984a)
C. miniata
O
HO
HO Oglc
Aucubina
O
HO Oglc
Bartsiósido
O
HO
HO Oglc
O
Catalpol
O
HO Oglc
O
6- deoxicatalpol
O
AcO
Oglc
HO
COOMe
Shanzhisidato de metilo
O
Oglc
COOMe
HO
Gardósidato de metilo
O
Oglc
COOMe
HO
8-epi loganina
O
Oglc
HO
COOMe
Mussaenósido
Arslanian et al. (1985)
C. integra
O
Oglc
COOOH
Shanzhisida
O
AcO
Oglc
HO
COOMe
Shanzhisidato de metilo
O
HO
HO Oglc
O
Catalpol
O
Oglc
COOMe
HO
HO
6-- Hidroxiadoxósido
O
HO Oglc
COOMe
Adoxósido
O
HO Oglc
COOH
Ácido adoxosídico
O
HO
HO Oglc
O
OH
Macfadienósido
O
Oglc
COOOH
HO
Ácido 8-epi-logánico
Gardner et al. (1987)
8
Cuadro 2 (continuación). Iridoides glucosilados identificados en el género Castilleja.
Especie Iridoides glucosilados Referencia
C. linariifolia
O
Oglc
COOOH
Shanzhisida
O
HO
HO Oglc
O
Catalpol
O
HO Oglc
COOMe
Adoxósido
O
HO Oglc
COOH
Ácido adoxosídico
Gardner et al. (1987)
C. wightii
O
HO
O Oglc
O
Oglc
10-O-trans-
cinnamoilmelitósido
O
HO Oglc
Bartsiósido
O
Oglc
HO
COOMe
Mussaenósido
Belofsky y Stermitz (1988)
C. sessiliflora
O
MeOCO
HO Oglc
Oglc
6-O-Acetilmelitósido
O
HO
HO Oglc
Oglc
Melitósido
O
HO Oglc
COOMe
Adoxósido
O
Oglc
HO
COOMe
Mussaenósido
Stermitz et al. (1991)
C. foliolosa
O
HO
HO Oglc
Aucubina
O
HO
HO Oglc
Oglc
Melitósido
O
Oglc
COOMeH
HHO
Genipósido
O
HO Oglc
COOH
Ácido geniposídico
C. exilis
C. minor O
AcO
Oglc
HO
COOMe
Shanzhisidato de metilo
O
Oglc
COOMe
HO
8-epi-loganina
O
Oglc
HO
COOMe
Mussaenósido
9
Cuadro 2 (continuación). Iridoides glucosilados identificados en el género Castilleja.
Especie Iridoides glucosilados Referencia
C. purpurea
O
MeOCO
HO Oglc
Oglc
6-O-Acetilmelitósido
O
AcO
Oglc
HO
COOMe
Shanzhisidato de metilo
Stermitz y Pomeroy (1992)
C. indivisa
O
HO
HO Oglc
Oglc
Melitósido
C. tenuiflora
O
HO
HO Oglc
Aucubina
O
HO Oglc
Bartsiósido
O
HO Oglc
COOH
Ácido
geniposídico
O
Oglc
HO
COOMe
Ácido
mussaenosídico
O
AcO
Oglc
HO
COOMe
Shanzhisidato de
metilo
Jimenez et al. (1995)
10
Cuadro 3. Feniletanoides glicosilados y ácidos fenólicos identificados en el género Castilleja.
N.I.: No identificado
Sobre la actividad biológica de C. tenuiflora se han realizado investigaciones acerca
de la actividad citotóxica y actividad antioxidante. En el primer caso, los extractos
metanólicos obtenidos de plantas colectadas en Ocuitlán (Estado de México),
presentaron actividad citotóxica en las líneas de cáncer cérvico-uterino (CaSki) y de
mama (MCF7) (Moreno-Escobar et al., 2011). En este estudio no se asoció la
actividad biológica con algún compuesto químico en específico. Por otro lado, los
extractos metanólicos de las plantas silvestres y órganos cultivados in vitro contienen
compuestos con actividad antioxidante, lo cual se demostró mediante modelos in
vitro de actividad antirradical (ABTS y DPPH) y de poder reductor (fosfomolibdeno).
Especie Feniletanoides glicosilados Ácidos fenólicos Referencia
C. integra
O
O
O
OHO
O
OH
OHHO
HOH3C
OHO
HO
OH
OH
Verbascósido
N.I. Gardner et al. (1987)
C. linariaefolia Verbascósido (Acteósido)
O
O
O
OHO
HO
O
OHHO
HO
OH
OHOHO
HO
Isoacteósido
N.I. Pettit et al. (1990)
C. sessiliflora Verbascósido N.I. Stermitz et al. (1991)
C. foliolosa Verbascósido N.I.
C. exilis Verbascósido N.I.
C. minor Verbascósido N.I.
C. chromosa Verbascósido
Salidrósido
11
La actividad antioxidante, ha sido asociada con el contenido de compuestos fenólicos
y flavonoides (López-Laredo et al., 2010; Trejo-Tapia et al., 2011). La concentración
de estos compuestos depende de la parte de la planta, así como de las condiciones
de crecimiento y desarrollo.
2.3. Iridoides glucosilados
Los monoterpenos son productos biosintéticos derivados de dos unidades de
isopreno y están distribuidos en una gran variedad de sistemas vivos: plantas,
microorganismos e insectos; algunos tienen función específica en el individuo
productor y varios presentan actividades biológicas de distinta naturaleza, por
ejemplo, atraen polinizadores, son agentes alelopáticos o sustancias de defensa
contra depredadores y parásitos (Marcano y Hasegawa, 2002).
Los iridoides son compuestos monoterpénicos de origen vegetal, aunque el primero
de ellos: la Iridomirmecina (Figura 2-A), se aisló de la hormiga carnívora australiana
Iridomyrmex detectus, de donde toman su nombre. En algunos casos se consideran
como marcadores quimiotaxonómicos de algunas familias y se les han encontrado
diversas actividades farmacológicas. Algunos iridoides glicosilados producen efectos
analgésicos, antiinflamatorios, protectivos, diuréticos, antidiarreicos, sedantes y
citotóxicos (Gálvez et al., 2005; Bi et al., 2008; Jeong et al., 2011; Kirmizibekmez et
al., 2011; Liu y Wang, 2011). Por otro lado, tienen un papel relevante el mecanismo
de defensa en insectos (L'Empereur y Stermitz, 1990a, b).
Los iridoides estructuralmente se caracterizan por tener unidades de isopreno (2-
metil-1,3-butadieno), son compuestos que tienen el esqueleto ciclopentanopirano, el
cual se forma por un anillo básico de dihidropirano fusionado a un ciclopentano
(McMurry, 2004) (Figura 2-B). En función de sus características estructurales, los
iridoides se pueden clasificar en: iridoides glicosilados, iridoides simples o no
glicosilados, secoiridoides (con el anillo ciclopentano abierto) y bis iridoides. Los
glicosilados se encuentran fusionados con un azúcar en el hidroxilo del C-1
12
preferentemente. Los iridoides simples tienen un esqueleto iridano con un metil en C-
8 y otro carbono doble en C-4 (Figura 2-B). La división del enlace 7-8 del anillo
ciclopentano forma secoiridoides, mientras que los bis iridoides resultan de la
dimerización de los iridoides y secoridoides (McMurry, 2004).
La introducción de carbonos, grupos funcionales y dobles enlaces en el esqueleto
iridano origina diversas estructuras de iridoides. Algunas variaciones estructurales
son la oxidación de los carbonos C-6, C-7, C-8 y C-10, epoxidación del anillo
ciclopentano, la introducción de grupos acetoxi y carboxilos, y a veces puede faltar el
enlace 7-8 formando parte de otros metabolitos como en el caso de los esqueletos de
alcaloides indólicos (seco-iridoides) (McMurry, 2004).
2.3.1. Biosíntesis de los iridoides glucosilados
La biosíntesis de iridoides del tipo de la aucubina ha sido poco estudiada. La mayor
parte de las investigaciones se han centrado en la biosíntesis del iridoide
secologanina, por su importancia como intermediario de la síntesis de los alcaloides
indolterpénicos. De tal forma que la mayoría de las reacciones para la síntesis de los
iridoides de este tipo aún no están claramente elucidadas (Oudin et al., 2007).
En las plantas, el isopreno se sintetiza a partir de dos vías diferentes del metabolismo
primario, la vía del acetato/ácido mevalónico (MVA), y la vía del 2-C-metil-D-eritrol-4-
fosfato (MEP), éstas ocurren en compartimientos diferentes: citosol y plastidio,
respectivamente (Lichtenthaler et al., 1997). En experimentos in vivo, donde se han
usado marcadores isotópicos para establecer los pasos de la ruta biosintética de los
Figura 2. Iridoides. A. Primer iridiode aislado: iridomirmecina. B. Sistema de numeración:
R= H ó glucosa. (Tomado de Sampaio-Santos y Kaplan, 2001).
A B
13
iridoides, han establecido como precursor al geraniol pirofosfato. La ciclización del
aldehído en un anillo ciclopentano da origen al iridodial y oxidaciones posteriores
forman un iridotrial. La forma hemiacetal produce el ácido deoxilogánico (Villaseñor,
2007).
Sampaio-Santos y Kaplan (2001), realizaron una revisión sobre la ruta de biosíntesis
de los iridoides del tipo de la aucubina, en distintas familias de plantas, encontrando
que dependiendo de la familia e incluso de la especie, la secuencia de los pasos
puede cambiar. Adicionalmente, hicieron un experimento marcando con deuterio, el
8-epi-iridodial, 8-epi-iridotrial y el glucósido 8-epi-iridotrial (boschnalosido), los cuales
dieron lugar al harpagido y aucubina, también mencionan que el 8-epi-ácido es
precursor del antirrhinosido en Antirrhinum majus. Con base en los estudios
realizados por éstos autores en especies de Scrophulariaceae: A. majus,
Scrophularia umbrosa, Buddleya albiflora y Scrophularia racemosa se propone la ruta
de biosíntesis que se presenta en la figura 3.
14
Figura 3. Propuesta de ruta de biosíntesis de iridoides glucosilados para Scrophularia
umbrosa (a), Buddleya albiflora (b), Antirhinum majus (c) y Scrophularia racemosa (d)
(Sampaio-Santos y Kaplan, 2001).
15
En cuanto a factores que regulan la biosíntesis de este tipo de iridoides, también
existe poca información. Al parecer la biosíntesis de iridoides ocurre en las hojas. Sin
embargo, en la raíz de varias especies se ha observado su acumulación y varios
reportes apuntan a que es diferencial en los diversos tejidos y órganos de la planta.
Por ejemplo, en la raíz de S. ningpoensis (Nguyen et al., 2005) y S. lepidota se
identificaron varios iridoides, entre ellos derivados de la aucubina y del catalpol
(Tasdemir et al., 2005). En la raíz de plantas silvestres de Scrophularia nodosa, el
harpagósido representa el doble (1.6%, base seca) de lo presente en hojas. De
manera inversa, la aucubina representa 1.5% (base seca) en hojas y sólo se
encuentra en 0.5% en raíz (Sesterhenn et al., 2007).
También se han observado diferencias en la acumulación en plantas in vivo e in vitro.
En plantas de A. majus desarrolladas en hidroponía, el iridoide antirrinósido estuvo
presente en todos los órganos incluyendo la raíz pero la mayor concentración fue en
tallos, yemas y flores. En contraste, el iridoide antirrínido se encontró solo en hojas.
Conforme las plantas crecen, el nivel de antirrinósido disminuyó y el del antirrínido
aumentó. Los resultados con 14C-antirrinósido sugieren que se trata de un compuesto
móvil a través del floema (Beninger et al., 2008). La concentración de harpagósido en
la parte aérea y la raíz de plantas micropropagadas de S. yoshimurae fue cinco
veces mayor que en la raíz de planta silvestre (Sagare et al., 2001).
