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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016 Memorias
Mutagenesis inducida por antibioticos y especies reactivas del oxigeno en una
cepa de Pseudomonas aeruginosa .
Roberto Adame Gómez (Becario) Facultad de Ciencias Químico Biológicas
Programa de Verano UAGro robert94a25@gmail.com
Área en la que participa: Medicina y ciencias de la salud
Dr. Arturo Ramírez Peralta (Asesor) Profesor-Investigador de la Facultad de Ciencias
Químico Biológicas ramirezperaltauagro@gmail.com
Resumen
La multiresistencia a antibióticos se genera por la exposición y adaptación a través de mutaciones aleatorias en el genoma de Pseudomonas aeruginosa, por lo cual en este estudio se determinaron los cambios fenotípicos en el perfil metabólico y factores de virulencia inducido por múgatenos en una cepa de P. aeruginosa, estos múgatenos pueden estar en contacto con esta cepa debido a que son utilizados como antibióticos o antisépticos para el control de este microorganismo; si estos múgatenos son capaces de inducir mutaciones podría explicar parte de la variedad de cepas que circulan clínicamente. En este estudio se obtuvieron 9 mutantes de P. aeruginosa utilizando tres múgatenos [rifampicina, ciproflaxino y peroxido de hidrogeno (H2O2)] en distintas concentraciones, una vez obtenidas las clonas se les realizo la determinación de lipasas, proteasas, producción de pigmento en medio de cultivo, cuntificacion de pioverdina, piocianina, biofilm por métodos espectrofotometría, resistencia a ampicilina por Kirby Bauer y una prueba de adherencia a superficies. Obteniendo que las clonas presentaron patrones diferenciales de expresión de piocianina, pioverdina y biofilm con respecto a la cepa de origen, e incluso la expresión cambia entre las clonas expuetas al mismo mutageno. La resistencia a ampicilina se conservó en todas las clonas y la producción de lipasas y proteasas fue atenuada en las clonas a exención de una. En conclusión la exposición a antibióticos y peróxido de hidrogeno generan cambios fenotípicos en la expresión de factores de virulencia en P. aeruginosa, y esto puede originar una mayor clonalidad de cepas circulantes en una población.
Palabras Clave: P. aeruginosa, Mutaciones, Biofilm, Rifampicina, H2O2
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016
Introducción
Pseudomonas aeruginosa es un microorganismo que se encuentra ubicuamente en el
ambiente, puede encontrarse en suelos y agua; contaminado alimentos y como un patógeno
oportunista en el ser humano, causando infecciones del aparato respiratorio y urinario, heridas,
bacteremia entre otros (Chugani and Greenberg 2007; Mena and Gerba 2009; Murray 2008).
Además, tiene una alta prevalencia como un microorganismo intrahospitalario y resistencia a
antibióticos.
Se han descrito múltiples factores de virulencia en P. aeruginosa que favorece el proceso
de colonización e infeccioso, como la presencia de adhesinas y flagelos unipolares, hemolisinas,
β-lactamasas, formación de biofilm, secreción de fosfolipasa C y proteasas, enterotoxina A,
exoenzima S y T. También produce pioverdina, piocianina y piorrubina; pigmentos que ayudan a
catalizar peróxido de hidrogeno o superóxido (Murray 2008; Forbes et al., 2004). La regulación
para la expresión conjunta de estos factores de virulencia de P. aeruginosa está basado en sistema
Quorum Sensing (Rutherford y Bassler, 2012) y la multiresistencia a antibióticos se genera por la
exposición y adaptación a través de mutaciones aleatorias en su genoma (Forbes et al., 2004).
En el presente estudio se determinaron los cambios fenotípicos en el perfil metabólico y
factores de virulencia inducido por múgatenos en una cepa de P. aeruginosa, estos múgatenos
pueden estar en contacto con esta cepa debido a que son utilizados como antibioticos o antisepticos
para el control de este microorganismo; si estos mutagenos son capaces de inducir mutaciones
podria explicar parte de la variedad de cepas que circulan clinicamente. .
