Métodos de estudio y

cultivo de virus Dra. Ana Marta de los

Ángeles Lobo Sánchez

Zaira Guerrero González

Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el

laboratorio son:

1.Animales de experimentación

2.Embriones animales

3.Cultivos celulares artificiales

1935.virus gripal

Cultivo en huevo fértil de ave

1929. Ernest

William

Goodpasture y

Woodruff

cuerpos intracelulares

Viruela aves

tripsina

estudio y propagación

patógeno para los pollos

Replicación en células vivas

Huésped específico

Tropismo

ℭ𝑒𝑙. y mem.

extraembrionarias

sustratos variados

Componentes

Agua

Proteínas

Aminoácidos (AA)

Carbohidratos

Lípidos / Grasas

Vitaminas Liposolubles

Vitaminas Hidrosolubles

Minerales

Otros Componentes

Embrión de pollo

Desarrollo del Embrión del Pollo

Viabilidad del embrión

Ubicación del embrión

Cámara de aire

Infección: lesión tisular

local (pústula)

Intraperitoneal, o intracerebral

Dilución Tiempo de incubación

Temperatura

Cantidad del inóculo

Vías de inoculación

Inoculación por saco alantoideo

• Con colorante se observa: liquido

alantoideo, albumina y cámara de aire

teñidos

• Liquido alantoideo: virus hemaglutinantes

o producción de hemaglutininas

• Embrión de 9-12 días, inoculo de 0.1-

0.2ml

1cm

3 mm

45 °

Inoculación en saco amniótico

• Con colorante: líquido amniótico, cámara

de aire

• Primoaislamiento de cepas de influenza

• Embrión de 7-15 días, inoculo de 0.1-

0.2ml

Inoculación en saco vitelino

• Con colorante: Saco vitelino, Cámara de

aire

• Cultivo de clamidias y ricketsias

• Embriones de 5-8días, inoculo de 0.2-1ml

Inoculación en saco vitelino

Inoculación en Membrana corioalantoidea (MCA)

• Con colorante: membrana

corioalantoidea

• Permite cuantificar aquellos grupos

virales que producen lesiones localizadas

• Embrion de 10-12 días, inoculo de 0.1-

0.5ml

Inoculación de membrana

corioalantoidea (MCA)

MEMBRANA VIRUS TIPO DE

EMBRIÓN

CANTIDAD DE

INOCULACIÓN

SIGNOS DE

CRECIMIENTO

Saco vitelino Herpes simple

Neumonía y

Rickettsias

Se emplean

embriones de

5 – 8 días

0.2 – 1 ml Muerte

Cariolantoíes Herpes simple

Poxvirus

Sarcoma de Rous

Varicela

Virus de

Laringotraqueitis

aviar

Enfermedad de

Beyer

Se emplean

embriones de 10 –

12 días

0.1 – 0.5 ml Muerte

Pústulas

Pústulas

Focos o pústulas

fácilmente visibles

Alantoides Influenza

New Castle

Virus de la

bronquitis infecciosa

Se emplean

embriones de

9 – 12 días

0.1 – 0.2 ml Hemoglutinación

Amniótica Parotiditis

Virus de la Gripe

7 – 15 días 0.1 – 0.2 ml Muerte

Intravenosa Virus de la

Leucemia

10 - 15 días 0.02 - 0.05 ml. Pústulas

Intracerebral Virus del herpes

Rabia

8 – 14 días 0.01 – 0.02 ml

Alteraciones

cerebrales

VENTAJAS DESVENTAJAS

Control preciso y fino del medio ambiente

(fácil manipulación)

Caracterización y homogeneidad de la

muestra

Economía

No es necesario el espacio ni el cuidado que

requieren los animales.

Mantenimiento de los cultivos celulares.

Se pueden cuantificar aveces al correlacionar el

numero de pustulas con la dilución viral inoculada.

(Herpes y vaccinia).

Se emplea para preparar vacunas (influenza, fiebre

amarilla)

Aislamiento para diagnostico (viruela, herpes,

influenza)

Hacer ensayos de nuevos agentes virales

técnica sensible

calidad y costos

Inestabilidad

Apreciación difícil durante los tres

primeros días de edad del embrión

Capacidad de anclaje

Monocapa Suspención

clasificación

Lineas celulares

Discontinuas

(t° limitado)

Cultivos primarios

Células diploides

Continuas Multiplicación

indefinida

La inoculación en animales de experimentación de

muestras clínicas o de virus para su aislamiento o

propagación.

Poco usada

Se emplea únicamente cuando se trata de propagar

virus cuya replicación en los otros sistemas no es

posible.

Los animales más utilizados:

monos, los cobayos y los ratones

lactantes

La inoculación animal sigue siendo un método de gran valor para estudiar:

La oncogénesis viral La patología de los padecimientos virales La respuesta inmune a los virus El efecto de los factores ambientales sobre infecciones virales

• cambios bioquímicos y moleculares,

morfológicos y de viabilidad celular,

visibles a microscopía óptica,

causados durante el ciclo de

replicación viral.

• Aunque todos los virus líticos

producen efecto citopático, puede

observarse una gran diversidad de

manifestaciones

En células infectadas en cultivo, en las que se aprecia:

• pérdida de adherencia al sustrato

• inhibición por contacto

• redondeamiento celular

• formación de sincitios

• cuerpos de inclusión citosólicos

• transformación celular

• lisis, etc.

• Es la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen, secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.

• Muchos tipos de virus

inducen la aparición

de estructuras

membranosas en el

citoplasma, en

algunos casos en

forma de grandes

vacuolas

citoplasmáticas o

pequeñas.

• Los sincicios son grupos de células fusionadas apreciables como una masa celular multinucleada

• Es una alteración en el crecimiento normal de las células en cultivo con evidentes manifestaciones morfológicas.

• Se asocia a una serie de cambio moleculares y está especialmente ligada a virus que insertan su genoma en el de la célula infectada, pudiendo causar mutagénesis insercional al interrumpir antioncogenes o activar pro-oncogenes, o alterando la correcta regulación de la expresión génica celular.

• Las alteraciones bioquímicas son muy diversas y específicas de cada virus, si bien pueden señalarse las más importantes a nivel general.

• Algunos virus son capaces de mostrar esta inhibición en etapas tempranas de la infección pero la mayoría de los virus animales lo hacen en etapas tardías. El efecto más drástico suele producirse en la inhibición de la expresión de proteínas celulares por traducción preferente o casi exclusiva de proteínas virales.

• 1.- Inhibición de la síntesis de proteínas

celulares

• 2.- Inhibición de la síntesis de DNA

celular

• 3.- Inhibición de la síntesis de RNA

celular

• Cambios en la actividad de enzimas

presentes en las membranas.

• Modificaciones en la funcionalidad del

sistema vesicular.

• Aumento de la permeabilidad de la

membrana plasmática.