Post on 19-Nov-2018
Nuevos enfoques del diagnóstico molecular de las Rickettsiosis
Dra. Isabel Jado GarcíaLaboratorio de Espiroquetas y Patógenos Especiales
Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud Carlos III
NIVEL BAJO DE SOSPECHA Y DETECCIÓN DE CASOS
DEFICIENCIAS EN SU ESTUDIO
No existen métodos comerciales de detección directa
Patógenos zoonósicos bacterianos emergentes :
‐ Son agentes de difícil diagnóstico
Necesidad de una tipificación más detallada
‐ Organismos de cultivo fastidioso
‐ Producen cuadros clínicos inespecíficosAlteraciones hematológicas y bioquímicas (TCP, leuc y enz hep ↑ )
‐ Enfermedades de baja incidencia
Diagnóstico de las rickettsiosis
1 Grupos de Medioambiente
Estudio de la dinámica de vectores y reservorios
(Entomólogos, Zoólogos, Veterinarios, Biólogos)
Obtención de muestras para su estudio
3 Grupos de Laboratorio
(Microbiólogos, Biólogos Moleculares, Taxónomos)
Desarrollo de metodología de detección y caracterización Estudio de muestras recogidas.
2 Grupos Clínicos
Identificación y estudio de casos humanos y animales
(Médicos y Veterinarios)
Obtención de muestras para su estudio
Necesidad de un abordaje multidisciplinar
Diagnóstico de las Enfermedades Infecciosas
CLÍNICA
EPIDEMIOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA
Los principales signos clínicos varían de la especie implicada, los daños tienen un mismoorigen y derivan de la vasculitis generalizada por la multiplicación bacteriana en lascélulas endoteliales.
Casos graves con afectación del SNC son relativamente frecuentes.R. conorii (subsp. conorii) 5‐6% formas severas y 2,5% † en pacientes diagnosticados
Diagnóstico: Aspectos Clínicos
ExantemaVasculitisEscara de inoculación
Una erupción febril inexplicada del adulto en veranoPresencia de lesiones cutáneas necróticasDespués de mordedura de garrapata si aparece:
‐Meningoencefalitis (con serología de borreliosis negativa) ‐ Fiebre a la vuelta de un país tropical o mediterráneo‐ Fiebre resistente a betalactámicos‐ Eritema crónico atípico
Además de las fiebres inexplicadas asociadas con neutropenia, trombopenia o elevaciónde las transaminasas, se debe sospechar una rickettsiosis:
Evaluación del riesgo
FACTORESCLIMÁTICOS
DISPONIBILIDADDE ALIMENTOS
DENSIDAD DE MICROMAMÍFEROS
MANTENIMIENTODE IXÓDIDOSINFECTADOS
El riesgo de que una garrapata transmita una rickettsia y la prevalencia de una determinadainfección depende de varios parámetros:
1. La prevalencia de garrapatas infectadas53,4 % de D. marginatus de Madrid infectados con R. raoultii0,4 % de I. ricinus del PV infectados con R. monacensis
2. La afinidad de las garrapatas para picar a humanosPrevalencia de FB en países mediterráneos 50/100.000: R. sanguineus ↓Amblyomma spp ↑↑↑
3. La abundancia de garrapatas en la zona: factores climáticos y ecológicos
LA DISTRIBUCIÓN DE UNA DETERMINADA ESPECIE
COINCIDE CON LA DISTRIBUCIÓN DE LA GARRAPATA VECTOR
Diagnóstico: Aspectos Epidemiológicos
IMPORTACIÓN ILEGAL DE ANIMALES AVES MIGRATORIAS
LA CIRCULACIÓN DE ESTOS PATÓGENOS SIGUE UN PATRÓN DINÁMICO
VECTORES
RESERVORIOS
CASOS HUMANOS
R. conorii R. japonicaR. conorii subsp. israelensis R. conorii subsp. caspiaR. sibirica R. africaeR. australis R. honeiR. prowazekii R. sibirica subsp. mongolotimonaeR. typhi R. slovacaR. rickettsii R. heilongjiangensisR. akari R. aeschlimanii
R. parkeriR. massiliaeR. marmioniiR. felis
Especies de Rickettsia patógenas hasta 1984
Nuevas especies de Rickettsia patógenasentre 1985 y 2004
Las rickettsiosis son enfermedades emergentes
R. parkeri
R. conorii (caspia)
R. japonica
R. honei
R. heilongjiangensis
R. sibirica mongolotimonaeR. helvetica
R. africaeR. aeschlimannii
R. sibirica mongolotimonae
R. slovacaR. aeschlimannii
R. sibirica mongolotimonaeR. helvetica
R. monacensis
¡ 11 especies de rickettsias emergentes !