Materiales y Métodos
Recuperación de la cepa bacteriana. La cepa de Pseudomonas aeruginosa es un
aislamiento recuperado a partir de mosto utilizado en la elaboración de vino artesanal. La cepa
permanece en el cepario del Laboratorio de Investigación de Patometabolismo Microbiano de la
Universidad Autónoma de Guerrero con número de control E205. La recuperación de la cepa se
realizó por resiembra en agar Mueller Hinton y se confirmaron las características de aislamiento
primario: oxidasa positiva, morfología rizoide, producción de pigmentos.
Mutagénesis inducida por antibióticos. La cepa E205 fue inoculada a partir de la resiembra
original en caldo infusión cerebro corazón (BHI) e incubada por 24 horas a 37˚C. A partir de este
cultivo, se inoculo 100 ul en caldos con las siguientes concentraciones de los antibióticos
rifampicina y ciprofloxacino: 0.05 mg, 0.075 mg y 0.125 mg. Los caldos fueron incubados por 30
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minutos para permitir la siguiente generación bacteriana. Para la inactivacion del antibiótico, este
fue diluido tomando 15 ul de cada cultivo y resuspendiéndolo en 1.5 ml de Caldo BHI. Tomando
100 ul para sembrar en agar Mueller Hinton por estria en ‘V’
Mutagenesis inducida por estrés oxidativo. La cepa E205 fue inoculada a partir de la
resiembra original en caldo infusión cerebro corazón (BHI) e incubada por 24 horas a 37˚C. A
partir de este cultivo, se transfieren 100 ul a una solucion de peroxido de hidrogeno al 3% en Tris
5mM en un volumen final de 1ml. La reaccion fue detenida en los tiempos 4’, 8’ y 12’; para detener
la reaccion se traspaso 15 ul de la mezcla a 1.5ml de caldo BHI Tris 5mM y se dejo incubado por
10 minutos. Al termino, se tomaron 100 ul y se resembraron en agar Mueller Hinton por estria en
‘V’.
Perfil bioquimico. Las cepas fueron inoculadas por estria cruzada en los medios: agar
nutritivo al 10% de yema de huevo para evidenciar la degradacion de lipidos a partir de la enzima
lipasa, agar nutritivo al 5% de leche el cual permite la determinacion de proteasas capaces de
degradar la caseina de la leche.
Resistencia a ampicilina. De un cultivo de 24 horas, se ajusta a escala de McFarland de 0.5
en solucion salina y se sembraron en agar Mueller Hinton con hisopo por estria en ‘V’. Despues
en condiciones de asepsia se coloca un disco de 10 ug de Ampicilina (Oxoid). El crecimiento es
incubado a 18hrs a 35˚C, la lectura se realizo midiendo el diametro de los discos y utilizando como
referencia los valores publicados por el CLSI.
Produccion de pigmentos. Para evidenciar cualitativamente esta caracteristica, las cepas se
sembraron en agar Mueller Hinton por estria cruzada, cuidando que el grosor de la caja fuera el
mismo y que de la estria se obtuvieran colonias aisladas despues de la incubacion a 24 hrs a 37˚C.
En el caso del metodo cuantitativo, las cepas se sembraron en caldo BHI y fueron incubadas por
48 hrs a 37˚C, al termino del periodo de incubacion, se recuperaron 700 ul de los sobrenadantes a
los cuales se les agrego 700 ul de cloroformo para la extraccion de piocianina, los tubos fueron
centrifugados a 3500 rpm por 5 minutos para obtener tanto la fase acuosa como la organica; la fase
acuosa fue utilizada para la determinacion de pioverdina la cual se realizo en microplaca de ELISA
con lectura a 460 nm. De la fase organica, se acidifico con HCl 0.2 N y esta se centrifugo por 5
minutos a 3500 rpm, de las dos fases obtenidas, se recupero la fase acuosa la cual fue utilizada para
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la determinacion de piocianina de la misma manera que pioverdina, solo cambiando la longitud de
onda a 520 nm.