En especies de otro género como Plantago lanceolata (Plantaginaceae) se han
realizado estudios más amplios, que muestran que el contenido de iridoides está bajo
control genético (Adler et al., 1995), puede variar en función de la edad de la hoja y
de la planta (Bowers et al., 1993; Darrow y Bowers, 1999), así como de factores
abióticos como la luz o del nivel de nutrimentos ó pueden ser inducidos por daño de
herbívoros o patógenos (Wurst et al., 2004; Wurst et al., 2010).
16
2.3.2. Actividad biológica de los iridoides glucosilados
Desde el punto de vista ecológico, la aucubina y el catalpol, son de los más
estudiados. El catalpol sirve como atrayente alimenticio y estimulante de larvas de
mariposa a las que protege de pájaros insectívoros debido al sabor amargo que les
confiere, por esto los iridoides han sido motivo de estudios ya que en las larvas y
mariposas son usados como defensa contra depredadores (Stermitz et al., 1986;
Baden et al., 2011; Dobler et al., 2011).
Para interés humano, los iridoides presentan actividades biológicas diversas:
antimicrobiana, antitumoral (Wysokinska y Skrzypek, 1992; Gálvez et al., 2005), anti-
inflamatoria (Chen et al., 2009; Liu y Wang, 2011), antinociceptivo ó analgésico (Li et
al., 2010), neuroprotectora (Jeong et al., 2011), citotóxica (Nguyen et al., 2005) e
inmunoestimulante (Mathad et al., 1998).
Los iridoides glicosilados harpágido de 8-O-E-p-metoxicinamoilo, harpágido de 8-O-
Z-p-metoxicinamoilo, harpágido de 6`-O-E-p-metoxicinamoilo, harpágido de 6`-O-Z-
p-metoxicinamoilo, E-harpagósido, Z-harpagósido y harpágido, aislados de raíces de
S. buergeriana, disminuyeron el daño neuronal que fue inducido por glutamato en un
cultivo de células corticales de ratas en un intervalo de concentración de 10 M y 100
M. Estos resultados indican un efecto protector ante la neurodegeneración inducida
por glutamato en un cultivo primario de células corticales de rata (Kim et al., 2002).
Ahmed et al. (2003) demostraron la actividad anti-diabética y anti-inflamatoria de los
IG: escropoliósido-D y el harpagósido-B, respectivamente. Éstos fueron aislados de
la parte aérea de Scrophularia deserti (Scrophulariacea). El escropoliósido-D
disminuyó en 31.47% los niveles de glucosa en sangre de ratones diabéticos,
después de una hora del tratamiento con respecto al nivel inicial. En cuanto a la
actividad anti inflamatoria, la evaluación se hizo en ratones, a los cuales se les indujo
17
el edema en la pata derecha. El harpagósido-B disminuyó la inflamación en 30% a
una dosis de 10 mg/kg después de 3 horas.
En específico, los IG identificados en C. tenuiflora presentan actividades biológicas
comprobadas, por ejemplo la aucubina posee propiedades como antioxidante y
control de la hiperglicemia (Jin et al., 2008), fotoprotección, prevención del
fotoenvejecimiento (Ho et al., 2005a; Ho et al., 2005b), citotóxica (Nguyen et al.,
2005), antitumoral (Gálvez et al., 2005; Hung et al., 2008) e inmunoestimulante
(Mathad et al., 1998). La aucubina y genipósido presentan actividad citotóxica en las
líneas celulares cancerígenas TK-10 (adenocarcinoma renal), MCF-7
(adenocarcinoma de seno) y UACC-62 (Melanoma) (Gálvez et al., 2005).
2.4. Feniletanoides glicosilados
Los FG son fenilpropanoides que también se conocen como glicósidos fenetilalcohol
(Inagaki et al., 1991). Son productos naturales solubles en agua que se caracterizan
por contener un dihidroxifenetil β-D-glucopiranósido, un ácido fenilpropenóico como
un éster (ácido cinámico, ácido p-cumárico, ácido cafeico y ácido ferúlico) y residuos
de monosacáridos (apiosa, ramnosa, glucosa y xilosa, entre otros) (Kawada et al.,
2002; Sinaphet et al., 2006) (Figura 4). Estos compuestos se encuentran distribuidos
entre plantas del orden Lamiales, que incluye las familias Scrophulariaceae y
Orobanchaceae (Scogin, 1992).
Se han identificado alrededor de 150 feniletanoides glicosilados que son producidos
por las plantas en respuesta al ataque de insectos y se ha demostrado que hay
diferencias en el contenido de estos compuestos en la misma planta y entre
poblaciones de la misma especie debido a la variación genética. Por ejemplo, en
clones de la especie Plantago lanceolata (Plantaginaceae) se demostró que hay
variación genética en la planta y entre poblaciones en cuanto a la producción de
verbascósido (feniletanoide glicosilado) (Adler et al., 1995).
18
El verbascósido también se conoce como acteósido, kusaginina y orobanchina
mientras que su isómero, el isoverbascósido como isoacteósido (Scogin, 1992;
Saimaru y Orihara, 2009). Son glicósidos pertenecientes a los fenilpropanoides y
constituyen una familia de compuestos orgánicos sintetizados a partir de la
fenilalanina. El verbascósido contiene un disacárido constituido por una unidad de
glucosa unido a una ramnosa en el C3; la glucosa está esterificada con el ácido
cafeico en el C4 y se une a través de un enlace de tipo éter con la unidad de 3,4-
dihidroxifenil etanol en el C1 (Figura 4).
Verbascósido
R1=H
R2=ramnosa
Figura 4. Estructura general de los feniletanoides. R1=H y R2= Ramnosa, glucosa, apiosa ó
xilosa.
El verbascósido fue aislado por primera vez de Verbascum sinuatum y la estructura
completa fue elucidada en Orobanche rapum-genistae, encontrándose que coincidía
con la reportada para el acteósido (Andary et al., 1982). Algunas de las plantas en las
que está presente el verbascósido son la Hierba Luisa (Aloysia triphylla,
Verbenaceae), el gordolobo (V. densiflorum, Scrophulariaceae), el tepozán (Buddleja
scordioides y B. cordata, Buddlejaceae), el llantén (Plantago major, Plantaginaceae)
ó el cistanche (Cistanche phelipea, Orobanchaceae).
2.4.1. Biosíntesis de los feniletanoides glicosilados
La biosíntesis de FG no ha sido estudiada extensamente. Actualmente existen pocos
reportes sobre la ruta de biosíntesis. Aún hay muchas incógnitas por resolver en los
pasos individuales de las secuencias biogénicas y se ha detectado más de un
camino para llegar a un mismo producto fenólico y ello depende del medio biológico
que lo sintetiza.
19
Saimaru y Orihara (2009) reportaron la ruta de biosíntesis del acteósido y aislaron
cuatro feniletanoides glicosilados (acteósido, isoacteósido, -oxoacteósido, -hidroxi-
acteósido) y uno de los precursores (salidrósido) en células en suspensión de Olea
europea (Oleaceae). La unidad de hidroxitirosol del acteósido (verbascósido) es
sintetizado de la tirosina a través de la dopamina, mientras que la unidad de cafeoil
del acteósido es sintetizado de fenilalanina a través del cinamato. La dopamina es
incorporada al acteósido a través de la oxidación del correspondiente aldehído,
reducción al alcohol y por último una -glicosilación (Figura 5).
20
Figura 5. Propuesta de ruta de biosíntesis de los feniletanoides glicosilados en Olea europea
(Oleaceae) (a) y Cistanche deserticola (Orobanchaceae) (b) (Saimaru y Orihara, 2009; Hu et
al., 2011). Pasos desconocidos (- - -).
a
21
2.4.2. Actividades biológicas de los feniletanoides glicosilados
Los FG son compuestos naturales, absorbibles por las células intestinales (Cardinali
et al., 2010; Cardinali et al., 2011) y tienen un amplio espectro de actividades
biológicas (in vitro e in vivo) (Dembitsky, 2005). Por ejemplo, el verbascósido elimina
efectivamente los radicales libres e inhibe la colinesterasa (Shindo et al., 2008; Martin
et al., 2009; Kahraman et al., 2010; Georgiev et al., 2011a). Es un potente agente
anti-inflamatorio, ya que inhibe la acumulación de moléculas pro-inflamatorias tales
como el óxido nítrico y citocinas, junto con la expresión de las ciclo-oxigenasas
(COX-1 y COX-2) (Gyurkovska et al., 2011).
El verbascósido también presenta efectos vasodilatadores en la aorta torácica
aislada de rata (Yoshikawa et al., 2006); actividad antibacteriana frente a
Staphylococcus aureus, al afectar la síntesis de proteínas (Avila et al., 1999) y
presenta actividad anti-hiperalgésica (Isacchi et al., 2011). El isoverbascósido
presenta una fuerte actividad sobre los radicales libres (Kim et al., 2009; Martin et al.,
2009; Arthur et al., 2011), inhibe la proliferación celular maligna y revierte las
características fenotípicas de la línea celular de cáncer gástrico MGC803 (Chen et
al., 2002).
El verbascósido e isoverbascósido presentaron actividad in vitro contra el virus
respiratorio sincitial, que provoca infecciones en los pulmones y en las vías
respiratorias y es la principal causa de enfermedades respiratorias en los niños
pequeños (Kernan et al., 1998) y contra el virus del herpes simplex HSV-1 y HSV-2,
que es una enfermedad infecciosa inflamatoria de tipo vírico, que se caracteriza por
la aparición de lesiones cutáneas formadas por pequeñas vesículas agrupadas en
racimo y rodeadas de un halo rojo (Martins et al., 2009). También éstos FG
mostraron un efecto hepatoprotector en un modelo in vivo (Morikawa et al., 2010) y
son citotóxicos porque inhiben la proliferación de las células HL-60 de leucemia
promielocítica (Pettit et al., 1990) y el melanoma murino B16F10 (Nagao et al., 2001).
22
Este tipo de compuestos poli activos, tales como los FG están siendo intensamente
buscados para el tratamiento de procesos patológicos como la inflamación o las
enfermedades crónicas (por ejemplo, artritis reumatoide y la enfermedad de
Alzheimer) (Georgiev et al., 2011a; Gyurkovska et al., 2011) siendo atractivos para la
industria de los alimentos y farmacéutica (Georgiev et al., 2010; Cardinali et al., 2011;
Stancheva et al., 2011).
2.5. Cultivos in vitro de raíces
La raíz constituye un órgano vegetativo importante de las plantas vasculares, situada
normalmente por debajo del suelo que desempeña varias funciones, como
proporcionar agua, nutrimentos, anclaje y soporte a la parte aérea de la planta. Sin
embargo, también se ha observado que cumple un papel muy importante en la
biosíntesis y acumulación de diversos metabolitos secundarios (Bais et al., 2001).
Los cultivos de tejidos vegetales in vitro, por su grado de especialización y
organización celular pueden sintetizar y/o acumular metabolitos secundarios de
interés farmacológico, representando una alternativa a la extracción directa de la
planta (Matkowski, 2008; Lubbe y Verpoorte, 2011).
En cultivo in vitro, el desarrollo del cultivo de raíces resulta tanto de la formación de
raíz laterales como de su elongación. Las raíces laterales se originan del primordio
de la raíz, luego hay crecimiento del primordium y emergencia. El crecimiento de la
punta es lineal y puede ser medido en unidades de longitud por tiempo. En el cultivo
de raíces el incremento en biomasa exponencial resulta de la formación de la raíz
lateral y un consecuente incremento exponencial en el número de puntas alargadas
(Dodds y Roberts, 1985).
Existen dos tipos principales de cultivos de raíces. El primero, son los cultivos de
raíces “no transformadas”, éstas son obtenidas de forma tradicional con o sin
regulador de crecimiento (auxina). Las auxinas que se usan son: ácido indolbutírico
23
(IBA) y ácido 3-indolacético (AIA). La respuesta a las auxinas es el efecto en la
elongación, la estimulación de la formación de las raíces laterales y la liberación del
etileno estimulada por la auxina (Fukaki et al., 2007; Ivanchenko et al., 2008). El
segundo tipo de cultivos de raíces son las “transformadas” ó “raíces peludas”, las
cuales resultan de la infección y la posterior transformación genética de tejidos
vegetales por el patógeno bacteriano del suelo: Agrobacterium rhizogenes. La
transformación ofrece células que proliferan hacia el crecimiento de raíz. En
cualquiera de los dos tipos de cultivo, las raíces se obtienen por la inoculación de las
puntas en medio líquido, éstas pueden obtenerse de las raíces de las plántulas
germinadas in vitro ó de raíces inducidas de otro tejido de la planta, callos ó
agregados celulares (Dodds y Roberts, 1985).