¡ 11 especies de rickettsias emergentes !
R. conorii conorii
R. conorii israelensis
R. conorii caspia
R. sibirica mongolotimonae
R. aeschlimanni
R. Slovaca
R. helvetica
R. massiliae/Bar29
R. monacensis y
otras relacionadas
R. raoultii
R. felisR. typhi
PATÓGENAS
SITUACIÓN EN EUROPA A PARTIR DE 2008
Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719‐756
Diagnóstico
DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
‐ Sarampión
‐Meningococemia
‐ Sífilis secundaria
‐ Dengue
‐ Toxicodermias
CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO(SIM) EN 2009
‐ AISLAMIENTO
‐ DETECCIÓN DE AG/GENOMA
‐ SEROCONVERSIÓN (IFI)
Modificado de P. Brouqui et al. Clin Microbiol Infect 2004; 10:1108‐1132
MUESTRA RecogidaTransporte Tiempo y Temperatura
Conservación Tiempo y Temperatura
PRUEBA DIAGNÓSTICA
NOTA
Suero Tubo con tapón de rosca
<24 h, 2‐8 C +24h, ‐20 C IFI1
Sangre con EDTA
Recoger en tubo con EDTA
< 24 h, 2‐8 ºC +24h, ‐20 C PCR2 El EDTA3
dificulta el cultivo
Sangre citratada
Recoger en tubo con citrato
< 24 h, 2‐8 ºC +24h, ‐60/‐80 C (no varias descongelaciones)
PCR, Cultivo4
Sangre heparinizada
Recoger en tubo con heparina
< 24 h, 2‐8 ºC +24h, ‐60/‐80 C (no varias descongelaciones)
Cultivo La heparina5
puede inhibir la PCR
LCR Recoger en tubo estéril
< 24 h, 2‐8 ºC +24h, ‐20 C PCR
Biopsia cutánea (escara de la picadura, piel del exantema, pápulas/máculas/vesículas)
Se recomienda asepsia en la toma de la muestra. Colocar el tejido en un tubo o frasco estéril con suero fisiológico estéril para prevenir la desecación
<24 h, 2‐8 C +24 h, ‐20 C Microscopía6
PCRMuestra de la escara de inoculación
Muestras
Tomado del Procedimiento en Microbiología Clínica (SEIMC): ”Diagnóstico microbiológico de las infeccionespor patógenos bacterianos emergentes: Anaplasma, Bartonella, Rickettsia, Tropheryma whipplei. 2007
Procesamiento de las muestras
MÉTODOS BASADOS EN PCR
INMUNOFLUORESCENCIATINCIÓN
DE GIMÉNEZ/ GIEMSA
CULTIVO CELULAR EN SHELL‐VIALSSEROLOGÍA
INMUNODETECCIÓN
ARTRÓPODOSBIOPSIA CUTÁNEA
(4°C 3 días)
SANGRE
ANTICOAGULANTE
EDTA CITRATO
SUEROPAPELFILTRO
LCR
Modificado de P. Brouqui et al. Clin Microbiol Infect 2004; 10:1108‐1132
El método serológico de referencia es la IFI. Permite el seguimiento de la respuesta inmuneespecífica y conocer la prevalencia de anticuerpos en un área determinada.
Existen portaobjetos comerciales sólo para ciertas especies.
