Post on 03-Apr-2018
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
1/78
Instrumentacin de HPLC
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
2/78
2
En esta seccin aprender lo siguiente:
Acerca de los sistemas de reparto de disolvente de HPLC.
Cmo funcionan los muestreadores.
Acerca de los detectores de HPLC habituales.
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
3/78
3
El principio Un ejemplo
Descripcin general de la instrumentacinde HPLC
Muestreador
Mezclador
Columna
Detector
Disolventes
Bombas
Detector
Compartimento
de las columnas
Muestreador
Bomba cuaternaria
Desgasificador de vaco
Cabina de disolventes
Mdulo de control
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
4/78
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
5/78
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
6/78
6
Funciones del sistema de reparto de disolvente
El sistema de reparto de disolvente tiene tres funciones bsicas:
1. Ofrecer un flujo constante y preciso.
2. Ofrecer composiciones de fase mvil precisas.3. Ofrecer la fuerza necesaria para empujar la fase mvil a travs
de la columna bien rellena.
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
7/787
Vlvula de gradiente multicanal
Determina la composicin de la fase mvil. El tapn de disolvente de mayor tamao se llena
primero. La bomba cuaternaria 1100, 1090 PV5 y 1050.
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
8/788
Bomba de dos pistones en serie
El primer pistndesplaza el disolventeal doble de velocidad
que el segundopistn.
Proporciona un flujoconstante y la presinnecesaria paradesplazarse por la
columna.
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
9/789
Formacin de gradientes
Gradiente de baja presinGradiente de alta presin
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
10/7810
Resumen
La bomba es la pieza ms importante del equipo para conseguir unbuen funcionamiento de la HPLC.
Parmetros de rendimiento para bombas de HPLC: Precisin de flujo Rango de flujo Volumen de retardo Pulso de presin Precisin de la composicin
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
11/7811
Muestreadores
Requisitos:
Introduccin reproducible del volumen de la muestra en el flujo dela fase mvil.
Dos diseos principales:Muestreadores automticos o muestreadores manuales
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
12/7812
Muestreadores manuales
Entradade la
muestra
Entrada del
disolventeSalida del
disolvente
Carga de la muestra
Inyeccin de la muestra
Desde la bomba
A la columna
Entrada de
la muestra
Entrada del
disolvente
Salida del
disolvente
Desde la bomba
A la columna
Muestreador
Mezclador
Columna
Detector
Disolventes
Bombas
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
13/78
13
Muestreadores automticos
Paso 1 Paso 2
Paso 3
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
14/78
14
Sistema de inyeccin automtica
Tratamiento previo con sistema de inyeccin automtica:
Muestra Reactivo
ReactivoDispositivo
de medida
Unidad de
muestreo
Vlvula de 6 puertosDesde la bomba
A la columna
A residuos
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
15/78
15
Horno de columnas
Es necesario que la columna y el disolvente tengan una temperaturaconstante para conseguir resultados reproducibles.
Tiempo de retencin
Da Da
Noche
Tiempo de retencin con horno - temperatura constante
Tiempo de retencin sintemperatura estable
Nmero de anlisis
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
16/78
16
Detectores habituales de HPLC
UV-VIS 65%RI LS 10%
Electro 10%
FLD 8%
MS
Radioactividad
ConductividadLC/IR
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
17/78
17
Necesidad de ms de un detector - Sensibilidad
El PAH se extrae de la tierra;Sup. LC-PAH 159 x 4,6 mm;Disolv.: H2O/CH3OH = 10:90
Fluorescencia
Seal UV
WL
241/394
WL
270/388
WL
248/411
WL302/420
WL
247/504
Tiempo (min.)
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
18/78
18
Necesidad de ms de un detector - Selectividad
Flecainida en suero
Concentracin teraputica: 1,8 mg/l, 20 ul inyectado
Seal de fluorescencia y UV
Seal FL
Seal UV
Tiempo (min.)