2.6. Cultivos de órganos in vitro como fuente de iridoides glucosilados y
feniletanoides glicosilados
Los cultivos de órganos y células vegetales son una fuente alternativa para la
producción de compuestos químicos, tales como FG (Georgiev et al., 2011b;
Stancheva et al., 2011) e IG (Sesterhenn et al., 2007; Grabkowska et al., 2010; Trejo-
Tapia et al., 2011). Éstas técnicas son útiles para la propagación y conservación de
germoplasma y por lo tanto representan una forma de proteger la biodiversidad de
las plantas (Lubbe y Verpoorte, 2011; Sarasan et al., 2011).
Los reportes de cultivo in vitro en las familias Scrophulariaceae u Orobanchaceae
son escasos (Cuadro 4). Por ejemplo, el cultivo de raíces peludas de Verbascum
xanthophoeniceum (Scrophulariaceae) acumuló 12.82 g L-1 del FG verbascósido
(Georgiev et al., 2011c), ésta concentración fue mayor a la reportada para el cultivo
de raíces peludas de Paulownia tomentosa (1 g L-1) (Scrophulariaceae) (Wysokinska
y Rozga, 1998). En callos y suspensiones de Penstemon serrulatus (Plantaginaceae,
antes Scrophulariaceae) la producción de los FG penstémido y serrulatolósido fue
mayor (2-4% base seca) que en hojas (3 y 1.4% en base seca, respectivamente). Por
otro lado, en cultivos de raíces adventicias de Cormus capitata (Corniaceae) se
24
identificaron los IG ácido 6--dihidrocórmico y ácido 6--dihidrocórmico (Tanaka et
al., 2001). En otra familia como Pediacelaea, las raíces transformadas de
Harpagophytum procumbes producen IG (Grabkowska et al., 2010).
La producción de FG en general, ha sido de interés en las últimas 3 décadas. En
particular, el verbascósido por las actividades biológicas que se han demostrado. La
producción de verbascósido en cultivos tejidos y células en suspensión es una
alternativa a la explotación de las especies silvestres. En el cuadro 4, se muestra la
producción del verbascósido mediante técnicas biotecnológicas.
Cuadro 4. Cultivos de raíces peludas y células en suspensión que producen verbascósido.
.
Familia/especie Sistema Verbascósido Referencia
Scrophulariaceae
Verbascum xanthophoeniceum
Raíces peludas 12.82 g L-1
Georgiev et al. (2011c)
Pedialaceae
Harpagophytum procumbens
Células en suspensión
Células en suspensión
Raíces peludas
445.44 mg L-1
517. 3 mg L-1
56.84 mg L-1
Georgiev et al. (2011b)
Stancheva et al. (2011)
Grabkowska et al.
(2010)
Buddlejaceae
Buddleja cordata
Células en suspensión 116 mg g-1
Estrada-Zúñiga et al.
(2009)
Verbenaceae
Gmelina arborea
Raíces peludas 3.64 mg g-1
Dhakulkar et al. (2005)
Orobanchaceae
Cistanche deserticola
Células en suspensión
Callos
9 mg g-1
BS
10.7% (w/w)
1.65 g g-1
BS
Ouyang et al. (2003)
Lu y Mei (2003)
Acanthaceae
Aphelandra sp.
Células en suspensión
15.1 % Nezbedová et al. (1999)
Plantaginaceae
(antes Scrophulariaceae)
Penstemon serrulatus
Células en suspensión cis y trans
6.1 g L-1
Skrzypek y Wysokinska
(1999)
Scrophulariacea
Paulownia tomentosa
Raíces peludas 1 g L-1
Wysokinska y Rozga
(1998)
25
2.7. Antecedentes sobre el cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora
Además de ser una fuente alternativa de compuestos bioactivos en los cultivos in
vitro de C. tenuiflora, también puede ser útil para la investigación sobre la bioquímica
de esta especie. Como parte de la investigación sobre la conservación y manejo
sostenible de especies de plantas medicinales, en el CeProBi se han estado
realizando trabajos sobre varios aspectos de biotecnología en C. tenuiflora,
incluyendo el establecimiento de cultivos in vitro y análisis de su composición química
y actividad biológica (Salcedo-Morales et al., 2009; Martínez-Bonfil et al., 2011; Trejo-
Tapia et al., 2011).
Rosas (2007) estableció cultivos in vitro de raíces de C. tenuiflora a partir de raíces
adventicias formadas de manera indirecta (vía callo) en explantes de hojas de
plantas silvestres. La inducción de los callos rizogénicos ocurrió en medio de cultivo
Murashige & Skoog (1962) con 10 µM de la auxina ácido -naftalenacético (ANA). El
cultivo de raíces se estableció cuando las raíces de los callos rizogénicos se
transfirieron a medio MS líquido sin reguladores de crecimiento. Bajo las condiciones
de cultivo evaluadas, en el día 28 se alcanzó la concentración de biomasa máxima
(25.141 g L-1) con un td de 19 días. El análisis fitoquímico mostró que los cultivos de
raíces acumularon aucubina y otros iridoides no identificados aún (Rosas, 2007). Por
lo tanto, el cultivo de raíces in vitro de C. tenuiflora es una alternativa potencial para
la producción principios activos para uso medicinal.
26
3. JUSTIFICACIÓN
Castilleja tenuiflora Benth. (Orobanchaceae antes Scrophulariaceae) es una especie
de importancia en la medicina tradicional Mexicana, se ha usado para tratar síntomas
asociados con el cáncer, enfermedades respiratorias y trastornos gastrointestinales;
en la actualidad, la Sociedad Farmacéutica de México la indica como diurético y
sialagogo. Se desconoce cuáles son los compuestos mayoritarios en las plantas
silvestres de ésta especie, por lo que es importante desarrollar una metodología para
aislarlos. Por otro lado, la limitada disponibilidad de fuentes naturales, hace que los
métodos biotecnológicos utilizados para la producción de metabolitos secundarios de
plantas, se hayan establecido firmemente por el alto valor económico. Por lo tanto, el
cultivo de raíces in vitro de C. tenuiflora es una alternativa sustentable para la
producción de iridoides y feniletanoides glicosilados, los cuales son compuestos con
un potencial uso como principios activos para uso farmacéutico.
27
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Identificar estructuralmente los compuestos mayoritarios en plantas silvestres de
Castilleja tenuiflora Benth. y evaluar su acumulación en cultivos de raíces in vitro.
4.2. Objetivos específicos
Aislar e identificar estructuralmente los compuestos mayoritarios en plantas
silvestres de C. tenuiflora.
Evaluar el efecto de auxinas para la producción de raíces in vitro de C.
tenuiflora y caracterizar su comportamiento cinético.
Determinar la concentración de los compuestos mayoritarios en plantas
silvestres y en las raíces in vitro de C. tenuiflora.
28
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Material vegetal silvestre
La colecta de plantas completas de C. tenuiflora en estado de floración, se realizó en
Noviembre de 2008. Se tomaron 49 plantas de una población silvestre en
Amecameca, Estado de México, México (coordenadas: N 19º 04’ 18.1”, W 98º 42’
01.9”; altitud: 3500 m.s.n.m.). Se tomó un ejemplar de la población para identificar la
especie y depositarlo en el herbario (registro HUMO13234) de la Universidad
Autónoma del Estado de Morelos (UAEM), México.
Las plantas se separaron en inflorescencias, raíces y tallos con hojas;
inmediatamente se registró el peso de la biomasa en fresco. El proceso de secado
fue a temperatura ambiente bajo sombra por 2 semanas, una vez secas las hojas, se
separaron de los tallos, para así obtener el peso de la biomasa de cada órgano
(Cuadro 5) y después se trituró en un molino granulador de cuchillas con un tamiz de
4 mm (PulvexMR Plastic, modelo 95). Las condiciones de almacenamiento fueron a
temperatura ambiente y en oscuridad.
Cuadro 5. Peso fresco y peso seco de cada órgano de la planta silvestre de C. tenuiflora.
Órgano Antes de la molienda Después de la molienda
Peso fresco (g) Peso seco (g) Peso seco (g)
Inflorescencia 160.30 31.28 30
Hojas - - 597
Tallos - - 1319
Raíces 889.24 358 350.09
29
5.2. Evaluación de protocolos de extracción
Se evaluaron tres métodos de extracción, en todos los casos se utilizaron 2 g del
material vegetal seco de C. tenuiflora. En el primero, se maceraron raíces e
inflorescencia (por separado) con 250 mL de metanol por 24 h a temperatura
ambiente. En el segundo, se preparó una infusión, la cual se realizó de la siguiente
manera: se calentaron 250 mL de agua a 60ºC, posteriormente se agregó el material
seco, ya sea raíces ó inflorescencias y se dejó reposar por una hora. En el tercero,
se realizó una maceración del material vegetal seco (raíces, hojas, tallos e
inflorescencias) con 40 mL de metanol por 30 min a 60oC en baño María. Terminados
los tiempos de extracción, se filtró para eliminar residuos sólidos. En el caso de los
extractos metanólicos, el disolvente se eliminó mediante un proceso de destilación a
presión reducida en un rota-evaporador (Büchi®-490; Büchi, Suiza) a 50ºC. Con el
propósito de conocer el perfil de los compuestos presentes en la infusión y los
extractos, se realizó una cromatografía en capa fina y se compararon con aucubina
(iridoide).
El rendimiento de los extractos metanólicos se obtuvo por la diferencia de pesos
entre matraz vacío y matraz con extracto seco; 10 mL del extracto acuoso, se
congelaron a -70 ºC y se liofilizaron (Liofilizadora LABCONCO, freeze dryer 18). Se
utilizó el proceso de diferencia de peso entre el matraz con el producto liofilizado y el
matraz sin extracto y se calculó el rendimiento. Todos los extractos se almacenaron a
-18ºC en oscuridad hasta su análisis.
5.3. Cromatografía de capa fina (CCF)
La CCF fue el método de elección para llevar a cabo el análisis de rutina de los
extractos, fracciones, compuestos puros y para optimizar la fase móvil de la
cromatografía en columna abierta.
30
Se utilizaron placas de cromatofolios de aluminio recubiertas de silica gel 60 F254
(Fase normal, 1.05554.001, Merck®) y como fase móvil una serie de mezclas
isocráticas de cloroformo (CHCl3)/Metanol (MeOH) (95:5, 90:10, 85:15 ó 70:30 v/v,
según la muestra a tratar) según la polaridad de las muestras analizadas. También
se utilizaron cromatofolios de aluminio recubiertos de silica gel 60 RP-18 F254S (Fase
reversa, 1.05559.0001, Merck®) y como fase móvil una serie de mezclas isocráticas
de agua/acetonitrilo. Las placas se analizaron con una lámpara de luz ultravioleta
(UVGL-58, UVP, Cambridge, UK) a 254 y 365 nm antes y después del tratamiento
con reveladores químicos.
Para la detección de iridoides y feniletanoides se utilizó como agente cromogénico la
solución denominada HS. La cual contiene 0.5 mg de 4-hidroxibenzaldehido
(Merck®), 90 mL de etanol y 10 mL de ácido sulfúrico. La coloración azul
Copenhague y café indicó la presencia de iridoides y, el magenta y amarillo ocre
indicó feniletanoides. Con esta mezcla también se detectan componentes de aceites
esenciales y saponinas al obtener colores lavanda, rosa y púrpura (Wagner et al.,
1996). En cuanto a flavonoides, se utilizó como agente cromogénico la solución
denominada NP/PEG, que contenía 5 mL de difenilboriloxietilamina, 200 mg de
polietilenglicol y 35 mL de etanol (Wagner et al., 1996). Después de aplicar el
revelador, las placas se colocaron en una parrilla a 90ºC durante 5 s y se observaron
en una cámara de luz ultravioleta (UV) a 365 nm. Finalmente, para cada compuesto
se determinaron los factores de retención (Rf) mediante la ecuación 1.
