Miguel Ángel Jiménez-ClaveroCentro de Investigación en Sanidad Animal

(CISA)-INIA, Valdeolmos, Madrid

XV XV SimposioSimposio anual de AVEDILA, Zaragoza, 18anual de AVEDILA, Zaragoza, 18 --19 de noviembre de 201019 de noviembre de 2010

La peste de los pequeños rumiantes y la fiebre/encefalitis por virus West Nile: Diagnóstico actual y perspectivas de futuro

Enfermedades infecciosas emergentes (EID): un problema específico para el diagnóstico

� “Enfermedad emergente” (O.I.E.*)� Una nueva infección que resulta de la evolución o cambio

de un agente patogénico ya existente.�Una infección conocida que se disemina a una nueva área

geográfica o población.�Una enfermedad o agente patogénico previamente no

reconocido, diagnosticado por primera vez.

*O.I.E., Código sanitario de los animales terrestres.

EID-cambio en un patógeno conocido

� Un agente infeccioso conocido que ocurre en una especie no descrita como susceptible hasta ese momento(salto de especie): Los cambios en el rango de huésped, debidos a la alta variabilidad y capacidad de adaptación de los virus, son su principal mecanismo de evolución.� Enfermedad vesicular porcina (China?

1946-1966�CVB5).� Influenza aviar en humanos y felinos.� Exantema vesicular porcino � Virus

del León Marino de San Miguel.� Virus del moquillo canino (CDV).en focas y

felinos � Lyssavirus de los murciélagos.

EID-expansión geográfica

� Un agente infeccioso conocido, que aparece en una nueva zona geográfica (enfermedad exótica o transfronteriza): Facilitado por fenómenos de movilidad geográfica, tráfico de personas y mercancías (globalización)� Lengua azul en Europa septentrional y central

2006 (BTV-8), 2008 (BTV-6, BTV-11).� Virus West Nile en Norteamérica, 1999-2010.� Virus Usutu en Centroeuropa, 2001.� Fiebre del valle del Rift en la Peninsula Arábiga,

2000.� Peste porcina africana en el Cáucaso, 2007.� Enfermedad re-emergente:� West Nile en Europa, 1997-2010.� Lengua azul en España y Mediterráneo

Occidental, 2000-2010.� Fiebre Aftosa en Reino Unido, 2001.

EID-nuevos patógenos

�Un agente previamente desconocido, que aparece por primera vez.� Virus SARS (sindrome respiratorio agudo

severo): Guandong, China, 2002.� HIV-SIDA (1981, EE.UU.).� Ebola-Marburg (Marburg, Alemania, 1967; Zaire,

1976).� Hantavirus (HPS: 1993, EE.UU.).� PRSS (sindrome respiratorio y reproductivo

porcino)(EE.UU. 1987).� Enfermedad Hemorrágica del Conejo (China,

1984).� Circovirus porcino (PMWS: Canadá, 1991)� Encefalopatías espongiformes transmisibles

(BSE, vCJD, Reino Unido, 1980’s).

EID: El laboratorio de diagnóstico ante lo “inesperado”� Los patógenos emergentes son un fenómeno en esencia inesperado,

de difícil previsión. � EID= patógeno nuevo � No existen técnicas para su detección � El

diagnóstico se hace especialmente difícil.� Laboratorio diagnóstico EID � INCERTIDUMBRE

� Conocer la situación epidemiológica de patologías emergentes más acuciantes del entorno, y actualizar frecuentemente esta información.

� Estar preparado ante LO INESPERADO .� En un mundo globalizado los patógenos tienen grandes oportunidades para

invadir un nuevo territorio.

100 Km.

BTV

WNVAHSV

AIV

PPRV

????

Métodos para detectar “lo desconocido”

van der Hoek L, Pyrc K, Jebbink MF, Vermeulen-Oost W, Berkhout RJ, Wolthers KC, Wertheim-van Dillen PM, Kaandorp J, Spaargaren J, Berkhout B.Identification of a new human coronavirus.Nat Med. 2004 Apr;10(4):368-73. Epub 2004 Mar 21.