Necesidad de sueros pareados para demostrar la seroconversión que puede tardar variassemanas o no producirse.
FB: sensibilidad 46% (sueros 5‐9 días) y del 100% (sueros después de 29 días)
En DEBONEL/TIBOLA y en infecciones por R. sibirica mongolotimonae se han descrito casos(PCR/aislamiento) con serologías negativas.
En R. africae se detectan anticuerpos 3‐4 semanas después del inicio de síntomas y la serologíanegativa en caso de instauración temprana de tratamiento antibiótico.
Diagnóstico serológico
Inconveniente: reacciones cruzadas entre las diferentes especies
Western blotting (absorción de los sueros con antígenos)
Diagnóstico serológico
NO absor absor absor R. conorii R. africae
conorii
conorii
conorii
africae
africae
africae
Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719‐756
El diagnóstico definitivo requiere el aislamiento e identificación de la especie a partir delcultivo (días‐semanas)
Cultivo en células vero‐E6 ⇒ efecto citopático no es muy característico ni especie‐específico (5‐7 días)
Diagnóstico mediante cultivo
Cultivo en shell‐vial
7 días
VARIOS PASES(20 días)
GiménezIFIPCR
Procedimiento muy laborioso, poco sensible y retrasa la emisión de resultados
El cultivo es la técnica diagnóstica más específica, fundamental para la obtención de antígenos y para estudiar la sensibilidad a los antibióticos
¡CULTIVO EN LABORATORIO BSL3!
Las muestras deben cultivarse el día de la extracción o congelarse a ‐80°C
No existen técnicas comercializadas.
Los genes más frecuentemente analizados son rOmpA, rOmpB y gltA.
PCR‐RLB del espacio intergénico 23S‐5S rRNA permite la identificaciónde la especie implicada sin necesidad de secuenciación. Este método esválido para muestras clínicas como ambientales.
Cuando se precisa mayor sensibilidad, hay que recurrir a PCR anidadas.
Diagnóstico molecular
Dianas más utilizadas
* En la PCR anidada “suicida” no se utiliza control positivo
Proteína externa de membrana A(ompA)
Citrato sintetasa (gltA)Todas las especies
(ompA)
Todas las especies excepto GT
Genes utilizados y especies Oligonucleótidos Método Muestra Referencia
PCR Biopsia cutánea Roux V. et al.Garrapatas Int J Syst Bacteriol 1997
“PCR suicida”* Suero Raoult D. et al.N Engl J Med 2001
Fournier P.E. et al. J Clin Microbiol 2004
PCR Biopsia cutánea Fournier P.E. et al. Garrapatas Int J Syst Bacteriol 1998
“PCR suicida”* Suero
*En la PCR anidada “suicida” no se utiliza control positivo y los oligonucleótidos sólo se usan una vez.
Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719‐756
Dianas más utilizadas
Citrato sintetasa (gltA)Todas las especies
Genes utilizados y especies Oligonucleótidos Método Muestra Referencia
PCR Biopsia cutánea Roux V. et al.Garrapatas Int J Syst Bacteriol 1997
PCR Biopsia cutánea Fournier P.E. et al. Garrapatas Int J Syst Bacteriol 1998
Proteína externa de membrana B(ompB)(Todas las especies excepto
PCR Biopsia cutáneaGarrapatas Roux V. et al.
Int J Syst Evol Microbiol 2000
Gen D (mayoría de las especies)
Gen que codifica la proteina de 17 kDa (todas las especies SFG)
PCR Biopsia cutánea Sekeyova Z. et al. Int J Syst Evol Microbiol 2001
PCR Biopsia cutánea Nested Suero Sangre
Garrapatas
Tzianbos T. et al. J Cin Microbiol 1989
Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719‐756
Filogenia
R. africaeRickettsia sp. “strain S”R. parkeriR. sibirica sibiricaR. sibirica mongolotimonaeR. conorii conoriiR. conorii indicaR. conorii caspiaR. conorii israelensisR. slovacaR. rickettsiiR. honeiR. japonica
R.