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
19/78
19
Necesidad de ms de un detector Informacincualitativa
Informacin cualitativa
Tomar un espectrode pico (UV)
Clorotoruln?
4468
58
96 132 138158
172
215
200
Tomar un espectro depico (MS)
104
Masa/Carga
Atrazina?
Longitud de onda (nm)
60 80 100 120 140 160 180 200 220
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
20/78
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
21/78
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
22/78
22
Ruido del detector - Deriva
El ruido es la amplitud de todas las variaciones aleatorias de laseal del detector.
La deriva es la pendiente media de la envolvente del ruidoexpresada en AU/h.
Tiempo
Absorbancia
60 minutos
Deriva
Ruido
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
23/78
23
Lmite de deteccin - Lmite de cuantificacin
El lmite de deteccin (LOD) es un resultado de todo el sistema decromatografa, no slo del rendimiento del detector.
El lmite de cuantificacin (LOQ) es un lmite definido de un mtodoutilizado para un fin especfico.
Rango lineal
Pendiente = sensibilidad
MQL
MDL
Respuesta
Cantidad
Interseccin
por ejemplo, RSD 20
Por ejemplo, S/N >3
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
24/78
24
Detectores de UV-VIS
b
c
Celda de flujo del detector
I0 I
Log I0 = A = abcI
Principios: La fraccin de luz transmitida a travs de la celda del
detector est relacionada con la concentracin del soluto, segn la leyde Beer.
Caractersticas: Especfico, sensible a la concentracin, buenaestabilidad, capacidad de gradiente.
Especial: Capacidad espectral UV-VIS (tecnologa de matriz de diodos).
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
25/78
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
26/78
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
27/78
27
Detector de UV-VIS con capacidad de espectros
Gracias al detector UV-VIS de matriz de diodos, es posible realizar medidas deespectros en lnea. Rango de longitud de onda de 190 - 900 nm. Resolucin de longitud de onda: hasta 1 nm. Calibracin de longitud de onda con filtro de xido de holmio.
Matriz de diodos
Red de difraccinRejilla ptica
Celda de flujodel detector
Filtro de holmio
Lentes acromticas
Lmpara de UV
Lmpara de VIS
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
28/78
28
Espectros en lnea - Detector UV-VIS
Longitud de onda
Tiempo
AbsorbanciaEspectros
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
29/78
29
Representacin grfica de la isoabsorbancia
La longitud de onda de
adquisicin se puedeoptimizar en funcin delos espectros almacenados.
Lo
ngitud
deond
a
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
30/78
HPLC prctica
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
31/78
31
En esta seccin aprender lo siguiente:
Cmo instalar un sistema de HPLC para realizar una inyeccin demuestra, incluidos los siguientes aspectos:
Manipulacin del disolvente
Preparacin de la fase mvil
Cebado del HPLC
Manipulacin de la columna - Equilibrio
Comprobacin del rendimiento del sistema
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
32/78
32
Manipulacin del disolvente
Caractersticas del disolvente (especificaciones): Pureza Viscosidad ndice de refraccin
Punto de ebullicin Toxicidad Transparencia de UV/lmite de UV Solubilidad
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
33/78
33
Miscibilidad del disolvente
Nombre
cido acticoAcetonaAcetonitriloBenceno
Alcohol butlicoTetracloruro de carbonoCloroformoCiclohexanoCiclopentanoDicloroetanoDiclorometanoDimetilformamidaDimetil sulfxidoDioxinaEtilacetato
Alcohol etlicoDietileterHeptanoHexano
Alcohol de metiloMetiletilcetonaI-OctanoPentano
I-Alcohol proplico
TetracloroetanoTetrahidrofuranoToluenoTricloroeteno
AguaXileno
Dipropileter
Inmiscible
Miscible
2-Propanol es unexcelente disolventeintermedio
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
34/78
34
Lmite de UV del disolvente/Transparencia
Disolvente Lmite de UV (nm)
Acetonitrilo 190
Agua 190
Ciclohexano 195
Hexano 200
Metanol 210Etanol 210
ter dietlico 220
Diclorometano 220
Cloroformo 240
Tetracloruro de carbono 265
Tetrahidrofurano 280 (220)
Tolueno 285
El lmite de UV es la longitud deonda en la que la absorbancia esigual a 1, medida en una celda de1 cm con aire como referencia.