La investigaciLa investigacióón en enfermedades n en enfermedades emergentes y emergentes y transfronterizastransfronterizas en el CISAen el CISA

��OrbivirusOrbivirus: lengua azul, AHS, EHD: lengua azul, AHS, EHD

��Virus porcinos: EVC, PPA, PPCVirus porcinos: EVC, PPA, PPC

�� Influenza aviarInfluenza aviar

��Fiebre/encefalitis por virus Fiebre/encefalitis por virus WestWest NileNile

��Peste de los pequePeste de los pequeñños rumiantesos rumiantes

��Dermatosis Dermatosis nodularnodular contagiosacontagiosa

��Viruela ovina y caprinaViruela ovina y caprina

��Alertas sanitarias (Convenio INIAAlertas sanitarias (Convenio INIA--MARM)MARM)

EID: El laboratorio de diagnóstico en alerta

� http://www.oie.int/wahis/public.php?page=home

� http://www.fao.org/ag/againfo/programmes/en/empres/home.asp

� http://www.glews.net/ Global Early Warning System for Major Animal Diseases, including Zoonoses (GLEWS)

� http://www.who.int/

� http://www.promedmail.org/

� http://www.ecdc.europa.eu/

EID: El laboratorio de diagnóstico en alerta

� http://rasve.mapa.es/

� http://ec.europa.eu/food/animal/index_en.htm

� Webs de Sanidad Animal de la CC.AA.

� Webs temáticas: � http://www.offlu.net� http://www.flu-lab-net.eu/� http://eubtnet.izs.it/btnet/inFocus/inFocus.html� etc

� Riec = Red de investigación sobre enfermedades compartidas (Red IRIS).

Ejemplo de actuaciones en dos epizootias recientes de importancia en sanidad animal

�Peste de los pequeños rumiantes, Marruecos, 2008

�Fiebre/encefalitis por virus West Nile, Europa y Mediterráneo, 1996-2010

Peste de los pequeños rumiantes, Marruecos, 2008

� Evolución de la PPR (junio – agosto 2008)(Tomado de Sanz-Alvarez J, Diallo A, de La Rocque S, et al. Peste des petits ruminants (PPR) au Maroc. EMPRES watch 2008 : 1-7).

12 y 26 de junio: 2 brotes epidémicos de campo declarados en 15 días.

30 junio – 19 julio: 24 brotes epidémicos de campo en 20 días

20 – 31 julio: 41 brotes epidémicos de campo en 12 días

31 julio – 4 agosto: 25 brotes epidémicos de campo en 5 días

Primera vez que aparece PPR en Marruecos.Focos: 25736 de las 61 provincias marroquíes, afectadas.

Peste de los pequeños rumiantes, Marruecos, 2008

� Medidas de lucha (OIE):�Cuarentenas.�Serovigilancia.�Desinfección de las estancias infectadas.�Sacrificio.�Vacunación:

�La campaña comenzó el 22 de septiembre de 2008�Se vacunaron 20 millones de cabezas (cabras y

ovejas).�Vacuna empleada: vacuna viva atenuada

monovalente.�Fecha oficial de resolución de la epizootia: 27-1-2009.�No ha habido ningún nuevo brote desde entonces.

Peste de los pequeños rumiantes: distribución mundial

� Linajes genéticos:� L-I (África

Occidental)

� L-II (África Central)

� L-III (África Oriental)

� L-IV (Asia-Oriente Medio, África oriental, Marruecos).

Tomado de: Minet, C. et al. Virologie 2009, 13 (2) : 103-13

Sudáfrica, 2010

� Linajes genéticos:� L-I (África

Occidental)

� L-II (África Central)

� L-III (África Oriental)

� L-IV (Asia-Oriente Medio, África oriental, Marruecos).

