TEMA 10

Cultivo y aislamiento depatógenos viables

Tema 10. Cultivo y aislamiento de patógenos viables

1. Medios de cultivo2. Preparación de medios de cultivo artificiales3. Condiciones para el aislamiento de patógenos

3.1. Comportamiento de los microorganismos frente al oxígeno3.1.1. Incubación de microorganismos microaerófilos y

capnófilos3.2. Comportamiento de los microorganismos frente a la temperatura3.3. Comportamiento de los microorganismos frente al pH. Tiempo de

incubación4. Medios artificiales

4.1. Ejemplos de medios de aislamiento primario4.1.1. Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA)4.1.2. Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos)

4.2. Ejemplos de caldos de enriquecimiento4.2.1. Caldo selenito

4.3. Ejemplos de medios enriquecidos4.3.1. Agar sangre

4.4. Ejemplos de medios diferenciales4.4.1. Agar de MacConkey4.4.2. Agar salino manitol (SM)

Tema 10. Cultivo y aislamiento de patógenos viables

4. Medios artificiales (continuación)4.5. Ejemplos de medios selectivos

4.5.1. Agentes inhibidores4.5.2. Agar entérico de Hektoen (HE)4.5.3. Agar alcohol fenil etílico (PEA)

4.6. Medios cromogénicos5. Recuento de patógenos

5.1. Mediante la técnica de estría en placa5.2. Mediante la utilización de asa calibrada

6. Cultivo de patógenos intracelulares obligados

Regla de oro de la Microbiología

Muestra

Cultivo y aislamiento de microorganismos

Cultivo puro

Identificación

Realización pruebas susceptibilidad

Etapa limitante en la rapidez del diagnóstico microbiológico

1. Medios de cultivo

¿Qué es un medio de cultivo?

1. Medios de cultivo

• Preparación

• Esterilización– Autoclave– Tindalización– Filtración– Luz UV– Horno a 180 ºC– Óxido de etileno

• Adición de sustanciastermolábiles

• Vertido en placas de Petri (medios sólidos) o tubos (medios líquidos o medios sólidos)

2. Preparación de medios de cultivo artificiales

• Medio de cultivo

– No exigentes: nutrientes (C, N, S, P), sales, tampón.

– Exigentes: nutrientes más sustancias complejas (sangre, suero,

huevo, patata, factor X, factor V, vitaminas).

• Condiciones de incubación

– Atmósfera

– Temperatura

– Humedad

– Tiempo de incubación

– pH

– Ausencia de factores inhibidores o antagonistas del crecimiento

3. Condiciones para el aislamiento de patógenos

• Aerobios

– Anaerobios facultativos

• Anaerobios

• Microaerófilos

– Frascos con vela

– Agar semisólido

• Capnófilos

– Atmósfera de CO2

– Sistemas GasPak, Bio Bag

(bicarbonato y ácidos)

– Utilización de estufas de CO2

3.1. Comportamiento de los microorganismos frente al oxígeno

A: Aerobios obligadosB: MicroaerófilosC: Anaerobios facultativosD: Anaerobios estrictos

Crecimiento

3.1.1. Incubación de microorganismos microaerófilos y capnófilos

• Temperatura de incubación

35-37 ºC

30 ºC

• Otras temperaturas

Elevadas (42 ºC)

Bajas (4ºC) enriquecimiento en frío

Intermedias (22 ºC)

3.2. Comportamiento de los microorganismos frente a la temperatura

3.3. Comportamiento de los microorganismos frente al pH. Tiempo de incubación.

• pH

• Tiempo de incubación

• Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento o medios nutritivos)

• Medios enriquecidos

• Caldos de enriquecimiento

• Medios diferenciales

• Medios selectivos

• Medios cromogénicos

4. Medios artificiales

• Agar nutritivo

• Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA)

• Agar triptona soja (TSA)

• Agar sangre

• Agar chocolate

• Agar CLED (urocultivo)

• Caldo con carne picada

4.1. Ejemplos de medios de aislamiento primario

Componentes

Extracto de cerebro

Extracto de corazón

Peptona

Glucosa

Tampón fosfato

NaCl

Agar

Cantidad

7,8 g/L

9,7 g/L

10 g/L

2 g/L

2,5 g/L

5 g/L

15 g/L

Propiedad

Fuente de nutrientes

Fuente de nutrientes

Fuente de proteínas

Hidrato de carbono

Regulación pH

Estabilizador osmótico

Agente solidificante

Medio rico, no selectivo, permite crecimientode la mayoría de microorganismos no exigentes.

Ausencia de agentes inhibidores.