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
35/78
35
Preparacin de la fase mvil
Pasos principales:
Medir el volumen apropiado de cada disolvente Mezclar los disolventes Aadir los tampones y los aditivos* Filtrar la fase mvil Desgasificar la fase mvil
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
36/78
36
Cebado del sistema de HPLC
Detector
Muestreador
Disolventes
Mezclador
Bombas
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
37/78
37
Almacenamiento dela columna
Evitar causar cualquier dao fsico a lacolumna
Cerrar ambos extremos para evitar quese seque
Guardar la columna bienenjuagada con el disolventeadecuado
Registrar el historial de la columna
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
38/78
38
Instalacin de la columna
Cada columna tiene una direccin de flujo definida. La direccin del flujo es la que indica la flecha, o la direccin del texto
escrito en la columna. No cambiar la direccin del flujo, ya que disminuir el rendimiento de la
columna.
Detector
Muestreador
Mezclador
Disolventes
Bombas
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
39/78
39
Equilibrado de la columna
Equilibrar con fase mvil
No presionar en exceso la columna.
De 5 a 10 volmenes de columna para equilibradode fase inversa.
Garantiza resultados reproducibles.
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
40/78
40
Comprobacin de la columna
Las columnas nuevas deben incluir un certificado derendimiento.
Cada uso adicional deber documentarse, incluyendo: Retropresin
Fase mvil Temperatura Tipo de muestra Condicin de almacenamiento (disolvente)
En base a ese historial, la columna se puede comprobar
con una mezcla de compuesto definida.
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
41/78
41
Cuidado y manipulacin de la columna
Lavar la columna despus de usarla con disolventesseleccionados; eliminar de la columna los componentesde la muestra fuertemente retenidos.
No guardar la columna en 100% de agua. Podrn desarrollarsemicrobios y obstruir la columna.
No abrir la columna y volver a empaquetar el material si sedesea mantener el rendimiento.
Utilizar la columna a su velocidad de flujo ptima - evitarvelocidades de flujo elevadas.
No utilizar slice o fases enlazadas durante largos perodos auna temperatura elevada. Mantener el pH de la fase mvil en un rango apropiado para la
columna.
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
42/78
42
Repaso
1. Est realizando un anlisis rutinario cuando se da cuenta de quese produce una perturbacin peridica en la lnea de base. Lalectura de la presin flucta hacia arriba y hacia abajo. Qu
ocurre? Cmo lo corregira?
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
43/78
43
Repaso
2. Ha decidido realizar un anlisis de fase inversa en un instrumento dellaboratorio. El operador anterior no indica los disolventes utilizados
por ltima vez en el instrumento. Pone agua en el canal A y enciendela bomba. No puede conseguir una lnea de base estable. Plantee cul
es la causa posible de este problema.
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
44/78
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
45/78
45
En esta seccin aprender lo siguiente:
Qu factores influyen en la resolucin entre los componentesde las muestras.
Cmo influyen en la resolucin el factor de capacidad (factorde retencin), la selectividad y la eficacia.
Cmo mejorar las separaciones.
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
46/78
46
La principal preocupacin del cromatgrafo:la resolucin entre los picos cromatogrficos
to
tRA
mAU
tiempo
tRB
tRB - tRAR = 2
wA + wB
R = 1,176tRB - tRA
w1/2A + w1/2B
R = Resolucin
tRA = Tiempo deretencin, componente A
tRB = Tiempo de
retencin, componente B
w = Ancho en la base
w1/2=Ancho a mitad dealtura
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
47/78
47
Para reas de picos iguales, un valor R de1,5 ofrece separacin de la lnea de base.