Tomado de: Banyard et al., J Gen Virol doi:10.1099/vir.0.025841-0

IV

Peste de los pequeños rumiantes: Linajes

Peste de los pequeños rumiantes: el virus

� Familia Paramyxoviridae� Género Morbillivirus� ssRNA-

Phosphoprotein (P)

Tomado de: Banyard et al., J Gen Virol doi:10.1099/vir.0.025841-0

http://www.virology.net/Big_Virology/EM/pprv.JPG

Peste de los pequeños rumiantes: el virus

� Familia Paramyxoviridae� Género Morbillivirus� ssRNA-� Especificidad de especie ALTA

Sarampión(humano)

Moquillo canino

Morbillivirusde los delfines

Moquillo de las focas

Peste bovina

Peste de los pequeños rumiantes

Peste de los pequeños rumiantes: la enfermedad

� Patogenicidad: � Depende de la cepa del virus y de la especie/raza

afectada).� Mortalidad:

� 50%-100% en poblaciones “naïve”.� Afecta a ovejas y cabras principalmente.� Forma grave:

� fiebre alta, conjuntivitis, neumonía, secreciones en los ojos y las fosas nasales, llagas en la boca, lesiones necróticas en las membranas mucosas, dificultades respiratorias y diarrea.

� Infecciones asintomáticas: � Ocurren en determinados casos (cepa de virus,

raza/especie de hospedador).� Otros hospedadores:

� Rumiantes silvestres: oryx, gacela, impala, etc.� Ganado doméstico: ¿camellos?¿bovinos?

� Contagio: contacto directo.� Secreciones-excreciones, aerosoles. � Aumenta con la densidad y la tasa de nacimientos. Tomado de: Minet, C. et al.

Virologie 2009, 13 (2) : 103-13

Peste de los pequeños rumiantes: el diagnóstico� Identificación del agente:

�Muestras: �hisopos (bucales, nasales,

conjuntivales), �Sangre EDTA.�Necropsia: nódulos linfáticos,

pulmón, bazo, mucosa intestinal.�Técnicas de cribado:

�RT-PCR.�AGID.�Contrainmunoelectroforesis. �ELISA de inmunocaptura (Ag).� IF, IHQ.�HA.

Peste de los pequeños rumiantes: el diagnóstico� Identificación del agente (cont.):

�Confirmación:�Aislamiento vírico:

• Células cultivo 1º riñón de oveja• Vero• CPE: 5 días.• Sincitios• 3 pases ciegos.

� Técnicas serológicas:�Cribado

�cH-ELISA (MAb anti-H)�cN-ELISA competición (MAb anti-N)

�Confirmación�Virus neutralización (VNT)

Peste de los pequeños rumiantes: las vacunas� Vacunas actuales:

�Vacuna viva atenuada monovalente:� Cepa vacunal más empleada:

• Nigeria 75/1.K6 BK2 Vero70 (linaje II)� Otras cepas (India):

• Sungri/96 (linaje IV)• Arasur/97• Coimbatore/97

� Vacunas de futuro:� DIVA: vacunas quiméricas

� RPV vacunal x genes PPRV (H, F & M)� ELISA DIVA: PPRV cH-ELISA & cN-ELISA� Problema: reacc. cruz. MAb N RPV� Posible solución: Ag C-terminal prot N PPRV

� Vacunas multivalentes marcadas (PPRV+BTV+ SGPV)

Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA

� RD 106/2010� LNR = LCV-Algete� Convenio INIA-MARM 2008-11:

�CISA=Laboratorio de apoyo al LNR.

� Técnicas de diagnóstico de la PPR implementadas en el CISA:�Detección del VPPR:

�RT-PCR en tiempo real (Bao, J. et al, 2008).�RT-PCR convencional (Couacy-Hymann et al; 2002, CIRAD)�

¡¡¡INESPECIFICIDAD CON ADN/ARN DE OVEJA!!!

�Aislamiento en cultivos celulares (Vero).

�Detección de anticuerpos frente al virus (suero):� ELISA de competición (CIRAD).� Neutralización (6-7 días).

Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA

� Viroteca y seroteca PPR: representantes de los linajes del VPPR y sueros de referencia (CIRAD).

� Armonización técnicas diagnósticas:� Participación en ensayo intercomparativo internacional EPIZONE 2009:

� Organizado por el laboratorio de referencia de la OIE para PPR (CIRAD, Montpellier, Francia).

� Participaron 8 laboratorios de otros tantos países.� Objetivos:

• Compartir material de referencia y protocolos para que puedan ser aplicados por los Laboratorios de Referencia Nacionales.