4.1.1. Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA)

Componentes Cantidad

Digerido pancreático de gelatina 4 g/LDigerido pancreático de caseína 4 g/LExtracto de carne 3 g/LLactosa 10 g/LL-cistina 0,128 g/LAzul de Bromotimol 0,02 g/LAgar 15 g/L

La lactosa es el único carbohidrato presente. Permite diferenciar losfermentadores de lactosa de los no fermentadores gracias a la presenciadel indicador azul de bromotimol que vira a color amarillo a pH ácido.

Debido a su deficiencia en electrolitos, no permite que las colonias de Proteus invadan la placa de cultivo, lo que facilita el recuento.

La cistina facilita el crecimiento de los coliformes.

4.1.2. Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos)

• Caldo selenito Salmonella

• Caldo tetrationato Salmonella y Shigella

• Caldo para Gram negativos Salmonella y Shigella

Se debe subcultivar en medios más selectivos al cabo de unas horas

4.2. Ejemplos de caldos de enriquecimiento

Componentes

Peptona

Lactosa

Selenito de sodio

Fosfato de sodio

Cantidad

5 g/L

4 g/L

4 g/L

10 g/L

Propiedad

Fuente de proteínas

Fuente de carbono

Agente inhibidor de la mayoría de enterobacterias, incluyendo muchas especies de Shigella

Tampón

Enriquecimiento de especies de Salmonella en muestras de heces, aguas fecales, etc.

Subcultivar al cabo de 8-12 horas en medio más selectivo (Agar SS o Agar sulfito de bismuto).

4.2.1. Caldo selenito

Agar base de Columbia + 5% sangre desfibrinada

Componentes Cantidad

Peptona 5 g/LTripteína 12 g/LExtracto de levadura 3 g/LExtracto de corazón (buey) 3 g/LAlmidón soluble 1 g/LCloruro sódico 5 g/LAgar 15 g/L

Medio rico y diferencial.

La sangre más comúnmente utilizada es la de oveja, al 5%, estéril y desfibrinada.

Una vez preparado el medio de cultivo, se enfría hasta 45ºC y se le añade la sangre.

4.3. Ejemplo de medios enriquecidos

4.3.1. Agar sangre

Beta hemólisisLisis completa de los glóbulos rojosHalo transparente alrededor de la colonia

Alfa hemólisis

Lisis parcial de los glóbulos rojosSe abren poros en la membranaSalida de hemoglobina al medioOxidación del grupo hemoFormación de biliverdina (color verdoso)Halo verdoso alrededor de la colonia

CARACTERÍSTICAS DE LA BETA Y ALFA HEMÓLISIS

4.3.1. Agar sangre

β

α

• Agar sangre

• Agar CLED

• Agar EMB

• Agar de MacConkey

• Agar SS

• Agar entérico de Hektoen (HE)

• Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

• Agar salino manitol (SM)

4.4. Ejemplos de medios diferenciales

Componentes

Peptona

Polipeptona

Lactosa

Sales biliares (conc. moderada)

Cristal violeta

NaCl

Rojo neutro

Agar

Cantidad

17 g/L

3 g/L

10 g/L

1,5 g/L

0,001 g/L

5 g/L

0,03 g/L

13,5 g/L

Propiedad

Fuente de proteínas

Fuente de proteínas

Azúcar fermentable

Inhibidor de Gram positivos

Inhibidor de Gram positivos

Estabilizador osmótico

Indicador de pH

Agente solidificante

Aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos Gram negativos fermentadores y no fermentadores de la lactosa.

4.4.1. Agar de MacConkey

Colonias rojas/rosa

Fermentadores de lactosa

No patógenos (E. coli, Citrobacter)

Patógenos (Klebsiella, Enterobacter)

Colonias transparentes/blancas

No fermentan la lactosa

Patógenos (Salmonella, Shigella, Yersinia, Proteus)

Precipitación en el medio

Fermentadores fuertes de lactosa

(E. coli, Enterobacter)

4.4.1. Agar de MacConkey

Medio de Chapman

Componentes Cantidad

Extracto de levadura 2,5 g/LTriptona 10 g/LGelatina 30 g/LLactosa 2 g/LManitol 10 g/LCloruro sódico 75 g/LFosfato dipotásico 5 g/LRojo fenol 0,025 g/LAgar 15 g/L

Se pueden distinguir los estafilococos que fermentan el manitol de los que no lo fermentan gracias al rojo fenol que vira a color amarillo en medio ácido.

La mayoría de los microorganismos no crecen a una concentración de cloruro sódico del 7,5%, mientras que los estafilococos sí lo hacen.