Produccion de biofilm. Las cepas fueron sembradas en 3 ml de caldo de BHI e incubadas a
37˚C por 48 horas. El crecimiento fue retirado y el tubo fue lavado tres veces con solucion salina
fisiologica y despues teñido con cristal violeta durante 10 minutos, despues el colorante es retirado
seguido de tres lavados con solucion salina. Por ultimo, se agrega un mililitro de etanol absoluto y
la cantidad del colorante desprendido del tubo es proporcional a la cantidad de biofilm. El etanol
absoluto fue leido en microplaca de ELISA a 500 nm.
Adherencia a superficies. En un caja de petri, se colocó un portaobjeetos en condiciones de
esterilidad, y a este se le colocaron 50 ul de caldo BHI, despues fue inoculado con una colonia de
las cepas de interes e incubado a 37˚C durante 24 hrs. Al termino de la incubacion, los portaobjetos
fueron lavados con solucion salina y teñidos con tincion de Gram. Se realizaron las lecturas a
microscopio optico a objetivo de inmersion. Se revisaron 10 campos y se tomaron fotos de campos
representativos de cada cepa utilizada.
Analisis estadistico. Los datos de pioverdina, piocianina y biofilm fueron ajustados en base
al crecimiento de las cepas. Los datos en las figuras se presentan con media y desviacion estandar.
Debido a que se contemplan nueve grupos de estudio, la comparacion de desviacion estandar se
hizo por la prueba estadistica ANOVA. Resultados menores a p= 0.05 se consideran como
estadisticamente significativos.
Resultados
Del 27 de Junio al 5 de agosto, se utilizaron tres mutagenos; dos de ellos antibioticos,
rifampicina y ciprofloxacino; y un agente oxidante, peroxido de hidrogeno; para generar
mutaciones aleatorias en una cepa de Pseudomonas aeruginosa; obteniendose ocho subclonas, de
las cuales cuatro fueron a partir de rifampicina (E205.1, E205.2, E205.3, E205.4), dos de
ciprofloxacino (E205.5, E205.6) y dos con peroxido de hidrogeno (E205.7, E205.8).
De acuerdo a las caracteristicas metabolicas, las subclonas son distintas, debido a que solo
la cepa original (E205) y la subclona obtenida de peroxido de hidrogeno (E205.7) son proteoliticas
y lipoliticas (cuadro 1). En cuanto a resistencia a penicilina, tanto la cepa original y las subclonas
muestran resistencia a ampicilina.
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Cuadro 1. Perfil bioquimico y de resistencia a ampicilina de las cepas de Pseudomonas aeruginosa de este estudio
Cepa 205 205.1 205.2 205.3 205.4 205.5 205.6 205.7 205.8 Lipasas a) + - - - - - - + - Proteasas b) + - - - - - - + - Resistencia a ampicilina c)
R R R R R R R R R
Fuente: Elaboracion propia. a) agar nutritivo al 10% de yema de huevo, b) agar nutritivo al 5% de leche, c) Kirbu Bauer
Una de las caracteristicas de selección de la subclonas fue la perdida del pigmento, por lo
cual al termino de la generacion de mutantes, se observó la produccion del pigmento difusible en
agar, donde se pierde el pigmento en la ultima subclona [Figura 1 j), E205.8]; ademas, la
morfologia entre la cepa y las subclonas cambia; observandose una morfologia rizoide en la cepa
original y en tres de las subclonas obtenidas con rifampicina [Figura 1 b) E205, c) E205.1, d)
E205.2, f) E205.4], y en ultima subclona obtenido con peroxido de hidrogeno, la morfologia
colonial fue puntiforme [Figura 1 j), E205.8]. Debido a que hay una diferencia entre la cepa y las
subclonas en la produccion de pigmentos que se ve reflejado en el color del medio, se realizo la
extraccion y se cuantifico pioverdina y piocianina, identificadose que que la subclona obtenida de
rifampicina fue la que produce una mayor cantidad de pigmentos tanto de pioverdina y piocianina,
incluso que la cepa original [Figura 1a)]. Tambien, se comprueba que la ultima subclona es la
menor productora de biofilm, caracteristica previamente evidenciada en placa [Figura 1j),