Rf = (1)
La aucubina (Sigma-Aldrich, ≥99.0% HPLC) y la apigenina (Sigma-Aldrich, ≥95.0%
HPLC) se utilizaron como estándares de referencia.
Distancia recorrida por el soluto____
Distancia recorrida por el disolvente
31
5.4. Análisis cromatográfico del extracto metanólico de tallo de C. tenuiflora.
Para realizar el aislamiento e identificación de los compuestos mayoritarios, se
maceración en metanol de 1300 g de tallos secos y molidos de C. tenuiflora.
Después de concentrar el extracto metanólico por destilación a presión reducida, se
obtuvieron 21.9 g de un extracto color marrón. Se tomaron 17 g de éste extracto al
que se adicionaron 200 mL de acetato de etilo y se puso en baño María a 50ºC
durante una hora. La parte soluble en el acetato de etilo se filtró y concentró por
destilación a presión reducida (F1). La parte insoluble (precipitado color marrón) fue
nuevamente re-suspendida en una solución de mayor polaridad (acetato de
etilo/metanol 7:3). La suspensión se mezcló en un baño ultrasónico (Bransonic®
1510, Branson), se filtró y concentró a sequedad mediante rota-evaporador y
posteriormente se liofilizó. Con este proceso se obtuvieron 13 g (F2).
En la figura 6 se muestra el resumen del aislamiento de aucubina y bartsiosido, a
partir de la fracción de acetato de etilo del tallo (F2), ésta fracción se purificó
mediante un proceso de cromatografía en columna abierta (40 cm de altura x 4 cm
de diámetro interno). La columna fue empacada con 90 g de silica gel 60 (Merck) y la
fase móvil consistió en una mezcla de cloroformo, acetona y metanol en el siguiente
orden y proporciones: Cloroformo 100%, cloroformo/acetona 95:15, 90:10, 85:15,
cloroformo/acetona/metanol 85:15:5 y metanol 100% (cuadro 6). De esta manera, la
fracción F2 se separó en 92 fracciones y con los resultados de los factores de
retención obtenidos en la CCF se agruparon en 30 fracciones que contenían
compuestos químicos de polaridad semejante.
Se analizó la fracción T9, ya que la CCF indicó la presencia de un compuesto
mayoritario. De la misma manera se analizaron las fracciones T19 y T22 y se realizó
un proceso de purificación descrito en el siguiente inciso.
32
Figura 6. Obtención de la fracción de acetato de etilo de tallo (F2) y aislamiento de
flavonoide (T9) e iridoides glucosilados (T19b y T22a).
33
Cuadro 6. Fraccionamiento cromatográfico del extracto metanólico de tallos
silvestres de C. tenuiflora.
SISTEMA DE ELUCIÓN FRACCIONES
COLECTADAS
FRACCIONES
REUNIDAS
CLAVE
Cloroformo 100% 1-21 1-4 T1
5-7 T2
8-12 T3
13-17 T4
18-19 T5
Cloroformo-Acetona 95:15 22-31 20-23 T6
24-26 T7
27-30 T8
Cloroformo-Acetona 90:10 32-38 31-33 T9
34-35 T10
36-37 T11
Cloroformo-Acetona 85-15 39-57 38-39 T12
40-42 T13
43-49 T14
50-53 T15
54-55 T16
56-58 T17
Cloroformo- Acetona- Metanol 85:15:5 58-89 59-60 T18
61-62 T19
63-65 T20
66-67 T21
68-69 T22
70 T23
71 T24
72-74 T25
75 T26
76-77 T27
78 T28
79-89 T29
Metanol 100% 90-92 90-92 T30
5.4.1. Purificación de la fracciones T19 y T22
La fracción T19 (505 mg) se suspendió en cloroformo, se concentró y se obtuvo una
fracción sólida a la cual se le agregó cloroformo/metanol (80:20). Este procedimiento
se realizó dos veces con la fracción sólida, como se indica en la figura 6. En este
proceso, la sub-fracción soluble T19b (26 mg) se concentró y posteriormente se
separó el compuesto por cromatografía preparativa (Cromatoplacas HPTLC, 5 x 5
cm, Silica gel 60 F254, precortado de 10 x 10 cm, Merck, Alemania).
34
La fracción T22 (649 mg) se suspendió en cloroformo y se obtuvo una fracción sólida
que se re-suspendió con cloroformo/metanol (80:20; 70:30 y metanol 100%) y al final
del proceso se obtuvo la fracción T22a (265 mg), como se muestra en la figura 6. Los
compuestos aislados en estas fracciones se identificaron por RMN de 1H (400 MHz).
5.5. Análisis cromatográfico del extracto metanólico de raíces de C.
tenuiflora
5.5.1. Obtención de la fracción acetónica de raíces
Se realizó una extracción metanólica de raíz silvestre (160 g) a 60ºC en baño María
por 30 min, se filtró y el disolvente fue eliminado mediante un proceso de destilación
a presión reducida en un rota-evaporador a 50ºC. El peso del extracto fue de 7.2 g, al
que se le adicionó cloroformo (600 mL) para obtener la fracción menos polar (F1, 1 g,
13.88%); se filtró y al precipitado (F2, 6.2 g, 86.12%) se le adicionó 600 mL de
acetona. Esta suspensión fue depositada durante un minuto en un baño ultrasónico a
temperatura ambiente para incrementar la solubilidad. Después de haber filtrado la
fracción soluble en acetona, ésta fue concentrada por destilación a presión reducida
obteniendo 1.6 g (F3, 22.2%). El precipitado fue secado a alto vacío (F4, 4.6 g,
63.88%) (Figura 7).
5.5.2. Fraccionamiento de la fracción acetónica (F3) de raíces
Se realizó un fraccionamiento de F3 (1.6 g) mediante una cromatografía en columna
abierta (40 cm de alto y 4 cm de diámetro) previamente empacada con silica gel 60
(40 g). Se eluyó con disolventes de polaridad creciente (Cloroformo 100%,
cloroformo/acetona 97:33, 90:10, 85:15, cloroformo/metanol 95:50, 80:20, 70:30 y
metanol 100%), se recolectaron 50 mL de cada fracción. En la cuadro 7, se muestra
la cantidad de fracciones recolectadas en cada sistema de elución y la agrupación de
éstas se realizó en base a la similitud de los compuestos observados en la CCF con
35
su respectiva clave. Se identificó por RMN de 1H y 13C del compuesto aislado de la
fracción R19’. Se obtuvo un precipitado blanco (soluble en cloroformo).
En la figura 7, se resume la purificación que se explica en los siguientes incisos.
Figura 7. Resumen del proceso de purificación del extracto metanólico de raíces de
C. tenuiflora.
36
Cuadro 7. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción acetónica del extracto
metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora.
SISTEMA DE ELUCIÓN FRACCIONES
COLECTADAS
FRACCIONES REUNIDAS CLAVE
Cloroformo 100% 1-23 1 R1
2 R2
3-4 R3
5-7 R4
8-9 R5
10 R6
1 R7
12 R8
13-15 R9
Cloroformo-Acetona 97:33 24-35 16-22 R10
Cloroformo-Acetona 90:10 36-45 23-64 R11
Cloroformo-Acetona 85:15 46-73 65-71 R12
Cloroformo- Metanol 95:5 74-86 72-81 R13
Cloroformo-Metanol 8:2 87-117 82-90 R14
91 R15
R15’
92-93 R16
94 R17
Cloroformo-Metanol 7:3 118-121 95-118 R18
119 R19
R19’
120-122 R20
Metanol 100% 122-132 123-132 R21
5.5.2.1. Purificación de las fracciones C1 obtenidas de la fracción acetónica del
extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora
Las fracciones R4, R7 y R10 (263 mg) se reunieron y se denominaron C1, fueron
purificadas en una columna abierta de fase reversa (RP18), utilizando un sistema de
elución: agua (5% de ácido trifluoracético, TFA)-acetonitrilo. Las fracciones obtenidas
fueron 52, las cuales se reunieron de acuerdo a la similitud de las bandas reveladas
en la cromatografía en capa fina, obteniendo así 7 fracciones, como se indica en el
cuadro 8.
37
Cuadro 8. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C1 obtenidas de la fracción
acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora.
SISTEMA DE ELUCIÓN FRACCIONES
COLECTADAS
FRACCIONES REUNIDAS CLAVE
Agua (TFA)-Acetonitrilo 80:20 1-27 1 C1R1
Agua (TFA)-Acetonitrilo 7:3 28-44 2-3 C1R2
Metanol 100% 45-52 4-27 C1R3
28-29 C1R4
30-33 C1R5
34-46 C1R6
46-52 C1R7
5.5.2.2. Purificación de las fracciones C2 de la fracción acetónica del extracto
metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora
La fracción R14 (419 mg) denominada C2, se suspendió en metanol formando una
fase soluble y otra sólida (que se disolvió con cloroformo-metanol) con la cual se hizo
el fraccionamiento mediante una columna abierta de fase reversa (RP18), utilizando
un sistema de elución: agua (TFA)-acetonitrilo. Las fracciones obtenidas fueron 41,
las cuales se reunieron de acuerdo a la similitud de las bandas reveladas en la
cromatografía en capa fina, obteniendo así 15 fracciones, como se indica en el
cuadro 9. Las fracciones 5 a 7 son de color amarillo, las demás no presentaron color
en el momento de recolectar las fracciones.
38
Cuadro 9. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C2 de la fracción acetónica
del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora.
SISTEMA DE ELUCIÓN FRACCIONES
COLECTADAS
FRACCIONES REUNIDAS CLAVE
Agua (TFA)-Acetonitrilo 80:20 1-10 1-4 C2R1
Agua (TFA)-Acetonitrilo 7:3 11-40 5-6 C2R2
Metanol 100% 41 7-9 C2R3
10-12 C2R4
13 C2R5
14-15 C2R6
16 C2R7
17-19 C2R8
20-21 C2R9
22 C2R10
23-25 C2R11
26 C2R12
27-28 C2R13
29-40 C2R14
41 C2R15
5.5.2.3. Purificación de la fracción C3 de la fracción acetónica del extracto
metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora
La fracción R16 (0.26 g) denominada C3, se disolvió en metanol. Se realizó una
CCF-FR, en un sistema de elución con agua (TFA)-acetonitrilo 8:2. Posteriormente
fue gradualmente incrementándose la cantidad de acetonitrilo. Las fracciones
obtenidas fueron 51, las cuales se reunieron de acuerdo a la similitud de las bandas
reveladas en CCF, obteniendo así 12 fracciones (Cuadro 10). La fracción C3R3 (95
mg) se analizó por cromatografía líquida de alta resolución y se identificaron por
comparación de espectros de RMN de muestras de referencia y/o con datos de RMN
consultado en la literatura. Los espectros de RMN 1H y 13C fueron obtenidos en un
equipo Varian Innova de 400 MHz, se utilizó cloroformo deuterado (CDCl3) y metanol
deuterado (DMSO) como disolventes y tetrametilsilano como referencia interna. Esta
técnica espectroscópica nos permitió determinar el contenido total de hidrógenos y
carbonos que constituyen a las moléculas que se elucidaron. Los valores de
desplazamiento químico (δ) expresados en partes por millón (ppm), así como las
39
intensidades de las señales permitieron descifrar el tipo de grupos funcionales a los
que se encuentra unido cada Carbono o Hidrógeno. Para esto se analizaron los
experimentos: COSY que es la correlación de núcleos de la misma especie protón-
protón, NOESY es la correlación de núcleos a través del espacio, HMQC es la
correlación de núcleos heteronucleares por su desplazamiento químico a un enlace
de distancia, HSQC es la correlación heteronuclear a un enlace de distancia y HMBC
es la correlación heteronuclear a dos y tres enlaces de distancia.
Cuadro 10. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C3 de la fracción
acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora.