rickettsii
GRUPO
R. massiliaeR. massiliae Bar29R. rhipicephaliR. aeschlimanniiR. montanensis
GRUPOR. massiliae
R. helvetica GRUPO R. helvetica
R. canadendisAB bacteriumR. belli
GRUPOAncestral
R. australis GRUPO R. akari
gltA ompA ompB gen D
Modificado de P. Parola et al. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719‐756
AY125017-R_helvetica TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125014-R_Bar29 TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125013-R_massiliae TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125012-R_conorii TAGCTCGATTGGTTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125011-R_conorii TAGCTCGATTGGTTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125015-R_honei TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAABW01000001-R_sibirica TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125009-R_slovaca TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125008-R_slovaca TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAU11022-R_rickettsii TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAAY125016-R_aeschlimannii TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAR_australis TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGGGATTACATATGCATATGGTGTTAAAFE01000001-R_akari TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGGGATTACATATGCGTATAGTGTTAR_felis TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACATATGCATATAGTGTTAU11015-R_bellii TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTACACATGTATATAGTGTTTAY125019-R_typhi TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTGTATATGCATATAGTGTTAU11018-R_prowazekii TAGCTCGATTGATTTACTTTGCTGTGAGATTATATATGCATATAGTGTTA *********** ************** **** * *** *** *****
SGR-TAGCTCGATTGRTTTACTTTG
ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA PARCIAL DE LOS GENES 23S y 5S rRNA Y ESPACIO INTERGÉNICO 23S‐5S
PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA
CAGCTTTATCAACTAATAAAGATGTTGTTGCATGACTA--ATGTCATAT- TAGCTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATCACTA--ATGTTATAC- TAGCTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATCACTA--ATGTTATAC- TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATATA TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATATA TAGTTTTATCAACTTATTAAAATGTTATTGCATAACTA--ATTTTATAC- TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC- TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC- TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC- TAGTTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATGTTATAC- TAGCTTTATCAACTAATAAAAATGTTATTGCATAACTA--ATATTATACT TAGCTTTATCAATGAATAAAGATGTTGTTGCACAGCTA--ATAATGTCAT TAGCTTTATCAATGAATAAACATGTTGTTGCACAGCTA--ATAGTGTCAT TAGCTTTACCAATGAATAAAAATGTTGTTGCACAGCTA--ATAATGTTAT TAGCTTTATCAACTAATAAAG-TGTTGTTGCATGATTGTCATCCCGTGGC TAGCTTTATCAATAAATAAAAATGTTATTCTATCGTTT------TATGT- TAGCTTTATCAATAAATAAAAATGTTATTCTATCGTTT------TATGT-