E205.8]. Por ultimo, se destaca que hay diferentes patrones de expresion de piocianina y pioverdina
en las subclonas con respecto a la cepa orginal [Figura 1a), p=0.01]
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Figura 1. Expresión cualitativa y cuantitativa de pigmentos en mutantes de P. aeruginosa. . a) muestra la cuantificación mediante un método espectrofotometrico, pioverdina de color verde (460nm) y piocianina de color azul (520 nm).La evaluación de la presencia de pigmentos se realizó en agar Mueller Hinton; b) cepa 205, c-f) clonas mutadas con rifampicina, g-h) con ciproflaxino y i-j) peróxido de hidrogeno
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Otra caracteristica importante a evaluar fue la produccion de biofilm, evidenciandose que
la produccion de biofilm es mayor en las ultimas subclonas obtenidas para los tratamientos con
antibioticos [Figura 2a)], incluso se observa que estas producen una mayor cantidad de biofilm
con respecto a la cepa original (p= 0.0032). El primer paso en la produccion de biofilm, es la
adherencia a superficies por lo cual se realizo una prueba de adherencia de cada cepa en cristal, en
cl cual se comportan de la misma manera a la produccion de biofilm, las subclonas que producen
mayor cantidad de biofilm se agregan con mayor facilidad y por lo tanto se identifica mayor
cantidad de celulas en el cristal [Figura 2c) E.2051, d) E205.2, e) E205.3, h) E205.6].
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Figura 2. Producción de biofilm y capacidad de adherencia de mutantes de P. aeruginosa. a) muestra la cuantificación de biofilm de cultivos de la clonas en caldo BHI durante 48 h y lectura a 500 nm. La adherencia a superficie se observa en objetivo de inmersión con tinción Gram, en b) cepa 205, c-f) clonas mutadas con rifampicina, g-h) con ciproflaxino y i-j) peróxido de hidrogeno.
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Discusión y conclusiones
Las mutaciones inducidas son aquellas provocadas por previa alteración experimental del
ADN, sea directamente, o indirectamente, por agentes físicos o químicos denominados mutágenos
(UNNE, 2016). En este estudio se realizaron exposiciones a tres múgatenos consecutivamente a
una cepa de P. aeruginosa, dos antibióticos (rifampicina y ciproflaxino) y un agente oxidante
(H2O2); para inducir mutaciones.
La rifampicina es un antibiótico de amplio espectro (Wehrli 1983) actuando sobre una
subunidad conservada del gen rpoB que codifica para la ARN polimerasa (RNAP), por coniguiente
se inhibe la síntesis de ARN (Villain et al., 2007).Este antibiótico fue el primero en utilizarse,
generando un cambio de morfología colonial, volviendo más irregular y rizoide la colonia y
después a una colonia circular de las clonas de P. aeruginosa (Figura 1 C)-F)) en contraste la
morfología colonial circular y con borde regular en la clonas tratadas con ciprofloxacino. Se ha
descrito que la resistencia a rifampicina es a costo de diversos cambios estructurales en P.
aeruginosa (Hall et al., 2011), Escherichia coli (Jin y Gross, 1989 ), Mycobacterium tuberculosis
(Gagneux et al., 2006) y Staphylococcus aureus (Wichelhaus et al., 2002).Pero no tan solo se
pueden producir estos cambios, la resistencia a antibióticos conferida por mutaciones
cromosómicas se expresan en términos de tasas de crecimiento reducidas, capacidad competitiva,
y la virulencia de las mutantes resistentes en comparación con los fenotipos de su antepasados
sensibles a antibióticos en ausencia de antibióticos; en este caso las mutantes con ambos
antibióticos muestran distintos patrones de expresión de piociniana y pioverdina en relación con
la cepa de origen e incluso entre las propias clonas, también la reducción de lipasa y proteasas.
