MÉTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGÍA

M.C.D. Ma. De Lourdes Urquizo RuvalcabaEsp. Patología y Medicina Bucal

MÉTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGÍA

HISTOLOGÍA Estudia la microanatomía de las células, los tejidos y

los órganos y correlaciona su función.

HISTOTECNOLOGÍA Conjunto de técnicas que se llevan acabo para la

preservación y preparación de los tejidos y células, para su estudio con microscopio de luz y sus variantes

MÉTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGÍA

OBJETIVOS DE LA HISTOTECNOLOGÍA

Preservación optima y funcional de los diferentes materiales tisularesy celulares que llegan al laboratorio.

Conocer los principios de las técnicas rutinarias y especiales, así como sus indicaciones precisas para el estudio de los tejidos

TÉCNICA HISTOLÓGICA

Comprende la preparación de tejidos para su estudio microscópico.

Se logra sometiéndolos a una serie de procesos: Obtención del tejido a estudiar Fijación Deshidratación Aclaramiento Inclusión Corte Montaje Observación (Diagnóstico)

TÉCNICA HISTOLÓGICA

OBTENCIÓN DEL TEJIDO A ESTUDIAR BIOPSIAS

Incisional Excisional

NECROPSIA O AUTOPSIA CITOLOGÍA EXFOLIATIVA FROTIS

TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJACIÓN

Se refiere al tratamiento del tejido con sustancias químicas que tienen varias finalidades:

Preservar el tejido de la putrefacción, autolisis, etc.

Conserva la estructura morfológica y química de las células y tejidos al estado vivo (citoarquitectura y ultraestructura)

Aumenta la dureza del tejido para facilitar la preparación de finas películas de éste.

Y permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima

TÉCNICA HISTOLÓGICA: CUALIDADES DE UN FIJADOR

Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan autólisis, desintegración, etc.)

Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas.

Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo

TÉCNICA HISTOLÓGICA: CUALIDADES DE UN FIJADOR

Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.)

No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales

No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.

TÉCNICA HISTOLÓGICA:¿Cómo actúan los fijadores?

Varía con la composición o naturaleza Coagulando las proteínas sin combinarse con ellas

(alcohol, ácido pícrico, yodo, calor)

Formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales), o reduciéndose en contacto con las mismas y originando un precipitado sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).

La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favorece la coloración ulterior de los tejidos.

TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS

Son los más utilizados Pueden ser: Fijadores simples

constituidos por una sola sustancia química

Fijadores compuestos cuando varias fijadores simples intervienen en su

constitución racionalmente elegidos con el fin de completar la

acción de cada uno de ellos o atenuar sus efectos

TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS

FIJADORES SIMPLES Formol al 10%

e s e l m á s us a d o . Reacciona con los grupos aminos de las proteínas, formando

enlaces transversales y conservando las estructuras de la célula.

Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos.

Alcohol etílico absoluto o de 96% Se usa generalmente en microquímica. Preserva el glucógeno. Causa distorsión del detalle nuclear y comprime el

citoplasma.

TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS

FIJADORES SIMPLES Alcohol metílico.

Se emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.)

Ácido ósmico al 1 ó 2% Es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien

estructuras celulares.

TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS

FIJADORES SIMPLES Bicromato de potasio al 3-5%.

Fija el citoplasma y no se precipita. Nunca se usa solo. Después de la fijación loes especímenes deben ser

lavados exhaustivamente para remover el oxido que se forma

TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS

FIJADORES COMPUESTOS Líquido de Fleming, m e z c la c ro m o -o s m io -

a c é tic a . Líquido de Zenker, m e z c la bic ro m a to -s ublim a d o -

a c é tic a . Líquido de Helly, m e z c la Ze nke r-fo rm o l. Líquido de Bouin, m e z c la p ic ro -fo rm o s -a c é tic a . Liquido de Duboscq-Brasil, o Bo uina lc o hó lic o

TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES FÍSICOS

Desecación. Calor seco.

Coagulación de las proteínas No es buena ya que las células se destruyen.

Calor húmedo. Frío y Congelación .

Se congela el tejido con dióxido de carbono o N liquido

Es mejor que el calor pero se pueden formar cristales.

TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL

I. FIJACIÓN Fijación en formol al 10% (1 parte

de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos durante 6 hs.

II. DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA Y CORTE

Se describe forma, color, textura, superficie, consistencia al corte y se mide.

Se le da el tamaño deseado a la pieza

Enjuaga durante 15 min.

TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL

III. DESHIDRATACIÓN Debido a que una gran parte del tejido está constituida por

agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante.

Se debe deshidratar el tejido, ya que la parafina nos es hidrosoluble

Alcohol 70º, 1h30'. Alcohol 96º, 1h30'. Alcohol 100º (l), 1h30'. Alcohol 100º (ll), 1h30'. Toluol O Xilol , entre 1h30' y 3hs. (Aclaramiento)

NOTA: si se colocara el tejido en una solución al 100% de alcohol inmediatamente, el agua saldría muy rápido del tejido y se deformaría.

TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL

ACLARAMIENTO Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una

sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusión (PARAFINA) a utilizar.