0,4 0,50,6 0,7
0,8 1,00 1,25
Valores de resolucin
Calcular la resolucin entre el primer
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
48/78
48
Calcular la resolucin entre el primery el segundo pico cromatogrfico
min1 2 3 4 5 6
mAU
0
50
100
150
200
250
300
DAD1 B, Sig=230,4 Ref=550,100 (DEMO\005-0102.D)
0
.747
1.
022
2.
569
5.
849
Respuesta_________
E i d l i f d l l
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
49/78
49
N: Nmero total de platos tericos disponibles; eficacia de la columna
k: Factor de capacidad (factor de retencin), la funcin de retencindel pico
La separacin relativa de los picos; la funcin de selectividad
CapacidadSelectividadEficacia
R = 1/4 N x xk'
1 + k'- 1
Ecuacin de resolucin fundamental para laelucin isocrtica
F t d l l i
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
50/78
50
Factores de la resolucin
Americas' Technical Center (Centro tcnico de Amrica)
Capacidad
Selectividad Eficacia
C id d R t i
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
51/78
51
Capacidad-Retencin
Inyectar
O
t - t ORt
=k'
tO
tR2
tR1
El factor de capacidad (factor de retencin) escaracterstico de un compuesto especfico en unacomposicin de fase mvil, a una temperatura y en untipo de columna determinados.
El factor de capacidad compensa los efectos de lasdimensiones de la columna y la velocidad de flujo.
El factor de capacidad es igual al nmero de moles enla fase estacionaria dividido por el nmero de moles enla fase mvil.
SelectividadEficacia
R = 1/4 N x - 1Capacidad
xk'
1 + k'
Ef t d l id d l l i
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
52/78
52
Efecto de la capacidad en la resolucin
R
k
0 2 4 6 8 10
Rangoideal de k
Los cambios en k'tienen poco efecto en la
resolucin
Los cambiosen k' tienenel mayorefecto
12 14 16
Capacidad
k'1 + k'
La utilizacin de la retencin para aumentar la resolucin es ms eficazcuando k se encuentra entre 0 y 5.
C id d C i i d l f il
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
53/78
53
Capacidad - Composicin de la fase mvil
Composicin del disolvente ms dbil
60% acetonitrilo40% agua
Tiempo (min.)
2 4 6 8 10
mAU
mA
U
Composicin del disolventems fuerte
Tiempo (min.)
80% acetonitrilo
20% agua
2 4 6 8 10
La manera ms importante de cambiar lacapacidad de un pico cromatogrfico es cambiarla composicin de la fase mvil:
Cuando aumenta la fuerza de la fase mvil,disminuye el factor de capacidad de los
eluyentes. En lo que respecta a la fase inversa, un
aumento del 10% orgnico hizo disminuir elvalor de k' en cada pico cromatogrfico en unfactor de 2 o 3.