4.4.2. Agar salino manitol (SM)

• Moderadamente selectivos

– MacConkey Enterobacterias

– EMB Enterobacterias

• Altamente selectivos

─ Agar salino manitol Staphylococcus

─ Agar SS Salmonella y Shigella

─ Agar entérico de Hektoen (HE) Salmonella y Shigella

─ Agar sulfito de bismuto Salmonella y Shigella

─ Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) Salmonella y Shigella

─ Agar alcohol fenil etílico (PEA) Gram positivos

4.5. Ejemplos de medios selectivos

• Colorantes (azul de metileno, cristal violeta, verde brillante, eosina)

• Antibióticos

• Metales (Se, Bi)

• Sales biliares

• Azida

• Alcoholes (alcohol feniletílico)

• Sales (cloruro sódico a alta concentración)

4.5.1. Agentes inhibidores

Componentes

Peptona

Extracto de levadura

Sales biliares (alta conc.)

Lactosa

Sacarosa

NaCl

Tiosulfato de sodio

Citrato férrico amónico

Azul de timol

Agar

Cantidad

12 g/L

3 g/L

9 g/L

12 g/L

12 g/L

5 g/L

5 g/L

1,5 g/L

0,04 g/L

14 g/L

Propiedad

Fuente de C y N

Fuente de N

Inhibidor de Gram positivos

Azúcar fermentable

Azúcar fermentable

Estabilizador osmótico

Fuente de azufre

Fuente de hierro

Indicador de pH

Agente solidificante

Aislamiento y diferenciación de especies de Salmonella y Shigella de otros bacilos entéricos Gram negativos en muestras fecales.

4.5.2. Agar entérico de Hektoen (HE)

Las colonias de los fermentadores de lactosa (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) se ven de color amarillo-naranja. Las de los no fermentadores se ven incoloras.

Salmonella tiene un punto negro central por la producción de sulfhídrico (sulfuro de hierro precipitado). La mayoría de las especies de Shigella no producen sulfhídrico.

4.5.2. Agar entérico de Hektoen (HE)

Componentes

Extracto de carne

Triptosa

Feniletanol

Cloruro de sodio

Agar

Cantidad

3 g/L

10 g/L

2,5 g/L

5 g/L

15 g/L

Propiedad

Fuente de C y N

Fuente de N

Inhibidor de Gram negativos

Estabilizador osmótico

Agente solidificante

Aislamiento de microorganismos Gram positivos, especialmente estafilococos y estreptococos, a partir de diversas muestras con microbiota mixta.

La adición de alcohol fenil etílico inhibe o reduce drásticamente el crecimiento de bacterias Gram negativas porque inhibe la síntesis de ADN. Además, previene la proliferación de colonias invasivas tipo “swarming”.

El alcohol fenil etílico es un antimicrobiano, antiséptico y desinfectante que también se utiliza como esencia aromática y preservativo en farmacia y perfumería.

Las placas de este medio recién preparadas huelen a rosas.

4.5.3. Agar Alcohol Feniletílico (PEA)

4.5.3. Agar Alcohol Feniletílico (PEA)

Cuando a este medio se le adiciona sangre de oveja al 5%, se convierte en un excelente medio para el aislamiento de bacterias anaerobias presentes en muestras clínicas donde hay una microbiota abundante y heterogénea que contiene bacterias Gram negativas de crecimiento rápido tal como Proteus.

Medios altamente selectivos y diferenciales.

Incorporan sustratos incoloros que se transforman en productos con color (cromogénicos) tras actuar sobre ellos una enzima específica.

Detección de actividades enzimáticas características de determinados géneros o especies de bacterias.

β- galactosidasa

β- glucosidasa

β- glucuronidasa

ONPG ONP + galactosa

Incoloro Amarillo

β- galactosidasa

La producción de un color característico permite la identificación.

4.6. Medios cromogénicos

Ejemplos de medios cromogénicos

• Agar CPS-ID3

• Chromogenic UTI

• CHROMAgar Orientation

• URI Select 4

4.6. Medios cromogénicos

Estimación del número de microorganismos en la muestra original en función del crecimiento:

• Escaso

• Moderado

• Abundante

5. Recuento de patógenos

5.1. Mediante la técnica de estría en placa

5.2. Mediante la utilización de asa calibrada

• Crecen sólo dentro de células (clamidias, ricketsias, virus)

• No se ha encontrado un medio completamente artificial para su desarrollo

– Legionella pneumophila (Agar BCYE)

• Cultivos de tejidos en el laboratorio

6. Cultivo de patógenos intracelulares obligados

Cultivos primarios (nº cromosomas=2n)

– Células de riñón– Fibroblastos

Líneas celulares continuas (aberraciones en el nº de cromosomas, aneuploidía)

– Hep-2, HeLa, Vero (Virus, ensayos de toxicidad Clostridium difficile)– McCoy (Clamidias)– A-549, RD, MDCK (Virus)

6. Cultivo de patógenos intracelulares obligados