----------CATGGCTTGATCCACGGTA----TCCAGTAAAA---ATTA----------TGTAGCCCCG-CCACGATA----TCTAG-AAAA---ATTA----------TGTAGCCCCG-CCACGATA----TCTAGCAAAA---ATTAC---------TGTAGCCCTG-CCACGATA----TCCAGCGAGA---ATTAC---------TGTAGCCCTG-CCACGATA----TCCAGCGAGA---ATTA----------TGTAGCCTTG-CCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA----------TGTAGCCCTG-CCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA----------TGTAGCCCCTGCCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTA----------TGTAGCCCCTGCCACGATA----TCCAGCGAAA---ATTT----------TGTAGTCCTG-CAACGATA----TCCAGCGAAA---ATTAGTA-------TGTAGCCCCG-CCACGATA----TCCAGCAAAA---ATTACT--------CGTGGCTTGA-CCACAGTA----TCTAG---C----AGTAGT--------CGTGGCTTGA-CCAC---------------------AGTAAC--------CGTGGTCCCG-CCAC---------------------GGTATTTATTTATATGTCATTCCTGCGAAAGCAGGAGTCTAGTAAAATATAATG----------CACGATTTGA-CCGTAA-GA---TC-------------------------TACGATTTGA-TAGTAA-AG---TTTTG--------ATCT
R_helBar29R_massR_conR_conR_honR_sibR_sloR_sloR_rickR_aeschR_ausR_akaR_felR_bellR_tyR_prow
DISEÑO DE SONDAS ESPECÍFICAS EN GENES 23S y 5S rRNA Y ESPACIO INTERGÉNICO 23S‐5S
103 pb
224 pb
318 pb
374 pb
152 pb
F1 R1
F2 R2
F3 R3
R4F4
F5 R4
DNA sintético de R. prowazekii
PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA
Reacción de ligación
Shock térmico
Selección de transformantes
Purificación de plásmidos
Secuenciación
CLONACIÓN
Semi‐NESTED MUESTRAS CLÍNICAS 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-810-3 10-4 10-5 10-6 -7 -
Copias 103 102103 102 10 1Dilución
PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA
SG-TG-wt GTTATTCTATCGTTTTATGTYACGSG-TG-mut1-GAATAACATACGAAAATAGAATCG (cambiadas A y T)
S-PROW- TACGATTTGATAGTAAAGTTTTGS-PROW-mut1-ATCGTAAAGTATGATTTGAAAAG (cambiadas A y T)
SG-Rick TAGCTCGATTGRTTTACTTTGSG-Rick-mut- TAGCTCCCATTAGTTCGGGTG (cambios en negrita)
GATAGGTCGGGTGTGGAAGCACAGTAATGTGTGTAGCTAACCGATACTAATAGCTCGATTGRTTTACTTTGCTGTGAGA
TTATATATGCATATAGTGTTAATTATATAAGTATTTAAGCATCAATTTGTAAATTATAATTTTAATGTTAAATTAGCTT
TATCAATAAATAAAAATGTTATTCTATCGTTTTATGTYACGATTTGATAGTAAAGTTTTGATCTTTCTTTAAGATATTG
TAGACAATTGTATATTATACCTTGCTTAAGAATAATATAATAGCATTAACAGCATATTATAATACAACCTATTTTGTTA
AATTTGTATTGCTAGCTTGGTGGTCATAGCATGAGTGAAACACACGATCCCATCCCGA
CONTROL POSITIVO: Clon mutado de R. prowazekii
Comparativa entre 23S‐5S rRNA y rOmpA
rOmpA
10‐3 10‐4 10‐5 10‐3 10‐4 10‐5 10‐6
1ª PCR nested
Dilución
427 pb532 pb
23S-5S rRNA
Copias
10‐610‐510‐410‐3 C‐10‐610‐510‐410‐3C‐
1 10 102 103
Dilución
1ª PCR seminested
10 VECES MAYOR SENSIBILIDAD!!!
374 pb
Fournier P.E. et al. Int J Syst Bacteriol 1998
Revelado de la reacciónC
B Incubación con productos de PCRA Fijación de las sondas
DETERMINACIÓN DE LA ESPECIE IMPLICADA (SIN NECESIDAD DE SECUENCIACIÓN)
Diagnóstico molecular en el Lab de Espiroquetas y Patógenos Especiales
PCR‐HIBRIADCIÓN EN FASE REVERSA (RLB) del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA
SONDASO
RG
AN
ISM
OS-CI2SG-RICKSG-SFGS-AESCHS-AKA3S-AUSS-BELLS-CONS-FELS-HELVS-RI/SIS-SLOSG-TGS-PROWS-TYPHIS-CI2
R. a
esch
liman
nii
R. a
kari
R. a
ustra
lisR
. bel
liiR
. con
ori
R. f
elis
R. h
elve
tica
R. r
icke
ttsii
R. s
ibiri
caR
. slo
vaca
R. p
row
azek
iiR
. typ
hiN
egat
ive
Con
trol
ESPECIFICIDAD
S-PHAS-CHAS-EWIS-MCOS-ALS
S-BACIS-BOV
S-CLARS-DOSHS-ELIZ
S-GRAH2S-HENSS-KOEHS-QUINS-SCHOS-TAY
S-TRIBS-VIN-A1S-VIN-A2S-VIN-BSG-BOR3
S-IS1111S-TUL
SG-RICKSG-SFGSG-TGS-CI2
Bruc
ella m
ellite
nsis
Chlam
ydia
pneu
mon
iaeC.