Se ha evidenciado como el ciprofloxacino favorece la disgregación de Biofilm, afectando la
motilidad y expresión de factores de virulencia (Parul et al., 2016). En este caso la producción de
biofilm muestra un comportamiento similar al de pioverdina y piocianina, y los resultados de
biofilm coincide con la prueba de agregación a cristal, es importante recordar que la primera etapa
de formación de biofilm es la agregación a alguna superficie; esta etapa se lleva a cabo por las
adhesinas presentes en la membrana bacteriana (Giaouris et al., 2015), por los cual las clonas que
en este estudio no fueron capaces de adherirse son las que tiene valores menores en la prueba de
biofilm, esto como producto de una mutación en el genoma de P. aeruginosa.
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Estas mutaciones también se pueden desarrollar in vivo, en el proceso infeccioso, por
ejemplo en la fibrosis quística la hipermutación facilita los cambios de las características
fenotípicos y clonales de P. aeruginosa para la adaptación al ambiente (Hogardt et al., 2007; Mena
et al., 2008). He incluso se ha estudiado el impacto en la producción de factores de virulencia del
ácido salicílico en plantas infectadas por P. aeruginosa, encontrado que este es capaz de disminuir
la agregación bacteriana y la producción de piocianina (Prithiviraj et al., 2005) por lo cual se puede
comprobar que las mutaciones inducidas pueden suceder en la naturaleza.
La misma evolución bacteriana requiere de tasas de mutación que permitan la adaptación
a través de la variación de secuencias y al mismo tiempo preservación de la integridad del genoma.
La amplia conservación de múltiples procesos de reparación de errores en el ADN a través de
todos ámbitos de la vida indica una preferencia por los bajos índices de mutación (Sniegowski et
al., 2000; De Visser, 2002). Dentro de estos procesos se encuentra los que se encargan de la
eliminación de los mutagenos en el medio, entre estos se encuentra la superoxido dismutasa y
catalasa; P. aeruginosa es una bacteria productora de catalasa mediante el gen katA, esta catalasa
actúa en el medio extracelular (In et al., 2016) por lo cual la bacteria asegura una mayor integridad.
Sin embargo, en el presente estudia las clonas que tiene un mayor cambio fenotipo en morfología
colonial y la mayor atenuación de factores de virulencia se obtuvieron al exponerlas al peróxido de
hidrogeno. El H2O2 genera especies reactivas de oxigeno las que generan en el ADN mutaciones y
carcinogénesis, hay pérdida de expresión o síntesis de una proteína por daño a un gen específico,
modificaciones oxidativas de las bases, delecciones, fragmentaciones, interacciones estables ADN-
proteínas, reordenamientos cromosómicos y desmetilación de citosinas del ADN que activan
genes(Venereo 2002); por lo cual en esta situación se necesita de un sistema de reparación por
escisión, ya que estas mutaciones se consideran letales para la bacteria.
En conclusión la exposición a antibióticos y peróxido de hidrogeno generan cambios
fenotípicos en la expresión de factores de virulencia en P. aeruginosa, y esto puede originar una
mayor clonalidad de cepas circulantes en una población.
Agradecimientos
Agradezco a la Dirección General de Posgrado e Investigación de la Universidad
Autónoma de Guerrero por permitir realizar esta estancia de instigación a través de la creación y
Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
difusión del programa “Verano de investigacion UAGro” para la vinculación e integración de sus
jóvenes universitarios en el arduo e increíble proceso de la investigación científica. También
agradezco al Concejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo económico para la realización
de esta estancia, así como al Dr. Arturo Ramírez Peralta por su apoyo y consejos durante este
proceso.
Referencias
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