� Test comparativo aplicado a:• Detección del genoma del VPPR.• Detección de anticuerpos de VPPR.

� Armonizar y estandarizar un nuevo desarrollo (real-time RT-PCR).

Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA

� Ensayo intercomparativo EPIZONE 2009� Panel 1: 15 sueros para serología.� Panel 2: 5 muestras de sobrenadante de

cultivo celular (Vero) para RT-PCR.� Protocolos :

� ELISA (CIRAD-BDSL)� PCR (convencional y/o real time)� Inmunofluorescencia� No se describe el protocolo de VNT

� Resumen:� ELISA (cN): Correcto en todos labs. (sueros de cabras vacunadas).� RT-PCR convenc. (4 labs): resultados aceptables, sensibilidad baja.� RT-PCR en tiempo real (6 labs): No todos los métodos detectan todos los

linajes. Los mejores: CIRAD y Bao et al. (CISA).

Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA

� Ensayo intercomparativo EPIZONE 2009�Panel 1: 15 sueros para análisis de anticuerpos.�Panel 2: 5 muestras de sobrenadante de cultivo celular (Vero)

para análisis por RT-PCR.�Protocolos :

� ELISA (CIRAD-BDSL)� PCR (Convencional-Real Time)� Inmunofluorescencia� No se describe el protocolo de VNT

�Resumen:� ELISA (cN): Correcto en todos labs. (sueros de cabras vacunadas).� RT-PCR convenc. (4 labs): resultados aceptables, sensibilidad baja.� RT-PCR en tiempo real (6 labs): No todos los métodos detectan

todos los linajes. Los mejores: CIRAD y Bao et al. (CISA).

Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA

� Mejoras en las técnicas serológicas de detección de anticuerpos frente a VPPR:�Para la vigilancia seroepidemiológica

es IMPRESCINDIBLE contar con una técnica de ELISA robusta y fiable.

�ELISA disponibles comercialmente:� BDSL cN-ELISA, desarrollado por

CIRAD (laborioso, caro, difícil de validar…).

� Por ello es muy necesario desarrollar nuevos kits de ELISA de Ac anti-VPPR.

� Trabajos que se llevan a cabo actualmente en el CISA:�Producción de antígeno (virus inactivado).�Antisueros monoespecíficos.�Clonaje proteinas víricas recombinantes.

para su uso como antígenos.

� 2 estrategias:�Antígeno= superficie / MAb= Anti-H o – F.�Antígeno= N recombinante / MAb= Anti-N.

Peste de los pequeños rumiantes: actividades en el CISA

Ejemplo de actuaciones en dos epizootias recientes de importancia en sanidad animal

�Peste de los pequeños rumiantes, Marruecos, 2008

�Fiebre/encefalitis por virus West Nile, Europa y Mediterráneo, 1996-2010

Virus West Nile (Nilo Occidental, WNV)

� WNV: flavivirus del grupo de la encefalitis japonesa.� Transmitido (no solo) por artrópodos, principalmente (no solo)

mosquitos, sobre todo (no siempre) del género Culex.� Principales reservorios: aves.� Éstas pueden acarrear el virus en sus migraciones,

translocándolo de unas zonas a otras.� Patogénico ocasionalmente en aves, dependiendo de la

especie de ave y de la variante del virus de que se trate.� Patogénico ocasionalmente en algunos mamíferos.� Eco-epidemiología compleja.

Virus West Nile : un flavivirus epizootico, epornitico y zoonotico

Aves: >300

especies

susceptibles

Mosquitos: >60

especies

portadoras

Muchos otros

vertebrados susceptibles

(mamíferos, ranas,

caimanes…)

¿todos “dead-end hosts”?

¿Otros

vectores

(garrapatas

p.ej.)?¿Contacto

directo?

¿Transmisión

transovárica?

¿Persistencia?

¿Transmisión oral?

¿Inmunidad cruzada?

Virus West Nile : un flavivirus emergente

19992004

2006

Distrito de Distrito de WestWest NileNileUganda, 1937Uganda, 1937

Out of Out of AfricaAfrica……

� Hasta hace poco, WNV era considerado un virus de poca importancia (“fiebres africanas”).