SISTEMA DE ELUCIÓN FRACCIONES
COLECTADAS
FRACCIONES REUNIDAS CLAVE
Agua (TFA)-Acetonitrilo 80:20 1-27 1-4 C3R1
Agua (TFA)-Acetonitrilo 7:3 28-44 5-7 C3R2
Metanol 100% 45-51 8 C3R3
9 C3R4
10 C3R5
11 C3R6
12-15 C3R7
16-23 C3R8
24 C3R9
25 C3R10
26 C3R11
27-51 C3R12
5.5.2.4. Purificación de la fracción C4 de la fracción acetónica del extracto
metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora
La fracción R18 (0.23 g) denominada C4, se disolvió en metanol. Se realizó una
CCF-FR, en un sistema de elución con agua (TFA)-acetonitrilo 80:20 y
posteriormente se incrementó la cantidad de acetonitrilo. Las fracciones obtenidas
fueron 27, las cuales se reunieron de acuerdo a la similitud de las bandas reveladas
en CCF, obteniendo así 8 fracciones (Cuadro 11). Las fracciones C4R2 (21 mg) y
C4R4 (12.8 mg) se analizaron por cromatografía líquida de alta resolución y RMN 1H.
40
Cuadro 11. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C4 de la fracción
acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora.
SISTEMA DE ELUCIÓN FRACCIONES
COLECTADAS
FRACCIONES REUNIDAS CLAVE
Agua (TFA)-Acetonitrilo 80:20 1-8 1-3 C4R1
Agua (TFA)-Acetonitrilo 7:3 9-25 4-7 C4R2
Metanol 100% 26-27 8-9 C4R3
10-12 C4R4
13-14 C4R5
15 C4R6
16-17 C4R7
19-27 C4R8
5.6. Cuantificación de aucubina
La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) se utilizó para analizar los
extractos y las fracciones, guiar la separación de compuestos en los procesos de
aislamiento, optimizar las condiciones para los procesos de cromatografía de
mediana presión y verificar la pureza de los productos aislados.
La cuantificación de aucubina en los extractos metanólicos de cada órgano de
plantas silvestres (inflorescencias, hojas, tallos y raíces) de C. tenuilfora y los cultivos
de raíces adventicias in vitro, se llevó acabo mediante la ecuación y=7575.9x +
248079 (R2=99958), la cual se obtuvo de una curva de regresión linear de áreas
obtenidas de las concentraciones (900, 450, 225 y 112 μg mL-1) del estándar
analítico, en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (Waters, Delta Prep.
4000), provisto con un detector de índice de refracción y un detector de arreglo de
diodos. Se utilizó una columna Lichrosphere RP-18 (250 x 4 mm, 5 μm, Merck)
empacada con material de fase reversa. La elución se llevó a cabo utilizando agua-
acetonitrilo 97:3 (A) y acetonitrilo (D) (Cuadro 12), aplicando un flujo constante de 1
mL min-1. El volumen de inyección fue de 20 μL y el tiempo de corrida de 32 min con
una longitud de onda de 205 nm.
41
Cuadro 12. Sistema de elución utilizado en la separación de iridoides glucosilados
por HPLC.
Tiempo (min) A (%) D (%)
0 100 0
8 100 0
9 80 20
10 80 20
11 70 30
15 70 30
16 40 60
23 20 80
25 20 80
26 0 100
28 0 100
29 100 0
32 100 0
5.7. Cuantificación de verbascósido e isoverbascósido
La cuantificación de los feniletanoides glicosilados verbascósido e isoverbascósido
en extractos metanólicos de cada órgano de plantas silvestres (inflorescencias,
hojas, tallos y raíces) de C. tenuilfora y los cultivos de raíces adventicias in vitro, se
llevó acabo mediante la ecuación y=22144x - 1614443 (R2=99965), la cual se obtuvo
de una curva de regresión linear de áreas obtenidas de las concentraciones (500,
250, 125 y 62.5 μg mL-1) del verbascósido aislado en el presente trabajo (≥94.0%
HPLC), en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (Waters, Delta Prep. 4000),
provisto con un detector de índice de refracción y un detector de arreglo de diodos.
Se utilizó una columna Lichrosphere RP-18 (250 x 4 mm, 5 μm, Merck) empacada
con material de fase reversa. La elución se llevo a cabo utilizando agua-acetonitrilo
97:3 (A) y acetonitrilo (B) (Cuadro 13), aplicando un flujo constante de 1 mL min-1. El
volumen de inyección fue de 20 μL y el tiempo de corrida de 17 min con una longitud
de onda de 330 nm.
42
Cuadro 13. Sistema de elución utilizado en la separación de feniletanoides
glicosilados por HPLC.
Tiempo (min) A (%) B (%)
0 100 0
2 77 23
3 77 23
11 70 30
13 70 30
14 0 100
15 0 100
16 100 0
17 100 0
5.8. Cuantificación de apigenina
La cuantificación de apigenina (flavona) en extractos metanólicos de cada órgano de
plantas silvestres (inflorescencia, Hoja, tallos y raíces) de C. tenuilfora, se realizó con
la ecuación y=70832x + 785112 (R2=99941), la cual se obtuvo de una curva de
regresión linear de las áreas obtenidas de las diferentes concentraciones (400, 200,
100, 50 y 25 μg mL-1) del estándar de apigenina, en un cromatógrafo de líquidos de
alta resolución (Waters, Delta Prep. 4000), provisto con un detector de índice de
refracción y un detector de arreglo de diodos. Se utilizó una columna LiChroCART®
RP-18e (125 x 4 mm, 5 μm, Merck) empacada con material de fase reversa. La
elución se llevo a cabo utilizando agua (A) y acetonitrilo (B) (Cuadro 14), aplicando
un flujo constante de 1 mL min-1. El volumen de inyección fue de 20 μL y el tiempo de
corrida de 28 min con una longitud de onda de 365 nm.
43
Cuadro 14. Sistema de elución utilizado en la separación de apigenina por HPLC.
Tiempo (min) A (%) D (%)
0 100 0
2 100 0
3 90 10
5 90 10
8 80 20
9 70 30
11 70 30
12 60 40
16 60 40
17 30 70
19 30 70
20 10 90
21 10 90
22 0 100
24 0 100
26 100 0
28 100 0
5.9. Inducción de raíces adventicias y cultivo in vitro de C. tenuiflora
Se utilizaron brotes in vitro de C. tenuiflora de 14 días de edad como fuente de
explantes (Salcedo-Morales et al., 2009). Los cultivos in vitro de raíces se iniciaron a
partir de los explantes de hojas en medio de cultivo B5 (Gamborg et al., 1968)
semisólido suplementado con 30 g L-1 de sacarosa, 10 M de ácido α-naftalenacético
(ANA) y 8 g L-1 de agar (Trejo-Tapia et al., 2011). El pH del medio se ajustó a 5.8
antes de la esterilización. Después de la inducción, las raíces fueron transferidas a
matraces Erlenmeyer de 50 mL con 10 mL de medio líquido B5 libre de auxina y las
raíces se subcultivaron cada 8 días durante 6 meses. Los cultivos se incubaron en la
oscuridad en un agitador rotatorio (120 rpm) a 25 ± 2°C.
Para los experimentos, se transfirieron segmentos de punta de raíces (1 cm de
longitud) a matraces Erlenmeyer de 50 ml con 10 mL de medio líquido B5
44
suplementado con 10 M de ácido indol-3-acético (AIA), 10 M ANA, 10 M de indol-
3-butírico (IBA) ó sin auxina (control). Cada semana se recolectaron raíces a partir de
tres matraces Erlenmeyer individuales, hasta los 37 días de cultivo. Para determinar
la biomasa, las raíces obtenidas en cada matraz Erlenmeyer, se liofilizaron y se
pesaron para obtener la biomasa seca (BS). Para el análisis químico, las raíces
liofilizadas se molieron hasta un polvo fino y se procesaron como se describe en la
sección 5.2. Se realizaron observaciones microscópicas en un microscopio
estereoscópico (modelo SMZ1500, Nikon Instruments Inc., Japón) con zoom de 0.75.
Las imágenes digitales se capturaron con una cámara de 3 CCD RealView (Dage-
MTI, Michigan, EE.UU.).
5.10. Determinación de parámetros cinéticos
A partir de los resultados de la cinética de crecimiento, se calcularon la velocidad
específica de crecimiento (μ, días-1), el tiempo de duplicación (td, días) y el índice de
crecimiento (IC) de acuerdo con las siguientes ecuaciones:
μ = ln (XF/X0) / t (2)
td = ln 2 / μ (3)
Donde X0 y XF son las cantidades de biomasa de raíces al inicio y al final del intervalo
de período del cultivo (g L-1), respectivamente; t es el intervalo de tiempo de cultivo
(días), td es el tiempo de duplicación (días) y μ es la tasa de crecimiento específico
(día -1).
El índice de crecimiento se calculó de la siguiente manera:
IG = (XF-X0) / X0 (4)
donde XF y X0 son la biomasa de raíces final e inicial, respectivamente.
45
5.11. Análisis estadístico
Los datos se analizaron por ANOVA de una sola vía, y la prueba de Holm-Sidak se
utilizó para las comparaciones múltiples entre las medias. El nivel de significancia
para todas las pruebas estadísticas fue de 5%. Los análisis estadísticos se realizaron
con SigmaPlot para Windows versión 11.0 (Systat Software Inc., San Jose, CA,
EE.UU.).
46
6. RESULTADOS
6.1. Evaluación de protocolos de extracción
La figura 8 muestra la CCF de los extractos metanólicos de inflorescencias y raíces
en comparación con la aucubina (estándar analítico) revelada con el HS. Las bandas
de color café indicaron la presencia de aucubina, demostrandose que este tipo de
compuesto puede ser extraído con los tres procesos de extracción evaluados. En la
infusión se obtuvieron rendimientos de 15.75% en raíces y 47.7% en inflorescencias.
Con metanol por 24 h los rendimientos fueron 11.17% para raíces y 33.85% para
inflorescencias.
A B C D E
Figura 8. Cromatografia en capa fina de extractos metanólicos (por 24 h) e infusiones de C.
tenuiflora. A. Infusión de raíces; B. Extracto metanólico de raíces; C. Aucubina; D. Infusión
de inflorescencias; E. Extracto metanólico de inflorescencias. Revelador HS. CCF fase
normal. Fase móvil: CHCl3/MeOH/H2O 7:2.5:0.5.
Debido a que la maceración con metanol nos permitió obtener el mismo perfil de
iridoides que una infusión pero sin la extracción exhaustiva de productos del
metabolismo primario, se decidió utilizar metanol para el análisis químico en todos los
órganos colectados de la planta, así como la extracción en baño María, porque ésta
se realiza en corto tiempo (30 min).
47
En la figura 9, se muestran CCF de los extractos metanólicos de inflorescencia,
hojas, tallos y raíces obtenidos en baño María a 60ºC por 30 min. Al comparar los
perfiles de los compuestos entre órganos, podemos observar una banda que produce
fluorescencia de color azul en todos los extractos cuando la placa fue expuesta a luz
UV (365 nm) (Figura 9-A). Éstos compuestos se aislaron e identificaron por RMN 1H
y 13C, por lo cual esta fluorescencia azul indicó la presencia de feniletanoides
glicosilados. Al revelar la placa con HS se observó una banda amarillo ocre en todos
los organos de la planta (Rf 0.3) la cual coincide con el Rf de la aucubina (Auc)
(Figura 9-B); ésta banda se observó mas intensa en las inflorescencias y raíces. Se
obtuvieron bandas de color azul Copenhague en todos los extractos, lo cual indicó la
presencia de otros iridoides menos polares que la aucubina (Rf 0.6). En la figura 9-C,
se observa la CCF revelada con el reactivo difenilboriloxietilamina en polietilenglicol
(NP/PEG); las bandas de color amarillo indican la presencia de flavonoides,
principalmente en inflorescencia, hojas y raíces. En base a esta información, se
procedió a fraccionar el extracto metanólico de tallos porque está constituido
principalmente por iridoides y el extracto metanólico de raíces para aislar los
feniletanoides glicosilados.