S l ti id d
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
54/78
54
Selectividad
SelectividadEficacia
R = 1/4 N x - 1
Capacidad
x k'1 + k'
= kBkA
= 1,1 =1,4 =1,8
Composicin de lafase mvil
Fase mvil pH de la fase mvil
Temperatura de la columna Efectos qumicos - Aditivos Fase estacionaria
P t f t l l ti id d
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
55/78
55
DISMINUCIN AUMENTO
Disolventesms dbilesDisolventesms fuertes
IPA/Agua MeOH/AguaACN/Agua
Fase estacionariaorgnica alta
C-2
C-18
Fase estacionariaorgnica baja
Se sobrecargafcilmente
No sesobrecargafcilmente
Cambio de composicinde la fase mvil
Cambio de la faseestacionaria
Parmetros que afectan a la selectividad
C bi d f t i i
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
56/78
56
Cambio de fase estacionaria
1. Met Encefalina2. Leu Encefalina3. Angiotensina II4. Neurotensina5. Insulina (BOV)6. Cadena de insulina B7. Citocromo C
8. Mioglobina9. Calmodulina10. Anihidrasa carbnica
Tiempo (min)
ZORBAX 300 SB-CN, SB-C3, SB-C8, SB-C18(4,6 x 150 mm, P/N:883995.905, 883995.909, 883995.906, 883995.902)
Fase mvil: 15-53% en 20 min.A: 5:95 ACN:Agua con 0,10% de TFA (v/v%). B: 95:5 ACN:Agua con 0,085% de TFA (v/v%)
Inyeccin 10 l, 2-6 g proteina (en 6M guanidina HCI, pH 7.0), 1,0 ml/min., 35 C, detect. UV (215 nm)Proporcionado de Loretta A. Sandoval
Efecto del termostato de la columna en la
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
57/78
57
Efecto del termostato de la columna en laseparacin
40 C
65 C
100 5
Tiempo enminutos
A B
AB
100 5
Ajuste de la temperatura de la columna
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
58/78
58
Ajuste de la temperatura de la columna
1/T (K)
Citocromo C
Insulina (BOV)
RNase
Uso de la temperatura para mejorar la resolucin
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
59/78
59
Uso de la temperatura para mejorar la resolucin
108
9
300 SB-CN
8
9
10
300 SB-C3
8
9
10
8
9
10 60 C35 C Mejora de laresolucin
Eficacia
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
60/78
60
Respuestadel
detector
Inyectar
Tiempo
Alta eficacia
Baja eficacia
CapacidadSelectividadEficacia
R = 1/4 N x xk'
1 + k'- 1
Eficacia
Clculo de la eficacia
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
61/78
61
Clculo de la eficacia
t R
W
Wi/2
TiempoB
Inyectar
N = 162
tRwB= 5,54 tRW1/2
2 =2 hptRA2
HETP = LN
N = Eficacia; Nmero de platosHETP = Altura equivalente a unaplaca tericaL = Longitud de columnahp = Altura de pico
A = rea de pico
Calcular la eficacia
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
62/78
62
Calcular la eficacia
min1 2 3 4 5 6
mAU
0
50
100
150
200
250
300
DAD 1 B, Sig=230,4 Ref=550,100 (DEMO\005-0102.D)
0.
747
1.
022
2.
569
5.
849
Respuesta____________
Velocidades de flujo tpicas
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
63/78
63
Velocidades de flujo tpicas
4,6 1-2
3,0 0,4-0,8
2,1 0,2-0,4
1,0 0,05-0,09
d.i. mm (partculas de 5 um) ml/min
velocidad de flujo2 =
d.i.2d.i.1
2
velocidad
de flujo1
Rendimiento mejorado con columnas
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
64/78
64
mAU
0
1020
30
mAU
0
10
20
30
min0 1 2 3 4 5 6 7 8
mAU
0
10
20
01576S1.PPT
Zorbax SB-CN
F = 1,06 min
F = 1,54 min
F = 2,03 min
GC A
T
LC: HP1090
Columnas: 4,6 x 150, 5 MFlujo: 1,0 ml / min.A: 0,1% TFAB: 97,5% MeOH:
2,5% H2O (0,1% TFA)Temp.: 30 CDetec.: 254 nm
Rendimiento mejorado con columnastradicionales utilizando velocidades de flujoaumentadas
Aumento de la resolucin
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
65/78
65
Aumentar k'
Aumentar laselectividadAumentar la eficacia
Aumento de la resolucin
Ejercicio
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
66/78
66
t0
Inicial
Variacin?
Aumento?
Aumento?
t
Ejercicio
Describir qu componente dela ecuacin de la resolucinse ha cambiado en cada caso:N, k o ?.
En cada uno de los casos,qu parmetro cambiara (esdecir, composicin de fasemvil) para mejorar laseparacin inicial?
Ejercicio
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
67/78
67
Ejercicio
El anlisis se realiz en una columna C-8 de 100 x 4,6 mm con un d.i. de 10um. La velocidad de flujo fue de 2 ml/min con 70/30 de alcohol IPA/agua.
Enumerar las maneras de mejorar la separacin.