� Pero en los últimos años del siglo XX produjo brotes cada vez más graves:�Rumanía, 1996, 1000 casos, 396 graves (17 muertes).�Volgogrado (sur de Rusia), 1999, 1000 casos de

meningitis/encefalitis confirmados, 40 muertes.� Israel, 1998-2000: 400 casos, 35 muertes.

� Hasta que en 1999 cruzó el Atlántico…

WNV: historia reciente

WNV: historia reciente

� ¡…apareciendo en Nueva York!� Desde entonces no ha parado de

extenderse por toda América, de costa a costa y desde Canadáhasta Argentína.

� En Norteamérica WNV es considerado ya endémico.

� En EE.UU. desde 1999 ha habido unos 29.000 casos humanos, de ellos unos 1200 han sido mortales.

� Las aves silvestres son muy sensibles a la infección, produciéndose en ellas una gran mortalidad.

� Una de las arbovirosis zoonóticas, epizoóticas y eporníticas más importantes de la historia.

� Por todo ello, el WNV se ha convertido en uno de los virus con más repercusión pública.

Casos WNV en EE.UU. 1999-2007*(*Hasta el 6 de noviembre)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007

Año

nº c

asos

Muertes

Otras m. clin./No especif.

Fiebre

Encef/mening

Israel, 1951, 1957

Egypt, 1950

Tunisia, 1997

Algeria, 1994

Portugal, 1971

Czech Rep. 1997 y 1999

Morocco, 1996

Russia, 1999-2002

Romania, 1996-98

Israel, 1998-2000

France, 1962-65Italy, 1998

France 2000

WNV en Europa y la región mediterránea, 1950-2010

Israel, 1951, 1957

Egypt, 1950

Tunisia, 1997

Algeria, 1994

Portugal, 1971

Czech Rep. 1997 y 1999

Morocco, 1996

Spain, 2007, 2010

Russia, 1999-2002

Romania, 1996-98

Israel, 1998-2000

Italy, 2008-2010

Austria, 2008-2010 Hungary

2004-2010

France, 1962-65

France 2000

Morocco2003, 2010

France, 2003, 2004, 2006

Italy, 1998

Russia, 2005-2008,

2010

Israel, 2000-2010

Tunisia, 2003

Greece, 2010

WNV en Europa y la región mediterránea, 1950-2010

Bulgaria, 2010

Romania, 2010

Portu-gal,

2004, 2010

Spain, 2007, 2010

Italy, 2008-2010

Austria, 2008-2010 Hungary

2004-2010

Morocco2003, 2010

Russia, 2005-2008,

2010

Israel, 2000-2010

Greece, 2010

Bulgaria, 2010

Romania, 2010

Lineage 2

Lineage 1Portu-gal,

2004, 2010

WNV en Europa y la región mediterránea, 1950-2010

Virus West Nile: tendencias

� Cada vez más frecuente en Europa y cuenca mediterránea.

� Más casos humanos.� Mayor afección en aves silvestres.� Nuevo linaje en Europa (L2).� Clima: básico para entender la

epidemiología.� Cuestiones:

�¿WNV persiste en Europa o es introducido cada vez desde África?

�¿Son los virus recientes más patogénicos?

Ejemplo de rutas migratorias de aves entre Europa y Africa

Virus West Nile en España: hitos

100 Km.

Y

� 70’ -80’ del s. XX : anticuerpos hemaglutinantes vs. flavivirus en roedores y humanos .

� 2001: Seroprevalencia en humanos en Sevilla (0.6%) y Delta del Ebro (0.2%).

� 2000-05: Alta seroprevalencia en rapacesde Castilla-La Mancha. Detección de genoma vírico.

� 2003-2006: Seroprevalencia significativa en determinadas especies de aves en el bajo Guadalquivir. Seroconversiones .

� 2005-07: Seroprevalencia significativa en caballos en libertad en Doñana.