Figura 9. Cromatografía en capa fina de extractos metanólicos de plantas silvestres de C.
tenuiflora. Maceración con metanol a 60oC en baño María por 30 min. A. CCF en luz UV 365
nm. B. CCF revelada con HS. C. CCF revelada con NP/PEG. I: Inflorescencia, H: Hojas, Auc:
Aucubina, T: Tallos, R: Raíces. CCF de fase normal. Fase móvil: CHCl3 – MeOH–H2O
7:2.5:0.5.
A
B
Rf 0.6
C
I H Auc T R I H Auc T R I H Auc T R
48
6.2. Identificación de apigenina en tallos silvestres de C. tenuiflora
En la figura 10, se comprueba la presencia de apigenina aislada en la fracción T9 (16
mg). La cual se obtuvo a partir de la fracción de acetato de etilo de tallos (Figura 7).
Se analizó por cromatografía líquida de alta resolución (Anexo 7) y se comparó con el
estándar analítico de apigenina, la cual tuvo un tiempo de retención de 15.23 min (λ=
225, 267.5 y 338,6 nm).
A B C
Figura 10. Cromatografía en capa fina de compuestos aislados del tallo (Luz UV 365
nm). A. Fracción FT9; B. Mezcla apigenina/fracción FT9. C. Apigenina. CCF de fase
normal. Revelada con NP/PEG. Fase móvil: CHCl3/MeOH 8:2.
6.3. Identificación de aucubina y bartsiósido en tallos silvestres de C.
tenuiflora
Se obtuvieron las fracciones T19b y T22a a partir de la purificación de la fracción de
acetato de etilo de tallos de C. tenuiflora. En los cuadros 15 y 16 se muestran los
desplazamientos químicos y las constantes de acoplamiento obtenidas mediante el
análisis de los datos espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) de las fracciones
T19b y T22a, respectivamente. Estos resultados se compararon con datos
previamente reportados para iridoides (Boros y Stermitz, 1990) lo que permitió
confirmar que corresponden al bartsiósido y aucubina, respectivamente. La diferencia
principal entre éstos iridoides glucosilados corresponde al hidroxilo ubicado en la
posición 6 (Figura 11).
49
Figura 11. Estructura química de aucubina y bartsiósido aislados de tallos silvestres
de C. tenuiflora.
Cuadro 15. Valores de desplazamiento químico del protón (δ, ppm) de aucubinaa
(CD3OD).
aDatos en
1H (400 MHz)
b Ver Fig. 11 para la numeración
Entre paréntesis está la multiplicidad y constante de acoplamiento (J, valores en Hz)
Posición del
carbonob Aucubina
1H (J) teórico
(ACD/HNMR)
1H (J) experimental
1 5.24
2
3 6.16 6.30 (dd 1.6, 6.4)
4 5.04 5.08 (dd 3.6, 6.4)
5 2.85 2.88 (6.8)
6 4.50 4.43 (dd 2, 3.2)
7 6.04 5.7 ( d 2)
8
9 3.11
10 4.25 4.32 (d 15.6)
Glucosa 1 4.70 4.67 (d 7.6)
2 3.44 3.42 (8.8)
3 3.53 3.61 (2)
4 3.03
5 3.60
6 3.69
3.85
3.66 (d 5.2)
3.87 (d 2.4)
50
Cuadro 16. Valores de desplazamiento químico del protón (δ, ppm) de bartsiósidoa
(CD3OD).
Posición del
carbonob Bartsiósido
1H (J) teórico
(ACD/HNMR)
1H (J) experimental
1 5.24 5.14 (d 6.4)
2
3 6.29 6.26 (dd 2,1.6)
4 4.93 4.68 (d 5.2)
5 3.75 3.69 (d 7.2)
6 2.1 2.08 (dd 1.6)
7 5.7 5.7 (d 1.2)
8
9 2.55 2.62 (dd 16.4,16.4)
10 4.23
4.28
4.16 (d 14.4)
4.27 (d 14)
Glucosa 1 4.7 4.66 (d 4.8)
2 3.44 3.43 (3.2)
3 3.52 3.48
4 3.09 2.9
5 3.6 3.6
6 3.7
3.85
3.8
3.8 a Datos en
1H (400 MHz)
b Ver Fig. 11 para la numeración
Entre paréntesis está la multiplicidad y constante de acoplamiento (J, valores en Hz)
6.4. Identificación de feniletanoides glicosilados en raíces silvestres de C.
tenuiflora
A partir de la purificación de la fracción acetónica de las raíces, se obtuvo la fracción
C3R3. En el cuadro 15 se muestran los desplazamientos químicos y las constantes
de acoplamiento de la fracción C3R3 obtenidas por RMN de 1H (500 and 300 MHz,
respectivamente) y 13C (125 and 75 MHz, respectivamente), además se analizaron
los espectros de 1H–1H COSY (Figura 13-17), 1H–1H NOESY, 1H–13C HSQC (Anexo
4 y 5) y 1H–13C HMBC (Figura 19), con los cuales se asignaron los protones y
carbonos de la molécula estudiada. Estos resultados también fueron comparados con
51
datos previamente descritos (Andary et al., 1982; Li et al., 2005) y se confirmó la
presencia del verbascósido aislado de las raíces silvestres de C. tenuiflora.
Del primer fraccionamiento de la fracción acetónica de las raíces se aisló de la
fracción R19’ un precipitado blanco (soluble en cloroformo), el cual se analizó por
RMN de 1H y 13C y se identificó como isoverbascósido. La diferencia principal entre el
verbascósido y el isoverbascósido es la ubicación del ácido cafeico en la molécula de
glucosa (resaltado en negritas en el cuadro 17).
Figura 12. Estructuras químicas de los feniletanoides glicosilados: verbascósido e
isoverbascósido aislados de raíces silvestres de C. tenuiflora.
52
Cuadro 17. Valores de desplazamiento químico del protón y carbón (δ, ppm) de
verbascósidoa e isoverbascósidob (CD3OD).
Posición
del carbonoc
Verbascósido Isoverbascósido
1H (J) 13C 1H (J) 13C
Aglicona 1 131.5 131.4
2 6.69 (d,2) 117.1 6.68 (d,2.1) 117.1
3 146.1 146.1
4 144.6 144.7
5 6.66 (d,8) 116.3 6.66 (d,7.5) 116.3
6 6.55 (dd,2,8) 121.2 6.55 (dd,2.4,7.8) 121.2
7 2.76 (ddd,3.5,7,14), 36.5 2.78 (m), 36.6
2.80 (ddd,3,7,14) 2.78 (m)
8 3.71 (ddd,6.5,7,8), 72.2 3.68 (m), 72.2
4.04 (ddd,3,6.5,8) 3.72 (m)
Glucosa 1 4.36 (d,8) 104.2 4.36 (d,8.1) 104.3
2 3.38 (dd,9.5,7.5) 76.2 3.35 (m) 76.3
3 3.81 (t,9.3) 81.6 3.81 (t,10.5,3) 78.1
4 4.91 (t,9.5) 70.6 3.4-3.5 (m) 70.4
5 3.52 (m) 76.0 3.60 (m) 76.0
6 3.54 (m), 62.3 4.46 (m), 65.1
3.60 (d,10) 4.28 (m)
Ácido cafeico 1’ 127.6 127.6
2’ 7.04 (d,2) 115.2 7.04 (d,2.1) 115.2
3’ 146.8 146.8
4’ 149.7 149.8
5’ 6.77 (d,8) 116.5 6.76 (d,8.1) 116.5
6’ 6.95 (dd,2,8) 123.1 6.96 (dd,2.7,8.1) 123.2
7’ 7.58 (d,16) 148.0 7.59 (d,16.2) 148.0
8’ 6.26 (d,16) 114.7 6.26 (d,15.9) 114.7
9’ 168.2 167.9
Ramnosa 1 5.18 (d,2) 103.0 5.173 (s) 102.2
2 3.91 (dd,2,3) 72.3 3.90 (m) 72.3
3 3.56 (dd,3,9.5) 70.4 3.567 (m) 70.4
4 3.28 (t,9.5) 73.8 3.5-3.8 (m) 73.8
5 3.55 (m) 72.0 4.00 (m) 72.0
6 1.08 (d,6) 18.4 1.17 (d,6) 18.0 a Datos en
1H (500 MHz) y
13C (125 MHz)
b Datos en
1H (300 MHz) y
13C (75 MHz)
c Ver Fig. 12 para la numeración
Entre paréntesis está la multiplicidad y constante de acoplamiento (J, valores en Hz)
53
Figura 13. Espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD) del verbascósido aislado del
extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora. Ampliación de las zonas
indicadas junto con la estructura. Azúl: protones del ácido cafeico y la aglicona;
Amarillo: protón de la ramnosa.
54
Figura 13 (continuación). Espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD) del verbascósido
aislado del extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora. Ampliación de las
zonas indicadas junto con la estructura. Azúl: protones de la aglicona; Amarillo:
protones de glucosa y ramnosa.
55
Figura 13 (continuación). Espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD) del verbascósido
aislado del extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora. Ampliación de las
zonas indicadas junto con la estructura. Azúl: protón de la aglicona; Amarillo:
protones de glucosa y ramnosa.
56
Figura 13 (continuación). Espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD) del verbascósido
aislado del extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora. Ampliación de las
zonas indicadas junto con la estructura. Azúl: protón de la aglicona; Amarillo: protón
de la ramnosa.
57
Se utilizó el experimento 1H-1H COSY para identificar el tipo y orientación espacial de
los azúcares presentes en el compuesto aislado (fracción C3R3). Se identificó el
protón anomérico (H-1) desplazado a 4.36 ppm con una constante de acoplamiento
J= 8.0 Hz que correlaciona con una señal desplazada a 3.38 ppm (J= 9.5, 7.5 Hz)
identificada como el H-2. La correlación de este protón con la señal presente en 3.81
ppm (J= 9.3) nos mostró la ubicación del H-3 de este azúcar. Los protones H-4, H-5,
H6a y H6b de este azúcar fueron ubicados mediante el mismo tipo de correlaciones
mostradas en la figura 14. Tanto los desplazamientos químicos como las constantes
de acoplamiento de este azúcar corresponden a una molécula de β-D-glucopiranosa.
Figura 14. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la secuencia
de espines de la glucosa.
58
La molécula de α-L-ramnopiranosa fue determinada mediante el mismo tipo de
correlación entre el acoplamiento vecinal del protón anomérico ubicado en 5.18 ppm
(J= 2.0 Hz) con la señal presente en 3.91 ppm (J=2, 3Hz) que correlaciona a su vez
con la señal dd ubicada en 3.3 ppm (J=3, 9.5). Las señales correspondientes a H-4,
H-5 y el metilo de la α-L-ramnopiranosa fueron ubicadas en 3.28 (J= 9.5 Hz), 3.55
(m) y 1.08 (J=6.0 Hz) ppm respectivamente (Figura 15).
Figura 15. Expansión del espectro COSY junto a la estructura del verbascósido
mostrando la secuencia de espines de la ramnosa.
59
Figura 15 (continuación). Expansión del espectro COSY junto a la estructura del
verbascósido mostrando la secuencia de espines de la ramnosa.
La molécula de la aglicona se determinó mediante el experimento 1H-1H COSY
(Figura 16 y 17). Se identificó la correlación entre el acoplamiento vecinal del
hidrógeno H-8a (3.71 ppm, J= 6.5, 7, 8) y H-8b (4.04 ppm, J= 3, 6.5, 8) con el H-7
desplazado a 2.8 ppm (J= 3, 7, 14). Los protones H-2, H-5, H6 de los anillos benceno
de la aglicona y el ácido cafeico se ubicaron mediante el mismo tipo de correlaciones
mostradas en la figura 16.
60
Figura 16. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la secuencia
de espines de la aglicona.
61
Figura 17. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la secuencia
de espines del anillo benceno éstos compuestos fenólicos.
Los espectros de 13C RMN (Figura 18) del compuesto aislado en la fracción C3R3
indicaron la presencia de 29 señales, de las cuales seis carbonos corresponden para
la β-D-glucopiranosa, seis para la α-L-ramnopiranosa, ocho para el feniletanoide y
nueve del ácido cafeico, de los cuales uno corresponde a un carbonilo C-9’ (δ 168.2).