0 tiempo
mAU
Ejercicio
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
68/78
68
Ejercicio
1. Enumerar tres maneras de aumentar la retencin del componente de unamuestra.
2. Enumerar cuatro maneras de disminuir el ancho de banda de los picos
cromatogrficos.
3. Cules de estos parmetros afectan a la eficacia de una columna? Fuerza de elucin Viscosidad de la fase mvil Tamao de partculas de la fase estacionaria Longitud de la columna Temperatura de la columna Volumen externo a la columna
El i d di t
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
69/78
Elucin de gradientes
En esta seccin aprender lo siguiente:
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
70/78
70
En esta seccin aprender lo siguiente:
En qu consiste el proceso de elucin de gradientes y cules sonsus ventajas.
Cmo optimizar una separacin de gradiente.
Consideraciones prcticas para establecer separaciones degradientes.
El problema general de la elucin
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
71/78
71
El problema general de la elucin
Resolucin defectuosa de los picosque antes eluyen.
Aumento del ancho de pico ydescenso de la altura de pico en los
picos que eluyen ms tarde.
Tiempos largos de anlisis debido aun rango amplio de valores k'. Contaminacin de columnas con
componentes de fuerte retencin.
Elucin isocrtica - La composicin de la fase mvil permanececonstante durante el tiempo que tarda la muestra en eluir.
Elucin de gradientes - Solucin A
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
72/78
72
Elucin de gradientes Solucin A
Elucin de gradientes - Lacomposicin de la fase mvil cambiadurante la separacin. Ventajas
Resolucin mejorada Mayor deteccin
Capacidad para separarmuestras complejas Tiempos de anlisis ms cortos Disminucin del deterioro de la
columna debido a loscomponentes retenidos confuerza
Otros usos Limpieza de la columna Anlisis de exploracin en el
desarrollo de mtodos
Separacin de gradiente de polipptidos
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
73/78
73
1 2 3
4
56
7 8
0 2 4 8 10 12 14 16 18 206Tiempo (min.)
Columna: ZORBAX 300SB-C3
5 m, 4,6 x 150 mmGradiente: 15-35% B en 19 min.Fase mvil: A: 95:5 H2O:ACN
con 0,1% de TFAB: 5:95 H2O:ACN
con 0,085% de TFA
1. Leucin a Encefal ina2. Angiotensina3. RNasa A4. Insulina5. Citocromo C6. Lisozima
7. Mioglobina8. Anihidrasa carbnica
Caractersticas de gradientes Se utilizan dos disolventes para desarrollar el
gradiente La fuerza de elucin aumenta con el tiempo Tener en cuenta la forma del gradiente Tener en cuenta la inclinacin del gradiente
Qu ocurre durante el anlisis de un gradiente?
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
74/78
74
Qu ocurre durante el anlisis de un gradiente?
%O
rg
0
25
50
75
100
0 10 20 30
Tiempo (min)
k'
Aumento del % de modificadororgnico
Cambio de particin a fase mvil
Aumento de la velocidad delcompuesto
A li i tit ti
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
75/78
Anlisis cuantitativo
En esta seccin aprender lo siguiente:
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
76/78
76
En esta seccin aprender lo siguiente:
Los principios del anlisis cuantitativo.
Anlisis cuantitativo
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
77/78
77
Anlisis cuantitativo
En la cuantificacin se utilizan tresprincipios diferentes:
Calibracin de patrn externo Calibracin de patrn interno Adicin de patrn %rea %Norm
1
23
4
5
Tiempo
6
Cantidad de compuesto 5?
R
e
s
pu
e
s
t
a
Calibracin de patrn externo
7/28/2019 Instrumentacin de HPLC
78/78
Ca b ac de pat e te o
Calibracinde 3 niveles
Respuesta
Cantidad
3 concentraciones
La calibracin de tres niveles es un requisito mnimo parademostrar la linealidad de la curva de calibracin
DMRFRespuestaCantidad xxMuestra =)(