� 2004: Primer caso clínico en humanos .� 2004-2008: Genoma vírico en mosquitosmosquitos,

Huelva y Doñana.� 2007: Primer aislamiento del WNV en

España, aves silvestres (águila real), Castilla-La Mancha.

� 2010: Cádiz, primeros casos clínicos en caballos . Dos casos clínicos en humanos .

Y

YY

Y

Y

Y

Y

Y

Y∞∞∞∞++++

Y++++++++Y

✱

∞∞∞∞∞∞∞∞

WNV en España: situación actual

� 26 y 30 de agosto de 2010: primeros casos sospechosos en caballos, Jerez de la Frontera.

� 2 septiembre: cELISA+� 10 septiembre: IgM+� Notificación

a la OIE.� Primera caracterización molecular:

linaje 1a, “cluster” mediterráneo occidental.

� Inicio de investigación epidemiológica, serovigilancia.

� Aislamiento y secuenciación molecular completa (en curso).

WNV en España: situación actual

� Focos (equinos) a 16-11-2010:�33 focos, 40 caballos

afectados, 10 muertos.

WNV en España: situación actual

� Casos humanos:� 1º, Varón, 60 años,

residente en Chiclana de la Frontera. Ingreso en el Hospital de Puerto Real el 20-9-2010 con signos de meningitis. Evolución favorable.

� 2º, Varón 77 años, residente en Benalup-Casas Viejas. Ingresó en el hospital de Puerto Real el 28 de septiembre con signos de meningitis. Evolución favorable.

++

Estudios sobre WNV en el CISA: Nuevos métodos diagnósticos� Moleculares: RRT-PCR multiplex para la detección simultánea y

diferencial de WNV L1, WNV L2 y USUV en la misma reacción.

FAM JOE Cy5FAM JOE Cy5FAM JOE Cy5FAM JOE Cy5

Tres sondas marcadas con tres fluoróforos que emiten señales a valores de λ no solapantes

FAM: 492-516 nm

JOE-VIC: 535-555 nm

Cy5: 635-665 nm

Estudios sobre WNV en el CISA: Nuevos métodos diagnósticos� Moleculares: RRT-PCR multiplex para la detección simultánea y

diferencial de WNV L1, WNV L2 y USUV en la misma reacción.WNV L1 NY´99 equine WNV L2

B956

USUV SAAR 1776

-0.03

0.07

0.17

0.27

0.37

0.47

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Cycles

Flu

ores

cenc

e (d

Rn)

1.26x105DICT50/mL

1.26x104DICT50/mL

1.26x103DICT50/mL

1.26x102DICT50/mL

1.26x10DICT50/mL

1.26 DICT50/mL

-0.03

0.07

0.17

0.27

0.37

0.47

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Cycles

Flu

ores

cenc

e (d

Rn)

1.26x105DICT50/mL

1.26x104DICT50/mL

1.26x103DICT50/mL

1.26x102DICT50/mL

1.26x10DICT50/mL

1.26 DICT50/mL

-0.009

0.011

0.031

0.051

0.071

0.091

0.111

0.131

0.151

0.171

0.191

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Cycles

Flu

ores

cenc

e (d

Rn)

6.3x104DICT50/mL

6.3x103DICT50/mL

6.3x102DICT50/mL

6.3x10 DICT50/mL

6.3 DICT50/mL

-0.009

0.011

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0.191

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Cycles

Flu

ores

cenc

e (d

Rn)

6.3x104DICT50/mL

6.3x103DICT50/mL

6.3x102DICT50/mL

6.3x10 DICT50/mL

6.3 DICT50/mL

-0.005

0.005

0.015

0.025

0.035

0.045

0.055

0.065

0.075

0.085

0.095

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Cycles

Flu

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e (d

Rn)

3.03x106DICT50/mL

3.03x105DICT50/mL

3.03x104DICT50/mL

3.03x103DICT50/mL

3.03x102DICT50/mL

3.03x10 DICT50/mL

-0.005

0.005

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1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Cycles

Flu

ores

cenc

e (d

Rn)

3.03x106DICT50/mL

3.03x105DICT50/mL

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-0.03

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0.37

0.47

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Cycles

Flu

ores

cenc

e (d

Rn)