La unión entre el ácido cafeico y la glucosa se determinó mediante el espectro de
HMBC (Figura 18) al observar que el H-4 de la glucosa (J = 9.5 Hz) presenta una
correlación con el C-9’ (δ 168.2) a dos ligaduras. De la misma manera se determinó
la union entre el hidrógeno H-8 (J = 6.5, 7, 8 Hz) del feniletanoide y el carbon C-1 (δ
104.2) de la glucosa.
62
La unión interglicosídica se determinó mediante el espectro HMBC (Figura 19) al
observar que el hidrógeno H-3 (J= 9.3) de la glucosa presenta correlación con el
carbono C-1 (δ 103.0) de la ramnosa.
Figura 18. Espectro del 13C y expansión del espectro HMBC junto a la estructura del
verbascósido mostrando la unión del carbono C-9 del ácido cafeico con el hidrogeno H-4 de
glucosa.
63
Figura 19. Expansión del espectro HMBC del verbascósido mostrando la unión del carbono
e hidrogeno de glucosa y ramnosa
Las fracciones 30 hasta 35, que se denominó C4, obtenidas de la fracción acetónica
de las raíces, al analizarse por CCF revelaron compuestos menos polares que el
verbascósido (una banda es de color amarillo ocre). Se analizaron por RMN 1H la
fracción C4R2 y C4R4 (Anexo 5 y 6). Los espectros demostraron la posible presencia
de otro feniletanoide glicosilado mezclado con otros compuestos, que no permitieron
la identificación.
6.5. Cuantificación de aucubina, verbascósido, isoverbascósido y apigenina
en plantas silvestres
El establecimiento de una metodología de análisis cuantitativo por HPLC utilizando
los productos comerciales (aucubina y apigenina), así como los productos aislados
64
verbascósido e isoverbascósido como estándares permitieron obtener curvas de
calibración adecuadas R2=0.99, 0.99, 0.99 y 0.99, respectivamente. En el cuadro 18
se presenta la concentración de aucubina, verbascósido, isoverbascosido y
apigenina en diferentes órganos de las plantas silvestres. La concentración de
aucubina varió entre 0.81 ± 0 (hojas) y 22.69 ± 1.29 (raíces) mg g-1 BS. El
verbascósido se acumuló principalmente en las raíces e inflorescencias (9.23 ± 0.07
y 7.88 ± 0.01 mg g-1 BS, respectivamente) y el isoverbascósido fue abundante en las
raíces (7.13 ± 0.07 mg g-1 BS). Las hojas y tallos acumularon bajas concentraciones
de éstos dos FG. La apigenina se acumuló principalmente en las hojas y no se
detectó en las raíces. Como la raíz fue el principal órgano de acumulación de la
acubina y los FG, se estableció el cultivo de raíces in vitro de C. tenuiflora y se
determinó su capacidad de sintetizar dichos compuestos.
Cuadro 18. Concentración de aucubina, feniletanoides y apigenina en los diferentes
órganos de plantas silvestres de C. tenuiflora.
Órgano de la planta Aucubina Verbascósido Isoverbascósido Apigenina
Raíces 22.69 ± 1.29 9.23 ± 0.07 7.13 ± 0.07 N.D.
Tallos 1.59 ± 0.08 0.39 ± 0.07 0.35 ± 0.01 0.05 ± 0.04
Hojas 0.81 ± 0 0.54 ± 0.01 0.42 ± 0.01 1.60 ± 0.004
Inflorescencias 14.01 ± 0.25 7.88 ± 0.01 0.52 ± 0.01 0.02 ± 0.001
La concentración de los compuestos químicos se reporta en mg g-1 biomasa seca. Los
valores son la media ± error estándar de tres determinaciones.
6.6. Inducción de raíces adventicias y cultivos in vitro de C. tenuiflora
La rizogénesis indirecta se observó sobre la superficie de los explantes de hoja
después de una semana de cultivo, en el medio B5 suplementado con 10 M de
ANA. A los 21 días, las raíces adventicias se desarrollaron completamente (Figura
20-A). Las raíces adventicias se transfirieron a medio líquido B5 sin regulador de
crecimiento (SRC), donde se observó crecimiento y desarrollo de raíces laterales
(Figura 20-B); para el mantenimiento del cultivo se renovó el medio de cultivo cada 8
65
días. En medio con IBA (24.6 μM) a los 30 días de cultivo, los explantes de raíz se
oxidaron y el medio se tornó café (Figura 20-C). En el medio SRC se formaron brotes
(Figura 20-D).
Figura 20. Inducción de raíces adventicias in vitro de C. tenuiflora. A. Formación de raíces
adventicias en explantes de hoja después de 21 días de estar en contacto con medio de
cultivo B5 suplementado con 10 μM de ANA. B. Raíces adventicias subcultivadas cada 8
días en medio líquido B5, sin regulador de crecimiento. C. Raíces en medio B5 con IBA (24.6
μM) a los 30 días. D. Formación de brotes en raíces crecidas durante 30 días en medio B5
sin regulador de crecimiento. Barras=1 cm.
En la figura 21, se observa la morfología de las raíces laterales obtenidas en medios
que contienen AIA, ANA y sin regulador de crecimiento. El AIA promovió
hinchamiento y callogénesis en los explante y posteriormente la formación de raíces
laterales de color amarillo pálido (Figura 21-A), éstas raíces se alargaron a través del
tiempo (Figura 21-B). Por el contrario, en el medio con ANA, las raíces fueron
inicialmente verdes y desarrollaron pocas raíces laterales (Figura 21-B), pero a los 30
días también se observó un desarrollo de raíces laterales, además de alargarse,
éstas a su vez generaron nuevas raíces laterales (Figura 21-C). En un medio libre de
C D
66
auxinas, hubo elongación en lugar de desarrollo de las raíces laterales y el grado de
desarrollo de raíces fue menor que el observado en el medio que contiene auxina
(Figura 21-D y 21-E). Al final del período de cultivo en el medio SRC, se formaron
brotes y en las raíces se desarrollaron protuberancias (Figura 21-F). Estos resultados
indican que las auxinas afectan la morfología de las raíces de C. tenuiflora cultivadas
in vitro.
Figura 21. Morfología de las raíces adventicias de C. tenuiflora cultivadas in vitro. A – C – E.
A los 9 días, inducción de raíces en medio liquido B5; A. 10 μM AIA, C. 10 μM ANA y E. sin
regulador de crecimiento. B – D – F. A los 30 días, crecimiento y desarrollo de raíces
laterales en medio liquido B5; B. 10 μM AIA, D. 10 μM ANA y F. sin regulador de crecimiento.
Las flechas señalan las “protuberancias” en las raíces que crecieron en medio liquido B5 sin
regulador de crecimiento. Barras=1 cm.
67
En la figura 22, se muestra el comportamiento cinético de cultivos in vitro de raíces
de C. tenuiflora. En la primera semana del cultivo, la biomasa seca de las raíces fue
similar entre todos los tratamientos. Entre los 9 y 30 días, hubo un aumento
exponencial de la biomasa en el medio con AIA ó ANA. La velocidad específica de
crecimento (μ) en el medio con AIA fue de 0.92 días-1, mientras que en el medio con
ANA fue de 1.01 días-1. El mayor rendimiento de biomasa seca fue con la auxina AIA
a los 30 días (30 g L-1). Este valor fue de 1.5 y 2.3 veces más alto (P <0,05) que lo
obtenido en un medio con ANA o sin regulador de crecimiento (control),
respectivamente. Al final del periodo del cultivo (37 días), las raíces cultivadas en el
medio de cultivo con AIA mostraron el índice de crecimiento más alto (74). En el
medio sin regulador de crecimiento, se formaron brotes a los 30 días. Al final del
período de cultivo, la biomasa de raíces secas en el medio SRC fue similar a la de
las raíces en el medio que contenía ANA (16 g L-1).
Figura 22. Cinética del cultivo de raíces adventicias de C. tenuiflora en medio líquido B5
suplementado con 10 M de AIA ó ANA ó sin regulador de crecimiento (control), según sea
el tratamiento. Los valores son la media error estándar de tres determinaciones.
68
6.7. Cuantificación de aucubina, verbascósido e isoverbascósido en
cultivos in vitro de raíces adventicias de C. tenuiflora
El análisis por HPLC confirmó que los cultivos de raíces C. tenuiflora acumularon
verbascósido e isoverbascósido (Figura 23-A), los cuales son los principales FG que
se identificaron en las raíces de plantas silvestres C. tenuiflora (Fig. 23-B). El perfil de
HPLC sugirió que el isoverbascósido es el FG mayoritario en cultivos de raíces in
vitro, mientras que el verbascósido se acumuló principalmente en las raíces
silvestres.
En los cultivos de raíces in vitro de C. tenuiflora, las raíces que crecieron en medio
suplementado con AIA contenía la mayor concentración específica de FG (Figura
24). La concentración máxima de verbascósido fue 14.62 mg g-1 biomasa seca
(438.6 mg L-1) y se obtuvo a los 30 días del cultivo (Figura 24-A). Esto fueron dos
veces mayor (P <0,05) que la concentración máxima en el control (7.13 mg g-1, que
corresponde a 92.69 mg L-1 a los 23 días). En el medio que contenía ANA, las raíces
acumularon bajos niveles de verbascósido (1,09 mg g-1 biomasa seca). Las raíces
cultivadas en un medio que contenía AIA mostraron el mayor rendimiento específico
de isoverbascósido (Figura 24-B) con una concentración máxima de 37.32 mg g-1 a
los 23 días (522.48 mg L-1). Este valor fue cinco veces mayor (P <0,05) que el
máximo en el control (7.27 mg g-1 correspondiente a 91 mg L-1) y seis veces mayor (P
<0,05) que en medio con ANA (6.61 mg g-1 correspondientes a 132.2 mg L-1). Los
niveles de trazas de verbascósido e isoverbascósido también fueron detectados en el
medio de cultivo, pero la concentración fue inferior a la mínima detectada por el
método HPLC (datos no mostrados). Así como verbascósido e isoverbascósido, las
raíces de C. tenuiflora también acumularon otros feniletanoides glicosilados que
podrían ser identificados en futuras investigaciones.
69
Figura 23. Cromatogramas de CLAR (detección a los 330 nm) de extractos metanólicos de
C. tenuiflora. A. Extractos de raíces adventicias cultivadas in vitro en medio líquido B5
suplementado con AIA, después de 30 días. B. Extractos de raíces silvestres. Picos: (1)
Verbascósido. (2) Isoverbascósido. Cuadro insertado: espectro de absorción UV de 1 y 2.
70
Figura 24. Producción de feniletanoides glicosilados en raíces adventicias de C. tenuiflora
cultivadas en medio líquido B5 suplementado con AIA, ANA ó SRC. A. Verbascósido. B.
Isoverbascósido. Los valores son la media error estándar de tres determinaciones.
B
A
71
7. DISCUSIÓN
Este trabajo de investigación se realizó el estudio químico de las raíces y tallos de
material vegetal silvestre de C. tenuiflora. La elucidación estructural de los
compuestos mayoritarios (iridoides en los tallos y feniletanoides en las raíces) nos
permitió utilizarlos como referencia para el desarrollo de metodologías de análisis
cualitativo y cuantitativo por CCF y CLAR, respectivamente. Estos procesos
cromatográficos fueron indispensables para realizar el estudio comparativo de
constitución química entre el material vegetal silvestre y el material obtenido por
cultivo in vitro. El fraccionamiento cromatográfico del extracto metanólico de las
raíces y la posterior purificación de algunas fracciones de este proceso generó el
aislamiento de dos compuestos que al ser analizados por RMN de 1H y 13C fueron
identificados como los feniletanoides glicosilados: verbascósido e isoverbascósido. El
mismo tipo de procesos cromatográficos y espectroscópicos realizados sobre el
extracto metanólico de los tallos de esta especie vegetal (material vegetal silvestre) y
sus componentes mayoritarios generó el aislamiento y elucidación estructural de los
iridoides acubina y batsiósido así como del flavonoide apigenina. Estos compuestos
se distribuyen de forma desigual entre los diferentes órganos de la planta. En las
raíces se acumula principalmente aucubina y feniletanoides glicosilados, siendo la
aucubina mayoritaria. En la hoja se encuentra la mayor concentración de apigenina.