psit
taci
Esch
erich
ia co
liLe
gion
ella p
neum
ophi
laLe
ptos
pira
inte
rroga
nsMy
copl
asm
a pne
umon
iaeOc
hrob
actru
m an
tropi
Orien
tia ts
utsu
gam
ushi
Pseu
dom
onas
aeru
gino
saSa
lmon
ella e
nter
ica Ty
phi
Stre
ptoc
occu
s pne
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iaeTr
epon
ema p
allid
umIxo
des r
icinu
sDe
rmac
ento
r mar
gina
tus
Ripi
ceph
alus s
angu
ineu
sAp
odem
us sy
lvatic
usADN humano
Control negativo
SONDAS
OR
GA
NIS
MO
PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA
APLICACIONES
10 B
LOO
D39
BLO
OD
135
SK
IN13
5 B
LOO
D17
2 PL
469
RBC
469
PL47
3 R
BC36
2 BC
362
RBC
226
PL22
6 LE
U17
5 BC
175
SER
SG‐RICKSG‐SFGS‐AESCHS‐AKA3S‐AUSS‐B29S‐BELS‐FEL
S‐HELVS‐CONS‐HONS‐RI/SIS‐SIBS‐SLOSG‐TG
S‐PROWS‐TYPHI
FIEBRE BOTONOSA
AY125019-R typhi
R typhi
U11018-R prowazekii
AY125009-R slovaca
AY125008-R slovaca
AY125015-R honei
AY125012-R conorii
AY125011-R conorii
U11022-R rickettsii
AY125014-R Bar29
AY125013-R massiliae
AY125016-R aeschlimannii
AY125017-R helvetica
362 BCR felis
R australis
U11015-R bellii
99
100
99
98
94
77
49
50
50
99
49
79
79
43
0.05
23S‐5S rRNA
Agente causal: R. conoriiVector: R. sanguineus
Nuevos patógenos humanos: R. monacensis
Rickettsia spp.
Detección de un patógeno diferente de R. conorii en un paciente con un cuadro similar a una fiebre botonosa
Identificación de R. monacensis mediante filogenia
Primera vez que se describe a esta especiecomo patógeno humano
rOmpA
gltA
Nuevos patógenos humanos: R. monacensis
CASO 1 ‐ Junio 2007:
• Mujer 67 años con fiebre, mialgias y lesión en cuero cabelludo de 10 días de evolución. Al ingreso: fiebre, confusión,adenopatías retroauriculares y exantema maculopapular en tronco y extremidades
• NO LINFANGITIS• Analítica: Hiponatremia, enzimas hepáticas ↑. Tratamiento: doxiciclina con buena respuesta• PCR de la escara de inoculación POSITIVA. PCR en sangre NEGATIVA• IFI con antígeno de R. sibirica mongolotimonae IgG:1/160 IgM: 1/50 (no suero de fase convaleciente)• Actividad de riesgo: jardinería
Descripción de 3 casos de R. sibirica mongolotimonae en Elche
CASO 2 ‐ Septiembre 2008:
• Varón 32 años con fiebre, escalofríos, mialgias y cefalea de 10 días de evolución• A la exploración escara en cara interna de muslo derecho con lifadenopatía regional y linfangitis. Analítica:
Hiponatremia, elevación de enzimas hepáticas• Tratamiento con azitromicina, a las 24h exantema en extremidades, palmas y plantas• PCR del aspirado de la adenopatía POSITIVA• Serología (fase aguda y convaleciente) NEGATIVA• Actividad de riesgo: trabajar en un campo de golf
CASO 3 ‐ Abril 2010:
• Varón 33 años con fiebre, mialgias de 5 días de evolución. A la exploración escara necrótica en regiónpretibial derecha y linfangitis con adenopatía inginal.