1.26x105DICT50/mL

1.26x104DICT50/mL

1.26x103DICT50/mL

1.26x102DICT50/mL

1.26x10DICT50/mL

1.26 DICT50/mL

-0.03

0.07

0.17

0.27

0.37

0.47

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Cycles

Flu

ores

cenc

e (d

Rn)

1.26x105DICT50/mL

1.26x104DICT50/mL

1.26x103DICT50/mL

1.26x102DICT50/mL

1.26x10DICT50/mL

1.26 DICT50/mL

-0.009

0.011

0.031

0.051

0.071

0.091

0.111

0.131

0.151

0.171

0.191

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Cycles

Flu

ores

cenc

e (d

Rn)

6.3x104DICT50/mL

6.3x103DICT50/mL

6.3x102DICT50/mL

6.3x10 DICT50/mL

6.3 DICT50/mL

-0.009

0.011

0.031

0.051

0.071

0.091

0.111

0.131

0.151

0.171

0.191

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Cycles

Flu

ores

cenc

e (d

Rn)

6.3x104DICT50/mL

6.3x103DICT50/mL

6.3x102DICT50/mL

6.3x10 DICT50/mL

6.3 DICT50/mL

-0.005

0.005

0.015

0.025

0.035

0.045

0.055

0.065

0.075

0.085

0.095

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Cycles

Flu

ores

cenc

e (d

Rn)

3.03x106DICT50/mL

3.03x105DICT50/mL

3.03x104DICT50/mL

3.03x103DICT50/mL

3.03x102DICT50/mL

3.03x10 DICT50/mL

-0.005

0.005

0.015

0.025

0.035

0.045

0.055

0.065

0.075

0.085

0.095

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Cycles

Flu

ores

cenc

e (d

Rn)

3.03x106DICT50/mL

3.03x105DICT50/mL

3.03x104DICT50/mL

3.03x103DICT50/mL

3.03x102DICT50/mL

3.03x10 DICT50/mL

Standard Curve

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

10.00 1000.00 100000.00 10000000.00

TCID50/mLC

t (dR

n)

CY5 Standards, RSq:0.999 CY5, Y = -3.344*LOG(X) + 42.89, Eff. = 99.1%

(Equivalentes)

Standard Curve

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

0.10 100.00 100000.00

TCID50/mL

Ct (

dRn)

FAM Standards, RSq:0.999 FAM, Y = -3.563*LOG(X) + 37.60, Eff. = 90.8%

(Equivalentes)

Standard Curve

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

1.00 100.00 10000.00 1000000.00

TCID50/mL

Ct (

dRn)

JOE Standards, RSq:1.000 JOE, Y = -3.522*LOG(X) + 35.69, Eff. = 92.3%

(Equivalentes)

Standard Curve

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

10.00 1000.00 100000.00 10000000.00

TCID50/mLC

t (dR

n)

CY5 Standards, RSq:0.999 CY5, Y = -3.344*LOG(X) + 42.89, Eff. = 99.1%

(Equivalentes)

Standard Curve

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

10.00 1000.00 100000.00 10000000.00

TCID50/mLC

t (dR

n)

CY5 Standards, RSq:0.999 CY5, Y = -3.344*LOG(X) + 42.89, Eff. = 99.1%

(Equivalentes)

Standard Curve

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

0.10 100.00 100000.00

TCID50/mL

Ct (

dRn)

FAM Standards, RSq:0.999 FAM, Y = -3.563*LOG(X) + 37.60, Eff. = 90.8%

(Equivalentes)

Standard Curve

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

0.10 100.00 100000.00

TCID50/mL

Ct (

dRn)

FAM Standards, RSq:0.999 FAM, Y = -3.563*LOG(X) + 37.60, Eff. = 90.8%

(Equivalentes)

Standard Curve

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

1.00 100.00 10000.00 1000000.00

TCID50/mL

Ct (

dRn)

JOE Standards, RSq:1.000 JOE, Y = -3.522*LOG(X) + 35.69, Eff. = 92.3%

(Equivalentes)

Standard Curve

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

1.00 100.00 10000.00 1000000.00

TCID50/mL

Ct (

dRn)

JOE Standards, RSq:1.000 JOE, Y = -3.522*LOG(X) + 35.69, Eff. = 92.3%

(Equivalentes)

<1 DICT50/ RT-PCR para los tres aislados

Estudios sobre WNV en el CISA: Nuevos métodos diagnósticos� ELISA de detección de anticuerpos frente a WNV

� Desarrollado en colaboración con la empresa INGENASA.