La tecnología in vitro ofrece varias ventajas, entre las cuales está la de extraer y
purificar de manera simple, compuestos químicos con calidad estándar a partir de
materia vegetal que crece con independencia de los factores climáticos, libre de
microorganismos y con menor variabilidad comparada con las plantas silvestres
(Lubbe y Verpoorte, 2011). Por lo tanto, se estableció el cultivo de raíces adventicias
de C. tenuiflora utilizando diferentes auxinas (ANA y AIA) y se cuantificaron los IG y
FG. Los cultivos de raíces adventicias producen niveles más altos de FG que las
72
plantas silvestres pero concentraciones menores de aucubina. Las raíces cultivadas
en medio que contiene AIA, acumularon las mayores concentraciones de FG.
Los feniletanoides glucosilados son marcadores taxonómicos de las plantas en el
orden Lamiales, que incluye la familia Orobanchaceae (Scogin, 1992). La presencia
de éstos compuestos puede estar restringida debido a que el alcohol 3,4-
dihidroxifenetil (hidroxitirosol) de los FG es raro entre los metabolitos secundarios
(Saimaru y Orihara, 2009). En el género Castilleja, el verbascósido ha sido reportado
en Castilleja integra (Gardner et al., 1987), mientras que el verbascósido e
isoverbascósido fueron reportados en Castilleja linariaefolia (Pettit et al., 1990). En
las plantas silvestres de C. tenuiflora, la mayor concentración de verbascósido se
encontró en la raíz, seguido de las inflorescencias, mientras que isoverbascósido se
encuentra casi exclusivamente en la raíz.
La distribución espacial del verbascósido y del isoverbascósido en los órganos de C.
tenuiflora puede ser el resultado de la regulación genética, como se observa para los
compuestos fenólicos en las especies relacionadas. En Cistanche deserticola
(Orobanchaceae), la expresión del gen CdPAL1 se correlacionó con la acumulación
de compuestos fenólicos totales en las flores, tallos y raíces (Hu et al., 2011). La
expresión de CdPAL1 fue mayor en las flores que en la raíz, y el nivel de expresión
mayor en las flores se asoció con su alto contenido de compuestos fenólicos. Se han
realizado estudios sobre la biosíntesis de FG en C. deserticola donde se demostró
que la fracción cafeoil es biosintetizada a partir de la fenilalanina a través de la vía de
cinamato y el alcohol 3,4-dihidroxifenetil es biosintetizado de la tirosina (Ouyang et
al., 2005; Hu et al., 2011), otro estudio realizado en Olea europaea (Oleaceae)
concuerda con esta propuesta de ruta de biosíntesis (Saimaru y Orihara, 2009). Por
lo tanto, la PAL puede ser una enzima clave en la biosíntesis de los FG en Castilleja.
Actualmente no hay reportes sobre la biosíntesis de éstos compuestos en Castilleja.
En la Biblioteca Digital de Medicina Tradicional Mexicana (2009), mencionan que las
inflorescencias y ramas de C. tenuiflora se usan como infusión. La identificación de
73
verbascósido en las inflorescencias de C. tenuiflora puede estar asociada con su uso
en los remedios tradicionales para el tratamiento de enfermedades respiratorias (tos,
por ejemplo), inflamación del intestino y dolencias gástricas (por ejemplo, colitis y
cólicos hepáticos) (Béjar et al., 2000; Nazemiyeh et al., 2008; Mazzon et al., 2009;
Esposito et al., 2010; Singh et al., 2010).
Las auxinas exógenas fueron necesarias para la inducción de raíces en el cultivo in
vitro de C. tenuiflora, también es el caso de otras especies estrechamente
relacionadas, tales como Ocimum sactum L. (Lamiaceae) (Shilpa et al., 2010) y
Lavandula pedunculata (Lamiaceae) (Zuzarte et al., 2010). La necesidad de auxinas
exógenas para la inducción de raíces pudo ser debida a la ausencia de primordios en
aquellas raíces que crecieron en medio de cultivo libre de auxinas por una síntesis
insuficiente de hormonas endógenas (Kim et al., 2003). Aunque el AIA y ANA
indujeron la formación de raíces laterales y un aumento en la biomasa de raíces, la
mejor respuesta de C. tenuiflora se logró con la auxina AIA. Como se reportó en otros
trabajos, los efectos de las auxinas exógenas sobre la morfología y el crecimiento de
los cultivos de raíces dependen de factores como el genotipo, la fuente de explante,
el medio de cultivo, entre otros (Sorin et al., 2005; Aloni et al., 2006; Fukaki et al.,
2007). Por ejemplo, ANA inhibió el desarrollo de las raíces laterales en el cultivo de
raíces de Hypericum perforatum (Hyperiaceae) (Cui et al., 2010). En Cichorium
litybus (Asteraceae), la mayor velocidad de enraizamiento se obtuvo mediante una
combinación de ANA e IBA (Nandagopal y Ranjitha-Kumari, 2007), en lugar de las
auxinas solas. En los cultivos de raíces transformadas de Rehmannia glutinosa
(Scrophulariaceae), AIA fue más efectivo que el ANA ó IBA para promover el
crecimiento (Hwang, 2005).
Las protuberancias que se observaron en las raíces de C. tenuiflora que crecieron en
medio libre de auxinas, podría suponerse que son haustorios, órganos que están
especializados para la fijación y la penetración de las raíces hospederas, que han
sido reportados en cultivos in vitro de raíces en especies estrechamente
74
relacionadas, tales como la hemiparásita Triphysaria versicolor (Orobanchaceae)
(Tomilov et al., 2005).
Los cultivos de raíces adventicias de C. tenuiflora acumularon verbascósido e
isoverbascósido en medio libre de auxina y en medio con AIA, mientras que ANA
parece afectar adversamente el metabolismo relacionado con la producción de FG.
Sin embargo, la concentración de aucubina fue menor a 0.1 mg g-1 BS. Este es uno
de los pocos reportes en donde los cultivos de tejidos in vitro producen mayores
cantidades de verbascósido e isoverbascósido que sus contrapartes, las plantas
silvestres (Wysokinska y Rozga, 1998; Estrada-Zúñiga et al., 2009; Stancheva et al.,
2011). El ANA influye negativamente en la acumulación de algunos metabolitos
secundarios, incluyendo compuestos fenólicos en los cultivos de raíces de H.
perforatum (Cui et al., 2010), las naftoquinonas en Impatiens balsamina
(Balsaminaceae) (Sakunphueak y Panichayupakaranant, 2010) y saponinas de
Panax ginseng (Araliaceae) (Kim et al., 2003). En otros estudios, el ANA influyó
positivamente en la acumulación de plumbagina (naftoquinona) en cultivos de raíces
peludas de Plumbago indica (Plumbaginaceae) (Gangopadhyay et al., 2011). Del
mismo modo, el AIA afectó positivamente la acumulación de la rutina (flavonoide) en
las raíces adventicias de Morus alba (Lee et al., 2011). Los diferentes efectos de las
auxinas en el metabolismo secundario en los cultivos de raíces también se asocian
con cambios en la especialización y la morfología celular (Kim et al., 2003; Cui et al.,
2010).
La acumulación de feniletanoides glicosilados en cultivos de raíces adventicias de C.
tenuiflora está asociado con el crecimiento. Esto también se reportó en los cultivos de
células en suspensión de Buddleja cordata (Estrada-Zúñiga et al., 2009) y
Harpagophytum procumbens (Georgiev et al., 2011b; Stancheva et al., 2011). El
rendimiento volumétrico del verbascosido (438.6 mg L-1) a partir de cultivos de raíces
adventicias de C. tenuiflora fueron mayores a los reportados para los cultivos de
raíces transformadas de Gmelina arborea (Verbenaceae) [3.64 mg L-1] (Dhakulkar et
al., 2005), H. procumbens (Pedaliaceae) [56.84 mg L-1] (Grabkowska et al., 2010) y
75
Verbascum xanthophoeniceum (Scrophulariaceae) [298.83 mg L-1] (Georgiev et al.,
2011c) e inferior a lo reportado en Paulownia tomentosa (Scrophulariaceae) [1 g L-1]
(Wysokinska y Rozga, 1998).
La concentración de verbascósido fue mayor en las plantas silvestres, mientras que
el isoverbascósido fue el principal compuesto en el cultivo de raíces adventicias.
Estas diferencias entre plantas silvestres y cultivos in vitro se han observado también
en otros sistemas, por ejemplo, el clon de HP-3 de las raíces peludas de H.
procumbens (Pedaliaceae) (Grabkowska et al., 2010) y las raíces peludas de V.
xanthophoeniceum (Georgiev et al., 2011c). Los cultivos de raíces adventicias de C.
tenuiflora ofrecen buenas perspectivas para ampliar aún más la capacidad de
obtener grandes cantidades de biomasa de raíces de C. tenuiflora en medio que
contiene AIA, los tiempos de duplicación cortos y altos rendimientos de FG. Este
sistema también podría utilizarse para identificar otros feniletanoides glicosilados y se
podrían utilizarse en otras aplicaciones de la biotecnología, tales como la
transformación genética de las raíces para mejorar los rendimientos de los FG.
76
8. CONCLUSIONES
Los feniletanoides mayoritarios se aislaron e identificaron estructuralmente como
verbascósido e isoverbascósido en el extracto metanólico de raíces silvestres de C.
tenuiflora.
Los iridoides mayoritarios se aislaron e identificaron como aucubina y bartsiósido en
el extracto metanólico de tallos silvestres de C. tenuiflora.
Se desarrollaron metodologías de análisis cuantitativo para iridoides y feniletanoides
glicosilados.
Se desarrolló un sistema de cultivo de raíces adventicias de C. tenuiflora. El AIA fue
el regulador de crecimiento que indujo mayor desarrollo y crecimiento de raíces
adventicias y en esta condición se obtuvo la mayor acumulación de verbascósido e
isoverbascósido.
Los cultivos de raíces in vitro de C. tenuiflora acumulan principalmente los
feniletanoides glicosilados verbascósido e isoverbascósido en mayor cantidad que
las raíces silvestres. Sin embargo, los cultivos in vitro acumulan aucubina en menor
cantidad que la planta silvestre.
En la planta silvestre, el verbascósido y la aucubina se acumularon principalmente en
raíces e inflorescencias, mientras que el isoverbascósido en las raíces y la apigenina
en las hojas.
Los cultivos in vitro de raíces de C. tenuiflora representan una fuente alternativa para
la producción de compuestos bioactivos como aucubina, verbascósido e
isoverbascósido.
77
9. PERSPECTIVAS
Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que los cultivos de raíces in
vitro de C. tenuiflora son fuente de verbascósido e isoverbascósido. Se propone,
continuar con el estudio químico de esta especie y realizar pruebas farmacológicas
de las fracciones aisladas y de los extractos completos, así como también iniciar con
estudios para elucidar la ruta de biosíntesis y la función de los fenieltanoides en C.
tenuiflora.
78
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89
ANEXO 1. Espectro de RMN 1H (400 Hz) del bartsiósido (T19b)
90
ANEXO 2. Espectro de RMN 1H (400 Hz) de la aucubina (fracción T22a)
91
ANEXO 3. Espectro de 1H–1H NOESY (400 Hz) del verbascósido
92
ANEXO 4. Espectro de 1H–13C HSQC (400 Hz) del verbascósido
93
ANEXO 5. Espectro de RMN 1H (300 Hz) de compuestos aislados de la fracción
C4R2 (posible feniletanoide glicosilado)
94
ANEXO 6. Espectro de RMN 1H (300 Hz) de compuesto aislado de la fracción
C4R4 (posible feniletanoide glicosilado)
95
ANEXO 7. Cromatograma de HPLC del extracto metanolico del tallo de C.
tenuiflora
Apigenina
96
ANEXO 8. Artículo publicado con los resultados de la presente tesis