Se sustituye el alcohol por un líquido intermediario normalmente el hidrocarburo bencénico (xilol, benceno, toluol).

Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción.

Nota: El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula y por lo cual al extraerse también se extraen las grasas y los lípidos de la célula.

TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL

IV. INCLUSIÓN A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos

para ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme. gelatina y parafina.

El objeto de la inclusión es: Distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la

matriz extracelular. Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y

corte. La parafina penetra en los vasos, en los espacios

intercelulares y en el interior de las células embebiendo el tejido y haciendo más fácil la obtención de cortes en el microtomo.

TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL

IV. INCLUSIÓN Infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en

estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido.

1.Secado de la muestra con gasa.

2) Parafina 56º (l), 1h30'.

3) Parafina 56º (ll), 1h30'.

4) Formación de la barra.

5) 30' de frezzer.

6) Fractura del taco

NOTA: Debido al calor, el xilol se evapora y los espacios anteriormente ocupados por el son ahora ocupados por la parafina

TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL

V. CORTE El taco ahora se puede cortar en secciones lo

suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz.

La mayor parte de los preparados para microscopia óptica tienen un grosor entre 3 a 10 micrómetros (5μ)

MICROTOMO.

TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL

VI. COLORACIÓN Y MONTAJE Los cortes todavía no son aptos para su examen con el

microscopio, puesto que los tejidos se hallan infiltrados en parafina y carecen de color.

Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les ha agregado una pequeña cantidad de Albúmina, la cual actúa como adhesivo.

La parafina se elimina en un solvente orgánico, de nuevo se incluyen en Xilol, y la muestra se rehidrata haciéndola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a una solución 100% y agua.

TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL

VI. COLORACIÓN Y MONTAJE Ya rehidratado se TIÑE EL TEJIDO. Los colorantes más utilizados son la HEMATOXILINA Y

la EOSINA. Una vez teñido, se deshidrata de nuevo, de tal manera

que pueda fijarse de modo permanente el CUBREOBJETOS con un medio adecuado para el MONTAJE (por ejemplo una gota de Bálsamo de Canadá o similar).

TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL

VI. COLORACIÓN Y MONTAJE 1.Xilol o toluol(I), 15' en estufa. 2. Xilol o toluol(II), 2'. 3. Alcohol 100º, 30". 4. Alcohol 96º, 30". 5. Alcohol 70º, 30". 6. Alcohol 50º, 30". 7.Agua destilada, 30". 8. Hematoxilina, 1´30". 9. Agua corriente, 2´. 10. Alcohol 50º, 15". 11. Eosina, 30". 12. Alcohol 96º, 10". 13. Alcohol 100º, 10". 14. Xilol, 1´ por lo menos. 15. Montaje con Bálsamo de Canadá sintético.

VI. COLORACIÓN Y MONTAJE

Los colorantes pueden agruparse en 3 clases: Colorantes que diferencian los componentes

ácidos y básicos de la célula. Colorantes especializados que distinguen los

componentes fibrosos de la matriz extracelular.

Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales con ellos

HEMATOXILINA Y EOSINA

Tinción PAS (ácido peryódico-reactivo de Schiff)

Es uno de los métodos químicos más empleados en histología. Tiñe carbohidratos y macromoléculas ricas en carbohidratos. Se usa para detectar :

glucógeno en las células Moco en diversos tipos celulares Membrana basal subyacente a los epitelios Fibras reticulares del tejido conectivo

Los anillos de las hexosas (carbohidratos) poseen carbonos adyacentes, cada uno con un grupo hidroxilo

El ac, peryódico rompe la unión entre estos átomos de carbono adyacentes y forma grupos aldehído.

Estos aldehídos reaccionan con el reactivo de Schiff para dar un color púrpura intenso (rojo luminoso)

Tinción PAS (ácido peryódico-reactivo de Schiff)

Tinción PAS (ácido peryódico-reactivo de Schiff)

Tricromico de Masson

Es una técnica para la coloración de fibras colágenas y elásticas. Se observan tres colores distintos:

Núcleos: Negro Músculo, citoplasma y queratina: rojo Colágeno: azul o verde

COLORACION DE WRIGHT

TEJIDO CONECTIVO LÍQUIDO: SANGRE

NEGRO SUDÁN

Los colorantes Sudán tiñen fuertemente los TRIGLICÉRIDOS, como por ejemplo:

Rojo de sudán o sudán III, en la coloración de células adiposas.

El negro de sudán o sudán IV, se emplea en la coloración de las vainas mielínicas de las fibras nerviosas compuestas por lipoproteínas.

TINCION ARGÉNTICA

TÉCNICA HISTOLÓGICA: INMUNICITOQUÍMICA

INMUNICITOQUÍMICA DIRECTA

INMUNICITOQUÍMICA INDIRECTA

AUTORRADIOGRAFIA

CRIOFRACTURA

CRIOFRACTURA

TÉCNICA HISTOLÓGICAVII. OBSERVACIÓN(DIAGNÓSTICO)

TÉCNICA HISTOLÓGICAVII. OBSERVACIÓN(DIAGNÓSTICO)

TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERAL

VII. OBSERVACIÓN (DIAGNÓSTICO) MICROSCOPIO