� Válido para anticuerpos en suero de amplio rango de especies hospedadoras, desde aves hasta mamíferos.

� Ventajas:� Bajo consumo de muestra (10 ml de

suero).� Alta sensibilidad y especificidad.� Detecta Ac a 3 dpi en aves infectadas

experimentalmente.� Detecta Ac frente a distintos linajes

de WNV.

Estudios sobre WNV en el CISA: Estudios serológicos en aves y caballos.

� Doñana y marismas del Guadalquivir:� Seroprevalencias por especies.

� Seroprevalencia en pollos de aves migratorias que crian en España.

� Migración y seroprevalencia en paseriformes.

� Seroprevalencia en aves que ingresan en los CREAS.

� Seroprevalencia en caballos en libertad.

� Castilla-La Mancha:� Rapaces protegidas

Estudios sobre WNV en el CISA: Estudios virológicos, primeros aislados virales españoles.

100 Km.

EspaEspa ñña, 2007a, 2007

Estudios sobre WNV en el CISA

�Estudios de patogénesis�En modelo murino:

Cepa NS3249 DL50 (PFU)Tiempo medio de

supervivencia ± SD (días)

SP`07 Pro 17,78 9,38 ± 1,51

M0`03 Thr 1,78 9,93 ± 1,86

NY`99 Pro 2,31 8,83 ± 1,17

B956 His 39,32 10,55 ± 1,5

NS3249Pro

NS3NS3249249ProPro no es un determinante de no es un determinante de

patogenicidadpatogenicidad consistenteconsistente

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10

Days postinoculation

% o

f Sur

vivo

rs

Virulencia en un modelo aviar autóctono del Sur de Europa: la perdiz roja (Alectoris rufa)

� Ambas cepas del MediterráneoOccidental son patogénicas en la perdizroja.

� La cepa Morocco/2003 (NS3249Thr) esmás virulenta que Spain/2007 (NS3249Pro).(Sotelo et al, Vet Res, en prensa).

1,0E+00

1,0E+02

1,0E+04

1,0E+06

1,0E+08

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Days postinoculation

PF

U/m

L1,0E+00

1,0E+02

1,0E+04

1,0E+06

1,0E+08

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Days postinoculation

PF

U/m

L

WNV SPA/2007(NS3249Pro)

WNV Mor/2003(NS3249Thr)

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10

Days postinoculation

% o

f Sur

vivo

rs

Virulencia en un modelo aviar eurasiáticoabundante en los humedales españoles: la focha común (Fulica atra).

1,0E+00

1,0E+02

1,0E+04

1,0E+06

1,0E+08

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Days postinoculation

PF

U/m

L

b)

1,0E+00

1,0E+02

1,0E+04

1,0E+06

1,0E+08

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Days postinoculation

PF

U/m

L

b)

WNV SPA/2007(NS3249Pro)

WNV NY99(NS3249Pro)

Estudio pendiente de anEstudio pendiente de anáálisis de resultadoslisis de resultados

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10

Days postinoculation

% o

f Sur

vivo

rs

Virulencia en un modelo aviar peridoméstico: el gorrión común (Passer domesticus).

1,0E+00

1,0E+02

1,0E+04

1,0E+06

1,0E+08

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Days postinoculation

PF

U/m

L

b)

1,0E+00

1,0E+02

1,0E+04

1,0E+06

1,0E+08

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Days postinoculation

PF

U/m

L

b)

WNV SPA/2007(NS3249Pro)

WNV NY99(NS3249Pro)

Estudio en curso actualmente en el CISAEstudio en curso actualmente en el CISA

Colaboraciones del CISA en investigación sobre WNV

IZSLER

OVI

¡Muchas gracias!