• Analítica: Hiponatremia, elevación de enzimas hepáticas• NO EXANTEMA• Tratamiento: doxiciclina con buena evolución• PCR de la escara positiva• Serología (fase aguda y convaleciente): NEGATIVA• Actividad de riesgo: pasear por el campo
CASO
1CA
SO 2
CASO
3R. con
orii
R. con
orii
SG‐RICK‐
SG‐SFG‐
S‐SIB‐
SECUENCIACIÓN
PCR‐RLB del fragmento hipervariable 23S‐5S rRNA
caso 1‐ NOcaso 2‐ HQ710799caso 3 ‐HQ710800
caso 1‐ HQ728350caso 2 ‐HQ728351caso 3 ‐HQ728352
23S‐5S rRNA
rOmpA
rOmpA Nested
CASO
1
CASO
2
CASO
3
Confirmación de Casos de Tifus Murino en GC
SG‐RICK‐MSG‐RICK SG‐SFGSG‐TG
S‐PROWS‐CON
S‐AESCHS‐SIBS‐SLO
HOSPITAL UNIVERSITARIO MATERNO INFANTILLAS PALMAS DE GRAN CANARIA
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
PARA LA CONFIRMACIÓN DE CASOS
DE TIFUS MURINO (2006)
EN GRAN CANARIAS
Estudio de vectores en Madrid
Estudio de garrapatas de erizo en Barcelona
• Tamaño muestral: 99 garrapatas de erizos
• Especies analizadas: Ixodes exagonus, Hyalomma lusitanicum,
Rhipicephalus spp. R. pusillus y R. turanicus
• Positivas: 34%
• Especies: R. conorii (1), R. massiliae y R. massiliae Bar 29 (2:1)
Colaboración con Elena ObonCentre de Recuperació de Fauna de TorreferrussaSanta Perpètua de Mogoda (Barcelona)Generalitat de Catalunya
EXISTE UN CICLO SILVESTRE DE R. massiliae Bar29 EN LA NATURALEZA
ESTUDIO DE VECTORES Y RESERVORIOS EVALUACIÓN DEL RIESGO
“ESTAMOS FRENTE A AGENTES CON UNA AGRESIVIDAD QUE ES IMPORTANTE IDENTIFICAR, PREVENIR Y TRATAR”
Antes...
Cuadros clínicos
autolimitados
Ahora...
Cuadros de evolución GRAVE
(neurológicos)
CONOCER LA DINÁMICA TEMPORAL DE ESTOS AGENTES EN LOS VECTORES
ESTABLECER ALERTAS Y PREVENIR RIESGOS POSTERIORES
MEJORAR EL NIVEL DE SOSPECHA CLÍNICA
La metodología disponible hasta ahora carecía de sensibilidad en muestras clínicas
Un proceso febril tras la picadura de una garrapata infectada, con resultados negativos por PCR en sangre es un hallazgo frecuente
HEMOS DISEÑADO UN MÉTODO VERDADERAMENTE GENÉRICO QUE AMPLIFICA CUALQUIER ESPECIE
PERMITE LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIE SIN NECESIDAD DE SECUENCIACIÓN
RESULTA 10 VECES MÁS SENSIBLE QUE OTROS MÉTODOS
CONCLUSIONES
MAYOR RAPIDEZ EN EL DIAGNÓSTICOMEJOR PRONÓSTICO PARA LOS PACIENTES
MEJOR CONOCIMIENTO DE LAS ESPECIES QUE CIRCULAN LOCALMENTE
DISPONEMOS DE CAPACIDAD PARA IDENTIFICAR LA CIRCULACIÓN DE CLONES NO AUTÓCTONOS
(IMPORTADOS/LIBERACIÓN INTENCIONADA)
CONCLUSIONES
DESCRIPCIÓN DE NUEVOS PATÓGENOS/DETECCIÓN DE PATÓGENOS EMERGENTES
Laboratorio de Espiroquetas y Patógenos EspecialesCentro Nacional de Microbiología
Majadahonda. Madrid
¡ GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓN!